Geeniekspressio: Mikrosirut. Geneettinen bioinformatiikka

Transkriptio

1 Geeniekspressio: Mikrosirut Geneettinen bioinformatiikka

2 Microarray Microarray is a compact device containing a very large number of capture molecules (synthetic oligos, PCR products, proteins, antibodies etc) organized in an structured format. Probes are typically attached to a solid surface or to microscopic beads (helmisiru, Illumina) Today, captured molecules are typically labeled with a fluorescent dye Information on identity and amount of captured molecules can be detected Provides massive parallel information Can be used in many biological and medical research questions and diagnostics

3 Many kinds of microarrays DNA microarrays (RNA expression, DNA content by CGH, CNV, SNPs) MicroRNA microarrays Protein microarrays Tissue microarrays Cellular microarrays Chemical combound microarrays (small molecules etc)

4 for all organisms Pre-designed arrays available for most model organisms Pre-designed arrays for spesific targets Custome arrays for any species/ targets where related sequence information is available

5 Why we need microarrays Needs no prior hypothesis High through-put High efficiency (cost and time/ data point) High accuracy Comparable results (tested protocols and background information)

6 DNA-mikrosiruja eri käyttötarkoituksiin Gene expression analysis tissue samples from various diseases micro organisms grown in different environments Genotyping (SNP) Copy Number Variation analysis.

7 Different microarray methods Spotted microarrays for in-house array production (target printed on a glass) Commercial oligonucleotide arrays: - Printing of probes by synthesis - 1 channel (Affymetrix) or 2/3 channel (Agilent) systems - Illumina bead arrays (not discussed) _documents/platformcomparison.pdf

8 Menetelmien vertailua Agilent glass arrays small density of features 60 mer probes Less expensive Affymetrix silicon arrays High density of features 25 mer probes probes per gene Expensive manufacturing Illumina bead arrays High density of features Multiple probes per gene 50 mer probes

9 Miten siru toimii? Tutkittavista biol. näytteistä eristetään mrna-populaatio, joka käännetään cdna:ksi ja leimataan sopivalla väriaineella. Kaksivärimenetelmissä näyte ja kontrollinäyte leimataan eri väreillä, tyypillisesti Cy3- ja Cy5-molekyyleillä, jotka ovat fluoresoivia väriaineita (punainen ja vihreä). Viikissä käytössä myös kolmen värin yhdistelmä Kolme eri näytettä yhdellä sirulla Lasisirut (Glass Microarrays), Illumina helmisirut (bead arrays) Usein ei selvää näyte kontrolliparia Aikasarja Monta genotyyppiä / monta tautityyppiä

10 Sirun toiminnasta Kuva osoitteesta 2-värikoeasetelma (lasisiru)

11

12 Miten siru toimii? Kaksivärimenetelmien yhteydessä saadaan kuvia, joilla on vihreitä, punaisia ja keltaisia täpliä sen mukaan kuinka paljon kys. geeniä oli kummassakin näytteessä Yhden värin kanssa mustavalkeita kirkkauksia Täplien intensiteetit (fluoresenssivoimakkuudet) sisältävät kuvat analysoidaan kuvankäsittelyohjelmalla, joka tunnistaa kuvassa olevat täplät, lukee niiden intensiteetit ja muuttaa tiedot lukuarvoiksi. Pseudo-värityksen käyttäytyminen B vahva B heikko A vahva keltainen punainen A heikko vihreä musta

13 Miten siru toimii? Yksivärimenetelmissä näytteet (ja kontrolli) leimataan yhdellä ja samalla fluoresoimattomalla värillä, koska ne hybridisoidaan eri DNA-siruille. Leimattujen cdna:iden annetaan reagoida DNA-sirujen kanssa, jolloin sirulla olevat koettimet sitovat vastinsekvenssinsä sisältävät cdna-molekyylit Affymetrix sirut

14 Sirun toiminnasta Affymetrix 1-väri-siru

15 Sirun toiminnasta Courtesy of Affymetrix

16 RNA-sekvensointi RNA-seq Sekvenoidaan mahdollisimman kattavasti lähetti-rna:t (sekvenssipaloja) Sekvenssipalat kasataan lähetti-rnasignaaleiksi + Voidaan selvittää Splice-variantit, muutoksia RNA:ssa + Analysoituja sekvenssejä ei tarvitse määrittää etukäteen - Yleisimmät sekvenssit tulvivat tuloksissa (jopa >80 %)

17 Onko mitään ongelmia?? Häiriöt näytteissä yksilöerot Häiriöt näytekäsittelyissä Häiriöt hybridisaatiossa Sirut joita ei voida käyttää lopullisessa analyysissä Eri RNA-sek:ien väliset vaihtelut sitoutumisessa Väärän RNA:n sitoutuminen toisen geenin täplään

