Bakteerin lääkeherkkyyden määrittäminen kiekkomenetelmällä Versio 6

Transkriptio

1 FiRe STANDARDI v Bakteerin lääkeherkkyyden määrittäminen kiekkomenetelmällä Versio 6 FiRe Suomalainen mikrobilääkeresistenssin tutkimusryhmä - Finnish Study Group for Antimicrobial Resistance (FiRe), 2009

2 FiRe STANDARDI v Kirjoittaja Antti Nissinen sairaalamikrobiologi, dosentti Keski-Suomen keskussairaala Toimituskunta Henrik Jägerroos kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri, LT Lapin keskussairaala Ulla Kärkkäinen kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri, LT Kuopion yliopistollinen sairaala Pauliina Kärpänoja sairaalamikrobiologi, FM Päijät-Hämeen keskussairaala Eveliina Tarkka sairaalamikrobiologi, FM Helsingin-Uudenmaan sairaanhoitopiiri Risto Vuento kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri, dosentti Tampereen yliopistollinen sairaala Antti Hakanen kliinisen mikrobiologian erikoislääkäri, LT Terveyden ja hyvinvoinnin laitos

3 FiRe STANDARDI v Sisällys 1 Johdanto Resistenssi Resistenssin mittaaminen Kiekkomenetelmä Historia Kiekkomenetelmän ongelmat FiRe kiekkomenetelmästandardi Yleiset periaatteet Herkkyysmäärityksen indikaatiot; diagnostiikka ja epidemiologia Bakteerilääkevalikoima - kiekkopaneelit Tulkinta - S/I/R Menetelmän erityisongelmat Materiaali Elatusaine Mueller-Hinton agar Elatusaineen rikasteet Maljojen valmistus Maljojen säilytys Maljojen laaduntarkkailu Bakteerilääkekiekot Koostumus Kiekkojen säilytys Turbiditeettistandardi Standardin käyttö McFarland 0.5 -standardiputkien valmistus ja säilytys Lämpökaapit Suoritus (Työn kulku; perussuoritus ja poikkeukset/täydennykset - liite 1) Siirrostus (ymppäys) Kiekotus Inkubaatio Luku Tulos - Estorenkaan halkaisija (ERH) Tulkinta - vastaus Laaduntarkkailu Kontrollikannat Kantojen säilytys Kantojen käyttö Testaaminen Löydösjakauman analysointi...13 Viitteet...15 Kiekkomenetelmä, työn kulku... Liite 1 Suositus bakteerilääkepaneeleiksi... Liite 2 Kiekkomenetelmän tulkintarajat... Liite 3a

4 FiRe STANDARDI v MIC-menetelmän SIR-tulkintarajat... Liite 3b ATCC-kontrollikantojen viitevälit kiekkomenetelmässä... Liite 4 Bakteeriryhmäkohtaiset kommentit... Liite 5 Täydentävät menetelmät... Liite 6 Bakteerilääkkeet ryhmittäin... Liite 7 Bakteerien luonnollinen resistenssi.. Liite 8

5 FiRe STANDARDI v Sivu 1 Bakteerien lääkeherkkyyden määrittäminen kiekkomenetelmällä 1 Johdanto 1.1 Resistenssi Kliinisen mikrobiologian laboratorion tulee bakteerin lääkeherkkyyden määrittämisellä vastata kysymykseen: onko kyseinen bakteeri herkkyydeltään normaali vai onko sen sietokyky hoidossa kysymykseen tulevaa bakteerilääkettä kohtaan normaalia merkitsevästi korkeampi. On sovittu, että merkitsevästi normaalia korkeamman sietokyvyn omaavaa bakteerikantaa kutsutaan resistentiksi. Lääkepitoisuutena ilmaistuna bakteeri on resistentti, jos se sietää suurempaa bakteerilääkepitoisuutta kuin mikä ihmiskehossa pystytään turvallisella annostuksella saavuttamaan. Kokemus on kuitenkin osoittanut, että tällainen raja voi olla korkeintaan viitteellinen koska bakteerilääkkeen in vitro tehon lisäksi potilaan paranemiseen vaikuttavat ratkaisevasti infektiotaudin tyyppi ja potilaan puolustuskyky. WHO onkin täydentänyt resistenssin määritelmää siten, että myös silloin bakteeria kutsutaan resistentiksi, jos se sietää merkittävästi korkeampia lääkepitoisuuksia kuin valtaosa saman lajin edustajista [31]. 1.2 Resistenssin mittaaminen Laboratorioilla on käytettävissä erilaisia menetelmiä, joilla lääkeherkkyydeltään poikkeava bakteerikanta voidaan osoittaa. Menetelmille on yhteistä se, että ne mittaavat bakteerin kykyä lisääntyä lääkkeen läsnäollessa. Kvantitatiivisiksi menetelmät on saatu siten, että kasvatuksen aikana bakteeri altistetaan lääkkeelle joko portaittaisesti (laimennosmenetelmät) tai jatkuvasti (agardiffuusiomenetelmä, E-testi) kasvavana pitoisuutena. Tällaisten yleiskäyttöisten menetelmien lisäksi on joissain tapauksissa tarkoituksenmukaista kohdentaa kysymys resistenssistä koskemaan tiettyä resistenssimekanismia (esim. beetalaktamaasin tuotto), resistenssistä vastuussa olevaa proteiinia (esim. stafylokokkien PBP2a-proteiini) tai geeniä (esim. stafylokokkien meca-geeni). Laimennosmenetelmällä ja E-testillä saadaan tulokseksi ns. pienin estävä bakteerilääkepitoisuus (minimum inhibitory concentration - MIC), jota voidaan suoraan verrata potilaan kehossa saavutettavaan lääkepitoisuuteen. Agardiffuusiomenetelmällä saatu tulos (pinta-alaltaan vaihteleva estorengas) on muutettava diffuusion teoriaan perustuvan laskukaavan avulla pitoisuudeksi, ennen kuin tällainen vertailu on mahdollista. Laimennosmenetelmä on vertailu- ( referenssi- ) menetelmä bakteerin lääkeherkkyyden määrittämiseksi. Manuaalisena se istuu huonosti diagnostiseen laboratorioon ja siksi vasta automaation myötä sitä on alettu hyödyntää näissä laboratorioissa. USA:ssa nämä ns. MICautomaatit yleistyivät nopeasti 1980-luvulla [12]. Eurooppalainen versio oli ns. breakpointkonsentraatioautomaatti, joka määrittää bakteerin herkkyyden suhteessa lääkkeen rajaarvopitoisuuksiin [11] luvulle tultaessa MIC-automaatiota on kehitetty niin, että nopean bakteerin tunnistuksen lisäksi myös lääkeherkkyystulos on käytettävissä työpäivän kuluessa (Vitek 2, biomerieux). Vaikka automaatio on oleellisesti lisännyt laimennosmenetelmien käyttökelpoisuutta, eivät nämä ole syrjäyttäneet agardiffuusiomenetelmää diagnostisen

