Kylmäsäilytystekniikan soveltaminen kasvullisesti lisättävien kasvien geenivarojen pitkäaikaissäilytyksessä

Transkriptio

1 Loppuraportti Kylmäsäilytystekniikan soveltaminen kasvullisesti lisättävien kasvien geenivarojen pitkäaikaissäilytyksessä Application of cryopreservation techniques to long-term gene resource preservation of vegetatively propagated plants MTT Kasvintuotannon tutkimus

2 Sisällysluettelo 1. Tutkimuksen tavoitteet Tutkimusosapuolet ja yhteistyö Tutkimuksen tulokset Tutkimusmenetelmät ja aineisto Kryosäilytys Somaattiset alkiot Pitkäaikaissäilytetyn aineiston yhtenäisyys ja mahdollisten geneettisten muutosten havaitseminen Viruspuhdistus Tutkimustulokset Kryosäilytys Somaattiset alkiot Pitkäaikaissäilytetyn aineiston yhtenäisyys ja mahdollisten geneettisten muutosten havaitseminen Viruspuhdistus Toteutusvaiheen arviointi Julkaisut Julkaisut Julkaisut Julkaisut Julkaisut Tulosten arviointi Tulosten käytännön sovelluskelpoisuus Tulosten tieteellinen merkitys Loppuraportin tiivistelmä

3 1. Tutkimuksen tavoitteet Kylmäsäilytystekniikan soveltaminen kasvullisesti lisättävien kasvien geenivarojen pitkäaikaissäilytyksessä -hanke liittyi Suomen maa- ja metsätalouden kansalliseen geenivaraohjelmaan Suomen kansallisen kasvigeenivaraohjelman toimeenpano. Ohjelman tärkeimpiä tavoitteita ovat 1) kasvigeenivarojen säilyttäminen, 2) kasvigeenivarojen kestävä käyttö ja 3) kasvigeenivaroja koskeva tutkimus, tiedotus, opetus ja neuvonta. Kansallinen kasvigeenivaraohjelma pyrkii turvaamaan pitkällä aikavälillä kotimaisten pelto- ja puutarhakasviaineistojen säilymisen. Tähän liittyen hankkeemme keskittyi kasvullisesti lisättäviin puutarhakasveihin ja perunaan, joille oli tavoitteena käynnistää pitkäaikaissäilytysmenetelmät nestetypessä. Hankkeen päätavoitteena oli kasvullisesti lisättävien kansallisten kasvigeenivarojen onnistunut pitkäaikaissäilytys kryomenetelmien avulla. Hankkeella pyrittiin mahdollistamaan MTT:n hallussa olevan laajan geenivara-aineiston säilyttäminen mahdollisimman turvallisesti ja kustannustehokkaasti. Osatavoitteita olivat kylmäsäilytysohjeiden ja lisäysmenetelmien optimoiminen säilytettäville aineistoille siten, että menetelmä soveltuu mahdollisimman monelle kulloinkin tutkittavan kasviryhmän kasville. Lisäksi tavoitteena oli optimoida menetelmiä ja laatia tarkemmat menettelyohjeet myös ns. vaikeille kasveille, joille yleisempi menettely ei sovellu. Hankkeen käynnistämisvaiheessa tavoitteena oli perustaa MTT:een pysyvä kylmäsäilytyskokoelma (kryopankki), johon kerätään säilytyksen kannalta arvokkaiksi todettuja geenivaroja. Kryopankin hallinnointiin soveltuva tietojärjestelmä oli tavoitteena kehittää yhteistyössä Laukaassa käynnistyvän tietojärjestelmähankkeen kanssa. Lisäksi tavoitteena oli, että kyseinen tietojärjestelmä rakennetaan yhteensopivaksi NordGenin (Pohjoismaisen Geenivarakeskuksen) jo olemassa olevien tietokantojen kanssa. Kiireisimmiksi säilytykseen otettaviksi kokoelmiksi todettiin hankkeen tavoitteita määritettäessä mm. NordGenin Prunus-kokoelma, joka sijaitsi MTT:n nyt lakkautetulla Hämeen tutkimusasemalla, Helsingin yliopiston vadelmakokoelma ja MTT Ruukin tyrnikokoelma. Kryotekniikkaan perustuva pitkäaikaissäilytysmenetelmä todettiin myös perunan kansallisten aineistojen säilyttämisen kannalta erittäin tärkeäksi, koska NordGenilla ei ole olemassa perunaaineistoista duplikaattikokoelmaa eikä varmuusvarastoja kryosäilytyksessä. Tavoitteena oli myös kehittää menetelmiä, jotka vähentäisivät resursseja vaativaa rutiininomaista toimintaa kasvien solukkoviljely- ja kylmäsäilytystekniikoissa, eli hankkeessa pyrittiin kehittämään kasvullisten alkioiden tuotantotekniikoita ja niille soveltuvia kryosäilytysmenetelmiä. Pitkäaikaistavoitteena kryosäilytyksen käyttöönotolla oli vähentää kenttäkokoelmien ja solukkoviljelmien lukumääriä ja samalla aineistojen säilytyskustannuksia. Tavoitteiden toteuttamista varten hanke jaettiin alunperin kahteen kolmivuotiskauteen, joista ensimmäinen kausi toteutettiin vuosina Hanke jakautui 22 osatehtävään. Osatehtävistä kolme päätettiin ohjausryhmän hyväksynnällä jättää toteuttamatta, keskittäen näin resursseja muille tehtäville. 3