18 Onko mitään ongelmia?? Eri sirujen tulosten keskinäinen normalisointi Säädeltymisen testaus usein (liian) pienillä toistomäärillä Suuret havaintomäärät => Väärien positiivisten tulosten riski Liian paljon dataa (säädeltyneitä geenejä)

19 Onko mitään ongelmia?? Huono koesuunnittelu Inhimilliset virheet Ohjelmien ja menetelmien virheellinen käyttö Analyysivaihtoehdot - Koesuunnittelu Tulosten järkevä evaluaatio (sen puute)

20 Sirudatan analyysi Erot lasisirujen ja affymetrix-sirujen välillä Esikäsittely Laadun tarkistus Säädeltyneitten geenien valinta

21 Tyypilliset työvaiheet Generate the GE data Generate the GE data Pre-processing (Normalization etc.) Pre-processing (Normalization etc.) Define Differentially Expressed genes Define Differentially Expressed genes Draw biological conclusions Find over-represented biological processes Cluster selected genes Draw biological conclusions

22 2-väri-sirujen analyysi Separate analysis for each spot (gene) Image Analysis Recognize spot region RED CHANNEL Spot area mean / median GREEN CHANNEL Spot area mean / median Background extraction Background extraction Take the ratio (R/G) Take a logarithm (or use a variance stabilizing function) These steps are done for each chip separately (if needed) Set the median / mean to zero Use lowess normalization (if needed)

23 Affymetrix-sirujen analyysi Separate analysis for each (gene).. From probe level to gene level Image Analysis Select probe region Perfect Match Probe signal mean / median Mismatch Probe signal mean / median (*) Background extraction Combine signals from different probes These steps are done for each chip separately (if needed) Take a logarithm (or use a variance stabilizing function) Use lowess normalization (if needed) *Many methods omit the mismatch probe signal

24 Aineiston esikäsittely Aluksi täplien intensiteeteistä vähennetään niiden ympäristön (taustan) intensiteettitaso Mahdollinen taustan kohinan häiriö poistetaan Lukuarvoista otetaan logaritmi Log-muunnos tasoittaa eroja pienien ja suurien lukuarvojen alueella tekee intensiteettisuhteiden jakaumasta enemmän normaalijakauman kaltaisen jakauma myös symmetrisoituu

25 Log-muunnos Intensiteetit Intensiteettisuhde

26 Aineiston esikäsittely: Normalisointi Eri sirujen ja värileimojen välillä eroja jotka esiintyvät joko kaikilla geeneillä tai osajoukolla geeneistä Suuri ongelma analyysille! Työvaihetta jossa nämä häiriöt poistetaan kutsutaan normalisoinniksi

27 Aineiston esikäsittely: Normalisointi Yksinkertainen menetelmä normalisointiin Keskiarvot / Mediaanit eri siruista säädetään samaan lukuarvoon Sirujen hajonnat säädetään samansuuruisiksi Kehittyneempiä ohjelmia normalisointiin: Loess, cyclic Loess, quantile normalization* *

28 Demo plot: Before /after normalization

29 A versus M: Laadun tarkastus: A vs. M Kuvaaja M = log 2 (intensiteettisuhde) A = log 2 (keskimääräinen intensiteetti) Informatiivinen aineiston visualisointitapa, jolla näkee tavanomaista hajontakuviota paljon paremmin mahdolliset vinoumat aineiston jakaumassa

30 M-A kuvaaja vs. tavallinen scatter plot

31 Upregulated genes Downregulate genes Low intensity measurements Low expr. levels High intensity measurements High expr. levels

32 Hyvät, pahat, rumat BAD! BAD / Border GOOD! BAD! Most of the genes usually do not react to the treatment. Consistent shifts point to Errors and biases

33 Laadun tarkistuksia Edelliset M-A kuvaajat havainnollistivat vain millainen on aineiston hajonta Tärkein tieto kuitenkin on: Kuinka varmuudella säädeltyneet geenit käyttäytyvät? Kuinka varmuudella ei-säädeltyneet geenit (kontrollitäplät) käyttäytyvät Määritä varmasti säädeltyneet geenit Määritä kontrolligeenit tai kontrollipisteet

34 Laadun tarkistuksia Punainen kolmio: Positiivinen kontrollitäplä lasisirulta Vihreä tähti: negatiivinen kontrollitäplä lasisirulta Musta tähti: geeni jota yliekspressoidaan X-akselin esittämällä sirulla Vasen kuva: Ennen normalisointivaiheita Oikea kuva: Normalisointien jälkeen Toronen et al. unpublished

35 Laadun tarkistuksia Visualisoi aktiivisuus joukolle oletettuja positiivisia geenejä Viivat esittävät kuvaajassa yksittäisiä geenejä Jokaisessa sarakkeessa on tulos yhdeltä mikrosirulta Esimerkkitapauksessa näimme selkeän vastaavuuden aikaisemmassa tutkimuksessa raportoidun geenijoukon ja kyseisen aineiston välillä Numerot kuvaajassa ovat erottelemassa eri viivoja toisistaan

