KUULUTUSJULKAISU [B] (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 7 3 8 8 5 C 7 (51) Kv.11(. 4/IntC1. 4 A 61 K 39/245 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyreisen (21) Patenttihakemus Patentansökning 833768 (22) Hakemispäivä Ansökningsdag 17.10.83 (23) Alkupäivä Giltighetsdag 14.02.83 (41) Tullut julkiseksi Blivit offentlig 17.10.83 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 31.08.87 (86) Kv. hakemus Int. ansökan PCT/US83/00182 (32) (33) (31) Pyydetty etuoikeus Begärd prioritet 18.02.82 04.02.83 USA(US) 350021, 463141 (71) University Patents, Inc., 537 Newtown Avenue, Norwalk, Connecticut, USA(US) (72) Gary H. Cohen, Haverton, Pennsylvania, Roselyn J. Eisenberg, Haddonfield, New Jersey, USA(US) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä Herpes simplex -virus tyyppi 1:n vaippaglykoproteiini gd-1:n ja Herpes simplex -virus tyyppi 2:n vaippaglykoproteiini gd-2:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi nestemäisestä näytteestä - Förfarande för isolering av ett motståndskraftförmedlande preparat av Herpes simplex -virus typ 1:s höljeglykoprotein gd-1 och Herpes simplex -virus typ 2:s höljeglykoprotein gd-2 ur ett vätskeprov (57) Tiivistelmä Keksintö koskee Herpes simplex-virusten vaippaglykoproteiineista gd-1 ja gd-2 muodostuvia immunologisesti aktiivisia valmisteita. Mieluiten monoklonaalisen antigd-vasta-aine-immunoadsorbentin avulla puhdistetut gd- 1- ja gd-2-valmisteet lisätään rokotteisiin, jotka synnyttävät immuunivasteen suojaamaan Herpes simplexin aiheuttamia sairauksia vastaan. Keksintö koskee myös synteettisten polypeptidien valmistusta ja käyttöä rokotusmenettelyissä mainittujen polypeptidien aminohapposekvenssien ollessa 1) olennaisesti yhteisiä sekä gd-1:11e etta gd-2:11e;2) luonteeltaan kumulatiivisesti hydrofiilisiä ja 3) immuunaktiokykyisiä tyypille yhteisen luokitusryhmään VII kuuluvan monoklonaalisen anti-gd-vastaaineen kanssa.
(57) Sammandrag Uppfinningen avser immunologiskt aktiva preparat utgörade av ytglykoproteinerna gd-1 och gd-2 av Herpes simplexvirus. De företrädesvis genom användning av en monoklonal anti-gd-antikropp-immunoadsorbent renade gd-1- och cd-2- preparaten införlivas med vacciner, vilka är användbara för alstring av immunsvar som skydd mot sjukdomstillstånd, vilka förorsakats av Herpes simplex. Uppfinningen hänför sig även till framställning och användning av syntetiska polypeptider i vaccinationsprocedurer, vilka polypeptider omfattar aminosyrasekvenser, vilka är 1) väsentligen gemensamma för både gd-1 och gd-2; 2) kumulativt hydrofila till naturen; och 3) specifikt immunoreaktiva med en för typ enlig monoklonal anti-gd-antikropp tillhörande klassificeringsgruppen VII.
1 5 Menetelmä Herpes simplex -virus tyyppi 1:n vaippaglykoproteiini gd-l:n ja Herpes simplex -virus tyyppi 2:n vaippaglykoproteiini gd-2:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi nestemäisestä näytteestä Keksintö koskee menetelmää Herpes simplex -virus tyyppi 1:n vaippaglykoproteiini gd-1:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristämiseksi sitä sisältävästä nestemäisestä näytteestä,sekä menetelmää Herpes simplex -virus tyyppi 2:n vaippaglyko- 10 proteiini gd-2:n vastustuskykyä aiheuttavan valmisteen eristä- miseksi sitä sisältävästä nestemäisestä näytteestä. Keksinnön mukaisesti valmistetut uudet HSV:n vaippa- glykoproteiini gd:n valmisteet aiheuttavat käytettyinä rokotekoostumusten aktiivisena immunogeeninä vastaanottajassa mer- 15 kitsevästi paremman suojan HSV-infektiota vastaan kuin tekniikan tasolla tähän saakka on ollut mandollista. Julkaisussa J. Infectious Diseases, 136 (1977) s. 706-711 todetaan, että Herpes simplex -viruksen aiheuttama kliininen sairaus ja erityisesti uusiutuvien infektioiden aiheutta- 20 ma työkyvyttömyys muodostavat merkittävän terveysongelman, jota ei nykyisellään pystytä ratkaisemaan. On päätelty, että immuunisysteemin muuttaminen rokottamalla voisi mandollisesti estää infektion tai lievittää sitä luonnollisen viruksen infektoidessa myöhemmin. Koska rokottaminen on osoittautunut 25 tehokkaaksi monien virusperäisten ihmissairauksien torjunnas- sa on loogista yrittää kehittää rokote HSV:tä vastaan. Huomattiin, että tämän tehtävän ratkaisemiseksi tyydyttävällä tavalla on tutkittava lukuisia seikkoja, jotka liittyvät nimenomaan viruksiin. Näitä ovat sairauksen luonnollinen kulku, 30 epidemiologia ja vaikeusaste, immuunivasteet, joiden tiede- tään liittyvän virusinfektioon tai testirokotteilla aiheutettuun immunisaatioon sekä rokotteen käytön mandolliset riskit. HSV:n, joka on suuri vaipallinen DNA-pitoinen virus, on havaittu aiheuttavan erilaisia ensi-infektioon liittyviä 35 kliinisiä tiloja, jotka lähinnä kohdistuvat ihoon, limakal- voihin, sarveiskalvoon ja hermostoon. Julkaisun mukaan voi-