4 2. Tutkimusosapuolet ja yhteistyö Kryosäilytyshanke oli MMM:n ohjelman "Suomen kansallisen kasvigeenivaraohjelman toimeenpano" alainen tutkimushanke. Kasvigeenivaraohjelman yhtenä tehtävänä on kehittää kasvigeenivarojen säilytystekniikoita. Kryosäilytyshankkeen toteuttivat yhteistyössä MTT Kasvintuotannon tutkimus (Taimistoryhmä, Laukaa) sekä MTT:n Biotekniikka- ja elintarviketutkimus (BEL, Jokioinen) ja Helsingin yliopisto (Soveltavan biologian laitos). Johtavana vastuualueena hankkeessa toimi MTT Kasvintuotannon tutkimus. Työnjako oli seuraavanlainen: Laukaassa kehitettiin kryopankkitoimintaa sekä kylmäsäilytysmenetelmiä ja Jokioisilla kehitettiin alkioviljelymenetelmiä, DNA-merkkien tuottoa sekä säilytettyjen kasvien aitoustestaustekniikoita molekyylimenetelmien avulla. Molekyylianalyysimenetelmät tehtiin MTT:n ja Biotekniikan instituutin yhteislaboratorion (Prof. Alan Schulman) kanssa yhteistyössä. MTT BEL vastasi myös perunan kryosäilytettyjen ja somaattisen embryogeneesin kautta tuotettujen kasvien morfologisista analyyseista, joka tutkimussuunnitelmasta poiketen toteutettiin Jokioisten kasvihuoneilla MTT Ruukin kenttäkokeiden sijaan. Lisäksi hankkeessa tutkittiin kryoterapiamenetelmää eli nestetyppikäsittelyyn perustuvaa viruspuhdistusmenetelmää Helsingin yliopiston Soveltavan biologian laitoksella, käyttäen mallikasvina vadelmaa. Tutkimukseen liittyi myös muita MTT:n sisäisiä yhteistyötahoja. Esimerkiksi MTT:n kasvigeenivaratyöryhmät toimivat asiantuntijoina mm. säilytettävien kasvigeenivarojen osalta. Lisäksi MTT:n eri toimipaikkojen kanssa oltiin yhteistyössä koskien niillä sijaitsevien kasvigeenivaraaineistojen tallettamista kryopankkiin. Kansallisella tasolla tutkimusyhteistyötä tehtiin Helsingin yliopiston soveltavan biologian laitoksen (Jari Valkonen) lisäksi myös Oulun yliopiston biologian laitoksen (Hely Häggman) kanssa. Perunan osalta yhteistyökumppanina oli Suomen siemenperunakeskus Oy (SPK) ja MTT:n kasvigeenivaraohjelman koordinaattori Merja Veteläinen (MTT BEL). Lisäksi oltiin yhteistyössä Jyväskylän ammattikorkeakoulun kanssa. Kansainvälisenä asiantuntijana hankkeessa toimi tohtori Qiaochun Wang (Key Laboratory of Genetic Improvement of Horticultural Plants of Northwest China, College of Horticulture, Northwest Agricultural & Forest University, Yangling, Shaanxi, Kiina). Tri Wang saapui Suomeen vuoden tutkijavierailulle lokakuussa 2005 ja toteutti tässä hankkeessa vuonna 2006 kryoterapian avulla tapahtuvan vadelman viruspuhdistuksen kehittämisen. Hankkeen ohjausryhmässä toimivat puheenjohtajana Tuula Pehu (MMM) ja jäseninä Paula Elomaa (HY), Aarne Kurppa (MTT), Jukka-Pekka Palohuhta (SPK), Mari Rusanen (METLA) ja Leena Ryynänen (METLA). Hankkeessa verkostoiduttiin myös kansainvälisesti. Hankkeen kautta oltiin mukana vuonna 2006 käynnistyneessä EU:n rahoittamassa COST Action 871 Cryoplanet -verkostossa. Kyseistä COSTohjelmaa koordinoi Dr. Bart Panis (Catholic University of Leuven, Belgia). Tässä hankkeessa osallistuttiin COST 871 hankkeen kahden työryhmän yhteiskokouksen järjestämiseen Oulun yliopistossa helmikuussa Hankkeessa vieraili Slovakian ja Suomen Akatemian yhteisrahoittamana tri Alena Gajdošová (Institute of Plant Genetics and Biotechnologysta, Nitra, Slovakia) kahden kuukauden ajan vuonna Lisäksi hankkeen kuluessa tehtiin yhteistyötä Scottish Crop Research Instituten (SCRI, 4