6 FiRe STANDARDI v Sivu 2 laboratorion perusmenetelmänä. Suomessa kiekkomenetelmä on FiRe:n selvitysten mukaan kaikkien kliinismikrobiologisten laboratorioiden perusmenetelmä. 1.3 Kiekkomenetelmä Historia Agardiffuusioon perustuva kiekkomenetelmä on joustavuutensa ja (näennäisesti) helpon teknisen suorituksensa vuoksi yleisin herkkyysmääritysmenetelmä. Englantilainen Alexander Fleming keksi penisilliinin sattumalta agardiffuusion avulla v ja hän oli myös ensimmäinen, joka käytti agardiffuusiota tutkimusmenetelmänä [10]. Agardiffuusiota käytettiin aluksi yksinomaan penisilliiniliuosten aktiivisuuden mittaamiseen mutta 1940-luvulla alettiin selvittää menetelmän yleiskäyttöisyyttä antiseptisten aineiden tutkimiseksi. Tutkimusten tuloksena kehitettiin matemaattinen teoria, joka on meille tutun agardiffuusiosovelluksen, kiekkomenetelmän, teoreettinen perusta [7]. Samaan aikaan todettiin, että menetelmää voitiin käyttää myös käänteisesti eli bakteerien lääkeherkkyyden mittaamiseen [6,21]. Liuosmainen, agariin porattuun kuoppaan pipetoitava lääkelähde korvattiin kätevämmällä agarin pinnalle asetettavalla imupaperikiekolla, johon lääke oli imeytetty luvulle tultaessa kiekkomenetelmä oli jo yleisesti käytössä bakteriologisissa laboratorioissa, ja vuonna 1966 amerikkalaiset tutkijat Bauer, Kirby, Sherris ja Turck kokosivat menetelmään kohdistuneet tutkimukset standardiksi, jota sittemmin on kutsuttu Kirby-Bauer menetelmäksi [5]. Kyseinen julkaisu on enemmän toteava kuin pohtiva, eikä se perustele kuvaamansa menetelmän avainkohtia, kuten elatusainevalintaa, ympin tiheyttä, estorenkaan reunan määritelmää jne.. Viisi vuotta myöhemmin, vuonna 1971, ruotsalainen Ericsson ja Bauerin ryhmässä mukana ollut Sherris julkaisivat WHO:n aloitteesta organisoimansa monikeskustutkimuksen International Collaborative Study raportin, jossa he pohtivat perusteellisesti kiekkomenetelmän keskeisiä tekijöitä ja päätyivät suositukseen, joka poikkeaa mm. ympin ja estorenkaan reunan määritelmän suhteen Kirby-Bauer -menetelmäsuosituksesta [9]. Ericssonin ja Sherrisin suosituksen mukaista menetelmää on kutsuttu raportin mukaan ICS-menetelmäksi erotukseksi Kirby-Bauer -menetelmästä. WHO:n käynnistämän tutkimuksen tarkoitus oli kansainvälisen yhteisymmärryksen saavuttaminen kiekkomenetelmän suhteen. Näin ei ole kuitenkaan tapahtunut, vaan monissa maissa kansalliset standardisoimisjärjestöt ovat laatineet omat suosituksensa kiekkomenetelmän keskeisistä tekijöistä [1]. Standardikiekkomenetelmää ei siis ole olemassa. Yhteistä on kuitenkin se, että kaikissa menetelmissä bakteerin herkkyys kvantitoidaan estorenkaan halkaisijan avulla. Saatua millimetrilukemaa verrataan raja-arvoihin, jotka perustuvat MIC:n luonnollisen logaritmin ja estorenkaan halkaisijan (ERH) väliseen lineaariseen riippuvuussuhteeseen [7]. Raja-arvot erottavat resistentin (R, resistant) bakteerin herkästä (S, susceptible). Näiden luokkien väliin on yleensä määritelty noin 5 mm. leveä alue, joka toimii puskurivyöhykkeenä estäen menetelmän epätarkkuudesta johtuvat virhetulkinnat. Tätä aluetta kutsutaan välialueeksi (I, indeterminate tai intermediate) Kiekkomenetelmän ongelmat