2 daan erottaa kaksi HSV-tyyppiä eli tyyppi 1 (HSV-1) ja tyyppi 2 (HSV-2) niiden antigeenisten, biologisten ja biokemiallisten tunnusarvojen perusteella. Koska HSV-1 ja HSV-2 eroavat antigeenisesti toisistaan ja jompikumpi tyyppi voi ensi- 5 infektoida yksilön, katsotaan kohtuullisen vaatimuksen olevan, että jokaiseen rokotteiden kehitysohjelmaan sisällytetään "tyyppispesifisiä" HSV-rokotteita. HSV:n on havaittu aiheuttavan sekä "ensi-infektioita" etttä "uusiutuvia infektioita". Koska ensi-infektioiden ja 10 uusiutuvien infektioiden patogeneesi on selvästi erilainen, perusteita rokotteen kehittämiseksi näitä kahta tapausta varten on käsitelty erikseen. HSV:n aiheuttaman luonnollisen infektion on havaittu heittävän peliin monia immuunipuolustussysteemiin liittyviä 15 spesifisiä ja ei-spesifisiä komponentteja. On havaittu, että vasta-aineet kehittyvät pian ensi-infektion jälkeen, saavuttavat maksimitasot kolmen tai neljän viikon kuluessa ja ovat todettavissa monta vuotta myöhemmin. HSV-infektion aiheuttamat spluimmuunivasteet voitiin myös todeta in vivo viivästys- 20 tyyppisen hypersensitiivisen vasteen avulla ruiskutettaessa virusantigeenejä ihonsisäisesti ja in vitro monien soluimmuniteettiin liittyvien korreloitumisien avulla. Raportoidaan vaikutuksia, jotka ilmenivät HSV:n aiheuttamana immuunivasteena, kun laboratorioeläimiä ja ihmisiä oli tämän jälkeen infek- 25 toitu. Havaittiin esimerkiksi, että hiiret jotka oli immunisoitu joko elävällä tai tapetulla HSV:llä, olivat joskus resistenttejä myöhemmällä HSV-letaalitartunnalle eroten täten immunisoimattomista hiiristä. Ihmisten suhteen havaittiin, että yksilöissä, joissa entuudestaan oli HSV-1-vasta-aineita, 30 HSV-2:n aiheuttama ensi-infektio oli lievempi. Tämän havainnon ja niiden tietojen perusteella, jotka saatiin tutkittaessa HSV-sairautta eläimissä, voitiin olettaa, että HSV:n synnyttämä immuunivaste voisi vaikuttaa edullisesti myöhempiin HSV-infektioihin ja, mikäli HSV-rokote pystyisi synnyttämään 35 samanlaisen immuunivasteen, tämä voisi parantaa HSV-ensiinfektion aiheuttamia kliinisiä manifestaatioita.
3 Havaittiin myös, että Herpes simplex -virukset pysyvät tunnusomaisen sitkeästi isännässä aiheuttaen uusiutuvia infektioita. Tähän uusiutumiseen liittyvää työkyvyttömyyttä kuvataan merkittäväksi terveysongelmaksi. Havaittiin, että 5 uusiutuvat herpestautitilat manifestoituvat useimmin suun ja kasvojen alueella ja sukupuolielinten alueella ja uusiutuva herpeskeratiitti karakterisoidaan tärkeimmäksi sokeuden aiheuttajaksi Yhdysvalloissa. Todetaan, että hepressukupuolielininfektiota, joihin liittyy huomattava uusiutu- 10 misvaara, havaitaan muita useammin. Kuolleisuus näissä infektioissa on merkittävän suuri. Sairauden uusiutumisen aiheuttavan viruksen alkuperä todetaan ensiarvoisen tärkeäksi HSV-rokotteen kehittämisperustelussa. Lukuisten kliinisten havaintojen perusteella 15 voitiin päätellä, että virus piilee hermokudoksessa. HSV-l:n eristämistä ihmisen kolmihaaraisista hermosolmuista ja HSV-2:n eristämistä ristiluuhermosolmuista samoin kuin eläinmalleilla saatuja tuloksia pidetään tärkeimpinä askelina edelleenkehittelyssä. Pohditaan laajasti latenttien 20 infektioiden kliinisiä tutkimuksia ja yleispäätelmänä tästä pohdinnasta on, että mandollisuus kehittää rokote, joka suojaisi sekä ensi-infektiolta että uusiutuvalta infektiolta, on varsin vähäinen. Luetellaan HSV-rokote-ehdokkaita: elävä, heikennetty 25 virus, inaktivoitu kokovirus ja inaktivoidut "alayksikkö"- viruskomponentit. Havaitaan, että elävään virukseen pohjautuvat rokotteet ovat usein suositumpia kuin inaktivoituun virukseen pohjautuvat rokotteet, koska elävien rokotteiden synnyttämät immuunivasteet tuntuvat olevan suurempia ja 30 pitkäkestoisempia ja koska elävien rokotteiden vaatima ymppi on pienempi, virushan pystyy lisääntymään isännässä. Pannaan merkille elävään virukseen pohjautuvien rokotteiden haittapuolet eli valmistusvaikeudet ja asianmukaisen heikennysasteen ylläpitäminen. Samoin pannaan merkille tuolloin 35 alustavat tutkimukset, jotka osoittivat ainakin HSV-2:n aiheuttavan kasvaimia ihmisessä. Koska kävi ilmi, että so-