5 Dundee, Iso-Britannia) tutkijoiden kanssa liittyen perunan alkiotuotantoon. Hankkeen aikana aloitettiin myös tutkimusyhteistyö Saksan IPK-tutkimuskeskuksen (Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Research, Gatersleben) kanssa liittyen perunan kryosäilytystekniikoihin. 3. Tutkimuksen tulokset 3.1. Tutkimusmenetelmät ja aineisto MTT Laukaassa käytettiin hankkeessamme uusimpia bioteknisiä kylmäsäilytysmenetelmiä, jotka perustuvat solukkoviljelyllä tuotettujen silmujen, versonkärkien tai keinotekoisten alkioiden säilytykseen nestetypessä tai sen kaasufaasissa. MTT BEL Jokioisilla kehitettiin somaattisten alkioiden viljelymenetelmiä perunalle ja vadelmalle. Lisäksi BEL:ssä tutkittiin embryogeneesin kautta tuotetun kasviaineiston yhdenmukaisuutta ja aitoutta perustuen morfologisiin menetelmiin ja molekyylianalyyseihin. Helsingin yliopiston Soveltavan biologian laitoksella kehitettiin nestetyppisäilytykseen perustuvaa viruspuhdistusmenetelmää käyttäen mallitapauksena erittäin vaikeasti eliminoitavan vadelman kääpiökasvuviroosin (RBDV) saastuttamaa vadelma-aineistoa Kryosäilytys Kryosäilytys on menetelmä, jossa kasvupisteitä kuten silmuja tai versonkärkiä pitkäaikaissäilytetään nestetypessä (-196 C) tai sen kaasufaasissa (alle -150 C). Kylmäsäilytysmenetelmät voidaan jakaa kahteen ryhmään: perinteisiin jäädytysmenetelmiin ja hiljattain kehiteltyihin vitrifikaatio- tai dehydraatiomenetelmiin. Tässä hankkeessa keskityttiin erityisesti solukkoviljeltyjen aineistojen kryosäilytykseen vitrifikaatiomenetelmin ja suurin osa kryosäilytyksen kohteista kuului ruusukasveihin, mutta tutkimusta tehtiin laajasti viiden eri heimon lajeilla (Taulukko1). Perinteisiä jäädytysmenetelmiä käytettiin vain pienimuotoisesti lepotilaisten silmujen säilytyskokeiluihin. Vitrifikaatiopohjaisten menetelmien vaatimuksena on mikrolisäysmenetelmän toimiminen säilytettävälle kasville. Vitrifikaatiossa kasvisolukon soluissa oleva vesi vaihdetaan jäänsuoja-aineisiin kuten sakkaroosiin, glyseroliin, etyleeniglykoliin ja dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Tällöin solujen ja soluvälien neste muuttuu niin viskoosimaiseksi, että kidemäistä jäätä ei synny. Tämä ilmiö estää jääkiteitä rikkomasta soluja ja solujen kasaan luhistumista kuivumisen takia. Laukaaseen parhaiten soveltuvat solukkoviljellylle materiaalille käytettävät yksivaihejäädytysmenetelmät ja niistä erityisesti pisara vitrifikaatio-menetelmä, jonka tohtori Wang on optimoinut vadelmalle. Se on ilmeisesti käytettävissä laajasti eri kasvullisesti lisättäville kasveille riippumatta niiden kylmäkaraistumiskyvystä. Solukkoviljelmistä eristettyjen silmujen tai versonkärkien kryosäilytys hankkeessamme perustui tälle menetelmälle. Esikäsittelyjen jälkeen solukkoviljelty kasvimateriaali jäädytettiin suoraan nestemäiseen typpeen. Lepotilaisille silmuille käytettiin kaksivaihejäädytystä. Aineistot sulatettiin +40 C:een vesihauteessa. Tämän jälkeen solukkolisätyillä aineistoilla jäänsuoja-aineet pestiin pois ja lepotilaisille silmuille tehtiin pintasterilointi ja kasvupisteet eristettiin. Kasvupisteet siirrettiin kasvamaan ravintoalustalle. Perunan mikromukuloille testattiin kolmen viikon pituiseen kylmäkäsittelyyn yhdistettyä vitrifikaatiomenetelmää. Perunan embryogeenisen kalluksen kryosäilytystä kapselointivitrifikaatiomenetelmällä kokeiltiin neljällä eri perunalajikkeella. 5

6 Taulukko 1. Hankkeen Kylmäsäilytystekniikan soveltaminen kasvullisesti lisättävien kasvien geenivarojen pitkäaikaissäilytyksessä aikana vuosina solukkoviljeltyjen aineistojen kryosäilytyskokeissa mukana olleiden sekä pitkäaikaissäilytykseen kryotankkiin talletettujen kasvikantojen (lajikkeiden) määrät lajiryhmittäin. Heimo ja lajiryhmä Kantojen (lajikkeiden) määrä kryosäilytyskokeissa Kantojen (lajikkeiden) määrä pitkäaikaisessa kryosäilytyksessä Rosaceae Vadelmat ja lakka Mansikat 10 8 Kriikuna 1 - Ruusut 1 - Omenat 2 - Grossulariaceae Herukat 7 1 Cannabaceae Humalat 9 9 Oleaceae Syreenit 1 1 Solanaceae Perunat 10 - Yhteensä Somaattiset alkiot Somaattiset alkiot ovat kryosäilytyksessä silmuille ja versonkärjille vaihtoehtoisia säilytysmuotoja. Somaattisella embryogeneesillä (kasvullisella alkionmuodostuksella) tarkoitetaan sitä, että mikä tahansa kasvin osa tuottaa alkiota muistuttavan rakenteen, jolla on kyky kasvaa geneettisesti samankaltaiseksi kasviksi kuin lähtöaineistona käytetty yksilö. Tärkeimpänä kohtana somaattisen embryogeneesin onnistumisessa voidaan pitää ns. varhaisalkioiden eli proembryoiden indusointia. Tutkimuksessamme indusoiduista varhaisalkioista erilaistettiin sirkkalehdellisiä vihreiden kasvien alkuja. Auksiinia pidetään merkittävimpänä embryogeneesiä indusoivana kasvunsääteenä, joka on tärkeä yhdiste yksittäisten solujen jakautumiselle ja muodostuneiden solukkojen kyvylle erilaistua alkioiksi. Hankkeessa keskityttiin somaattisten alkioiden tuottoon kahdesta kasvilajista: perunasta ja vadelmasta Pitkäaikaissäilytetyn aineiston yhtenäisyys ja mahdollisten geneettisten muutosten havaitseminen Kryosäilytyksessä olleiden kasvien vaatimuksena on, että kasvit pysyvät ns. aitoina eli geneettisesti stabiileina, yhdenmukaisina ja samankaltaisina kuin niiden emoyksilöt. Mahdollisen muuntelun aikaansaamat muutokset tulevat esiin täysikasvuisissa kasviyksilöissä esimerkiksi ulkomuodossa, kasvurytmissä tai satoon liittyvissä ominaisuuksissa. Poikkeavat yksilöt tulisi tunnistaa ja poistaa lisäyksestä mahdollisimman varhaisessa vaiheessa. Suuria geneettisiä muutoksia liittyen ploidiatason muutoksiin (koko kromosomistojen kaksinkertaistuminen) tai aneuploidisiin muutoksiin (hypoploidia, hyperploidia) tutkittiin perunan somaattisen embryogeneesin kautta muodostuneista kasveista virtaussytometriaa käyttäen. Lisäksi morfologisesti poikkevat perunat (ns. off-tyypit) kirjattiin. Kryosäilytettyjen mansikoiden ja vadelmien yhdenmukaisuus tutkittiin Laukaassa morfologisia menetelmien avulla vertailemalla aineistoja emokasveihin. 6

