Biotuotteiden ja biotekniikan laitos. CHEM-C2310 Bioprosessitekniikka. Laboratoriotyöt

Transkriptio

1 Biotuotteiden ja biotekniikan laitos CHEM-C210 Bioprosessitekniikka Laboratoriotyöt Kevät 2018

2 SISÄLLYSLUETTELO TURVALLISUUSMÄÄRÄYKSIÄ... 1 KURSSIN OHJAAJAT JA VASTUUHENKILÖT... 2 YLEISTÄ KURSSISTA... 2 TÖIDEN SISÄLTÖ... 2 SUORITTAMINEN... 2 ESITIEDOT... 2 AIKATAULU... SUORITETTAVAT TYÖT... ARVOSTELU... TYÖOHJEET... 4 ESCHERICHIA COLI BAKTEERIN RAVISTELUKASVATUS... 4 GLUKOOSIN ISOMEROINTI GLUKOOSI-ISOMERAASILLA... 6 LIITTEET Liite 1. Työvihko-ohje Liite 2. Työselostusohje Liite. Yleisiä kommentteja selostustöistä

3 Turvallisuusmääräyksiä Hätänumero on 112. Siivoa aina omat jälkesi, käyttämäsi välineet ja työpöytä. Laboratoriossa tulee käyttää kiinni napitettua työtakkia ja suojalaseja. Vaarallisia kemikaaleja (esim. happoja ja emäksiä) käsitellessäsi käytä asianmukaisia suojautumisvälineitä. Ulkovaatteita ei saa tuoda laboratorioon. Takit jätetään kurssin ohjaajien työhuoneisiin tai laboratorion läheisyydessä oleviin naulakoihin. Laboratoriossa ei syödä eikä juoda. Bioreaktorihuone on pidettävä siistinä ja kaikki tavarat niille varatuilla paikoilla. Pöytäpinnat pidetään aseptisina pyyhkimällä ne 70 %:lla etanolilla. Etanolia on oranssikorkkisissa ruiskupulloissa laboratoriossa. Rikkoutunutta lasia varten on jätesäiliöt laboratorion käytävällä. Autoklaaveja, sentrifugeja tai muita laitteita ei saa käyttää ilman opastusta. Kaikissa epäselvissä tilanteissa pyydä ohjaaja paikalle.

4 Kurssin ohjaajat ja vastuuhenkilöt Kurssin vastuuopettaja Avustavat tutkijat Tero Eerikäinen (D416d) puh , Laura Lemetti Robert Pylkkänen Yleistä kurssista Töiden sisältö Töiden tavoitteena on oppia eräitä mikrobikasvatuksen sekä entsyymireaktion perusteita kokeellisen työskentelyn avulla. Laboratoriotyö koostuu kahdesta eri työstä työvaiheesta: 1) Escherichia coli bakteerin ravistelukasvatus sekä 2) glukoosin isomerointi glukoosi-isomeraasilla. Tavoitteena on myös, että opiskelija oppii kurssilla yhdistämään kokeellisesti saatuihin tuloksiin ja havaittuihin ilmiöihin kurssilla opiskelemansa teorian. Suorittaminen Kurssin suorittamiseen kuuluu laboratoriotöihin valmistautuminen työohjeeseen tutustumalla, osallistuminen oman ryhmän töihin, tulosten kirjaaminen töiden aikana ja jakaminen muiden ryhmäläisten kanssa sekä työtentti. Esitiedot CHEM-C200 ja CHEM-A1010 Turvallinen työskentely laboratoriossa.

5 Aikataulu Laboratoriotyöt sijoittuvat ajanjaksolle Osallistuminen edellyttää kirjatumista omaan ryhmään WebOodin kautta ennen työn alkua. Suoritettavat työt Työt koostuvat kahdesta laboratoriotyöstä, jotka suoritetaan 16 (2x8) hengen ryhmissä. Ryhmät muodostetaan ennen töiden alkamista. Ennen laboratoriotyöpäivää tulee töihin tutustua huolellisesti. Laboratoriossa tehtävistä töistä tulee tehdä omakohtaisia muistiinpanoja joiden perusteella tuloksista voi laskea tarvittavia tulosmuuttujien arvoja. Arvostelu Itse työstä saa suorituspisteitä ja työtentistä/--tehtävistä lisäpisteitä.