7 FiRe STANDARDI v Sivu 3 Kiekkomenetelmään on vuosien saatossa kohdistunut paljon kritiikkiä. Jo edellä mainittu ICSraportti [9] toi esille keskeisimmät arvostelun kohteet: laimennosmenetelmällä saadut ja kiekkomenetelmätulokset eivät ole aina yhtenäiset eivätkä SIR-rajat päde kaikille bakteerilajeille. Lisäksi elatusaineen eri aineosat ja inkubaatioatmosfääri saattavat aiheuttaa häiriötä ja vaikuttaa tuloksiin. SIR-rajojen ekstrapolointi MIC-asteikolta ERH-asteikolle perustuu siihen olettamukseen, että MIC- ja ERH-arvojen suhde on lineaarinen. Tämä ei kuitenkaan aina pidä paikkaansa [8,14]. Lisäksi regressioanalyysi, joka on ekstrapolaation matemaattinen apuväline, jättää huomiotta MIC-määritykseen sisältyvän virheen (keskimäärin ± 1 laimennosta) [9]. Edelleen, tarkastelemalla mitä tahansa regressiokuvaajaa jossa eri bakteerilajeja edustavien bakteerikantojen MIC- ja vastaavat ERH-tulokset on esitetty pisteinä koordinaatistossa, nähdään, että tiettyä MIC-arvoa vastaavissa ERH-arvoissa on hajontaa [9]. ERH-arvojen hajoaminen tietyn MIC-arvon kohdalla selittyy osin sillä, että eri bakteerilajit käyttäytyvät herkkyysmäärityksissä hieman eri tavalla. Niinpä standardeissa onkin tietyille bakteerilajeille omat ERH-SIR-rajansa. Lisäksi on todettu, että saman bakteerikannan tulokset saattavat eri laboratorioissa sijoittua eri kohtiin ERH-akselilla [3,9,15,19,26] siitäkin huolimatta, että laboratoriot noudattavat samaa standardia. Syitä laboratorioiden väliseen vaihteluun ei tunneta. Ei myöskään tiedetä, missä määrin vaihtelua tapahtuu laboratorion sisäisesti. 80-luvulla Kronvall kollegoineen kiinnitti asiaan erityistä huomiota ja teki ehdotuksia menettelytavoista asian korjaamiseksi [16,28,30]. Kronvallin esittämiä Single strain reggression analysis (SRA) ja Standard curve reggression analysis (SCA) -tekniikoita ei ole kuitenkaan otettu yleisesti käyttöön eikä niiden toimivuutta ole testattu muiden tutkijoiden toimesta. Heidän tutkimuksensa kuitenkin osoittivat, että ERH-SIR-rajojen hienosäätö laboratoriokohtaisesti on mahdollista ja perusteltua. Sekä Kirby-Bauer- että ICS-menetelmän elatusaineena käytetään Mueller-Hinton agaria. Alusta on rakenteeltaan kompleksinen ja sellaisena tarkkaan mittausmenetelmään teoreettisestikin huonosti sopiva. Huolimatta siitä, että elatusaineen valmistajilla on ollut jo kymmenisen vuotta käytettävissä amerikkalainen standardi Mueller-Hintonin laatukriteereistä [25], esiintyy eri valmistajien erien välillä yhä yllättäviä vaihteluita [17,20,29]. ICS-tutkimuksen raportissa Ericsson ja Sherris totesivat kompleksisen elatusaineen ongelmat ja esittävät tavoitteeksi rakenteeltaan täysin määritellyn (synteettisen) elatusaineen [9]. Synteettisen elatusaineen kompastuskiveksi on koitunut sen huono kasvatuskyky [4]. Sen sijaan ns. puolisynteettiset alustat, kuten PDM-ASM (valmistus lopetettu 2003) ja Iso-Sensitest-agar (Oxoid), ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi. Iso-Sensitest sisältää puhtaiden aineiden lisäksi proteiinihydrolysaatteja (peptoneja), joiden koostumus on varsin tarkkaan hallittavissa verrattuna lihauutteeseen, joka on Mueller-Hintonin ainoa biologinen rakennusosa [1,27]. Mueller-Hinton agar on USA:laisen CLSI:n (Clinical and Laboratory Standards Institute = entinen NCCLS) standardin suosittelema elatusaine. Iso-Sensitest-agaria suosittelee ruotsalaisen SRGA:n menetelmästandardi [ hollantilainen standardi WRG [1] ja brittiläinen BSAC:n standardi [33]. Huolimatta useista ongelmista, joita liittyy kiekkomenetelmän käyttöön, luotettavien tulosten saaminen sitä käyttäen on mahdollista. Menetelmän suorituskyvyn optimointi edellyttää kuitenkin laboratorioilta huolellista menetelmävalidointia. Käytännössä tämä tarkoittaa sitä, että

8 FiRe STANDARDI v Sivu 4 SIR-rajojen sijainti suhteessa kiekkoherkkyystuloksiin (ERH/mm) on tarkistettava jokaisessa laboratoriossa ja tarvittaessa rajat on korjattava. Jatkossa rajojen osuvuus on tarkistettava määräajoin. Käytännössä bakteerilajikohtainen ERH-rajojen tarkistus edellyttää laboratoriolta atk-järjestelmää, johon ERH-tulokset voidaan tallentaa millimetreinä edelleen analysoitaviksi. 1.4 FiRe kiekkomenetelmästandardi Seuraava standardi on perusrakenteeltaan sama kuin CLSI:n julkaisema [23] ja koostuu seuraavista peruselementeistä: - elatusaine Mueller-Hinton agar - bakteerilääkekiekot imupaperia, halkaisija 6 mm (1/4 ) - ymppi Kirby-Bauer (opalisoiva bakteerisuspensio) 2 Yleiset periaatteet 2.1 Herkkyysmäärityksen indikaatiot; diagnostiikka ja epidemiologia Herkkyysmääritys on perusteltu silloin, kun tutkitaan infektiotautiin liittyvää bakteeria jonka herkkyydessä tietylle bakteerilääkkeelle esiintyy siinä määrin vaihtelua, ettei sitä voida ennustaa [23]. Herkkyysmääritys on perusteltua myös silloin, kun selvitetään bakteerin resistenssitilannetta tietyllä alueella empiirisen hoidon perustaksi. 2.2 Bakteerilääkevalikoima - kiekkopaneelit Tietylle bakteeriryhmälle testattava lääkevalikoima on viime kädessä kunkin laboratorion itsensä ratkaistava. Valinta riippuu laboratorion asiakkaiden (kliinikot) tarpeista ja alueella noudatettavasta mikrobilääkepolitiikasta [24]. Herkkyysmääritystä ei tule tehdä lääkkeelle, jolle bakteeri on luonnostaan resistentti. Liitteessä 2 on luettelo Suomessa tavallisimmin kysymykseen tulevista lääkevalikoimista laboratoriokohtaisen valikoiman pohjaksi. Liitteessä 3 on lisäksi otettu kantaa lääkkeiden välillä vallitsevaan ristiresistenssiin, mikä seikka on tärkeää ottaa huomioon testipaneelia rakennettaessa ja herkkyystuloksia vastattaessa. Liitteessä 7 on lueteltu ryhmittäin Suomessa käytössä olevat bakteerilääkkeet. 2.3 Tulkinta - S/I/R Kiekkoherkkyysmäärityksen tulos, estorenkaan halkaisija (ERH/mm), vastataan seuraavan periaatteen mukaan tulkittuna [24]: S Herkkä (engl. susceptible) Bakteerin herkkyys ei poikkea normaalista ja infektio voidaan turvallisesti hoitaa normaalilla lääkeannostuksella. MIC-arvo on todennäköisesti matalampi kuin lääkkeellä saavutettavat kudospitoisuudet. R Resistentti (engl. resistant)

