G-PROTEIINIKYTKENTÄISET RESEPTORIT

Transkriptio

1 G-PROTEIINIKYTKENTÄISET RESEPTORIT PAULI TURUNEN Medicum/fysiologia Alberts ym. Molecular Biology of the Cell kpl 15

2 MENU Mitä ovat G-proteiinit? Toimintaperiaate ja säätely yleisesti Monomeeriset G-proteiinit (esimerkkinä Ras) Heterotrimeeriset G-proteiinit ja niiden viestintä Mitä ovat G-proteiinikytketyt reseptorit (GPCR:t)? Rakenne Ligandit Reseptorien säätely TAUKO? Oreksiinit ja oreksiinireseptorit GPCR-viestinnän esimerkkinä GPCR viestinnän säätely ja monimuotoisuus

3 MITÄ OVAT G-PROTEIINIT (GTPaasit)? Solunsisäisiä proteiineja, joilla: Ominaisuus 1: sitovat guaniininukleotidejä Inaktiivinen, kun GDP kiinni Aktiivinen, kun GTP kiinni (konformaation muutos) Ominaisuus 2: hydrolysoivat GTP GDP + Pi Aktiivisuutta säätelee GDP/GTP vaihto/hydrolyysisykli P i G GDP GTP GDP GTP vaihdetaan GDP:n paikalle GTP hydrolysoidaan GTP G

4 G-PROTEIININ VIESTINTÄ ON PÄÄLLÄ VAIN NIIN KAUAN KUN GTP ON SITOUTUNEENA SIIHEN! MONIEN G-PROTEIINIEN HYDROLYYSIREAKTION KATALYYTTINEN NOPEUS ON VIESTINNÄN KANNALTA LIIAN HIDAS (jopa 4min -1 ) TOIMIVAAN VIESTINTÄÄN TARVITAAN MUITAKIN SÄÄTELYMEKANISMEJÄ, VAIKKA SYTOPLASMASSA ON 10x ENEMMÄN GTP:tä

5 G-PROTEIINIEN AKTIIVISUUDEN SÄÄTELY GDP/GTP vaihto/hydrolyysisyklin säätely GDP:n irtoamisen stimuloiminen (1) GTP:n sitoutumisen estäminen (2) GTP:n hydrolyysin nopeuttaminen (jopa 2000x (3) Apuproteiinit GEF:t 1 (guanine nucleotide exchange factor) GDI:t 2 (guanine nucleotide dissociation inhibitor) GAP:t 3 (GTPase accelerating protein) GAP = RGS:t (regulators of G-protein signaling) 1 aktiivinen GAP + inaktiivinen G G GDP GTP GDI GEF

6 G-PROTEIINIEN KOLME PÄÄLUOKKAA Monomeeriset G-proteiinit Heterotrimeeriset G-proteiinit Muut GTPaasit

7 MONOMEERISET G-PROTEIINIT Kutsutaan myös nimellä pienet G-proteiinit tai Ras-superperhe > 150 geeniä ihmisellä Usein esim. kasvutekijäreseptorit säätelevät (epäsuorasti) näitä Jako viiteen pääryhmään sekvenssin ja funktionaalisten tehtävien perusteella Ras superfamily Ras family 39 members Rho family 22 members Rab family 63 members Ran family 1 member Arf family 30 members Other 10 members

8 Ras-PERHEEN G-PROTEIINIT Ras GDP GTP H-, K- ja N-Ras (Rat sarcoma) Harvey, Kirsten, neuroblastoma Solunjakaantuminen ja selviytyminen (survival) Aktivoivat esim. Erk ja PI3K -reittejä P i Ras GTP GDP Pysyvästi aktiivinen Ras on klassinen esimerkki protoonkogeenistä GEF Merkitys lääkäreille: n. 30% syövistä Ras on mutatoitunut, haimasyövissä jopa 90%