4 lujen in vitro -transformaatioissa ei tarvita infektoivaa virusta, tämän riskin kannalta erittäin epäedullisen päättelyn katsottiin pätevän myös inaktivoituihin, virusnukleiinihappoa sisältäviin rokotteisiin. Käsitellään erilaisia elä- 5 vään ja heikennettyyn virukseen pohjautuvia rokotevalmisteita ja loppupäätelmänä on, että mitkään niillä saavutetut tulokset eivät ole riittävän hyviä kasvainriskin ottamiseksi. Niinpä ehdotetaan kasvainriskin vähentämiseksi inaktivoidun rokotteen kehittämistä, joka sisältää alayksikkö- 10 viruskomponenetteja eikä lainkaan tai vähän virus-dna:ta. Mutta havaitaan, että alayksikkökomponenttirokotteet edellyttävät hankalia puhdistusprosesseja ja että niiden haittapuolena tavallisesti on vähäinen immunogeenisuus. Epäillään myös, että rokotteen myöhemmin kehittämä immuniteetti 15 ei vain ole tehoton suojaamaan luonnonviruksen aiheuttamaa infektiota vastaan, vaan inaktivoidun tuhkarokkorokotteen tapauksessa voi kuvitella sen aiheuttavan paljon vakamman kliinisen sairauden altistettaessa luonnonvirukselle. Vuoden 1977 julkaisusta voidaan päätellä, että, jos- 20 kin rokottaminen oli vain eräs mandollinen keino proflylaksian saavuttamiseksi, silloiset pyrkimykset kliinisesti hyväksyttävän ja todistetusti tehokkaan HSV-rokotteen kehittämiseksi epäonnistuivat täysin. Yllä mainitun julkaisun jälkeen monet tutkijat ovat 25 osoittaneet, että Herpes simplex -virus-dna ja -RNA aiheuttavat kasvaimia. Ks. esim. Rapp, "Transformation by the Hepreps Simplex Viruses", s. 221-227 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York. N.Y. 30 (1981) ja siinä mainittuja julkaisuja. Tällaiset tutkimukset ovat olennaisesti eliminoineet uskon voida laajasti käyttää elävään virukseen pohjautuvia rokotteita tai rokotekoostumuksia mukaan lukien ehdottomasti ei-patogeenit, heikennetyt HSV-kannat, joita kuvataan US-patenttijulkaisussa 35 3 897 549. Rinnan sen yleisen käsityksen kanssa, että on toivottavaa käyttää rokotekoostumuksia ilman Herpes simplex -virus-
5 DNA:ta ja -RNA:ta, on tapahtunut kasvua ehdotuksissa ns. "alayksikkö" rokotteiden saamiseksi. Ks. yleiskatsauksina Moreschi et al., "Prevention of Herpes Simplex Virus infections", s. 440-445 teoksessa "The Human Herpesvirus, An Interdisciplinary 5 Perspective", Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York, N.Y. (1981). Eräänä esimerkkinä US-patenttijulkaisussa 4 158 054 ehdotetaan, joskaan ei esitetä esimerkkejä, Hepres simplex -alayksikkörokotetta, joka valmistetaan syöttämällä inaktivoituja kokovirushiukkasia jatkuvasyötteiseen 10 vyöhykeultrasentrifugiin, jossa hiukkasiin kohdistuu tiheysgradientti ja joka sisältää hemolyyttistä pinta-aktiivista ainetta ja sitomalla sitten "lohkaistut" alayksiköt iso- pyknisesti. Muina esimerkkeinä mainittakoon nukleiinihapoista puhdistetut rokotteet, joita ovat kuvanneet Cappel, Archives of 15 Virology, 52 (1976) 29-35; Kitches et al., Infection and Immunity, 16 (1977) 955-960; Slichova et al., Archives of Virology, (1980) 207-214 sekä Skinner et al., Med. Microbiol. Immunol., 169 (1980) 39-51. Kaikki yllä mainittujen julkaisujen rokotekoostumukset valmistettiin erotusmenetelmin, joissa pidetään enem- 20 män tai vähemmän huolta siitä, että nukleiinihappojen määrää rajoitetaan tai nukleiinihapot eliminoidaan uutetuista fraktioista. Mutta on havaittu, että mikään näistä rokotteista ei pysty täysin suojaamaan rokotettuja koe-eläimiä kuolemalta Herpes simplex -viruksella infektioinnin jälkeen, jota 25 suojaa yleisesti pidetään jatkuvan kehittelyn edellytyksenä. Toinen hiljattain ehdotettu ja suhteellisen perusteellisesti testattu Herpes simplex -rokote on koostumus, jonka valmistuksessa käytetään virusglykoproteiinialayksiköksi kutsuttua fraktiota. Kirjoituksessa Hillmena et al., "Sub- 30 unit Herpes Simplex Virus-2 Vaccine", s. 503-506 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective" Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland Inc,. New York, N.Y. (1981) on ehdotettu glykoproteiinialayksikkösekarokotetta, joka valmistetaan Hepres simplex -virus tyyp- 35 pi 2:11a infektoitujen kananpoika-alkioiden fibroblasteis- ta. Lyhyesti selostettuna rokotevasta-aine valmistetaan va-
6 pauttamalla glykoproteiini käsittelemällä infektoituja soluja Triton X-100:11a, digestoimalla DNAas'illa, puhdistamalla lektiiniaffiniteettipylväässä ja kromotgrafoimalla Sephadexilla. Sitten ainesta käsitellään formaliinilla ja 5 formuloidaan aluna-apuaineeseen. On havaittu, että rokotettuja hiiriä voidaan suojata Herpes simplex -virus tyyppi 2:n letaali-infektiota vastaan merkitsevästi paremmin kuin aluna-apuaineella käsiteltyjä kontrolleja. Mutta glykoproteiinin kuolleisuutta vähentävä vaikutus oli kuitenkin pienempi 10 kuin vesipitoisella, UV-inaktivoidulla kokovirusrokotteella (joka sekään ei pystynyt estämään kuolemaa kaikissa rokotetuissa eläimissä). Todettiin, että glykooroteiinirokotteen kyky indusoida ihmisessä sekä homologisten ja heterologisten vasta-ainetyyppien muodostusta oli rajoitettu ja homo- 15 logisten ja heterologisten tyyppien soluvälitteisen immuniteetin määritykset osoittivat sekä rajoittavia että siirtymisvaikutuksia. Käsiteltävänä olevan keksinnön taustan kannalta merkittävä on se laaja informaatio, joka vuosien mittaan on 20 saatu HSV:n tärkeimmistä vaippaglykoproteiineista. Tätä aihetta kosketteleva laaja ja erittäin seikkaperäinen monografia on Norrild, "Immunochemistry of Herpes Simplex Virus Clycoproteins" teoksessa Current Topics in Microbiology and Immunology, 90, s. 67-106, Springer Verlag, Berlin (1980). 