9 FiRe STANDARDI v Sivu 5 Bakteerin sietokyky lääkkeelle on muuttunut normaalia oleellisesti korkeammaksi eikä estävää pitoisuutta todennäköisesti saavuteta normaalilla annostuksella. MIC-arvo ylittää todennäköisesti lääkkeellä saavutettavat kudospitoisuudet. I Epävarma (engl. indeterminate) tai Siltä väliltä (engl intermediate) Bakteerin sietokyky lääkkeelle saattaa olla normaalia korkeampi, joten normaalilla annostuksella ei mahdollisesti saavuteta estävää pitoisuutta ellei lääke konsentroidu kohdealueelle. I-alue toimii puskurina S- ja R-alueen välillä ja sen tärkein tehtävä on ehkäistä menetelmän epätarkkuudesta johtuvien väärien R- tai S-tulkintojen syntyminen. ERH-SIR-rajat, joiden perusteella laboratoriokohtaista menetelmää lähdetään pystyttämään, (Liite 3a) perustuvat CLSI:n suositukseen jossa käytetään Mueller-Hinton agaria [24]. Rajojen sijainti on, riippumatta elatusaineesta, tarkistettava laboratoriokohtaisesti ks. kohta 7. Vastaavat MIC-arvot on kuvattu liitteessä 3b. 2.4 Menetelmän erityisongelmat Kiekkomenetelmä ei toimi kaikkien bakteerien ja bakteerilääkkeiden suhteen samalla luotettavuudella. Bakteerin kasvuvaatimukset saattavat edellyttää elatusaineelta sellaista koostumusta, josta on haittaa lääkkeen vaikutukselle (hemofilus, gonokokki). Toisaalta bakteerin resistenssi ei aina ilmene selkeänä estorenkaan pienenemisenä (beetalaktamaasivälitteinen resistenssi, heteroresistenssi, matala-asteinen resistenssi). Tällöin resistenssi saattaa ilmetä vain estorenkaan reunan epätyypillisenä ulkonäkönä (stafylokokkien beetalaktamaasivälitteinen resistenssi, enterokokin matala-asteinen vankomysiiniresistenssi). Bakteerin luontaisen resistenssitason ollessa suhteellisen korkea, vaaditaan hankitun korkean resistenssitason toteamiseen bakteerilääkekiekko, jossa on poikkeuksellisen suuri lääkemäärä (enterokokin ns. high-level-aminoglykosidiresistenssi). Beetalaktamaasivälitteinen resistenssi voidaan kiekkomenetelmää luotettavammin todeta määrittämällä bakteerin entsyymiaktiivisuus kromogeenisen substraatin avulla (Nitrocefin) tai epäsuorasti ns. apilatestillä [13]. Monilla bakteereilla, mm. kaikilla enterobakteereilla, on luontaisia beetalaktamaaseja, joiden aiheuttamasta taustakohinasta johtuen testin ennustearvo on huono. Sen sijaan bakteereilla, joilla ei luontaisia beetalaktamaaseja esiinny, kuten stafylokokit, gonokokki, hemofilukset ja Moraxella catarrhalis, on entsyymin suora osoitus käyttökelpoinen menetelmä resistenssin toteamiseksi ks. liite 6. Matala-asteisen resistenssin havaitsemiseksi voidaan kiekkomenetelmää eräissä tapauksissa herkistää käyttämällä kiekkoa, jossa on poikkeuksellisen pieni lääkemäärä (pneumokokin, gonokokin ja hemofiluksen matala-asteinen penisilliiniresistenssi, enterokokin matala-asteinen vankomysiiniresistenssi). Resistenssin asteen mittaamiseksi on näissä tapauksissa tarjolla E-testi (Liite 6), jota tietyissä harvinaisissa tapauksissa on järkevää käyttää myös primaarimenetelmänä (veren ja likvorin pneumokokkilöydökset, gonokokkilöydökset).

10 FiRe STANDARDI v Sivu 6 Heteroresistenssillä tarkoitetaan ilmiötä, jossa bakteerikasvusto jakautuu kahtia siten, että vain osa pesäkkeistä on resistentin bakteerisolun muodostamia tai bakteerisolu resistenssiä ilmentäessään kasvaa kituliaasti muodostaen hyvin pieniä pesäkkeitä, joiden havaitseminen vaatii erityistä tarkkaavaisuutta (heteroresistentit MRSA-kannat). 3 Materiaali 3.1 Elatusaine Mueller-Hinton agar Standardin peruselatusaine on Mueller-Hinton agar. Elatusaineen mahdollisimman tasaisen laadun varmistamiseksi tulee käyttää vain sellaisen kuiva-aineen valmistajan tuotetta, joka noudattaa CLSI:n laatukriteerejä [25], joilla tuotteiden ja erien välinen vertailukelpoisuus on varmistettu Elatusaineen rikasteet Kaikki bakteerit eivät kasva Mueller-Hinton-elatusaineella. Tällöin niitä joudutaan käyttämään eri tavoin rikastettuina tai valitsemaan jokin muu, riittävän ravinnekoostumuksen omaava alusta. Esim. streptokokkien kasvun mahdollistamiseksi voidaan elatusaineeseen lisätä 5 % lampaan defibrinoitua [23] tai sitraattiverta [9]. Haemophilus influenzaen herkkyysmääritystä varten Mueller-Hinton agariin lisätään seuraavia aineita: NAD (15 mg/l), naudan hematiini (15 mg/l) ja hiivauute (5 g/l). Saatu elatusaine on nimeltään HTM (Haemophilus Test Medium) [23], jota on myös kaupallisesti saatavana. HTM:a tulee käyttää vain hemofilusten herkkyysmääritykseen. Neisseria gonorrhoeaen herkkyysmääritysalustaksi suositellaan GC-agaria johon on lisätty 1 % supplementtiliuosta. Supplementti valmistetaan liuottamalla 1 litraan vettä seuraavia aineita: L- kystiini 1.1. g, guaniinihydrokloridi 0.03 g, tiamiinihydrokloridi 3 mg, para-aminobentsoaatti 13 mg, B12-vitamiini 0.01 g, kokarboksylaasi 0.1 g, NAD 0.25 g, adeniini 1 g, L-glutamiini 10 g, glukoosi 100 g ja ferrinitraatti 0.02 g. [23] Virheellisten tulosten välttämiseksi rikastettuja elatusaineita tulee käyttää vain niille bakteeriryhmille, mille ne on suunniteltu Maljojen valmistus Elatusaine valmistetaan valmistajan ohjeen mukaan ja yleisiä elatusaineen valmistuskäytäntöjä noudattaen [esim. 22]. Elatusainekerroksen paksuuden valmiilla maljoilla tulee olla 4 ± 1 mm ja ph:n säädetyissä rajoissa. Elatusaineet sisältävät monia aineita hivenpitoisuuksina ja siksi sen säilytyksen ja valmistuksen suhteen on oltava erityisen huolellinen - kuiva-aineen kostuminen tai liiallinen lämpökuorma