7 Hankkeessa kehitettiin myös molekyyligeneettisiä työkaluja peruna- ja vadelma-aineistojen geneettisen yhdenmukaisuuden testaamiseksi. Koska poikkeamia aiheuttavat DNA-tason muutokset ovat usein hyvin pieniä ja paikallisia, vaaditaan käytettävältä menetelmältä erityistä tarkkuutta. Tässä hankkeessa testattiin luotettavan ja tehokkaan DNA-tunnistusmenetelmän löytämiseksi MSAPmenetelmän (metyloituneen DNA:n tunnistava tekniikka) ja S-SAP-menetelmän (retrotransposonien aktivoitumisen tunnistamiseen liittyvä tekniikka) toimivuutta vadelma- ja peruna-aineistoille Viruspuhdistus Kasvimateriaalien säilytyksessä ongelmia aiheuttavat säilytettävien kasviaineistojen tautisuus, erityisesti virustaudit. Kasvintuhoojapuhdistus ja -testaus ovat laadukkaan geenivaraohjelman perusedellytykset. Helsingin yliopiston Soveltavan biologian laitoksella kehitettiin tässä tutkimuksessa nestetyppisäilytykseen perustuva viruspuhdistusmenetelmä (kryoterapia) käyttäen aineistoina MTT:n testauksissa löydettyä vadelman kääpiökasvuviroosin (RBDV) saastuttamaa vadelmalajiketta. Kyseinen virus on aikaisemmin Laukaan tutkimus- ja valiotaimiasemalla tehdyissä tutkimuksissa todettu erityisen vaikeasti eliminoitavaksi virukseksi. Perinteisin menetelmin ja yksinkertaisella kryokäsittelyllä vaikeasti eliminoitavissa olevan RBDV:n eliminoimiseksi tässä hankkeessa kokeiltiin lämpökäsittelyn yhdistämistä nestetyppikäsittelyyn. Kasvimateriaalina käytettiin solukkoviljeltyjä vadelman versoja, joita lämpökäsiteltiin 38 C:ssa 6-7 viikon ajan. Tämän jälkeen eristettiin noin 1 mm:n pituisia versonkärkiä, joille tehtiin kryokäsittely käyttäen menetelmiä, joissa toipumisprosentti on alhainen. Tällöin vain elinvoimaisimmat solut säilyivät. Käsittelyjen onnistumista havainnoitiin Elisa-testauksin ja toipuvien kasvupisteiden kasvuunlähtöä tutkittiin mikroskooppikuvista Tutkimustulokset Kryosäilytys Tutkimuksen alkuvaiheessa perustettiin MTT:lle kylmäsäilytysgeenivarakokoelma eli kryopankki, johon voidaan nestetypen kaasufaasiin tallettaa duplikaatit (varmuusvarat) perinteisin menetelmin säilytettävistä kannoista. Kryosäilytys on vastannut odotuksia ollen tähän mennessä saatujen tulosten mukaan myös turvallista. Kryosäilytyksen tehokkuutta kehitettiin koko hankkeen ajan. Laukaan pisara-vitrifikaatiomenetelmä soveltui lähes kaikille testatuille kannoille paitsi yhdelle kriikunakannalle, mutta useampien lajien kohdalla ilmeni tarvetta varsinaisen kryosäilytysprosessin jälkeiseen toipumisalustojen kehittelyyn. Kryosäilytys tehtiin kattavasti alun perin kansallisen geenivaraohjelman määrittämässä laajuudessa pitkäaikaissäilytykseen valittujen Piikkiön vadelmakokoelman kantojen osalta muutamia yksittäisiä kantoja lukuun ottamatta. Laukaan ydinkasvihuollon mansikkakokoelmista saatiin kryotankkiin säilytykseen lajikkeet Polka ja Jonsok, joten niiden vuosittaisesta uusien aloitusten otosta ja testauksesta voidaan luopua. Tankkiin talletettiin myös lajikkeet Lina, Kent, Cavendish, Kulkuri, Suvetar ja Valotar. Tärkeimmät Prunus-kannat, joiden alkuperä on MTT:n laukkautetulta Hämeen tutkimusasemalta, otettiin Laukaaseen solukkoylläpitoon myöhempää kryosäilytystä varten. Myös eri herukkakantojen ja syreenin osalta tehtiin kryosäilytysmenetelmien kehittämistä. Mustaherukat ja viherherukat todettiin selvästi punaherukoita helpommin kryosäilytettäviksi aineistoiksi. Syreenien elpyminen kryosäilytyksestä todettiin onnistuvan, mutta jatkokasvatus ja hyvin jakaantuvien 7