25 Käsitellyt pääaiheet ovat HSV-peräisten glykoproteiinien rakenne, synteesi ja toiminta, virusmembraaniproteiinien ja niiden komponenttien immunolgoinen reaktiivisuus sekä selonteko vasta-aineiden antigeenispesifisyydestä yksittäisten Glykoproteiinien kohdalla. 30 Lyhyesti selostettuna julkaisussa todetaan, että Herpes simplex -virus tyyppi 1:ssä (HSV-1) ja tyyppi 2:ssa (HSV-2) on vähintään viisi merkittävää glykoproteiinia (merkinnällä ga, gb, gc, gd ja ge) joita esiintyy ei vain virushiukkasten vaipassa, vaan myös infektoituneiden solujen 35 plasmamembraanissa ja infektoituneista soluista saaduissa, detergentillä käsitellyissä sytoplasmauutteissa. Näissä
7 glykoproteiineissa on voimakkaita antigeenideterminantteja, mm. kyky tuottaa vasta-aineita infektoituneessa isäntäorganismissa, ja isännässä ne näyttävät toimivan immunokemiallisina pää-ärsykkeinä sekä humoraali- että solutasolla. Jot- 5 kut virusantigeenideterminantit ovat yhteisiä (ts. gb ja gd) ja jotkut taas ovat spesifisiä jommallekummalle virustyypille (ts. gc ja ge). (Ks. myös Spear, "Herpes Viruses", s. 709-750 teoksessa "Cell Membranes and Viral Envelopes, Vol. 2", Blough, et al., eds., Academic Press, New York. N.Y. 10 (1980)). Käsiteltävänä olevan keksinnön taustan kannalta vieläkin merkittävämpiä ovat tämän keksinnön keksijöiden sekä heidän työtoveriensa julkaisut, joita on ilmestynyt vuodesta 1972 ja jotka muodostavat varsin olennaisen osan saata- 15 vissa olevasta informaatiosta, joka koskee HSV-vaippaglykoproteiinia eli gd:tä. Niinpä tähän on liitetty viitteinä (1) Cohen, et al., J. Virol. 10 (1972) 1021-1030; (2) Ponce de Leon, et al. J. Virol. 12 (1973) 766-774: (3) Cohen, et al., J. Virol. 14 (1974) 20-25; 20 (4) Cohen, et al., J. Virol. 27 (1978) 172-181; (5) Eisenberg, et al., J. Virol 31 (1979) 608-620; (6) Eisenberg, et al., J. Virol. 35 (1980) 428-435; ja (7) Cohen, et al., J. Virol. 36 (1980) 429-439. Keksijöiden ja heidän työtoveriensa yllä mainituissa 25 julkaisuissa raportoidut tutkimukset ovat keskittyneet HSV-1:n glykoproteiiniin gd ("gd-1") ja erityisesti tämän glykoproteiinin eristämiseen, puhdistamiseen ja karakterisointiin. Käyttämällä kromatografisten vaiheiden laajoja sarjoja natiivi gd-1 (tunnettiin aikaisemmin nimellä CP-1 antigeeni) on 30 voitu puhdistaa määrinä, jotka ovat riittäneet kehittämään monopresipitiini (eli polyklonaalinen)-anti-cp-1-seerumi, jonka tyyppiyhteisen neutralointiaktiivisuuden tiitteriarvot ovat suuria. Käyttämällä anti-cp-1:tä immunologisena koettimena, on voitu osoittaa, että gd-1 ja HSV-2:n gd ("gd-2") 35 prosessoituvat infektoituneissa soluissa pienimolekyylisistä prekursoreista suurimolekyyliksiksi tuotemuodoiksi lisättäes-
8 sä oligosakkarideja. Tryptiinipeptidianalyysin avulla on voitu osoittaa merkitseviä rakennesamanlaisuuksia gd-l:n ja gd-2:n välillä. Lisäksi on voitu osoittaa gd-l:n rakenneidenttisyys riippumatta siitä, onko eristäminen tapahtunut infek- 5 toiduista ihmis(kb- tai hamsteri(bhk21)-soluista. Huomattavan mielenkiintoisia ovat yllä mainitut raportit, jotka koskevat mandollisuutta kromatografisesti puhdistaa gd-1 seerumia neutraloivien vasta-aineiden syntymisen indusoimiseksi in vivo, jotka vasta-aineet suojaavat viljel- 10 tyjä soluja sekä HSV-1- että HSV-2-infektioilta sekä gd-1:n mandollisuutta "estää" HSV-1- ja HSV-2-virusinfektioiden neutralointi suojaseerumien avulla. Todettakoon lopuksi, että viime aikaisissa tutkimuksissa on kuvattu HSV-glykoproteiini gd:n ja muiden HSV-gly- 15 kooroteiinien useiden monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusta ja ominaisuuksia. Eräässä näihin tutkimuksiin liittyvässä raportissa (Dex et al., Infection and Immunity 34 (1981) 192-199) mainitaan, että gd-l:n ja gc-l:n määrättyjä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää synnyttämään 20 passiivinen immunologinen suoja HSV-1:n letaalitartuntaa vastaan. Esitetään myös passiivinen immunisointi gd-l:n monoklonaalisella vasta-aineella (merkinnällä "HD-1"), jolla saavutetaan suoja HSV-2:n letaalitartuntaa vastaan. Yllä kuvatun rokotevalmisteisiin kohdistuvan tarpeen 25 lisäksi, joita valmisteita voidaan käyttää Herpes simplex -virusten aiheuttamien sairaustilojen ennalta ehkäisyssä ja hoidossa, on olemassa tarve saada nopeita ja spesifisiä testejä herpesvirussairauksille ja erityisesti antigeenisille aineille, jotka ovat käyttökelpoisia fluoresenssi-, immuno- 30 peroksidaasileimaus-, radioimmuuni- ja entsyymiin sidotun immunoabsorbentin määrityksissä. Tällaisia määrityksiä käytetään yleisesti esim. Herpes simplex -virusten vasta-aineiden toteamiseksi kehonneste-, esim. selkäydinnestenäytteistä, jotka on otettu potilaista, joiden epäillään sairastavan 35 Herpes simplex -virusperäistä enfefaliittia. Ks. esim. Sever, "The Need for Rapid and Specific Tests for Herpesviruses",
