Listeria-säilyvyyskokeet

Transkriptio

1 Listeria-säilyvyyskokeet Ajankohtaista laboratoriorintamalla Erikoistutkija, jaostopäällikkö Tuula Johansson Evira 1

2 Mikrobikriteeriasetus Raja-arvoa 100 pmy/g sovelletaan Muihin kuin imeväisille ja erityisiin lääkinnällisiin tarkoituksiin tarkoitettuihin, sellaisenaan syötäviin elintarvikkeisiin (RTE) joissa Listeria monocytogenes (LMO) ei voi kasvaa joissa LMO voi kasvaa, mutta valmistaja pystyy osoittamaan toimivaltaista viranomaista tyydyttävällä tavalla, että tuote ei ylitä rajaa 100 pmy/g myyntiaikana Tuotteen valmistuksesta vastaavan elintarvikealan toimijan tulee tehdä tutkimuksia, joilla arvioidaan tuotteiden LMO-pitoisuuksia ennakoitavissa olevissa säilytysolosuhteissa 2

3 3 Ohjeistukset Elintarvikealan toimijoille TECHNICAL GUIDANCE DOCUMENT On shelf-life studies for Listeria monocytogenes in readyto-eat foods (2005) Laboratorioille GUIDANCE DOCUMENT On Listeria monocytogenes shelf-life studies for ready-to-eat foods, under Regulation (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstuffs (2008) Training package on: Challenge tests, durability studies and predictive microbiological software (2010)

4 5 osaa Koulutuspaketti EU-RL Listeria monocytogenes (ANSES) 1 Johdanto 2 Kasvututkimukset kasvupotentiaalin määrittämiseksi ( δ challenge tests) 3 Kasvututkimukset maksimikasvunopeuden määrittämiseksi ( µ max challenge tests) 4 Myyntiaikatutkimukset (durability studies) 5 Yhteenveto 4

5 Johdanto Myyntiaikatutkimukset - tehdään luonnollisesti kontaminoituneilla näytteillä LMO-pitoisuus tutkimuksen päätyttyä arvioitu tuotemäärä, jonka pitoisuus >100 pmy/g myyntiajan lopussa 5

6 Johdanto (2) Kasvututkimukset (challenge tests) - tehdään keinotekoisesti kontaminoiduilla näytteillä a) Kasvupotentiaalin (δ) määrittäminen tarkastelun kohteena: RTE, joissa LMO ei kasva RTE, joissa kasvaa kasvupotentiaalin määrittäminen Kun tiedetään δ ja lähtöpitoisuus, voidaan laskea lopullinen pitoisuus δ :n avulla on mahdollista päätellä lähtöpitoisuus, jolla pitoisuus myyntiajan lopussa on 100 pmy/g 6

7 Kasvututkimukset Johdanto (3) b) Maksimikasvunopeuden (µ max ) arvioiminen/määrittäminen Maksimikasvunopeuden avulla voidaan laskea pitoisuus minä tahansa päivänä annetuissa säilytysolosuhteissa 1) lähtöpitoisuus pitoisuus tiettynä ajankohtana 2) pitoisuus tiettynä ajankohtana lopullinen pitoisuus 7

8 Johdanto (4) Kyseessä uusi tuote Mitataan ph ja aw ph < 4,4 tai aw < 0,92 ph < 5,5 ja aw < 0,94 LMO ei voi kasvaa 2. Muut ph- ja aw- olosuhteet Arvioidaan kyky kasvaa elintarvikkeessa ja kasvu myyntiaikana kasvukokeet kasvupotentiaalin arvioimiseksi tai ennustava eli prediktiivinen mikrobiologia Jo kaupallistettu tuote Myyntiaikatutkimukset antavat tietoa LMOn kasvusta 8

9 Kasvupotentiaalin (δ) määrittäminen esimerkkinä pekonikuutiot Pekonikuutiota voidaan syödä raakana RTE, jossa listeriariski 9

10 Kasvupotentiaalin (δ) määrittäminen (2) Kokeella arvioidaan LMOn kasvua elintarvikkeessa, joka keinotekoinen kontaminoitu Säilytetään ennakoiduissa olosuhteissa tuotannosta kulutukseen δ = (pitoisuus log 10 kokeen lopussa) (pitoisuus log 10 kokeen alussa) 10

