Suositus sienten lääkeherkkyyden määrittämiseksi Versio 1.0

Transkriptio

1 Suositus sienten lääkeherkkyyden määrittämiseksi Versio 1.0 FiRe Suomalainen mikrobilääkeresistenssin tutkimusryhmä - Finnish Study Group for Antimicrobial Resistance (FiRe),

2 Kirjoittaja Markku Koskela kliinisen mikrobiologian ylilääkäri, dosentti Oulun yliopistollinen sairaala Toimituskunta Pirkko Koukila-Kähkölä mykologi, FK HUSLAB, Mykologian yksikkö Tarja Ojanen sairaalamikrobiologi, FT Kanta-Hämeen keskussairaala 2

3 Sisällys 1. Johdanto Hiivojen herkkyysmääritys Milloin ja millä edellytyksillä Herkkyysmääritys E-testillä Suoritus Tulokset ja niiden tulkinta Laadunvarmistus Sisäinen laadunvarmistus Ulkoinen laadunarviointi...6 3

4 1. Johdanto Sienille voidaan periaatteessa tehdä lääkeherkkyysmäärityksiä samoilla menetelmillä kuin bakteereillekin. Edellytyksenä on, että sieni kasvaa herkkyysmäärityksen kannalta sopivassa nestemäisessä elatusaineessa tai sopivalla herkkyysmaljalla nopeasti (1-2 vrk:ssa) ja selvänä kasvustona, jonka estyminen lääkeaineen vaikutuksesta voidaan riittävän tarkasti havaita ja mitata. Käytännössä on havaittu, että sienten lääkeherkkyysmäärityksiä on vastaavia bakteerien lääkeherkkyysmäärityksiä vaikeampi vakioida, mistä johtuen niiden käyttö on ollut vähäistä. Ongelmana on erityisesti sienen kasvun estymisen MIC-arvon tulkinta. Kliinisesti sienilääkeherkkyystuloksia tarvitaan silloin, kun aiheuttajana on sieni, jonka herkkyys voi olla alentunut empiirisessä hoidossa käytettävälle lääkkeelle ja halutaan tietää sienen herkkyys toissijaisille sienilääkkeille. Tällaisten sienten esiintyvyys kliinisissä näytteissä lisääntyy mm. laajakirjoisen mikrobilääkityksen seurauksena. Sienilääkeherkkyysmäärityksiä tehdään ensisijaisesti Candida-suvun hiivasienille. Niitä on tehty myös Aspergillus-suvun ja Zygomycetes-sukujen rihmasienille, kun kyseessä on ollut epäily syvästä nopeasti etenevästä homesieni-infektiosta. Sienilääkeherkkyysmääritysten referenssimenetelmänä pidetään CLSI:n (entinen NCCLS) laimennossarjaan perustuvaa MIC-menetelmää, josta on oma standardi hiivoille (M27-A3) ja rihmasienille (M38-A2). Eurooppalaisen kliinisen mikrobiologian ja infektiotautien yhdistyksen (ESCMID) mikrobilääkeherkkyyskomitea (EUCAST) on tehnyt CLSI:n menetelmästä version, jossa määritys tehdään mikrotiterlevyllä ja mittaus tapahtuu spektrofotometrisesti. Myös vastaavia kaupallisia herkkyysmääritysmenetelmiä on saatavissa (esim. ATB Fungus 2, VITEK 2, FUNGIFAST ja FUNGITEST). Näissä kaupallisissa herkkyyspaneeleissa on sienilääkkeitä, joita ei Suomessa käytetä sieni-infektioiden hoidossa ja vastaavasti niistä puuttuu hoidossa käytettyjä lääkkeitä. Myös eri menetelmillä saadut herkkyystulokset vaihtelevat eri Candida-lajien kohdalla. Varsinkin Pohjoismaissa rutiinimäärityksiä tehdään E-testillä. Kiekkodiffuusiomenetelmällä saadaan vain suuntaa antavia tuloksia. 1