9 s. 379-380 teoksessa "The Human Herpesviruses, An Interdisciplinary Perspective", Nahmias, et al., eds., Elsevier North Holland, Inc., New York. N.Y. (1981). Watson et al. ovat suorittaneet nukleiinihapposek- 5 venssitutkimuksia HSV-1(Patton-kanta)-genomin proteiininkcodausalueella, joka vastaa gd-1:tä. Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty julkaisussa Science, 218 (1982) 381-384. Näissä tutkimuksissa todetun nukleiinihapposekvenssin nojalla Watson et al. esittävät gd-1:lle hypoteettisen 394-10 aminohapposekvenssin, osoittavat todennäköisiä glykosylointikohtia, kutsuvat aminopäätteen 25 ensimmäistä aminohappoa hypoteettiseksi "signaali"peptidiksi ja pitävät todennäköisenä, että karboksipäätteen 25 aminohapon sarja on mukana ankkuroimassa glykoproteiini membraanin mu ihin komponent- 15 teihin. DNA-vektoreita, joista mikään ei sisälly julkistetun DNA-sekvenssin 52 ensimmäiseen kodoniin (146 emästä), käytetään "gd-sukuisen" polypeptidin ja -,c,/g-galaktosidaasi/gd-1-sukuisen fuusiopeptidin ilmaisemiseksi mikrobiologisesti. Watson et al. raportoivat edelleen, että kaniinit, 20 joihin oli ruiskutettu fuusiogeenin E. coli -ilmentymästä saatua fuusiproteiinituotetta, muodostivat sekä HSV-1:tä että HSV-2:ta neutraloivia vasta-aineita. Suoraan ilmaistua polypeptidiä ei testattu in vivo, mutta sillä suoritettiin immuunipresipitaatiomääritys, jonka kohteena olivat 25 eräät niistä 17:stä monoklonaalisesta vasta-aineesta, joista Eisenberg et al., J. Virol., 41 (1982) 478-488 olivat tutkineet neutralointi- ja RIP-aktiivisuuden. Havaittiin, että ryhmien I, IV ja V monoklonaaliset vasta-aineet (tyyppiyhteinen 4S, tyyppi 1 spesifinen 1S ja RIP tyyppi 1 spe- 30 sifinen 55S ja 57S) sekä polyklonaalinen anti-hsv-1-kaniinin antiseerumi immuunisakkauttavat suoraan ilmaistun, gdsukuisen polypeptidin. Raportoidaan, että ryhmien II ja III monoklonaalit (RIP-tyyppiyhteinen 12S ja tyyppiyhteinen 11S) tai luokittelematon monoklonaalinen vasta-aine 50S eivät im- 35 muunisakkauta polypeptidiä. Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa ensimmäistä kertaa menetelmää HSV-2:n vaippaglykoproteiini gd-2:n immunolo-
10 gisesti aktiivisen valmistetaan valmistamiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) nestemäinen näyte saatetaan kosketukseen monoklonaalisen anti-gd-vasta-aineimmunoadsorbentin kanssa olo- 5 suhteissa, joissa reversiibeli immunositoutumisreaktio voi tapahtua glykoproteiinin ja immunoadsorbentin välillä, jolloin muodostuu gd-2/anti-gd-vasta-ainekompleksi; ja b) vaiheessa a) muodostunut gd-2/anti-gd-vasta-ainekompleksi käsitellään sellaisissa olosuhteissa, joissa immu- 10 nologisesti sitoutunut kompleksi hajoaa, ja eristetään glykoproteiini gd-2. Glykoproteiinivalmiste ei sisällä muita HSV-vaippaglykoproteiineja, se ei sisällä virus- tai solu-. peräistä DNA:ta ja RNA:ta ja sillä on ainutlaatuisia immunologisia ominaisuuksia. Keksinnön mukaisesti suositeltava gd- 15 2:n lähde on HSV-2-viruksella infektoiduista soluista saatu sytoplasmauute. Lisäksi käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa ensimmäistä kertaa menetelmää HSV-l:n vaippaglykoproteiini gd-1:n immunologisesti aktiivisen valmisteen valmistamiseksi, joka 20 eroaa tekniikan tasosta siinä suhteessa, että eristäminen tapahtuu sitomalla selektiivisesti ja reversiibelisti monoklonaaliseen anti-gd-vasta-aineimmunoadsorbenttiin. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) nestemäinen näyte saatetaan kosketukseen monoklo- 25 naalisen anti-gd-vasta-aineimmunoadsorbentin kanssa olosuhteissa, joissa reversiibeli immunositoutumisreaktio voi tapahtu glykoproteiinin ja immunoadsorbentin välillä, jolloin muodostuu gd-1/anti-gd-vasta-ainekompleksi; ja b) vaiheessa a) muodostunut gd-1/anti gd-1-vasta-ai- 30 nekompleksi käsitellään olosuhteissa, joissa immunologisesti sitoutunut kompleksi hajoaa, ja eristetään glykoproteiini gd-1. Näin valmistetun glykoproteiinivalmisteen immunologiset ominaisuudet ovat paljon paremmat kuin tekniikan tasolla tähän saakka saatavissa olevien glykoproteiini-gd-l:n pisim- 35 mälle puhdistettujen valmisteiden vastaavat ominaisuudet ja ne ovat samanveroisia yllä mainitun gd-2-valmisteen kanssa, koska