9 HETEROTRIMEERISET G-PROTEIINIT G G G -kompleksi (kirjoitetaan usein G ) G ihmisellä tunnetaan 31 versiota, G 5 ja 11 G G sitoo GDP/GTP:n G :t jaetaan rakenteen perusteella neljään perheeseen: G i : (G i, G o, G z, G t, G gust) G s : (G s, G olf ) G q : (G q, G 11, G 14, G 15/16 ) G 12/13 : (G 12, G 13 )

10 HETEROTRIMEERISTEN G-PROTEIINIEN TOIMINTASYKLI GDP GTP aktiivinen P i G G G R GDP G G inaktiivinen GTP G

11 VIDEO GPCR-SYKLISTÄ

12 G s -VIESTINTÄ (AC ja PKA) G s GTPaasi inhiboituu koleratoksiinilla (V. cholerae ripuli) Aktivoitu Gs stimuloi adenylaattisyklaaseja (AC) ja lisää camp:n määrää solussa Esim. -adnergiset reseptorit, glukagonireseptori, makean aistiminen G s ATP camp adenylaattisyklaasi fosfodiesteraasi AMP

13 Käsitelty Juha Klefströmin luennolla!

14 G i -VIESTINTÄ Tunnetuimmat vaikutukset ovat adenylaattisyklaasin (AC) inhibition ja fosfodiesteraasin aktivointi (PDE) mm. näköaisti Reseptoreita esim. ACh:n muskariiniset M2- ja M4-reseptorit, histamiinin H3- ja H4-reseptorit, rhodopsiini G i Valoreseptorisoluissa adenylaattisyklaasi fosfodiesteraasi G t fosfodiesteraasi ATP camp AMP cgmp GMP

15 G q -VIESTINTÄ: fosfolipaasi-c (PLC ) reitti PIP 2 - hydrolyysi G q PLC DAG PIP2 IP 3 Muodostuu 2 viestimolekyyliä: DAG ja IP 3 PIP 2 = phosphatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatti DAG = diasyyliglyseroli IP 3 = inositoli-1,4,5-trisfosfaatti MBC 15-28

16 G q -VIESTINTÄ: fosfolipaasi-c (PLC) reitti jatkuu IP 3 : kalsiumin (Ca 2+ ) vapautus ja DAG aktivoi proteiinikinaasi C:n

17 Ca 2+ LYHYESTI Yksi tärkeimmistä toisioläheteistä [Ca 2+ ] i pidetään hyvin pienenä 10-7 M (sakkaus) Viestinnässä Ca 2+ peräisin lähinnä ER:stä (release) tai solun ulkopuolelta (influx), harvemmin mitokondrioista Ca 2+ sitovat proteiinit Varastoissa ER:ssä mm. calsequesterin ja calreticulin Signaloinnissa moni entsyymi, esim. PKC ja Ca 2+ sensori calmodulin Calmodulin on rakenteellinen osa monia proteiineja (esim. CaMK II) [Ca 2+ ] i muutos on lyhytaikainen ja usein oskilloiva Eri pitoisuudet aktivoivat eri proteiineja

18 ENTÄS -ALAYKSIKKÖ? Stabiili dimeeri, ei dissosioidu, pitää G :n inaktiivisena? Liikkuu membraanin tasossa lipidiankkurin avulla (G ) Osallistuu myös viestintään, kohteena esim. K + -kanavat, Ca 2+ -kanavat Hyperpolarisaatio

19 YHTEENVETO G-PROTEIINEISTA Monomeeriset G-proteiinit Rakentuvat yhdestä proteiiniketjusta Sytoplasmisia Usein reseptorista alavirtaan signaalivälitysreitillä GTPaasi-aktiivisuus GTP/GDP sykli (on/off) Apusäätelijät (GEF, GAP) Trimeeriset G-proteiinit Muodostuvat kolmesta eri proteiinista +, ) Myös sytoplasmisia Sitoutuvat GPCR:iin suoraan GTPaasiaktiivisuus G -alayksikössä GTP/GDP sykli (on/off) Apusäätelijät (GEF, GAP) reseptori toimii GEF:na + Muut GTPaasit (esim. tubuliini, monet elongaatiofaktorit jne.)