5 2. Hiivojen herkkyysmääritys 2.1. Milloin ja millä edellytyksillä Ensisijaisesti on tehtävä luotettava hiivasienen lajimääritys, koska kokemusperäisesti tiedetään, mitkä lajit ovat yleensä herkkiä tai resistenttejä tietylle sienilääkkeelle (taulukko 1). EUCAST valmistelee suositusta, jossa olisi lajikohtaisesti MIC-arvojen herkkyystulkintarajat eri Candida-hiivoille, mikä myös edellyttää oikeaa lajitunnistusta. Taulukko 1. Hiivojen luonnollinen herkkyys sienilääkkeille Hiivalaji Amfoterisiini B Flukonatsoli Vorikonatsoli Kaspofungiini C.albicans S S S S C.glabrata S (S)/I/R S/(I /R ) S C.tropicalis S S S S C.parapsilosis S S S S C.krusei S(R) R S S C.norvegensis S R?? C.dubliniensis S S S S C.lusitaniae S S S S Suluissa oleva tulkinta tarkoittaa, että osa kannoista edustaa kyseistä herkkyyttä. Lajimäärityksen ohessa tehdään sienilääkeherkkyysmääritys näytteen laadusta, lähetetiedoista ja alustavasta lajitunnistuksesta (Candida albicans vai ei C.albicans) riippuen seuraavasti (taulukko 2). Veri- ja likvoriviljelyistä kasvaneille hiivoille tehdään aina herkkyysmääritys. Syvistä kudosja märkänäytteistä eristetyille hiivoille tehdään herkkyysmääritys potilaskohtaiseen kliiniseen konsultaatioon tai sairaalakohtaiseen kliinikoiden kanssa tehtyyn sopimukseen perustuen. Pinnallisista näytteistä eristetyille hiivoille ei tehdä herkkyysmäärityksiä, ellei niitä erikseen perustellusta syystä tapauskohtaisesti pyydetä. Tällaisia tapauksia voivat olla mm. palovamma- ym. traumapotilaiden, leukemia ym. immuunipuutteisten potilaiden ja tehohoitoa vaatineiden potilaiden iho- ja limakalvonäytteistä tai pinnallisista haavanäytteistä eristetyt hiivat. 2

6 Taulukko 2. Herkkyysmäärityksen minimitarve sienilajin mukaan C.albicans Candida, ei C. albicans Ei herkkyysmääritystä tai perustellusta syystä flukonatsolille. Jos flukonatsoli on R, herkkyysmääritys myös muille sienilääkkeille. Herkkyysmääritys sekä flukonatsolille että kaspofungiinille; tarvittaessa myös vorikonatsolille ja amfoterisiini B:lle. Kun lajitunnistus on tehty tai lajista on saatu esim. kromogeenimaljalla alustava arvio, herkkyysmääritysten laajuutta voi tarkentaa ja tulkinnassa huomioida: C. tropicalis ja C. parapsilosis Yleensä herkkiä kaikille sienilääkkeille. Jos flukonatsoli on I tai R, herkkyysmääritys tehdään myös muille sienilääkkeille. C. glabrata Flukonatsoli on yleensä I tai R, joten herkkyysmääritys on syytä tehdä heti myös muille sienilääkkeille. C. krusei Flukonatsoli aina R. Herkkyysmääritys kaspofungiinille ja tarvittaessa myös vorikonatsolille ja amfoterisiini B:lle. Muut Candida-lajit Herkkyysmääritys flukonatsolille ja tarvittaessa muille sienilääkkeille Herkkyysmääritys E-testillä Määritykset tehdään RPMI 1640 maljalla (katso koostumus ja valmistusohje: ETEST APPLICATION SHEET, Yeast, EAS 006, Ab Biodisk, Ruotsi, E-testimanuaalissa (katso E-test technical guide 4: Antifungal susceptibility testing of yeasts, Ab Biodisk, Ruotsi) kuvatulla tavalla: Suoritus Tee hiivasta puhdasviljelmä ei selektiiviselle maljalle (Sabouraud-malja, joka ei sisällä sykloheksimidiä) ja inkuboi sitä yön yli 35 C:ssa. Tee hiivakasvustosta keittosuolaan McFarland 0.5 -vahvuinen suspensio. (Cryptococcus neoformansista McFarland 1 -vahvuinen suspensio). 3

7 Siirrosta suspensio vanutikulla ja dreijaamalla herkkyysmaljalle niin, että koko maljan alueelle tulee tasainen kasvusto. Anna maljan pinnan kuivahtaa. Siirrä E-testiliuska aseptisesti maljalle. Laita maljat muovipussiin (esim. Minigrip-pussiin) niin, että pussiin jää ilmaa mutta maljat eivät kuivu. Aseta maljapussi kannella varustettuun laatikkoon, joka ei sisältä helposti jäähdy kun inkubaattoria avataan. Inkuboi maljoja pusseissaan laatikoissa 35 C:ssa, tuntia. Lue E-testitulokset alustavasti, kirjaa ne ylös ja vastaa tarvittaessa alustavana tuloksena liittämällä herkkyysvastaukseen kommentti: Alustava sienilääkeherkkyystulos. Jatka inkubaatiota ad. 48 tuntia. Lue E-testitulokset. Vastaa lopulliset tulokset. (Huom. C. neoformansin herkkyys luetaan alustavasti 48 tunnin ja lopullisesti 72 tunnin inkubaation jälkeen j E-testitulosten lukeminen (vrt. E-testien kuvaliitteet, Biodisk) o Atsoliryhmän sienilääkkeiden (flukonatsoli, vorikonatsoli) ja kaspofungiinin herkkyys luetaan valmistajan ohjeen mukaisesti 80 % estovyöhykkeen mukaan tunnin inkubaation jälkeen. Tulos tarkistetaan 48 tunnin inkubaation jälkeen, jolloin huomioidaan estovyöhykkeen alueelle mahdollisesti muodostuneet selvät makropesäkkeet. Huom! Tasaista, pienipesäkkeistä estovyöhykkeen vähitellen hävittävää ylikasvua eli huntuilua ei huomioida. o Amfoterisiini B-herkkyystulos luetaan 100 % estovyöhykkeen mukaan, joten määrityksessä huomioidaan myös estovyöhykkeen sisälle mahdollisesti muodostuneet mikropesäkkeet, jotka usein ovat nähtävissä vasta 48 tunnin inkubaation jälkeen. 4