11 niissä ei ole muita HSV-vaippaglykoproteiineja eikä virustai soluperäistä DNA:ta. Keksinnön mukaisesti suositeltava gd-l:n lähde on HSV-1-viruksella infektoiduista soluista saatu sytoplasmauute. 5 Keksinnön mukaisesti saadut valmisteet ovat terapeuttisesti aktiivisia ja niitä voidaan käyttää rokotteissa immunologisen suojavasteen synnyttämiseksi HSV-virusinfektiosairauksia vastaan. Rokotekoostumukset voivat sisältää joko gd-2:ta tai gd-l:tä, jotka on yllä karakterisoitu, tai mo- 10 lempia ja mieluiten niitä annetaan sellaisia määriä, että annosyksikkö sisältää 0,01-10,0 mikrogrammaa immunologisesti aktiivista glykoproteiinia kilogrammaa kohti vastaanottajaeläimen kehonpainoa. Suojauksen kokonaisannos voi olla 0,1- n.100 mikrogrammaa antigeeniä. Rokotekoostumukset voi- 15 vat gd-l:n ja/tai gd-2:n lisäksi sisältää immunologisesti hyväksyttäviä laimentimia ja kantajia samoin kuin yleisesti käytettyjä apuaineita, kuten Freundin täydellistä apuainetta (Freund's Complete Adjuvant), saponiinia, alunaa jne. Tavallinen ja suositeltava monoklonaalinen anti-gd- 20 vasta-aine gd-l:n ja gd-2:n valmistamiseksi on puhdistettu IgG-fraktio, joka saadaan askitesnesteistä, jotka on kehitetty monoklonaalista vasta-aine-hd-1:tä muodostavan hybridoomasolulinjan avulla, kuten ovat kuvanneet Dix et al. yllä. Ks. myös Periera et al., J. Virol., 29 (1980) 724-732. Lu- 25 kuisia muitakin monoklonaalisia anti-gd-vasta-ainevalmisteita voidaan hyvin tuloksin käyttää immunoabsorbentin valmistamiseksi, jolla gd-1 ja gd-2 puhdistetaan keksinnön mukaisesti. Keksinnön mukaisesti HSV-1-glykoproteiini-gD-1 ja erityisesti HSV-2-glykoproteiini-gD-2 saadaan nopean suursaanto- 30 menetelmän avulla, jossa HSV-vaippaglykoproteiiniseoksia puhdistetaan monoklonaalisella anti-gd-vasta-aineimmunoadsorbentilla. Kuten yllä mainittiin HSV-vaippaglykoproteiinien sopivia lähteitä on vaippa, joka saadaan virushiukkasista, infektoitujen solujen plasmamembraaneista ja HSV-infektoitujen solujen 35 detergentillä käsitellyistä sytoplasmauutteista. Viimeksi mainitut muodostavat suositeltavan lähteen. Anti-gD-vasta-aine-
12 lähteinä voidaan käyttää haluttu määrä monoklonaalista vasta-ainetta muodostavia hybridoomasolulinjoja immunoabsorbenttien saamiseksi keksinnön gd-l:n ja gd-2:n puhdistamiseksi. Käyttökelpoisiin vasta-aineen tuotantolinjoihin kuu- 5 luu 17 hybridoomalinjaa, joita ovat kuvanneet Eisenberg et al., J. Virol. 41 (1982) 478-488. Tavallinen ja suositeltava monoklonaalinen solulinja on HD-1, jota ovat kuvanneet Dix et al., yllä. Suositeltavalla monoklonaalisella vasta-aine-hd-1:11ä, jota käytetään sekä gd-l:n että gd-2:n 10 puhdistamiseksi immunoadsorbenttiaffiniteettikromatografoi- malla, on seuraavat ominaisuudet: 1) kuten Dix et al. yllä ovat osoittaneet, se neutraloi sekä HSV-1:n että HSV-2:n tehon suurien tiitterien suhteen ja suunnilleen samoilla tasoilla, 2) radioimmuunipresipitaatio(rip)-tutkimukset osoit- 15 tavat, että yli 90 % gd:stä pysyy sitoutuneena HD-1:teen kaksituntisen 37 C:ssa inkuboinnin jälkeen ja 3) HD-1 tunnisti gd:n kaikissa testatuissa HSV-1- ja HSV-2-kannoissa. Näitä ominaisuuksia analysoimalla on voitu päätellä, että HD-1 tunnistaa gd-1:n ja gd-2:n pinnalla olevan tyyppiyhteisen antigeeni- 20 determinantin ja sitoutuu suhteellisen suurella afiiniteetil- lä, HD-1-vasta-aineiden suositeltava lähde on IgG-fraktio askitesnesteestä, joka on kehitetty antamalla HD-1-hybridoomasoluja intraperitoneaalisesti sopivalle immuunivasteiselle eläimelle. Suositeltava matriisi on Sepharose 4B (Pharmacia), 25 mutta voidaan käyttää muitakin vasta-aineen immobilisointi- systeemejä (ks. esim. Biotechnology Newswath, Vol. 2, no. 2, s. 3 (January 18, 1982)). Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavien koe-esimerkkien ja esimerkkien avulla. Jos määrätyt olosuhteet tai 30 menetelmät ilmoitetaan raportoiduiksi tai julkistetuiksi "aikaisemmin", ne löytyvät tämän keksinnön keksijöiden ja heidän työtoveriensa yhdestä tai useammasta yllä esitetystä julkaisusta. Seuraava koe-esimerkki kuvaa keksinnön mukaisesti 35 puhdistetun gd-l:n ja gd-2:n immunologista aktiivisuutta.
13 Koe-esimerkki 1 Käytettiin kahta menetelmää alla esitetyn esimerkin 2 mukaan valmistetun gd-l:n ja gd-2:n biologisen aktiivisuuden toteamiseksi. Ensimmäisellä menetelmällä määritettiin 5 vasteena gd-1:llä ja gd-2:lla suoritetulle immunisoinnille syntyneiden vastaseerumien kyky neutraloida HSV:tä. Toisella menetelmällä määritettiin puhdistetun gd-1:n ja gd-2:n kyky estää yllä kuvatulla tavalla valmistetun anti-cp-1-seerumin neutralointikyky. On huomattava, että tämä lienee gd-2:n 10 osalta ensimmäinen tämäntyyppinen immunologinen aktiivisuuden määritys. Anti-gD-1- ja anti-gd-2-seerumit valmistettiin ensimmäisessä menetelmässä seuraavasti. CAFI-hiiriä (naaraita, ikä 10 viikkoa) immunisoitiin immunoadsorbenttipuhdistetulla 15 gd-1:llä ja gd-2:lla. Jokaiseen hiireen ruiskutettiin i.p. neljän ruiskeen sarjana asianmukaista antiaeeniä (immunisoinnin kokonaisannos 7,5 rg proteiinia) emulgoituna Freundin täydelliseen apuaineeseen. Ruiskutusohjelma oli seuraava. Ensin ruiskutettiin 3 rg ja sitten ruiskutettiin 1,5 pg ad:tä I - 20 päivinä 7, 21 ja 35. 