20 G-PROTEIINIKYTKETYT RESEPTORIT (GPCR) Suurin kalvoproteiinien perhe ja yksi suurimmista proteiiniperheistä Nisäkkäillä 800 (ihminen)-2000 (hiiri) geeniä lajista riippuen (+vaihtoehtoinen silmukointi). Hyönteisilläkin satoja geenejä, löytyvät myös hiivasoluista Tärkein lääkeainekohde (suoraan tai epäsuorasti) > 50% lääkeaineista Viestivät heterotrimeeristen G-proteiinien kautta (toimii GEF:na) Synonyymejä 7-TM reseptorit, serpentiinireseptorit, heptahelikaasi reseptorit

21 GPCR PERUSRAKENNE 7 solukalvon läpäisevää proteiiniketjua ( helix) N-terminaalinen solunulkoinen osa Mukana joidenkin ligandin sitoutumisessa C-terminaalinen sytoplasminen osa Reseptorin aktivoituessa sitoutuu G-proteiineihin Tertiaarinen rakenne on nippumainen

22 GPCR LIGANDIKIRJO ON VALTAVA Biogeeniset amiinit Haju- ja makumolekyylit Aminohapot Ioni Ca 2+ Nukleotidit Fotoni 2-AG Lipidit Peptidit Glykoproteiinihormonit Orexin A

23 ERI LIGANDIT SITOUTUVAT ERI KOHTIIN RESEPTORISSA Ligandin rakenne määrittää sitoutumispaikan Lipidiligandit menevät membraaniin ja siirtyvät siitä GPCR:n Tarkka mekanismi tunnetaan vain muutamasta reseptorista Esim. monet aminohapot, lipidit, nukleotidit FSH, LG, TSH Ca 2+, glutamaatti Vrt. videon sitoutumiskohta

24 GPCR RAKENNEVARIAATIO ON MYÖS SUURI GRAFS-luokittelu Glutamaatti- Rhodopsin- Adhesion- Frizzled- Sekretiini-reseptoriperhe Perustuu sekvenssin ja rakenteen samankaltaisuuteen Muita luokittelujakin löytyy!

25 JOITAIN GPCR VAIKUTTAVIA LÄÄKEAINEITA Reseptori Lääkeaine vaikutus M3 Atropiini (antagonisti) laajentaa pupiileja Skopolamiini (antagonisti) matkapahoinvointiin 1 Propranolol (antagonisti) betasalpaaja 2 Salbutamol (agonisti) bronkodilaattori astmaan AT1 Losartan (antagonisti) angioiotensiinin reseptorin blokkeri; verenpaine D2 Levodopa (agonisti) Parkinsonin tauti

26 ORVOT RESEPTORIT (Orphan receptors) Tunnetaan lukuisia GPCR geenisekvenssejä (tai proteiineja), joiden fysiologinen ligandi on tuntematon (140 kpl vuonna 2012) Potentiaalisia tulevaisuuden lääkeaineiden kohdemolekyylejä Tämänhetkiset lääkekohteet Erinomainen tutkimuskohde lääkekehittelystä kiinnostuneille!

27 GPCR-VIESTINNÄN SÄÄTELY Useimmiten viesti pyritään pitämään mahdollisimman lyhytaikaisena ja paikallisena viestimolekyylin poisto tai hajotus sekä solunulkoiset että -sisäiset viestimolekyylit viesti pysyy päällä vain niin kauan kuin sitä aktiivisesti tuotetaan kohteen epäherkistyminen (desensitisaatio) ja downregulation jatkuvassa stimulaatiossa vaste pienenee proteiinikohteen muokkaus (esim. fosforylaatio by GRK) tai ilmentymistason väheneminen (arrestiinin sitoutuminen, sisäänotto ja mahd. hajotus) Joissakin tilanteissa päinvastaista: viesti jää päälle tai jopa vahvistuu

28 GPCR-VIESTIN NEGATIIVINEN SÄÄTELY LIGANDI ligandin saatavuus ja stabiilisuus GPCR Epäherkistyminen (desensitisaatio), reseptorin sisäänotto (internalisaatio), reseptorin hajotus, viestireitin muuttuminen G-proteiini GTP-hydrolyysi Kohdeproteiini Toisiolähetti desensitisaatio, hajotus HUOM! Pitkällä aikavälillä geenisäätelyn muutoksia