8 viljelmien saaminen syreeniaineistosta todettiin haastelliseksi. Syreenin toipumisalustan optimoiminen on tulevaisuudessa tarpeellista. Perunalla mikromukuloiden ja somaattisten alkioiden kryosäilytys ei onnistunut ja meristeemienkin kryosäilytysmenetelmät vaativat vielä optimointia, ennen kuin kryopankkitoiminta voidaan aloittaa lajilla Somaattiset alkiot Saamiemme tulosten perusteella kaikki kymmenen Suomen siemenperunakeskus Oy:sta saamaamme perunalajiketta muodostivat versoja somaattisen embryogeneesin kautta, kun kehitimme tekniikkaa kasvunsääteiden avulla. Somaattinen embryogeneesi varmistui tekemällä viljelmistä värjättyjä parafiinileikkeitä ja selvittämällä alkiomaisten rakenteiden muodostuminen. Näytteet fiksoitiin Jokioisilla ja analysoitiin Slovakiassa. Ensimmäisten kokeidemme perusteella epäsuoran somaattisen embryogeneesin kautta muodostuneissa kasveissa oli morfologista vaihtelua, joten kaikki kasvit eivät olleet geneettisesti yhdenmukaisia. Kasveissa todettiin myös ploidiatason muutoksia. Vadelman somaattinen embryogeneesi onnistui hankkeen kuluessa. Ottawa-lajikkeen lehtiruoteja käytettiin uusintakokeiden lähtöaineistona, koska olimme aiemmin todenneet alkiorakennelmia muodostuneen eniten lehtiruodeista verrattuna muihin kasvinosiin. Kasvatusalustassa käytettiin korkeaa auksiinipitoisuutta. Viljelmät fiksoitiin eri kasvatusvaiheissa ja näytteet lähetettiin histologisia analyyseja varten tarkasteltavaksi Nitraan, Slovakiaan. Saamamme tulokset osoittivat, että suurin osa versoista oli muodostunut epäsuoran somaattisen embryogeneesin kautta, sillä histologisissa näytteissä oli sekä varhaisvaiheisia (globulaarivaiheisia) että torpedovaiheisia alkiomuodostelmia. Osassa viljelmiä oli myös adventiiviversoja Pitkäaikaissäilytetyn aineiston yhtenäisyys ja mahdollisten geneettisten muutosten havaitseminen Hankkeessa keskityttiin somaattisen embryogeneesin kautta tuotettujen kasvien geneettisen aitouden analyysiin. Alkioista tuotettujen perunoiden aitous testattiin kaikilla kymmenellä tutkittavalla lajikkeella. Kasvit kasvatettiin samaan aikaan samoissa kasvuoloissa kasvihuoneella ja lehtinäytteet kerättiin mahdollisimman samanaikaisesti, jotta näytteitä voidaan myöhemmin soveltaa MSAPanalyysiin. S-SAP-analyysissa peruna-aineisto testattiin kahdesti eri alukeyhdistelmillä. Lajikkeiden sisäistä vaihtelua ei havaittu. Sen sijaan kaksi kasvinäytettä, jotka oli satunnaisesti sijoitettu saman lajikkeen kasvien joukkoon, poikkesivat muista kasveista, ja ne oli helppo tunnistaa erilleen. Vadelmalla S-SAP menetelmän eri vaiheet optimoitiin ja testattiin kahdella lajikkeella: Ottawa (vadelma) ja Heisa (vadelma x mesimarja risteymäjälkeläinen). S-SAP menetelmän optimoinnin jälkeen ehdittiin testata 16 kryosäilytysketjun läpikäynyttä näytettä, jotka edustivat seuraavia lajikkeita: Ottawa, Jatsi ja Jenkka. S-SAP-menetelmällä tehtyjen vadelma-analyysien tulokset osoittivat, että mukana olleiden näytteiden lajikeaitous oli helppo todeta. Menetelmä tuotti useita spesifisiä markkereita, joilla mahdolliset lajikesekaannukset ovat selkeästi todettavissa. Lajikkeen sisäistä eli somaklonaalista muuntelua havaittiin hyvin vähän. Erot eivät olleet toistettavissa, joten niiden aiheuttaja oli todennäköisesti menetelmästä johtuva epätarkkuus. Myös M-SAP-menetelmä otettiin hankkeen aikana käyttöön solukkoviljelmien ja kryosäilytyksen aikaansaaman metyloituneen DNA:n tunnistamiseksi kasveissa. 8

9 Viruspuhdistus Kiinalainen asiantuntijamme tri Wang onnistui yhdistetyn lämpö- ja kryokäsittelyn avulla puhdistamaan vadelman kääpiökasvuviroosista kärsineen vadelmakannan. Puhdistettua vadelmakantaa ylläpidetään Laukaassa. Perunan kryoterapian avulla tapahtuvan viruspuhdistuksen kehittämisestä perunalla luovuttiin ohjausryhmän luvalla, koska tohtori Wang julkaisi tulokset jo hankkeemme alkuvaiheessa vuonna Toteutusvaiheen arviointi Hanke oli suunniteltu alunperin kuusivuotiseksi, koostuen kahdesta kolmevuotiskaudesta. Osa hankkeen tavoitteista oli määritelty tätä pidempää aikaväliä silmällä pitäen. Tutkimus toteutui lähes alkuperäisen suunnitelman mukaan (Kuvio 1). Tutkimuksen alkuvaiheessa kehitettiin Laukaassa mansikan ja vadelman kryosäilytysmenetelmä ja Jokioisilla kehitettiin menetelmää perunan ja vadelman somaattiselle embryogeneesille. Jokioisilla alettiin myös tuottaa perunan ja vadelman aitousanalyyseihin soveltuvia geneettisiä merkkejä M-SAP ja S-SAP-tekniikkaa käyttäen. Molekyylimerkkien tuotto aloitettiin hieman aikataulusta myöhässä, koska MTT:n molekyylibiologian laboratorio muutettiin vuonna 2007 väliaikaistiloihin. Kryosäilytysmenetelmien kehittyessä menetelmäosaamista siirrettin myös Jokioisille. Perunan alkiontuotantomenetelmää sovellettiin kryosäilytyksessä Laukaan ja Jokioisten yhteistyönä. Vadelman somaattisille alkioille kylmäsäilytysmenetelmiä ei tehty, koska vadelman alkionmuodostus varmistui vasta hankkeen lopussa. Hankkeen lopulla kryosäilytettyjen vadelmien ja somaattisen embryogeneesin kautta tuotettujen perunoiden geneettistä yhdenmukaisuutta (aitoutta) tutkittiin DNA-merkkien avulla. Lisäksi kasvien aitoutta tutkittiin morfologisin menetelmin puutarhakasvien osalta Laukaassa ja perunan osalta Jokioisilla kasvihuoneella ja kenttäkokein. Hankkeessa suunnitelluista tehtävistä jätettiin toteuttamatta kryoterapian kautta tapahtuva perunan viruspuhdistus ja siihen liittyvän tieteellisen artikkelin kirjoittaminen. Näiden tehtävien toteuttamatta jättämiseen saatiin ohjausryhmän lupa. 9