11 FiRe STANDARDI v Sivu 7 valmistuksen aikana saattavat johtaa hivenravinteiden tuhoutumiseen ja sen myötä elatusaineen kasvatuskyvyn heikkenemiseen Maljojen säilytys Valmiita maljoja säilytetään kylmässä (2-8 o C) valolta suojattuina ja ne on käytettävä viikon kuluessa tai, jos ne on suojattu kuivumiselta (esim. höyrytiiviisti muovipusseissa), 3 viikon kuluessa Maljojen laaduntarkkailu Jokainen maljaerä tulee tarkistaa ja hyväksyä käyttöön vain siinä tapauksessa, että kaikki alla esitetyt vaatimukset toteutuvat. Tarkistuksesta on hyvän laboratoriokäytännön mukaisesti syytä pitää kirjaa. Maljan ph ph mitataan mieluiten pintaelektrodilla esim. erän ensimmäiseltä ja viimeiseltä maljalta ja sen tulee olla kuiva-aineen valmistajan ilmoittamissa rajoissa. Maljan ulkonäkö. Agarin tulee olla kirkas ja väritön tai hieman kellertävä. Ruskea väri ja saostumat (pääasiassa Ca 2+ -, Mg 2+ - ja Fe 3+ -trifosfaatteja) kertovat liiallisesta kuumentamisesta. Agarin paksuus Paksuus mitataan esim. erän ensimmäiseltä ja viimeiseltä maljalta ja sen tulee olla 3-5 mm. 3.2 Bakteerilääkekiekot Koostumus Kiekot on valmistettu tietyt laatukriteerit täyttävästä suodatinpaperista, johon bakteerilääkeliuos on imeytetty. Kuivatuksen jälkeen levystä on stanssattu halkaisijaltaan n. 6 mm (alunperin 1/4") kokoisia kiekkoja. Myös muusta materiaalista valmistettuja kiekkoja on saatavilla. Oleellista on, että kiekkojen lääkemäärä on standardin mukainen ja kustakin valmistuserästä on olemassa laatusertifikaatti Kiekkojen säilytys Kosteus on bakteerilääkekiekkojen suurin vihollinen. Erityisesti penisilliinit, kefalosporiinit ja klavulaanihappo ovat alttiita sen vaikutukselle. Niinpä kiekkoja käsiteltäessä on huolehdittava siitä, että ne ovat kosteustiiviissä astiassa, jossa lisäksi on vesihöyryä absorboivaa ainetta. Siirrettäessä kiekkoja jääkaapista tai pakastimesta huoneenlämpöön, on kiekkojen ehdottomasti saatava temperoitua ennen astian avaamista. Jos tästä ei huolehdita, kylmän kiekon pinnalle kondensoituu huoneilmasta kosteutta, joka imeytyy kiekkoon ja liuottaa siinä olevan bakteerilääkkeen. Tällöin inaktivoituminen alkaa välittömästi ja kiekko on peruuttamattomasti pilalla. Päivittäistä käyttöä varten on laboratorion syytä tehdä suunnitelma, jonka mukaan aina toimitaan.

12 FiRe STANDARDI v Sivu 8 Harvoin tarvittavat kiekot tulee huomioida erikseen. On parempi säilyttää kiekkoja (kuivausaineella varustetussa suljetussa astiassa) huoneenlämmössä, jos niitä vielä tarvitaan samana päivänä, kuin panna ne muutamaksi tunniksi jääkaappiin. Kun kosteussuojauksesta on huolehdittu, kestävät kiekot hyvin päivittäisestä käytöstä johtuvan lämpötilavaihtelun. Suomalaisen tutkimuksen mukaan [34] beetalaktaameja sisältävät kiekot säilyvät näin säilytettyinä käyttökelpoisina varmuudella kaksi kuukautta ja muita lääkkeitä sisältävät kolme kuukautta. Satunnaisesti käytettävien kiekkojen säilytyksessä tulee olla erityisen huolellinen. Kuivausaineen teho on kiekkojen säilyvyyden kannalta keskeinen tekijä ja siksi siitä tulee varmistua aina ennen kiekkojen viemistä kylmäsäilytykseen. 3.3 Turbiditeettistandardi Standardin käyttö Oikea ymppitiheys saadaan aikaan vain oppimisen kautta. Lähtökohta on kuitenkin tietyn vahvuinen bakteerisuspensio, jonka tiheys määritetään silmämääräisesti. On todettu, että ihmissilmä on herkimmillään opalisoivan suspension (n elävää bakteeria/ml) arvioinnissa. Tällainen suspensio vastaa ns. McFarland turbiditeettistandardin 1:2 laimennosta ( McFarland 0.5") McFarland 0.5 -standardiputkien valmistus ja säilytys Valmista 0.5 % BaSO 4 -suspensio sekoittamalla 1 % BaCl 2 - ja H 2 SO 4 -liuoksia (joita säilytetään tiiviisti suljetuissa astioissa jääkaapissa ad. 1 vuosi) seuraavassa suhteessa: 0.5 ml 1 % (0.048 M) BaCl 2 (1.175 % BaCl 2 2H 2 O) ml 1 % (0.36 N) H 2 SO 4 Jaa suspensio samantyyppisiin putkiin, joihin bakteerisuspensiot tehdään, sulje putket tiiviisti ja säilytä niitä huoneenlämmössä valolta suojattuina. Suspensiot säilyvät vähintään 3 kk. BaSO 4 - kiteet kasvavat vähitellen jolloin suspensio muuttuu rakeiseksi ja siten käyttökelvottomaksi. Standardi tulee tarkistaa kuukausittain mittaamalla sen absorbanssi 1 cm:n kyvetillä. Aallonpituudella 625 nm absorbanssin tulee olla välillä HUOM: McFarland standardeja on saatavana myös kaupallisina versioina, joissa suspension muodostavat latex-partikkelit. Tällainen suspensio on oikein säilytettynä hyvin pysyvä. 3.4 Lämpökaapit Kliinisessä bakteriologiassa yleisesti suositeltava inkubaatiolämpötila on 35 o C, mikä on sopiva myös herkkyysmäärityksiä tehtäessä. Bakteerien lääkeherkkyys muuttuu jyrkästi inkubaatiolämpötilan ylittäessä 38 o C [18]. Tämän vuoksi lämpökaappien lämpötila tulee olla säädettävissä riittävän tarkasti ja sitä on tarkkailtava jatkuvasti minimi-maksimi-lämpötilamittarilla. 4 Suoritus (Työn kulku; perussuoritus ja poikkeukset/täydennykset - liite 1)