11 Kasvupotentiaalin (δ) määrittäminen (3) Kasvupotentiaalia voidaan käyttää Selvittämään, voiko LMO kasvaa elintarvikkeessa Määrittämään, kuinka paljon LMO voi kasvaa elintarvikkeessa tuotannosta kulutukseen Määrittämään sellainen lähtöpitoisuus, joka ei ylitä 100 pmy/g myyntiajan lopussa 11

12 Kasvupotentiaaliin vaikuttavat mm. Siirrostetut kannat Sisäiset tekijät - ph, NaCl-pitoisuus, a w, taustamikrobisto, säilöntäaineet ym. Ulkoiset tekijät - lämpötila, kaasuilmakehä Stressi - kylmyys, osmoottinen stressi 12

13 Kasvupotentiaalia määritettäessä huomioon otettavat tekijät/asiat (1) Tuotteen ominaisuudet Erien lukumäärä Kantojen valinta Siiroksen valmistaminen Minimäärä tutkittavia näytteitä/erä Näytteiden siirrostaminen Siirrostetun elintarvikkeen säilytysolosuhteet 13

14 Kasvupotentiaalia määritettäessä huomioon otettavat tekijät/asiat (2) Fysikaalis-kemialliset mittaukset LMOn osoittaminen ja määrittäminen Kasvupotentiaalin laskeminen Tulosten hyväksikäyttö Tutkimusraportti Tutkimuksen standardisointi Euroopan laboratorioissa tulosten vertailukelpoisuus 14

15 Tuotteen ominaisuudet ja myyntiaika Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet Vähintään ph, a W, (suolapitoisuus, säilöntäaineet) Taustamikrobisto ja tuotteelle spesifinen mikrobisto esim. maitohappobakteerit Pakkaus esim. tyhjiö, suojakaasu Myyntiaika VKP tai parasta ennen 15

16 Erien lukumäärä ja LMO-kantojen valinta Vähintään 3 erää Vähintään 3 LMO-kannan sekoitus Yksi vertailukanta Muut kaksi eristetty ko. matriisista tai sen kaltaisesta matriisista 16

17 LMO-siirroksen valmistaminen Kukin kanta kasvatetaan stationäärivaiheen alkuun (37 C/18 h) 1. Ensin optimiolosuhteissa 2. Edelleen olosuhteissa, jotka vastaavat tuotteen säilytysolosuhteita sopeutuminen Kasvua voidaan mitata turbidometrisesti esim. spektrofotometrillä tai viljelyllä 17

18 Erien lukumäärä ja kantojen valinta Vähintään 3 eri erää Vähintään 3 kannan sekoitus Yksi vertailukanta Muut eristetty ko. matriisista tai sen kaltaisesta matriisista 18

19 LMO-siirroksen valmistaminen (2) Kukin viljelmä säädetään samaan pitoisuuteen ja yhdistetään yhtä suurina tilavuuksina Yhdistelmäviljelmä laimennetaan ennen tuotteeseen pipetointia siten, että pitoisuudeksi tuotteessa 50 pmy/g Yksityiskohtaiset ohjeet siirroksen valmistamisesta koulutuspaketissa 19

20 LMO-siirroksen lisääminen tuotteeseen Siirros lisätään joko kokonaiseen tuotteeseen tai sen osaan Jos tuote koostuu useista komponenteista (esim. salaatti), siirrostetaan se komponentti, joka todennäköisimmin saastuu listerialla Pyritään jäljittelemään luonnollista kontaminaatiota Siirrostus sisäosaan, jos tuote homogeeninen (esim. jauhetut tuotteet tai salaatti) Siirrostus pintaan: jäljitellään tietyn tuotteen osan saastumista tuotantolinjassa (esim. kylmäsavusavulohi, joka saastuu siivutettaessa) 20

21 LMO-siirroksen lisääminen tuotteeseen (2) Siirrostus voidaan tehdä Pakkauksen läpi (kalvo 22, kuva oikealla) Avaamalla pakkaus ja pakkaamalla tuote uudelleen siirrostuksen jälkeen siten, kaasuilmakehä on sama kuin alkuperäisessä pakkauksessa (kalvo 22, kuva vasemalla) 21

22 Siirroksen valmistaminen Kukin kanta viljellään stationäärivaiheen alkuun 1. Optimiolosuhteissa 2. Olosuhteissa, jotka vastaavat tuotteen säilytysolosuhteita Kukin viljelmä säädetään samaan pitoisuuteen ja yhdistetään yhtä suurina tilavuuksina Yhdisteviljelmä laimennetaan vastaamaan tuotteessa esiintyvää pientä pitoisuutta Yksityiskohtaiset ohjeet siirroksen valmistamisesta koulutuspaketissa 22