8 Tulokset ja niiden tulkinta Taulukko 3. Sienilääkkeiden SIR-tulkintarajat hiivoille MIC (µg/ml) Sienilääke S S-DD # R Amfoterisiini B $ 1 - Flukonatsoli $ C.albicans, C.parapsilosis ja C.tropicalis 2 4 Itrakonatsoli $ Vorikonatsoli $ Kaspofungiini * 2* # Lääkeannosriippuvainen (Dose Dependent) herkkyysalue. $ CLSI M27-A3, Ab Biodisk EAS 006 EUCAST Technical Note on fluconazole, Clin Microbiol Infect, 14/2: ,2008. EUCAST n lajikohtainen suositus flukonatsolin herkkyystulkintarajoiksi, jonka mukaisesti Candida albicans -, C. parapsilosis- ja C. tropicalis kantojen MIC-arvot 2 tulkitaan S ja MIC-arvot 4 tulkitaan R. Koska flukonatsoli tehoaa heikosti C.glabrata-kantoihin ja C.krusei on sille resistentti, flukonatsoliherkkyyttä ei tule raportoida näille Candida-lajeille. Jos flukonatsoliherkkyystulos on vastattu hiiva, ei C.albicans-lajille, joka jatkotutkimuksissa osoittautuu C.glabrataksi tai C. kruseiksi, vastaukseen tulee liittää kommentti, että flukonatsolia ei suositella tämän hiivalajin aiheuttaman infektion hoitoon. Muiden hiivojen flukonatsoliherkkyystulos tulkitaan: MIC <8 on S, on lääkeannoksesta riippuva herkkyys eli I alue ja >64 on R. * Kaspofungiinille sekä anidulafungiinille on annettu herkkyystulkinnan raja-arvoksi S on 2. Jos kaspofungiinin tai anidulafungiinin MIC-arvo on >2, kannan herkkyys saattaa olla alentunut ja herkkyysvastaukseen liitetään kommentti, että MIC-arvo viittaa siihen, että kannan herkkyys on mahdollisesti alentunut in vitro Laadunvarmistus Sisäinen laadunvarmistus Jokaisen sienilääkeherkkyysmaljaerän toimivuus varmistetaan valmistajan ohjeen mukaisesti ATCC -referenssikannoilla (taulukko 4). Määritysten toimivuus päivittäisessä rutiinissa varmistetaan riittävän usein kerran viikossa tehtävillä ATCC-referenssikantojen herkkyysmäärityksillä. Jos laboratorio ei tee päivittäin sienilääkeherkkyysmäärityksiä, sisäinen laadunvarmistus tehdään jokaisen potilasnäytteestä eristetyn hiivakannan herkkyysmäärityksen yhteydessä ainakin sitä vastaavalla ATCCkannalla (esim. C. albicans ja C.albicansin ATCC kannalla) 5

9 Taulukko 4. Referenssikantojen viitevälit RPMI-agarilla 48 t inkubaation jälkeen (Biodisk EAS 006) Kanta Amfoterisiini B Flukonatsoli Vorikonatsoli Kaspofungiini C.albicans ATCC90028 C.parapsilosis ATCC22019 C.krusei > ATCC Ulkoinen laadunarviointi Labquality Oy:n ja UKNEQAS n järjestämät sienten laaduntarkkailukierrokset. 3. Viitteet CLSI M27-A3. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard Third Edition, CLSI M27-S3. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Third Informational Supplement, CLSI M38-A2. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard Second Edition, EUCAST Technical Note on Fluconaxole; Clin Microbiol Infect 2008;14: EUCAST EDef 7.1; Clin Microbiol Infect 2008; 14: AB BIODISK ETEST APPLICATION SHEET, EAS 006; Yeast ( ) 6