6 Työohjeet Escherichia coli bakteerin ravistelukasvatus 1. Työn tavoitteet Perehdyttää ravistelukasvatuksen eri vaiheisiin (kasvatusalusta, sterilointi, siirrostus, kasvun seuranta, kasvatuksen lopetus) Antaa konkreettinen esimerkki bakteerin kasvunopeudesta ja sameusmittauksen käytöstä kasvun seurannassa Oppia sameusmittauksen kalibrointi solumassan pitoisuuden määrittämiseksi Oppia tulkitsemaan mittausdataa erilaisissa kasvatusolosuhteissa Oppia kommentoimaan kokeellista dataa 2. Materiaalit Mikrobi: Escherichia coli K-12 kanta valmiina siirrosteena kasvatettuna ravistelukasvatuksena yli yön Luria Broth (LB) kasvatusalustalla Siirrostusvalmiit Klett-pullot, joissa 7 o C kasvatusalustaa 50 ml 250 ml:n erloissa Ravistelija säädettynä 7 o C:een Steriilejä 10 ml:n pipettejä sekä moottoripumpetti aseptista siirrostamista ja laimennossarjan tekoa varten Klett-Summerson sameusmittari, jossa suodatin joka päästää erityisesti valon aallonpituuksia noin 540 nm lävitseen, tai työhön soveltuva spektrofotometri esim. Spectroquant Pharo 00 (mittaus 600 nm) Koeputkia siirrosteesta tehtävää laimennossarjaa varten Koeputkisekoittajia laimennosten sekoittamista varten Sentrifuugi siirrosteen solumassapitoisuuden määrittämiseen (solujen erottamiseen siirrosteesta ja niiden pesuun) Kuivapainoastia/Al-foliota pestyn solumassan kuivaamiseen. Kasvatusalustat Eri pareilla vaihdellen: Parit (1&2): LB Parit (&4): LB+1 g/l glukoosi Parit (5&6): LB+5 g/l glukoosi Parit (7&8): LB+10 g/l glukoosi 4. Siirrostus Pipetoidaan aseptisesti 2 ml siirrostetta per pullo 5. Kasvatus Lämpötila: 7 o C; Yksittäiset työparit tekevät rinnakkaiset kasvatukset Ravistelijan kierrosnopeus: 200 rpm

7 6. Kasvatuksen seuranta Mitataan ilman näytteenottoa kasvatusliemen sameus 2 kertaa tunnissa, myös välittömästi siirrostuksen jälkeen, siirrostamatonta kasvatusalustaa vasten (nollaus tällä); glukoosia sisältävät alustat: mitataan optinen tiheys myös ennen siirrostusta nollausalustaa vastaan (tämä arvo vähennetään kasvatuksen sameusarvoista) Kasvatuksen loputtua mitataan kasvatusliemen ph 7. Sameusmittauksen kalibrointi Siirrosteesta ylijääneestä kasvustosta sentrifugoidaan taaratuissa eppendorfputkissa 4 x 1,5 ml kasvustoa rpm 1 min; poistetaan supernatantti ja putken pohjalla olevaan solunappiin lisätään tislattua vettä 1,5 ml, sekoitetaan hyvin koeputkisekoittajalla ja fuugataan solut uudelleen pohjaan Lopuksi kuivataan 80 o C:ssa yli yön tästä saadaan punnitsemalla solumassan pitoisuus cdw (cell dry weight) siirrosteessa (g/l) Ylijääneestä kasvustosta tehdään myös laimennussarja 1:10 1:6 1:4 1:2 ja mitataan näistä sameus (kukin pari pipetoi itselleen ensin 5 ml siirrostetta): laimennos siirrostetta (ml) tisl.vettä (ml) 1: :4 1 1:6 0,75,75 1:10 0,5 4,5 1:20 0,25 4,75 8. Tehtävien suoritukseen tarvitaan tietoja sameus kasvatusajan funktiona sameusmittauksen kalibrointisuora/käyrä laskennalliset kuiva-ainepitoisuudet kasvatuksessa vertailu eri kasvatusalustojen loppu-ph-arvoista kommentit työn onnistumisesta