10 Teht. No Tehtävän nimi AIKATAULU kuukaudet Kryopankin perustaminen 2 Kryopankin tietojärjestelmän kehittäminen 3 Kryosäilytysmenetelmien kehittäminen puutarha-kasvien kansallisten geenivarojen säilytykseen 4 Puutarhakasvien kansallisten geenivarojen kryosäilytys 5 Pitkäaikaisen kryosäilytyksen vaikutusten tutkimus Mansikan meristeemien kryosäilytystekniikan kehittäminen Vadelman somaattisten alkioiden tuotantotekniikan kehittäminen Vadelman somaattisten alkioiden kryosäilytystekniikan kehittäminen (ei toteutettu) 9 Vadelman DNA-merkkien kehittäminen Kryosäilytetyn mansikka- ja vadelma-aineiston sekä somaattisista alkioista tuotetun vadelma-aineiston aitouden testaaminen Tieteellisen julkaisun kirjoittaminen mansikan ja vadelman kryosäilytyksestä (toteutus eri muodossa) Perunan somaattisten alkioiden tuotantotekniikan kehittäminen Perunan somaattisten alkioiden kryosäilytystekniikan kehittäminen Perunan meristeemien kryosäilytystekniikan kehittäminen Perunan DNA-merkkien kehittäminen Kryosäilytetyn sekä somaattisista alkioista tuotetun peruna-aineiston aitouden testaaminen Tieteellisen julkaisun kirjoittaminen perunan kryosäilytyksestä ja alkiotuotannosta Kryoterapian avulla tapahtuvan viruspuhdistuksen kehittäminen vadelmalla Kryoterapian avulla tapahtuvan viruspuhdistuksen kehittäminen perunalla (ei toteutettu) Tieteellisen julkaisun kirjoittaminen vadelman viruspuhdistuksesta Tieteellisen julkaisun kirjoittaminen perunan viruspuhdistuksesta (ei toteutettu) 22 Ammattilehtikirjoitus hankkeesta MTT, Kasvintuotannon tutkimus, Laukaa MTT, Biotekniikka- ja elintarviketutkimus, Jokioinen Tehtävien eteneminen joulukuuhun 2008 MTT, Biotekniikka- ja elintarviketutkimus, Ruukki HY, Soveltavan biologian laitos Tehtävälle lisätty ajoitus Tehtävältä poistettu ajoitus Kuvio 1. Hankkeen Kylmäsäilytystekniikan soveltaminen kasvullisesti lisättävien kasvien geenivarojen pitkäaikaissäilytyksessä tehtävien suorittamisen alkuperäisen tutkimussuunnitelman mukainen ajoittuminen sekä tehtävien etenemisen toteutunut ajoittuminen vuosina

11 3.4. Julkaisut Hankkeesta on tähän mennessä ilmestynyt viisi tieteellistä asiantuntijatarkastettua artikkelia (Nukari & Uosukainen 2007, Uosukainen ym. 2007, Wang ym. 2008, Wang ym ja Wang & Valkonen 2009). Hankkeesta valmistui yksi opinnäytetyö. Hanketta esiteltiin laajasti erilaisin kokousjulkaisuin ja ammattilehtikirjoituksin, joita ilmestyi yhteensä lähes 20. Alkuperäisen suunnitelman lisäksi hankkeen tuloksia esiteltiin posteriesittelyin ja kansainvälisesti COST 871 hankkeen yhteydessä. Oulussa järjestetty COST871-kokous poiki kryosäilytysaiheisen Agricultural and Food Science teemanumeron, joka ilmestyy vuonna 2009 ja johon on jätetty tätä hanketta koskeva käsikirjoitus. Hankkeen tuloksista tullaan kirjoittamaan vielä lisäjulkaisuja kahden vuoden kuluessa hankkeen päättymisestä Julkaisut 2006 Uosukainen, M., Laamanen, J. Cryopreservation - a new tool in production and maintenance of strawberry nuclear stock. NJF Report 2(2006) 10: 9 Nukari, A., Uosukainen, M., Flyktman, A. Cryopreservation of strawberry. NJF Report 2(2006) 10: 10 Sahramaa, M., Nukari, A Geenivarojen suojelu. Maa- ja elintarviketalous 89: Julkaisut 2007 Vuori, E Geenit hyvässä tallessa pellossa, huoneessa, purkissa, syväjäässä Puutarha & Kauppa 17(2007): 4-6. Wang, Q., Laamanen, J., Nukari, A., Uosukainen, M., Valkonen, J Terveitä kasveja kryoterapialla. Kasvinsuojelulehti 3(2007): Uosukainen, M., Nukari, A. Kasvullisesti lisättävien puutarhakasvien kylmäsäilytys. Pohjolan GEENIvarat 6(2007): 8-9. Uosukainen, M., Laamanen, J., Nukari, A Cryopreservation in certified plant production. Advances in horticultural science 21(2007):4, Doi: /85617 Nukari, A., Uosukainen, M Cryopreservation in the Finnish national germplasm programme for horticultural plants. Advances in Horticultural Science 21: Nukari, A., Uosukainen, M Cryopreservation in the Finnish national germplasm programme for the horticultural plants. In: CryoPlanet, Cost Action 871, 1st Meeting of Working Group 2 : Technology, application and validation of plant cryopreservation, Florence, May 10-12, 2007, Abstract Book. CNR-IVALSA. p Nukari, A., Uosukainen, M., Flyktman, A Cryopreservation of strawberry. In: Fundamental aspects of cryopreservation/cryoprotection and genetic stability: CryoPlanet, Cost Action 871, First meeting of working group 1, Oviedo, Spain, April, p