13 FiRe STANDARDI v Sivu 9 Herkkyysmääritys tehdään kaikille bakteeriryhmille saman periaatteen mukaan. Tiettyjen bakteerien kohdalla tule kuitenkin huomioida erilaisia erityispiirteitä, joita on kuvattu liitteessä 5. Joskus kiekkoherkkyysmääritys ei yksin ole riittävä resistenssin luotettavaksi toteamiseksi ja tarvitaan täydentäviä menetelmiä. Näitä on kuvattu liitteessä Siirrostus (ymppäys) (1) Poimi viljelysauvalla muutamaa erillistä pesäkettä koskettamalla bakteerimassaa tuoreelta viljelmältä ja suspendoi massa steriiliin 0.9 % keittosuolaan niin, että suspension vahvuus on sama kuin MacFarland 0.5 standardin. Suspension tiheyden määrittäminen edellyttää hyvää valaistusta ja tummaa taustaa. Parhaan tuloksen saa tarkastelemalla standardi- ja bakteerisuspensioita rinnan musta-valkojuovaista pahvia vasten. Valmiin suspension tulee olla tasainen. Pienikokoisten bakteerien, kuten H. influenzaen, P. aeruginosan ja B. fragilis-ryhmän kohdalla suspensiosta tulee helposti liian tiheä ja sen myötä estovyöhykkeen reunat saattavat muodostua diffuuseiksi ks. liite 5. Jos pesäkkeen poimimisessa ja suspendoimisessa on vaikeuksia, saattaa vanutikun käyttö sauvan sijasta antaa paremman tuloksen. (2) Ime suspensiota steriiliin vanutikkuun työntämällä vanu suspensioon. Poista sitten vanusta ylimäärä suspensiota pyörittämällä ja painamalla sitä voimakkaasti putken seinämää vasten. (3) Siirrosta vanutikussa olevalla ympillä huoneenlämpöinen, pintakuiva malja koko pintaalaltaan joko dreijaamalla tai tiheällä sik-sak-liikkeellä. Toista sik-sak-liike kaksi kertaa 60 o kulmassa edelliseen siirrostukseen nähden tasaisen lopputuloksen aikaansaamiseksi. Siirrostuksen tulee tapahtua 15 minuutin kuluessa ympin valmistuksesta. Tavoitteena on jatkuva (confluent), tasainen kasvusto, jossa estorenkaiden reunat ovat ehjät ja mahdollisimman selväpiirteiset. 4.2 Kiekotus Aseta kiekot maljalle painamalla ne kevyesti agarin pintaa vasten hyvän kontaktin varmistamiseksi. HUOM.: Jos kiekko tipahtaa maljalle, joko annostelijasta tai pinsetistä, jää kontakti maljan pintaan huonoksi. Tällöin lääke ei diffundoidu elatusaineeseen ajoissa ja kanta kasvaa kiinni kiekkoon vaikka se olisi lääkkeelle herkkä. Tämä tekninen virhe on yleisin syy väärään R-tulkintaan.

14 FiRe STANDARDI v Sivu 10 Lääke alkaa diffundoitua kiekosta välittömästi sen kosketettua agarin pintaa joten kiekkoa ei saa siirtää. Kiekkojen tulee olla riittävän kaukana toisistaan, jotta estorenkaan halkaisija tai säde on kaikissa tapauksissa mitattavissa. Käytännössä tämä tarkoittaa sitä, että 9 cm:n maljalla kiekkoja voi olla korkeintaan kuusi niin, että maljan keskusta on vapaa. Maljan tulee olla pintakuiva ennen kiekotusta. 4.3 Inkubaatio Aseta maljat välittömästi (15 minuutin kuluessa) 35 o C (± 2 o C) lämpökaappiin kannet alaspäin. Inkubaatioaika on h. On muistettava, että pinossa keskimmäisenä olevat maljat lämpenevät hitaasti [1], joten pinojen ympärille on jätettävä ilmatilaa. Tietyt bakteerit joko vaativat kasvaakseen normaalista ilmasta poikkeavan atmosfäärin (esim. anaerobit, gonokokki, heliko- ja kampylobakteerit) tai kasvavat oleellisesti paremmin hiilidioksidirikkaassa atmosfäärissä (esim. hemofilukset, pneumokokki ja eräät muut streptokokit). Tällaisten bakteerien herkkyysmääritysviljelmät on syytä johdonmukaisesti inkuboida kyseisessä atmosfäärissä. Korkea hiilidioksipitoisuus vaikuttaa merkitsevästi tiettyjen bakteerilääkkeiden aktiivisuuteen, mikä on otettu huomioon standardin SIR-tulkintarajoissa. 4.4 Luku Tarkastele maljaa h ( yli yön ) inkubaation jälkeen. Jos siirros on tasainen kautta maljan ja kasvu on tiheydeltään jatkuvaa confluent (pesäkkeet kiinni toisissaan), on testi onnistunut. Jos pesäkkeet ovat irti toisistaan, on ymppi liian harva ja määritys tulee uusia. Estorenkaan halkaisija (ERH) mitataan työntötulkilla millimetrin tarkkuudella. Estorenkaan reuna on siinä, missa bakteerikasvusto maljan pohjan läpi katsottuna jyrkästi heikkenee. Tämä estorenkaan reunan määritelmä takaa rutiinityöskentelyssä parhaan toistettavuuden [9]. Kun malja on läpinäkymätön, mitataan esto vastaavasti kasvuston puolelta. Useimmissa tapauksissa estorenkaan reuna on jyrkkä ja helppo määrittää. Aina näin ei kuitenkaan ole ja mahdollisimman oikean tuloksen ja hyvän toistettavuuden saamiseksi tulee huomioida seuraavat seikat: Häipyvä kasvu: Tiettyjen bakteerilääkkeiden suhteen esiintyvää, usean millimetrin mittaista häipyvän kasvun aluetta ei tulkita kasvuksi. Portaittainen kasvu: Häipyvä kasvu on tärkeä erottaa portaittaisesta bakteerin kasvutavan muuttumisesta sub-inhibitoristen lääkepitoisuuksien vaikutuksesta. Tällainen ilmenee mm. silloin, kun bakteerin kapselin tuottokyky heikkenee huomattavasti ennen kasvun