23 Tutkimukset Tutkittava min 3 näytettä/erä kokeen aloituspäivänä ja viimeisenä päivänä (VKP tai parasta ennen) Suositeltavaa tutkia myös pari kertaa siltä väliltä, esimerkissä yhteensä 30 näytettä tutkittavana LMO osoittaminen ja määrittäminen kontrolleista (n=6) ja määrittäminen siirrostetuista näytteistä (n=12) Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet; yksi näyte riittää, jos tuote homogeeninen (n=6) Taustamikrobiston pitoisuus (n=6) 23

24 Säilytysolosuhteet Kylmäketjun kohta Tuottajalta vähittäismyyntitiin Säilytys/inkubointi lämpötila Maakohtainen; mikäli ei tietoa kansallisesti, 8 C Säilytyksen/inkuboinnin kesto Maakohtainen; mikäli ei tietoa kansallisesti a)1/3 myyntiajasta, mikäli < 21vrk b) 7vrk, mikäli myyntiaika >21vrk Vähittäismyynti Kuluttajan jääkaappi Maakohtainen; mikäli ei tietoa kansallisesti,12 C Maakohtainen; mikäli ei tietoa kansallisesti a)1/3 myyntiajasta, mikäli < 21vrk b) myyntiaika miinus 7vrk jaettuna 2:lla, mikäli myyntiaika >21 vrk 24

25 Kasvupotentiaalin laskeminen Kullekin 3:lle erälle δ = (mediaanipitoisuus log 10 kokeen lopussa) (mediaanipitoisuus log 10 kokeen alussa) valitaan maksimiarvo jatkolaskelmia varten Yksityiskohtaiset ohjeet koulutuspaketissa 25

26 Kasvupotentiaalin hyödyntäminen δ < 0,5 LMO ei kasva δ > 0,5 LMO kasvaa δ-arvoa voidaan käyttää kasvun ennustamiseen Lopullinen pitoisuus = alkupitoisuus + δ Lähtöpitoisuus = lopullinen pitoisuus - δ 26

27 Maksimikasvunopeuden (µ max ) määrittäminen esimerkkinä kylmäsavulohi Laboratoriotutkimus, joka mittaa yhden LMO-kannan kasvunopeutta keinotekoisesti kontaminoidussa elintarvikkessa, jota säilytetään tietyssä lämpötilassa µ max saadaan kasvukäyrästä = eksponentiaalisen kasvuvaiheen kulmakerroin 27

28 Maksimikasvunopeuteen vaikuttavat tekijät LMO-kanta Sisäiset tekijät ph, NaCl-pitoisuus, a w, taustamikrobisto, säilöntäaineet ym. Ulkoiset tekijät - lämpötila, kaasuilmakehä 28

29 Maksimikasvunopeutta määritettäessä huomioon otettavat tekijät/asiat Tuotteen ominaisuudet Erien lukumäärä Kantojen valinta Siirroksen valmistaminen Tutkittavien tuotteiden lkm/erä Näytteiden siirrostaminen Siirrostettyjen tuotteiden säilytysolosuhteet Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet Mikrobiologiset analyysit: osoittaminen ja määrittäminen µ max laskeminen Tulosten hyödyntäminen lihavoimattomat: kuten kasvupotentiaalia määritettäessä; lihavoidut: erilainen lähestymistapa 29

30 Kantojen valinta ja siirroksen valmistaminen Valitaan 2 nopeimmin kasvavaa kantaa, jotka eristetty kylmäsavulohesta; valinta liemikasvatuksen perusteella Kaksi uudelleenviljelyä stationäärivaiheen viljelmistä alustavat kokeet tuotteeseen siirrostettavan LMO-pitoisuuden arvioimiseksi 30

31 Tutkittavien näytteiden minimilukumäärä/erä LMO-pitoisuuden määrittäminen Osoittaminen päivänä 0 ja määrittäminen kokeen lopussa Fysikaalis-kemialliset ominaisuudet Taustamikrobiston pitoisuus Näytteiden lukumäärä Vähintään 10-15; välttämätöntä kasvukäyrän piirtämiseksi * + 3* 2 tai * Yksi näyte riittää, jos tuote homogeeninen 31