36 Data-analyysi Säädeltyneistä geenien haku Geeniryhmien vertailu Klusterointi Geeniontologioiden käyttö analyysissä Visualisaatio

37 Säädeltyneet geenit: Intensiteettisuhde Usein vertaillaan geenin signaalitason suhdetta kahden näyteryhmän välillä (disease vs. ctrl.) Tätä mitataan geenin intensiteettisuhteella Int.suhde = mean(disease) / mean(control) Yleensä intensiteettisuhteesta otetaan kaksikantainen logaritmi: Log 2 (intensiteettisuhde) = log 2 (disease/ctrl.) HUOMAA: Jos log on jo otettu datasta esikäsittelyssä voidaan ottaa erotus: log 2 (disease/control) = log 2 (disease) - log 2 (ctrl.)

38 Säädeltyneet geenit: T-testi Satunnaiset häiriöt geenien mittauksissa aiheuttavat eroja näyteryhmien (disease ctrl) keskiarvojen välillä Intensiteettisuhde ei kerro oliko havaittu ero ryhmien välillä merkittävä Tähän kysymykseen käytetään T-testiä G.expr. datan parissa suositaan muunnettuja T-testejä (LIMMA, IBMT *)

39 Data-analyysi Säädeltyneiden geenien vertailu eri käsittelyistä Venn diagrammit Up in treatment B Up in treatment A

40 Data-analyysi Varsin tyypillisesti suoritetaan ryhmittely l. klusterointianalyysi, jolla samaan tapaan ilmentyvät geenit sijoitetaan esim. puukaaviossa samaan haaraan Esim. geeniryhmät, jotka ekspressoituvat samoin tutkituissa syöpäsolutyypeissä Klusterointi tarjoaa hajoita ja hallitse ratkaisun suuren aineiston analyysissä Löydetyt ryhmät esittävät monesti jonkin säädellyn biologisen prosessin geenejä

41 Hierarkkinen ryhmittelyanalyysi Kaksi vaihetta: 1. Valitse etäisyysmitta (geenien välinen etäisyys) Euclidian Pearson / Spearman correlation 2. Valitse puunpiirtomenetelmä Single linkage Average linkage (UPGMA) Complete linkage Suositukset: average linkage ja pearson correlation

42 Hierarkkinen ryhmittelyanalyysi Figure originally presented in Toronen et al. Current Genomics, 2002 Figure originally presented in Cheok et al. Nature Genetics, 2002, supplementary data

43 Geeniontologian käyttö ekspressiodatan kanssa Analyysin lopputuloksena saadaan usein suuri joukko säädeltyneitä geenejä Tulosten tulkinta on usein vaikeaa Satunnaiset väärät positiiviset signaalit geeneillä Geenien vaihtoehtoiset toiminnot Aineisto pitäisi muuttaa biologiseksi ymmärrykseksi

44 Geeniontologian käyttö ekspressiodatan kanssa Ratkaisuna käytetään geenien luokitteluja toiminnallisiin luokkiin Geenien sijasta keskitytään tutkimaan geeniryhmiä jotka osallistuvat samaan toimintoon Joukko geenejä tarjoaa usein luotettavamman signaalin kuin 1 geeni Geeniontologia (GO) on tässä tarkoituksessa eniten käytetty luokittelu

45 Miten GO:ta sovelletaan? Otetaan tautinäytteessä aktivoitunut joukko geenejä Selvitetään mitä GO-luokkia (jos mitään) esiintyy poikkeuksellisen paljon kyseisessä joukossa Järjestetään GO-luokat merkittävyyden mukaan TAI Otetaan klusteroinnista saatu mielenkiintoinen joukko Tehdään sille sama selvitys kuin edellä

46 Two examples of sorted class lists functional class -log10(p) P size of the class obs. number o expected STD of exp mitochondrial organization respiration PROTEIN SYNTHESIS ribosomal proteins ENERGY assembly of protein complexes CELLULAR ORGANIZATION mrna processing (splicing) regulation of phosphate utilization functional class -log10(p) P size of the obs. numbeexpected STD of exp TRANSCRIPTION mrna transcrition nuclear organization mrna synthesis rrna transcription transcriptional control rrna processing mrna processing (splicin rrna synthesis trna transcription general transcription activ

47 Loppupointit Geeniekspressio-analyysi on tänään tärkeä osa bio-, lääke- ja ympäristötieteitä Tuotettu data usein hyvin kohinaista ja häiriöitä täynnä Häiriöitä poistetaan esikäsittelyllä ja normalisointimenetelmillä

48 Loppupointit Hanki kontakti bioinformaatikkoon aikaisessa vaiheessa tutkimusta Koesuunnittelu (!!!!!!!) Biologisia toistoja mielellään > 3 Julkaisujen minimi on usein 3 Kaikki mittausaineistot (bio)tieteissä sisältävät häiriöitä. Geeniekspressio vain vahvistaa säännön.