45 päivän kuluttua hiiristä otettiin veri talteen. Neutralointitiitteri määritettiin aikaisemmin kuvatun plakin pienentämistekniikan modifikaation avulla. Lyhyesti selostettuna erilaisia vastaseerumilaimennoksia ja 60 pfu 25 virusta inkuboitiin 90 minuuttia 37 C:ssa lopullisessa tila- vuudessa 40 rl. Jokaisesta seoksesta lisättiin puolet (30 pfu virusta) 96-lokeroisen levyn (Costar) yhteen lokeroon, jossa oli BHK-soluja. Tunnin adsorptioajan kuluttua soluille kaadettiin tuoretta elatusainetta, inkuboitiin 24 tuntia 30 37 0C:ssa ja plakit laskettiin ylösalaisin käännetyn mikroskoopin alla. Neutralointitiitterit valittiin käänteisarvo suurimmasta laimennoksesta, joka aiheutti tiitterin piene- nemisen 50 %:11a verrattuna ennalta immuuniin seerumiin. Kaikki hiiret muodostivat monopresipitiinivastasee- 35 rumia, joka immuunisakkautti prekursorin pgd tyyppiyhteisellä tavalla. Nämä havainnot ovat lisätodisteena gd-l:n ja
14 gd-2:n puhtaudesta. Taulukko 1 osoittaa, että gd-1 ja gd-2 stimuloivat tyyppiyhteisten suurien tiitterien muodostumista neutraloimalla vastaseerumia jokaisessa immunisoidussa hiiressä. Yhteenvetona näistä kokeista voidaan todeta, että 5 sekä gd-1 että gd-2 oli puhdistunut biologisesti aktiivisessa muodossa. Taulukko 1 Vastaseerumi Valmistettu käytettä- Neutralointiväksi hiiressä nro tiitteri a 10 HSV-1 HSV-2 anti-gd-1 1 2 048 1 536 2 1 536 512 15 20 anti -gd -2 3 1 536 512 1 192 512 2 512 1 024 3 1 024 1 024 4 1 024 1 536 5 192 512 a Tulokset on ilmoitettu käänteisarvona suurimmasta seerumilaimennoksesta, joka aiheutti pfu-arvon pienenemisen 50 %:11a verrattuna asianmukaisiin viruskontrolleihin ja ennalta immuuneihin hiiriseerumikontrolleihin (22). Anti-CP-1-seerumin (kaniini) neutralointitiitteri HSV-1:tä vastaan oli 512 25 ja HSV-2:ta vastaan 256 testattuna saman määrityssysteemin avulla. Näytteet toista seeruminestomääritystä varten preparoitiin seuraavasti. Puhdistetun gd-l:n tai gd-2:n näyteosa (30-50 ig proteiinia) ML-puskurissa dialysoitiin pe- 30 räkkäin NP-40:n kasvavia (0,1 %, 0,01 %, 0,001 %, ei NP-40:ä) konsentraatioita vastaan Tris-puskurissa, 0,01-m, ph 7,5, 0,15-m NaCl. Jokaisen dialyysivaiheen jälkeen poistettiin osa radioaktiivisuus- ja sitoutumisaktiivisuusmääritystä varten kvantitatiivisen radioimmuunipresipitaatiomenetelmän 35 avulla. Ainoa merkittävä hukka tapahtui viimeisessä dialyysivaiheessa (ei NP-40:ä). Tässä vaiheessa menetettiin n. 50 %
15 trikloorietikkahapolla sakkautettavissa olevasta radioaktiivisuudesta, mutta jäljellä olevalla 50 %:11a ei voitu havaita merkitsevää HD-1-sitoutumisaktiivisuuden hukkaa. Määritys suoritettiin 96-lokeroisilla levyillä ai- 5 kaisemmin kuvatun menetelmän modifikaationa. Lyhyesti sanottuna gd-l:n ja gd-2:n laimennokset sekoitettiin vastaseerumin vakiolaimennokseen. Vastaseerumilaimennokseksi valittiin laimennos,joka aiheuttaisi viruksen GO pfu:n 75-90-%:isen neutraloitumisen. Antigeenin ja vasta-aineen seosta inkuboi- 10 tiin tunti 37 o C:ssa ja sitten kukin seos lisättiin 60 pfu:hun virusta (lopputilavuudessa 40 111). Seoksia inkuboitiin 90 minuuttia 37 C:ssa ja puolet jokaisesta seoksesta lisättiin 96-lokeroisen levyn (Costar) yhteen lokeroon, jossa oli BHK- soluja. Tunnin adsorptioajan kuluttua soluille kaadettiin 15 tuoretta elatusainetta, inkuboitiin 24 tuntia 37 C:ssa ja plakit laskettiin ylösalaisin käännetyn mikroskoopin alla. 50 %:n päätepisteenä oli gd:n laimennos, joka esti seerumin neutraloimiskyvyn 50 %:lla. Aikaisemmin on osoitettu, että puhdistettu CP-1-an- 20 tigeeni stimuloi tyyppiyhteistä virusta neutraloivan vasta- aineen suurien tiitterien muodostumista. Jos puhdistetulla gd-1:llä ja gd-2:lla on sama biologinen aktiivisuus, niiden pitäisi pystyä yhdistymään anti-cp-l-seerumiin (samoin kuin jokaiseen seerumiin, joka sisältää gd:n avulla neutraloivaa 25 vasta-ainetta) ja estämään sen neutralointikyky. Esikokeet oosittivat, että NP-40:n pitoisuudet glykoproteiinifraktiois- sa estivät sekä virusta että soluja. Glykoproteiinien dialyysi Tris-puskuria vastaan, joka sisälsi keittosuolaa, mut- tei NP-40:ä, ei merkitsevästi muuttanut sitoutumisaktiivi- 30 suutta ja valmisteilla ei ollut enää estovaikutusta. Mutta näin menetellen proteiinin hukka oli n. 50 %. Jokaisesta gd-valmisteesta titrattiin seerumin estokyky anti-cp-1-see- rumin suhteen ja yhden kokeen tulokset (korjattu ottamalla huomioon proteiinihukka) ilmenevät taulukosta 2. Havaitaan, 35 että kummankin glykoproteiinin seeruminestokyky oli suunnilleen sama. Tämä koe osoittaa selvästi, että gd-2 pystyy estämään heterologisen vastaseerumin neutraloinnin.