32 LMOn siirrostaminen näytteisiin Lohesta leikataan halkaisijaltaan 9 cm kokoisia kiekkoja, joiden paino on n. 20 g Yhteensä LMO:lla siirrostettua kasvukäyrä 6 siirrostamatonta taustamikrobiston määrittäminen 6 siirrostamatonta LMO toteaminen pävänä 0 ja määrittäminen viimeisenä pvnä 6 siirrostettavaksi fysiologisella suolaliuoksella fysikaalis-kemialliset määritykset 32

33 LMOn siirrostaminen näytteisiin Siirrostetaan 5 x 20 µl LMO-suspensiota pistemäisesti puolikkaan näytekiekon pinnalle Käännetään kiekon siirrostamaton puoli siirrostetun päälle todellisten olosuhteiden jäjittämiseksi Tyhjiöpakataan Säilytetään tietyssä lämpötilassa toisin kuin kasvupotentiaalitutkimuksissa, jotka vaihtelevissa lämpötiloissa 33

34 Tulosten hyödyntäminen Kasvukäyrän piirtäminen Maksimikasvunopeuden (µ max ) määrittäminen käyrältä Tulosten tulkinta mallintamalla vaatii ennustavan (prediktiivinen) mikrobiologian osaamista 34

35 Edut ja haittapuolet Edut Voidaan arvioida LMO-pitoisuus myyntiaikana minä tahansa ajankohtana eri lämpötiloissa Haittapuolet Paljon kalliimpi ja aikaa vievempi kuin kasvupotentiaalimääritys Ei ota huomioon lag- ja stationäärivaiheita Tulokset voivat olla idioottivarmoja tai käyttökelvottomia Toissijainen tutkimus; jos tarvitaan lisäinformaatiota 35

36 Myyntiaikatutkimus (durability study) Tutkimus mikro-organismin kasvun arvioimiseksi elintarvikkeessa Luonnollisesti kontaminoitunut tuote Säilytys ennakoitavissa olevissa olosuhteissa (reasonably foreseeable) Muita nimityksiä: Storage trial varastointikoe Ageing test ikääntymis-/vanhenemiskoe Durability säilyvyys tai kestoaika myyntiaika 36

37 Huomioon otettavat seikat Näytteenotto Säilytysolosuhteet Mikrobiologiset analyysit Tulosten laskeminen Tulosten hyödyntäminen 37

38 Näytteenotto Tulee olla edustava Tarkoituksena on valita tuotantolinjalta n näytettä erän näytteistä (N) Yksinkertainen satunnaisnäytteenotto esim. Excel-ohjelmalla Joko numeroiduista yksiköistä Tai numeroiduista tuotantoajoista 38

39 Yksinkertainen satunnaisnäytteenotto Yhtäläisen todennäköisyyden periaate jokaisella yksilöllä populaatiossa yhtäläinen mahdollisuus tulla valituksi Oletus, että n/n < 10 % n= alapopulaation koko Erän koko Numeroidaan tuotteet tai tuotantoajat ja valitaan satunnaisesti numerot riittävän näytemäärän saamiseksi Esim. satunnaisnumerot Excelistä =RAND(), tai satunnaislukutaulukoista kuvattu ohjeistuksessa 39

40 Säilytysolosuhteet ja mikrobiologiset analyysit Säilytysolosuhteet kuten kasvupotentiaalia määritettäessä Tutkimukset säilytysajan lopussa LMOn osoittaminen LMOn lukumäärän määrittäminen Samasta suspensiosta tai homogenoidusta näytteestä Määritysraja 10 pmy/g Määritysrajan alentamiseksi EU-RL kehittänyt suodatusmenetelmän, jossa entsymaattinen digestio suodattuvuuden parantamiskesi: määritysraja 0,2 pmy/g, jos 50 ml alkususpensiota maljataan kolmelle suodatinpaperille 40

41 Tulosten laskeminen Tulos on niiden näytteiden osuus (%), joiden pitoisuus ylittää 100 pmy/g myyntiajan lopussa luotettavuusrajoineen (CI) säilytettynä ennakoitavissa olevissa olosuhteissa Ideaalitilanne: 0-tulosta >100 pmy/g, tai vielä parempi, jos kaikki tulokset <10 pmy/g, edellyttäen, että n on riittävän suuri Mitä enemmän näytteitä, sitä luotettavampi tulos tulosten kerääminen toistetuista tutkimuksista 41

42 Luotettavuusrajojen (CI) laskeminen Laskija internetistä; osoite koulutuspaketissa s. 78: Myös kuvaus CI:n laskemisesta Esimerkki kylmäsavulohesta 42