29 YHTEENVETO Erilaisia GPCR:ta on monia, sitovat rakenteeltaan erilaisia ligandeja Ligandin sitoutuessa aktivoivat heterotrimeeristen G-proteiinien G alayksikön GDP GTP vaihdon Erilaisia G-proteiineja on lukuisia (G s, G i, G q jne.) G s aktivoi adenylaattisyklaasin (AC); camp soluissa nousee G i inhiboi AC:n; camp laskee G q nostaa solunsisäistä [Ca 2+ ] GPCR-viestintää vaimennetaan monella tasolla

30 TAUKO

31 GPCR-LUENTO PART 2: OREKSIINIT JA OREKSIINIRESEPTORIT & GPCR VIESTINNÄN SÄÄTELY Oreksiiniviestintä esimerkkinä GPCR:ien toiminnasta fysiologiassa Uni/Valvesykli Syöminen ja metabolia Termoregulaatio Palkitsemisjärjestelmä/addiktiot Synapsinen plastisuus, oppiminen ja muisti Kivun modulointi keskushermostotasolla Ruoansulatuskanava eritystoiminnan säätely Endokriinisen erityksen säätely Rasvakudoksen toiminnan säätely

32 OREKSIINIT Neuropeptidejä Oreksiini-A ja oreksiini B (hypokretiini 1 ja 2)

33 OREKSIINIRESEPTORIT OX 1 R OX 1 - ja OX 2 -reseptorit G-proteiinikytkentäisiä (erityisesti Gq, mutta ainakin koe-oloissa myös Gs ja Gi) Poikkeuksellisen monimutkainen solutason signalointi OX 2 R

34 OREKSIINIT KESKUSHERMOSTOSSA Oreksiergiset somat Lateraalinen hypothalamus

35 OREKSIINIT KESKUSHERMOSTOSSA Oreksinergiset aksonit Hypothalamus, thalamus, aivorunko, selkäydin, aivokuori...

36 OREKSIINIEN KESKUSHERMOSTOVAIKUTUKSIA Lisääntynyt ruokahalu (ja metabolinen nopeus?) anatomia oreksiini-injektio aivojen ventrikkelitilaan lisää ruokahalua lyhyellä tähtäimellä mahd. lisääntynyt metabolinen nopeus tai aktiivisuuden lisääntyminen (tehostaa syömistä) Sakurai et al., Cell 92, , 1998

37 OREKSIINIEN KESKUSHERMOSTOVAIKUTUKSIA Valvetilan ja unirytmin säätely anatomia oreksiini-injektio aivojen ventrikkelitilaan lisää valveillaoloaikaa ja vähentää uniaikaa (ennen kaikkea REMunta) sairaudet... narkolepsian ja oreksiinien välillä on vahva yhteys ctrl oreksiini-a arousal REM SWS1 SWS2 Hagan et al., PNAS 96, , 1999

38 Dr. Mignot, Stanford University Koiran perinnöllinen Ihmisen sporadinen oreksiinit OX 2 -reseptori oreksiini oreksiinireseptorit

39 NARKOLEPSIA % eri ihmispopulaatioissa Chemelli et al., Cell 98, , 1999 Oireet päiväsaikaan hypersomnia katapleksia, hallusinaatiot nukahtaessa ja herätessä, uniparalyysi jne. diagnostisesti mm. lyhyt nukahtamisaika (erityisesti REM-uneen) pidetään siis ennen kaikkea REMunen säätelyhäiriönä Oreksiinien ajatellaan stabiloivan valvetilan

40 NARKOLEPSIA Epäillään autoimmuuniksi sairaudeksi, oreksinergiset neuronit kuolevat vahva assosiaatio HLA-DQB1*0602:n kanssa Post-mortem tutkimuksessa oreksinergiset neuronit puuttuvat Pandemrix-rokote yhteydessä sporadiseen narkolepsiaan, mekanismi tuntematon Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet autovasta-aineita potilasnäytteistä, mutta data on puutteellista