8 Glukoosin isomerointi glukoosi-isomeraasilla 1. Työn tavoitteet Perehdyttää koejärjestelyihin entsyymiapplikaatioiden tutkimisessa Saada konkreettinen käsitys entsyymikinetiikasta ja eräistä entsyymin toimintaan vaikuttavista tekijöistä Osoittaa esimerkit 1) elintarviketeollisuuden käyttämän entsyymin toiminnasta ja 2) diagnostiikkamittarin soveltuvuudesta ja mittauksissa Oppia tulkitsemaan mittausdataa erilaisissa koeolosuhteissa 2. Materiaalit Entsyymi: Immobilisoitu glukoosi-isomeraasi (GI), omassa laboratoriossa valmistettu erä (vastaavaa kuin Novozymesin kauppanimellä Sweetzyme IT, jonka alkuperäinen aktiivisuus > 50 U/g; T opt: o C, ph opt 7,5-7,8 ; entsyymi ollut meillä varastossa joitakin vuosia). Valmiit reaktioliuokset fruktoosista, glukoosista, näiden seoksista ksyloosin kanssa 2,5 mm Tris-HCl puskurissa (ph 7,5), jossa 12 g/l MgSO 4 7H 2O; liuokset on temperoitu 55 o C:een Tris-HCl puskuri 2,5 mm, ph 7,5, 12 g/l MgSO 4 7H 2O Ravistelija säädettynä 55 o C:een, ravistelu 10 rpm Accu-Chek veren glukoosimittari määritysliuskoineen, mittausalue 0,5 mmol/l (vastaa veressä 0,09 6 g/l, tämän työn näytematriisiin kalibrointi erikseen) Pasteur pipettejä ja pipetin kärkiä näytteen asettamiseen glukoosimittarin liuskaan Pipettejä ja koeputkia näytteen laimentamista varten. Reaktio-olosuhteet Kussakin ryhmässä pareilla seuraavat lähtöliuokset: i. parit 1&2: glukoosi 0 g/l ii. parit &4: glukoosi 0 g/l + 5 g/l ksyloosia iii. parit 5&6: fruktoosi 0 g/l iv. parit 7&8: fruktoosi 0 g/l + 5 g/l ksyloosia 4. Työn toteutus Reaktioseoksesta otetaan nollanäyte 0,2 ml ennen entsyymin lisäämistä; glukoosiliuokset laimennetaan Milli-Q vedellä 1:10 (0,2 ml + 1,8 ml), fruktoosiliuoksia ei laimenneta; glukoosipitoisuus määritetään Accu-Chek-laitteella Lisätään entsyymi n. 0,67 g (eli pipetoidaan 2 ml sekoitettua kidesuspensiota), jolloin isomerointireaktio alkaa ja aloitetaan ajanotto