15 FiRe STANDARDI v Sivu 11 loppumista ja syntyy kaksi sisäkkäistä estorengasta. Näistä sisempi otetaan huomioon. Heterogeeninen kasvu: Estorenkaan alueella esiintyvät pesäkkeet (heterogeeninen resistenssi) kertovat yleensä todellisesta resistenssistä. Pesäkkeiden sekä koko että määrä voivat vaihdella suuresti muutamasta normaalikokoisesta pesäkkeestä tiheään pienipesäkkeiseen kasvuun. Tällaisessa tapauksessa oikean tuloksen saamiseksi tulee herkkyysmääritys uusia erillispesäkkeistä. Jos ilmiö toistuu, mittaa esto kiekkoa lähinnä olevista erillispesäkkeistä. POIKKEUS: Mesillinaamin suhteen esiintyy erityisesti E. colilla ja Klebsiellalajeilla tavan takaa erillisiä pesäkkeitä, muutamasta pesäkkeestä kymmeniin, vieri-vieressä kasvaviin pesäkkeisiin. Kyseisellä ilmiöllä ei ole kliinistä merkitystä ja aina, kun estorengas on määritettävissä, mitataan esto siitä jättäen erilliset pesäkkeet huomiotta, olipa niitä kuinka paljon tahansa. Epätyypillinen reuna: Enterokokin ja stafylokokkien vankomysiiniresistenssi saattaa ilmetä ainoastaan estorenkaan reunan muuttumisena häipyväksi normaalin korostuneen ilmiasun sijaan. Mittauspisteet estorenkaan kehältä tulee valita mahdollisimman kaukaa naapurikiekoista, jotta lääkkeiden mahdolliset yhteisvaikutukset eivät vääristäisi tulosta. Myöskään aivan maljan reunan läheisyydestä pistettä ei saa valita reunan aiheuttaman konsentraatiovääristymän vuoksi. Jos estorenkaan halkaisijaa edellä mainituista syistä ei voi mitata, mitataan sen säde kiekon keskeltä maljan keskikohdan suuntaan ja kerrotaan saatu tulos kahdella. Koska näin tavan takaa joudutaan tekemään, on kasvuston tasaisuuteen maljan keskialueella kiinnitettävä erityistä huomiota. Liian tiheä ymppi johtaa yleensä estorenkaan reunan hämärtymiseen. Erityisen haitallinen tämä ilmiö on hennosti kasvavien bakteerien, kuten H.influenzaen, ja herkästi autolysoituvan pneumokokin kohdalla. 5 Tulos - Estorenkaan halkaisija (ERH) Kiekkomenetelmän tulos on estorenkaan halkaisija (ERH) millimetreinä. 6 Tulkinta - vastaus Estorenkaan halkaisijan mukaan bakteeri tulkitaan kyseiselle lääkkeelle joko herkäksi (S), resistentiksi (R) tai ilmoitetaan tuloksen olevan epävarma (I). Tulkinta tapahtuu vertaamalla saatua ERH-tulosta raja-arvoihin (Liite 3). Tuloksen tulkinnassa on tarvittaessa huomioitava bakteerin beetalaktamaasiaktiivisuus ja mahdollinen ristiresistenssi muiden lääkkeiden kanssa (Liite 3).

16 FiRe STANDARDI v Sivu 12 7 Laaduntarkkailu 7.1 Kontrollikannat Jokaisen bakteeriryhmä-lääkekiekko-parin toimivuus tulisi kontrolloida tunnetuilla, tarkoitukseen varatuilla bakteerikannoilla. Käytännössä rajoitutaan tavallisimpien bakteeriryhmien edustajien testaamiseen (Liite 4). Kontrollikantojen herkkyysmääritys tulee tehdä samoin kuin potilaskantojen jotta tulokset ovat vertailukelpoisia. Standardin mukaiset (Liite 3) SIR-rajat ovat oikeassa paikassa, jos kontrollikantojen tulokset sijoittuvat annettuihin rajoihin (Liite 4) Kantojen säilytys Kantojen säilytyksessä tulee noudattaa yleisiä referenssikantojen säilytykseen tarkoitettuja ohjeita. Kantojen ominaisuuksien muutosten minimoimiseksi noudata seuraavaa ohjetta: (1) Tee referenssilaboratoriosta saamastasi kannasta yksi puhdasviljelmä, josta säilöt massaa - 70 o C:een esim. 10 % kuorittuun maitoon (Skim milk powder -tuotenimellä elatusainevalmistajilta): perusputki(pari) ja käyttöputkia sopiva määrä. Käyttöputket voi valmistaa suspendoimalla bakteerimassaa esim. 5 ml:aan steriiliä 10 % kuorittua maitoa ja jakamalla suspensio 100µl:n erissä eppendorf-putkiin. Putket voi sitten säilöä esim. kannellisessa muoviastiassa -70 o C:een. Käyttöviljelmän voi sitten uusia kuukausittain (tai tarvittaessa tiheämminkin) suoraan pakasteesta eikä pistoviljelmiä (kohdat 2-4) lainkaan tarvita. (2) Viljele käyttöputkesta (esim. raaputtamalla jäisen putken pintaa maljalle) massaa sopivalle elatusaineelle puhdasviljelmäksi. (3) Tee puhdasviljelmältä pisto-/vinopintaviljelmä kyseiselle bakteerilajille sopivalle herkkyysmäärityselatusaineelle. (4) Säilytä viljelmää jääkaapissa ja uusi se käyttöputkesta kuukausittain. Jos/kun pakastimessa oleva viimeinen käyttöputki kontaminoituu/ehtyy, tee perusputkesta puhdasviljelmän kautta uusia käyttöputkia Kantojen käyttö (1) Viljele kanta putkesta (pakaste-, pisto- tai vinopinta-) käyttöviljelmäksi sopivalle elatusainemaljalle. Luonnollisen (bakteerilääkkeille herkän) kannan maljaviljelmää voi paseerata useita kertoja

17 FiRe STANDARDI v Sivu 13 sen herkkyysominaisuuksien muuttumatta. Sensijaan hankittu resistenssi saattaa hävitä paseerauksen aikana. Jotta käyttöviljelmä olisi mahdollisimman homogeeninen, tee nuorennus aina yhdestä pesäkkeestä. (2) Tee kannalle herkkyysmääritys rutiinimenetelmällä. (3) Mittaa estorenkaiden halkaisijat ja kirjaa ne niin, että niitä voidaan analysoida Testaaminen Menetelmän ollessa uusi, testataan se kontrollikannoilla päivittäin kuukauden ajan. Saatuja ERHtuloksia verrataan viitearvoihin (Liite 4). On tärkeää, että alkuvaiheessa kaikki herkkyysmäärityksiä tekevät henkilöt osallistuvat menetelmän testaamiseen. Jos tulokset sijoittuvat viitevälille, voidaan kontrollointia harventaa tapahtuvaksi kerran viikossa. Jos tulokset tai osa niistä sijoittuu viitevälin ulkopuolelle, on menetelmää tarkasteltava virheiden löytämiseksi ja vian löydyttyä kuukauden jakso uusittava. Tavallisimpia virheitä ovat: (1) kirjausvirhe, (2) mittausvirhe (estorenkaan reuna vaikea määritellä, mittaussuunta toista kiekkoa/maljan reunaa kohti) (3) kontaminoitunut, vaihtunut tai muuttunut viljelmä, (4) liian tiheä tai harva ymppi (turbiditeettistandardin kunto/käyttö!), (5) elatusaineen laadunvaihtelu (vanhenemispäivämäärä, säilytys!) ja (6) kiekon pilaantuminen (kosteus!). Virhelähteen löytäminen edellyttää hyvää dokumentointia kaikissa työn vaiheissa. Uusi malja-/kiekkoerä on aina testattava ennen käyttöönottoa. 7.2 Löydösjakauman analysointi ERH-SIR-rajojen paikkansapitävyys on tarkistettava vähintään kerran vuodessa laboratorioja bakteerilajikohtaisesti. Tämä tapahtuu helpoiten tallentamalla potilaskantojen ERH-tulokset atk:lle, jolloin bakteerilaji-lääkekohtaista ERH-jakaumaa voidaan analysoida ja tulkinta tehdä automaattisesti. Bakteerin normaalipopulaation pitäisi sijaita suurin piirtein samalla kohdalla kuin vastaavan, herkkyysmäärityskontrollina käytetyn herkän ATCC-kannan:

18 FiRe STANDARDI v Sivu 14 E. coli ATCC (määrityskertojen määrä = 137) E. coli, potilaskannat (kantojen määrä = )

19 FiRe STANDARDI v Sivu 15 Viitteet 1 Acar JF, Goldstein FW. Disk susceptibility tests. In: Lorian V ed. Antibiotics in laboratory medicine. 3rd ed. Baltimore: Williams & Wilkins Co., 1991: Alustavat tulokset kiekkomenetelmän toimivuudesta; FiRe-kokous Barry AL, Fuchs PC, Allen SD, Jorgensen JH, Tenover FC, Murray PR, Hardy DJ, Baker CN. Tentative criteria for confirming the in vitro susceptibilities of Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae to two fluoroquinolones (Sparfloxacin and Levofloxacin), including quality control parameters. J Clin Microbiol 1993;31: Barry AL. Procedures and theoretical considerations for testing antimicrobial agents in agar media. In: Lorian V ed. Antibiotics in laboratory medicine. 3rd ed. Baltimore: Williams & Wilkins Co., 1991: Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol 1966;45: Bondi A, Spaulding EH, Smith DE, Dietz CC. A routine method for the rapid determination of susceptibility to penicillin and other antibiotics. Am J Med Sci 1947;213: Cooper KE, Woodman D. The diffusion of anticeptics trogh agar gels, with special reference to the agar cup assay method of estimating the activity of penicillin. J Pathol Bacteriol 1946;58: Drugeon HB, Juvin ME, Caillon J, Courtieu AL. Assessment of formulas for calculating critical concentration by the agar diffusion method. Antimicrob Agents Chemother 1987;31: Ericsson HM, Sherris JC. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol Microbiol Scand 1971;Sect B, Suppl 217: Fleming A. Antibacterial action of cultures of Penicillium with special reference to their use in isolation of B. influenzae. Br J Exp Pathol 1929;10: Gayral JP, Albertini MT, Gallice E, Marcel JP, Carret G, Flandrois JP. Rapid ATB: A new system for rapid susceptibility testing of bacteria. Recent Advances in Chemotherapy 1985: poistettu 13 Kjällander J, Myrbäck KE. A simple test for penicillinase production. Acta Pathol Microbiol Scand 1964;61:494.

20 FiRe STANDARDI v Sivu Kraseman C, Hildenbrand G. Interpretation of agar diffusion tests. J Antimicrob Chemother 1980;6: Kronvall G, Ringertz S, Karlsson I, Göransson E, Dornbush K. Laboratory- and speciesspecific interpretative breakpoints for disk diffusion tests of chloramphenicol susceptibility of Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother 1988;32: Kronvall G. Analysis of a single reference strain for determination of gentamicin reggression line constants and inhibition zone diameter breakpoints in quality control of disk diffusion antibiotic susceptibility testing. J Clin Microbiol 1992;16: Mackenzie AMR, Richardson H, Lannigan R, Wood D. Evidence that the National Committee for Clinical Laboratory Standards disk method is less sensitive than the screen plate for detection of low-expression-class methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1995;33: Mackowiak PA, Marling-Cason M, Cohen RL. Effects of temperature on antimicrobial susceptibility of bacteria. J Infect Dis 1982;145: Manninen R, Eerola E, Huovinen P. Disk diffusion susceptibility tests: need for laboratory-specific breakpoints. Scand J Infect Dis 1995;27: Mendelman PM, Wiley EA, Stull TL, Clausen C, Chaffin DO, Önay O. Problems with current recommendations for susceptibility testing of Haemophilus influenzae. Antimicrob Agents Chemother 1990;34: Morley DC. A simple method of testing the sensitivity of wound bacteria to penicillin and sulphathiazole by use of impregnated blotting paper discs. J Pathol Bacteriol 1945;57: Nash P, Krenz MM. Culture media. Kirjassa: Balows A, Hausler WJ, Herrmann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ (toim.) Manual of Clinical Microbiology, 5. painos. American Society for Microbiology, Washington D.C., USA. 1991: Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests - Approved Standard, CLSI Document M2-A10, Clinical and Laboratory Standards Institute., Wayne, PA, USA Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Nineteenth International Supplement. CLSI Document M100-S19, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protocols for Evaluating Dehydrated Mueller-Hinton Agar; Approved Standard. NCCLS document M6-A, 1996; NCCLS, Wayne, PA., USA.

21 FiRe STANDARDI v Sivu Nissinen AJ, Seppälä H, Huovinen P and the Finnish Study Group for Antimicrobial Resistance (FiRe). Detecting erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes: reliability of the disk diffusion method and the breakpoint susceptibility testing method. Scand J Infect Dis 1995;27: Oxoid. Iso-Sensitest Agar. Culture Media, p , kirjassa: Oxoid The Manual. May 90. Unipath Ltd, Basingstoke, England. 28 Petersson AC, Kronvall G. Determination of interpretative breakpoints for ceftazidime disc-diffusion susceptibility testing using single-strain reggression analysis. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 1985;Sect B 93: Pollock HM, Barry AL,Gvan TL, Fuchs PC, Hansen S, Thornsberry CL, Frankel H, Fordythe SB. Selection of a reference lot of Mueller-Hinton agar. J Clin Microbiol 1986;24: Ringertz S, Kronvall G. On the theory of the disk diffusion test. Evidence for a nonlinear relationship between critical concentration and MIC, and its practical implications for susceptibility testing of Haemophilus influenzae. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 1988;96: Soussy CJ, Cluzel L, Courvalin P, and the Comité de l Antibiogramme de la Société Françaice de Microbiologie. Definition and determination of in vitro antibiotic susceptibility breakpoints for bacteria in France. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13: poistettu 33 Andrews JM for the BSAC Working Party of Susceptibility Tesiting. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 4). J Antimicrob Chemother 2005;56: Meurman O & Nissinen A. Stability of antimicrobial susceptibility discs stored at normal laboratory conditions. Käsikirjoitus.