12 Flyktman, A Mansikan meristeemien kryosäilytys pisara-vitrifikaatiomenetelmällä. Opinnäytetyö. Jyväskylän ammattikorkeakoulu. 60 s Julkaisut 2008 Flyktman, A Mansikan meristeemien kryosäilytys pisara-vitrifikaatiomenetelmällä. MTT:n selvityksiä 166, 51 s. Nukari, A., Uosukainen M Challenges for cryopreservation of vegetatively propagated plant genetic resources in Finland. In: Possible directions for low temperature biology in the next five years: the 2008 scientific meeting and AGM, September, faculty of life sciences, University of Copenhagen. p. 29. Nukari, A., Rantala, S., Uosukainen, M Laukaan kryopankki. In: Merja Veteläinen (toim.). Suomen Kansallinen Kasvigeenivaraohjelma suojelutyön tukena MTT:n selvityksiä 165: Laamanen, J., Uosukainen, M., Häggman, H., Nukari, A., Rantala, S Cryopreservation of crop species in Europe : CRYOPLANET - COST Action th-23rd of February 2008, Oulu, Finland. Agrifood Research Working papers 153, 67 s Verkkojulkaisu päivitetty Antonius, K., Rokka, V-M., Tenhola-Roininen, T., Gajdosová, A., Kalendar, R., Schulman, A. H Monitoring clonal stability with retrotransposon-based markers. Agrifood Research Working papers 153: 50 s Nukari, A., Wang, Q., Uosukainen, M., Laamanen, J., Rokka, V-M., Rantala, S., Valkonen, J Evaluation of encapsulation and droplet vitrification methods in gene preservation work. Agrifood Research Working papers 153: s Uosukainen, M., Laamanen, J., Nukari, A Ydinkasvipankki kasvigeenivaraohjelman osana. Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote 23, 5 p Julkaistu Wang, Q., Laamanen, J., Nukari, A., Uosukainen, M., Kesulahti, J., Valkonen, J Säilytettävän aineiston tautipuhdistus kryoterapialla. Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote :23, 6 p Julkaistu Wang, Laamanen, J., Nukari, A., Uosukainen, M., Kesulahti, J., Valkonen, J Säilytettävän aineiston tautipuhdistus kryoterapialla. Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote 24: 133. Nukari, A., Rantala, S., Uosukainen, M Pitkäaikaissäilytys kryomenetelmällä. Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote 23, 4 p Url, Julkaistu Nukari, A., Rantala, S., Uosukainen, M Pitkäaikaissäilytys kryomenetelmällä. Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote 24: 132. Uosukainen, M., Laamanen, J., Nukari, A Ydinkasvipankki kasvigeenivaraohjelman osana. Suomen maataloustieteellisen seuran tiedote 24:

13 Wang, Q.C., Cuellar, W., Rajamäki, M.L., Hirata, Y. & Valkonen, J.P.T Combined thermotherapy and cryotherapy for virus eradication: relation of virus distribution, subcellular changes, cell survival and viral RNA degradation in shoot tips to efficient production of virus-free plants. Molecular Plant Pathology 9: Doi: /j x Uosukainen, M., Laamanen, J. Cryopreservation - a new tool in production and maintenance of strawberry nuclear stock. NJF Report 2(2006) 10: 9 Nukari, A., Uosukainen, M., Flyktman, A. Cryopreservation of strawberry. NJF Report 2(2006) 10: 10 Sahramaa, M., Nukari, A Geenivarojen suojelu. Maa- ja elintarviketalous 89: Julkaisut 2009 Nukari, A., Uosukainen, M., Rokka, V-M, Antonius, K., Wang, Q.C. & Valkonen, J.P.T Cryopreservation techniques and their exploitation in vegetatively propagated crop plants in Finland. Agricultural and Food Science (asiantuntijatarkastettavana). Wang, Q.C. Wang, Q.C. & Valkonen, J.P.T Recovery of cryotherapy-treated shoot tips following thermotherapy of in vitro-grown stock shoots of raspberry (Rubus idaeus L.). CryoLetters, in press. Wang, Q.C. & Valkonen, J.P.T Cryotherapy of shoot tips: novel pathogen eradication method. Trends in Plant Science 14, in press. (published on-line, doi: /j.tplants ) Wang, Q.C., Bart, P., Engelmann, F., Lambardi, M. & Valkonen, J.P.T Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen eradication to produce healthy planting material and for cryopreservation of healthy plant genetic resources. Annals of Applied Biology 154, in press (published on-line, DOI: /j x) 4. Tulosten arviointi 4.1. Tulosten käytännön sovelluskelpoisuus Kryosäilytys ja Laukaan geenipankki luovat MTT:lle edellytykset hoitaa sille asetetun velvoitteen säilyttää Suomen kasvigeenivarat kasvullisesti lisättävien puutarhakasvien osalta. Harvinaisten ja vain ajoittain kysyttyjen lajikkeiden ylläpito ja taimituotannon nopea uudelleen käynnistäminen mahdollistavat geenivarojen aktiivisen käytön viljelyssä, tutkimuksessa ja jalostuksessa. Ilmastonmuutos lisää tarvetta nykyisten geenivarojen nopealle kryosäilytykselle. Kryotekniikoiden käyttöönotolla on merkitystä paitsi kansallisella tasolla myös laajemmin pohjoisten alueiden kasvigeenivarojen säilytyksessä ja kasvintuotannossa. MTT Kasvintuotannon tutkimus oli vuonna 2006 Pohjoismaiden ainoa kryosäilytystä kasvullisesti lisättävien puutarhakasvien pitkäaikaissäilytyksessä hyödyntävä yksikkö. Hankkeessa kehitetyt mansikan kryosäilytysmenetelmät ovat sovellettavissa monilla muillakin kasvilajeilla käytettäviksi. Pohjoismailla onkin valmisteilla suunnitelma MTT Laukaan kryopankin palvelujen käyttämisestä. 13