9 Isomeroinnin aikana otetaan näytteitä noin 20 min välein Pasteur pipetillä (fruktoosiliuokset) tai pipetillä (0,2 ml glukoosiliuokset) varoen entsyymin joutumista näytteeseen ja mahdollisimman vähän (Accu- Chek vaatii vain pisaran näytettä, kosketa pisaralla mittausliuskan aivan kärkeä, tulos vaihtelee voimakkaasti pisaran asettamisen vaihdellessa); glukoosiliuos laimennetaan alusta pitäen 1:10 Milli-Q vedellä (pipetillä näyte 0,2 ml + 1,8 ml vettä); fruktoosiliuosta laimennetaan vasta kun on odotettavissa, että Accu-Chek lukema menee yli mittausalueen (lukema HI), jolloin näytekin kannattaa ottaa tarkasti pipetillä (0,2 ml) Parien pitää aloittaa reaktio ja ottaa näytteet samaan aikaan ja mahdollisimman nopeasti, jotta pullot ovat mahdollisimman vähän aikaa ilman sekoitusta Fruktoosilla aloittavat parit (parit ) tekevät Accu-chek mittaukselle kalibroinnin: tehdään glukoosiliuoksesta laimennossarja veteen: 0,5 1 2 g/l ja määritetään pitoisuus Accu-Chekillä On tärkeää, että kukin pari on koko ajan selvillä näytteenottoajankohdasta (= reaktioaika) Näytteenottoa jatketaan n. klo 15:0 asti, puoli tuntia on varattu pasteurpipettien ja koeputkien pesuun ja paikan siivoukseen 5. Laskentaa varten Entsyymin aktiivisuudella tarkoitetaan substraatin kulumisnopeutta tai tuotteen muodostumisnopeutta (ainemäärän muutos aikaa kohti). Esimerkiksi glukoosin kulumisnopeus perustuen alkunopeuteen saadaan kahden ensimmäisen pisteen kulmakertoimesta. Samalla tavalla, mutta kulmakertoimen pisteitä vaihtelemalla saadaan laskettua kulumisnopeudet jokaisen pisteen välille ja kumulatiivisesti, niin kuin työohjeessa on neuvottu. Excelissä on SLOPE-funktio, jolla kulmakertoimia voi laskea helposti. Yleensä aktiivisuuden yksikkönä on ns. unit (U = μmol/min), joka jaetaan joko käytetyn entsyymin tilavuudella (ml) tai määrällä (mg), jolloin saadaan volumetrinen (U/mL) tai spesifinen aktiivisuus (U/mg). Tätä varten tulokset pitää muuttaa mikromooleiksi (1 mol = 10 6 μmol) konsentraation ja ainemäärän yhtälöillä (c=n/v, n=m/m). Esimerkiksi jos kulumisnopeus on 1 g/l glukoosia (M = g/mol) minuutissa: c/t=n/tv=m/tmv=1 g/1 min g/moll= mol/l min=5551 μmol/l min=5551 μm/min Jotta tästä saadaan aktiivisuus yksikössä U/mL, on kulumisnopeus kerrottava reaktiotilavuudella (litroina), ja jaettava käytettävän entsyymin määrällä (millilitroina). Esimerkki: aktiivisuus=c V reaktiot /V entsyymi=5551 μmol/l min 0.1 L/2 ml= μmol/(ml min)= U/mL Jos tiedetään entsyymin pitoisuus (mg/ml), voidaan tästä laskea myös spesifinen aktiivisuus U/mg.

10 Termodynaaminen tasapainotila on helpompi. Sen voi määrittää, jos reaktiokäyrä näyttää tasaantuvan loppua kohti, kuten yllä olevassa kuvassa. Tasaantuminen kertoo, että reaktion lähtöaineet ja tuotteet lähestyvät tasapainopitoisuuksia, jolloin niiden konsentraatiot pysyvät vakiona. 6. Tehtävien suoritusta varten Verrataan mittaustuloksia kalibrointisuoran tuloksiin ja muunnetaan mittausarvot todellisiksi glukoosipitoisuuksiksi Esitetään glukoosipitoisuus ajan funktiona (koko ryhmän tulokset) Lasketaan entsyymin aktiivisuus usealla eri tavalla: i. Perustuen reaktion alkunopeuteen (glukoosin kulumisen tai muodostumisen nopeus interpoloituna nollahetkeen (kulmakerroin hetkellä t=0) ii. Perustuen kunkin perättäisen mittaushetken arvoihin iii. Perustuen kumulatiiviseen arvoon (esim. väli 0 0, h; 0 0,67 h jne.) Arvioidaan tulosten perusteella (jos mahdollista), mikä on isomerointireaktion termodynaaminen tasapainotila (glukoosin loppupitoisuus tasapainossa % alkuperäisestä glukoosi- tai fruktoosipitoisuudesta) Arvioidaan ksyloosin vaikutusta isomeroinnissa Kommentoidaan tuloksia ja työn tekemistä