41 OREKSIINIEN MOLEKYLAARINEN VIESTINTÄ Viestimolekyylissä (tässä oreksiini) ei itsessään ole viestiä, vaan sisältö riippuu vastaanottavasta solusta! Samanlaisten solujen erilainen "kytkentä": jos oreksiini injisoidaan tiettyihin tumakkeisiin, saadaan ruokahaluvaste, toisista taas valvetila, kolmansista stressivaste jne. Solutasolla erilainen molekylaarinen viestintä esim. mihin G :an reseptori solussa kytkee Millaisen pitoisuuden oreksiinia reseptori vastaanottaa Kuinka kauan stimulus kestää Oreksiinireseptorit lisäävät Ca 2+, camp, aktivoivat monia lipaaseja, jotka tuottavat lipidiviestimolekyylejä (esim. 2-AG, eräs endokannabinoidi), aktivoivat kinaaseja (p38 MAPK).

42 NOPEAT OREKSIINIVASTEET: NEUROEKSITAATIO Voi vaikuttaa sekä pre- että postsynaptisella puolella synapsia Eriksson et al., J. Neurosci., 2001

43 PITKÄAIKAISET OREKSIINIVASTEET: ohjelmoitu solukuolema periferiassa Aikaansaavat ohjelmoidun solukuoleman tietyissä solutyypeissä Spesifinen syöpäsoluilla? Esim. paksunsuolen syöpäsolut kuolisivat, mutta normaalit epiteelisolut eivät Laburthe M and Voisin T Br J Pharmacol. 2012

44 MISTÄ RIIPPUU GPCR:n VASTEEN TYYPPI? oreksiinit Ligandin konsentraatiosta Ligandin vaikutusajasta solujakaantuminen/ selviytyminen/ erilaistuminen solukuolema

45 MISTÄ RIIPPUU VASTEEN TYYPPI: RESEPTORIEROT GPCR GPCR Ionikanava M 2 (Gi) M 1 (Gq) Ionikanava camp, Ca 2+ depolarisaatio Selitys: erilainen reseptori samalle ligandille (muskariininen vs. nikotiini), eri isomuodot reseptorista (M1, M2, M3, M4, M5)

46 MISTÄ RIIPPUU VASTEEN TYYPPI: SIGNAALIREITTIEN INTERGAATIO Esim. adenylylsyklaasin stimulaatio +/- Ca 2+ tuottaa erilaisen vasteen (tässä geenituotteen aktiivisuus) Selitys: eri viestireittien yhdistelmät, viestien samanaikaisuus tai viestinnän loppuminen MBC 15-4

47 MISTÄ RIIPPUU VASTEEN TYYPPI: G- PROTEIINIVASTEET SOLUN SISÄLLÄ GPCR G s G i G q G 12 G Selitys: sama reseptori voi kytkeä eri G-proteiineihin

48 MISTÄ RIIPPUU VASTEEN TYYPPI: SIGNALOINTIKOMPLEKSIT Solut ovat kompartmentalisoituneita Eri "kokotasoja" soluorganelleista yksittäisten molekyylien muodostamiin komplekseihin Signalointikompleksit varmistavat Spesifisiteetin Nopeuden (esim. glykolyysin entsyymitunnelit ) Ekonomian (paikallinen hot spot)

49 ESIMERKKEJÄ SIGNALOINTIKOMPLEKSEISTA Post-synaptic densities (PSD) ja T-solun aktivointi perustuvat proteiini proteiini-interaktioille Adaptoriproteiinit = scaffold-proteiinit liittävät yhteen muita proteiineja mahdollistaen viestinnän E S Adaptori T-soluissa LAT Kreienkamp, Curr. Opinion Pharmacol, 2002

50 YHTEENVETO GPCR:t fysiologiset vaikutukset ovat moninaiset ja riippuvat ligandin lisäksi ainakin Reseptorista (kudosspesifiset isomuodot) (samaan) reseptoriin kytkevistä eri G-proteiineista Signaalireittien vuoropuhelusta Signalointikomplekseista solun sisällä

51 KIITOS!