14 Vadelmalle kehitetty kryoterapiamenetelmä on sovellettavissa sekä Laukaan ydinkasvihuollossa eri kasvilajeille että laajemminkin. Kryoterapian hyödyntäminen NordGen-organisaation kasvullisten geenivarojen säilytyksessä edistää myös geenivarasäilytyksen laadullisten tavoitteiden saavuttamista. Vadelman ja perunan epäsuora somaattinen embryogeneesi pystyttiin indusoimaan hankkeen kuluessa. Toistaiseksi kyseisiä lajeja ei kuitenkaan olla ryhtymässä lisäämään tätä tekniikkaa hyödyntäen, vaan tavoitteena on myöhemmin erilaistaa myös sekundaarialkioita. Tämän jälkeen tuloksia voidaan soveltaa kasvien lisäykseen ja mahdollisesti myös automatisointitekniikoiden kehittämiseen. Somaattisia alkioita voidaan myös käyttää kryosäilytysmateriaalina, mutta tämän hankkeen kuluessa alkioiden kryosäilytys ei vielä osoittautunut mahdolliseksi. Hankkeessa kehitettiin uusia aitoustestauksiin soveltuvia molekyylimerkkejä. Retrotransposonien sijainnin analysointiin kasvien genomissa perustuva S-SAP-menetelmä tuotti useita spesifisiä markkereita, joilla mahdolliset lajikesekaannukset ovat selkeästi todettavissa. Lajikkeen sisäistä eli somaklonaalista muuntelua havaittiin aineistoissa hyvin vähän. S-SAP ja M-SAP-menetelmiä voidaan tulevaisuudessa soveltaa myös muiden kasvien geneettisen aitouden määritykseen sekä kasvien DNA:n metyloitumisen määritykseen Tulosten tieteellinen merkitys Hankkeesta on saatu tieteellisesti merkittäviä tuloksia. Osa tuloksista on jo julkaistu kansainvälisissä tieteellisissä julkaisusarjoissa. Vielä julkaisemattomat tulokset raportoidaan myöhemmin kansainvälisen julkisuuden aikaansaamiseksi suomalaiselle geenivaratyölle. Kryosäilytyksen soveltaminen varmennetun taimituotannon ydinkasvihuollossa ja toiminnan yhdistäminen osaksi geenivaratyökentelyketjua ovat merkittäviä tuloksia. Vadelman ja mansikan kryosäilytys ja tässä hankkeessa saadut tulokset ovat pohjana Anna Nukarin väitöskirjatyölle. Vadelman kryoterapiaa yhdistettynä lämpökäsittelyyn voidaan pitää tieteellisenä läpimurtona. Vadelman somaattista embryogeneesiä ei ole aikaisemmin maailmalla raportoitu, joten hankkeen aikana saavutettiin tulos, joka voidaan luokitella erittäin hyväksi tieteellis-teknologiseksi saavutukseksi. S-SAP-analyysia on myös hyvin vähän aiemmin sovellettu kasvien geneettisen aitouden määrittämiseen, joten molekyylianalyysein tapahtunut geneettisen stabiliteetin todentaminen on uusi kryosäilytyksen vaikutusmekanismien tutkimukseen sovellettu tekniikka. 14

15 5. Loppuraportin tiivistelmä KYLMÄSÄILYTYSTEKNIIKAN SOVELTAMINEN KASVULLISESTI LISÄTTÄVIEN KASVIEN GEENIVAROJEN PITKÄAIKAISSÄILYTYKSESSÄ APPLICATION OF CRYOPRESERVATION TECHNIQUES TO LONG-TERM GENE RESOURCE PRESERVATION OF VEGETATIVELY PROPAGATED PLANTS Vastuuorganisaatio MTT Kasvintuotannon tutkimus Marjatta Uosukainen Antinniementie VIHTAVUORI puh fax Kesto (Loppuraportti ) Rahoitus Kokonaiskustannukset ,07 euroa MMM:ltä saatu kokonaisrahoitus ,61 euroa Tutkimuslaitoksen oma rahoitus ,71 euroa Muista julkisista lähteistä saatu rahoitus ,75 euroa Muu rahoitus 0,00 euroa Avainsanat DNA-merkit, geenipankki, humala, kasvigeenivarat, kasvinjalostus, kasvullinen alkio, kriikuna, kryosäilytys, kylmäsäilytys, mansikka, monimuotoisuus, nestetyppi, peruna, pitkäaikaissäilytys, puutarhakasvit, vadelma, varmennettu tuotanto, viruspuhdistus Tiivistelmä TAVOITTEET Kylmäsäilytystekniikan soveltaminen kasvullisesti lisättävien kasvien geenivarojen pitkäaikaissäilytyksessä hankkeen päätavoitteena oli kansallisten 15

16 kasvigeenivarojen onnistunut pitkäaikaissäilytys kryomenetelmien avulla. Hankkeessa keskityttiin kasvullisesti lisättäviin puutarhakasveihin ja perunaan, ja hankkeen tavoitteena oli kehittää MTT:n hallussa olevan laajan geenivara-aineiston säilyttämistekniikoiden turvallisuutta ja kustannustehokkuutta. TULOKSET Hankkeen kuluessa Laukaaseen perustettiin pysyvä kylmäsäilytyskokoelma eli kryopankki. Hankkeen muut keskeiset tulokset olivat menetelmiä, joita sovelletaan sekä tieteellisessä tutkimuksessa että geenivaraohjelmien toimintatapojen kehittämisessä. Mansikalle kehitettiin toimiva kryosäilytysmenetelmä ja laajamittainen kryosäilytys aloitettiin sekä vadelmalla että mansikalla. Hankkeessa kehitettiin uusi kryoterapiamenetelmä, jossa yhdistetyn lämpö- ja kryokäsittelyn avulla puhdistettiin vadelman kääpiökasvuviroosista kärsinyt vadelmakanta. Somaattinen embryogeneesi onnistui sekä perunalla että vadelmalla. S-SAP-menetelmää sovellettiin sekä perunan että vadelman aitouden havainnointiin. TULOSTEN ARVIOINTI Hankkeesta saatiin tieteellisesti merkittäviä tuloksia. Kehitetty mansikan kryosäilytysmenetelmä on sovellettavissa monilla muillakin kasvilajeilla käytettäviksi. Vadelman ja mansikan kryosäilytys ja tässä hankkeessa saadut tulokset ovat pohjana Anna Nukarin väitöskirjatyölle, joka on aloitettu tämän hankkeen yhteydessä vuonna Menetelmää, jossa vadelman kryoterapia yhdistettiin lämpökäsittelyyn, voidaan pitää tieteellisenä läpimurtona. Vadelmalle kehitetty kryoterapiamenetelmä on sovellettavissa sekä varmennetun taimituotannon ydinkasvihuollossa eri kasvilajeille että laajemminkin mm. geenivarasäilytykseen valittujen kasvikantojen laadun parannuksessa. Hankkeessa vadelmalla onnistuneesti aikaansaatu somaattinen embryogeneesi on tietojemme mukaan ensimmäinen, joten tulos voidaan luokitella erittäin hyväksi teknologiseksi saavutukseksi. Perunan ja vadelman S-SAP- ja M-SAP-menetelmät ovat nyt hyödynnettävissä etsittäessä eri pitkäaikaissäilytysmenetelmiin mahdollisesti liittyvää somaklonaalista muuntelua ja epigeneettisiä muutoksia. Julkaisut Katso Loppuraportin kohta 3.4. Julkaisut 16