16 Taulukko 2 Käytetty virus Tarvittava gd-konsentraatioa gd-1 gd-2 HSV -1 37 ND b 5 HSV -2 35 30 a gd:n määrä nanogrammoina, joka tarvitaan estämään 50 % anti-cp-1-seerumin kyvystä neutraloida 30 pfu joko HSV-1:ä tai HSV-2:a. 10 bei maaritetty. Seuraava koe-esimerkki kuvaa gd-1-rokotekoostumuksen tehoa rokotettujen eläinten suojaamiseksi kuolemalta infektoitaessa niitä voimakkaasti sekä HSV-1:n että HSV-2:n letaalikannoilla. 15 Koe-esimerkki 2 Käytetty ymppi muodostui liuoksesta, jossa oli 1 mikrogramma gd-1:tä, joka alla esitetyn esimerkin 2 mukaan oli eristetty HSV-l:n kannalla HF infektoitujen solujen sytoplasmasta, Freundin täydellisessä apuaineessa. Jokainen Balb/c- 20 hiiri ensimmäisessä inokuloidussa ryhmässä sai kaikkiaan viisi ruisketta intraperitoneaalisti kanden kuukauden aikana. Seitsemän päivää ensimmäisen inokuloinnin jälkeen seerumia, joka saatiin retro-orbitaalipleksuksesta otetusta verestä, tutkittiin Eisenberg et al., J. Viro1,31 (1979) 608-620 kuvaa- 25 maila radioimmuunipresipitaatiomenetelmällä (RIP) ja Cohen et al., J. Virol. 19 (1972) 1021-1030 kuvaamalla neutraloivan vasta-aineen menetelmällä. Kaikki immunisoidut eläimet reagoivat positiivisesti ja niiden neutraloivat vasta-ainetiitterit olivat n. 1:16-n. 1:128 ja immuunipresipitaatio- 30 tulokset osoittavat vasta-aineiden muodostuvan vain gd:n avulla. Koska vasta-aine immuunisakkautti sekä gd-l:n että gd-2:n, on ilmeistä, että kaikki 10 rokotettua eläintä olivat muodostaneet tyyppiyhteisen, neutraloivan vasta-aineen HSV:n gd:n suhteen. 35 14 päivää viimeisen inokuloinnin jälkeen koottiin ensimmäinen 10 rokotetun hiiren ryhmä, jossa seerumia neut-
17 raloivan vasta-ainetiitterin arvot vaihtelivat (kolmella n. 1:128, kolmella n. 1:64 ja neljällä n. 1:32). Näille 10 hiirelle ja 9 (rokottamattomalla) kontrollihiirelle annettiin intraperitoneaalisesti annos 4 x 10 6 pfu HSV-l:n 5 Patton-kantaa (vastaten suunnilleen nelinkertaisesti tämän kannan LD 50 -arvoa). Kaikki kontrollieläimet kuolivat seitsemän päivän kuluessa, mutta kaikki rokotetut eläimet elivät pitkään eivätkä koskaan näyttäneet sairailta. Koottiin toinen kandeksan rokotettua hiirtä käsittä- 10 vä ryhmä, jossa seerumia neutraloivan vasta-aineen tlitterit vaihtelivat 1:16-1:128. Jokainen hiiri sai lisäannoksena 1 mikrogramma gd-l:tä. Näille hiirille ja 11 kontrollihiirelle annettiin intraperitoneaalisesti 1 x 10 6 pfu HSV-l:n (letaali) kantaa 186. 10 päivän kuluessa 11 kontrol- 15 lieläimestä kuoli kandeksan. Kolme jäljelle jäänyttä eläintä pysyivät elossa ja ne lopetettiin myöhemmin. Kaikki rokotetut eläimet pysyivät terveinä eikä niissä ilmennyt neurologisia oireita (liiallista levollisuutta), jotka liittyvät HSV:n intraperitoneaaliantoon. 20 Seuraava koe-esimerkki kuvaa gd-l-rokotekoostumusten kykyä stimuloida neutraloivien vasta-aineiden muodostumista. Koe-esimerkki 3 Tässä menetelmässä käytettiin neljää kaniinia. Kaksi rokotettua eläintä saivat lihakseen hieman toisistaan eroa- 25 via annoksia alla esitetyn esimerkin 2 mukaan valmistettua gd-l:tä ja gd-2:ta Freundin täydellistä apuainetta sisältävässä rokotekoostumuksessa. Ensimmäinen eli gd-l:llä rokotettu eläin sai kaikkiaan neljänä annoksena 10, 10 ja 5 ja 5 mikrogrammaa vastaavasti neljän viikon aikana. Toinen eläin 30 sai samana aikana annokset 9, 9, 4,5 ja 4,5 mikrogrammaa gd-2:ta. Kumpikin eläin sai "kiihokkeena" 1 mikrogramma gd-l:tä suunnilleen 10 päivään myöhemmin ja molemmista eläimistä poistettiin veri kolme päivää kiihokeamoksen jälkeen. Talteen otetulla seerumilla suoritettiin seerumia 35 neutraloivan vasta-aineen määrityksiä. Saadut arvot olivat suunnilleen 3-5-kertaa suurempia kuin käytettäessä kromatografisesti puhdistettuacp-1-valmistetta Cohen et al., J. Virol.
18 27 (1978) 172-181 mukaan. Ennen käsiteltävänä olevaa keksintöä tämän viitteen mukainen CP-1 oli tekniikan tasolla pisimmälle puhdistettu ja aktiivisin glykoproteiini-gd-isolaatti. 5 Sen lisäksi, että rokotteet suojaavat sairauksia vas- taan, jotka johtuvat rokotuksen jälkeen saadusta infektiosta, ne pystyvät rajoittamaan hermosolmuinfektioita, joskaan tätä ei ole voitu todistaa kontrolloitujen kokeiden avulla. Tällaiset tulokset saattavat olla yhtäpitäviä aikaisempien tie- 10 tojen kanssa, joiden mukaan latentin HSV-2-infektion vaara on pienempi eläimillä, johin on tartutettu HSV-2 elävällä HSV-1:11ä inokuloinnin jälkeen. Ks. esim. McKendall, Infection and Immunity, 16 (1977) 717-719. Voidaan myös olettaa rokotteiden rajoittavan tai eliminoivan itsepäisesti pesivän her- 15 mosolmuinfektion, joka on kehittynyt vastaanottajassa jo en- nen rokottamista. Ks. esim. Hilleman et al. ja Moreschi et al. yllä. Alla olevassa esimerkissä 1 kuvataan sytoplasmauut- teiden valmistusta sekä HD-1-anti-gD-vasta-aineen ja HD-1-20 immunoabsorbentin valmistusta (ja tunnusarvoja). Esimerkki 1 1. Solujen leimaus ja sytoplasmauutteiden valmistus Olosuhteet infektoitujen solujen pulssileimauksessa on raportoitu aikaisemmin. gd:n puhdistukseen tehtiin mää- 25 rättyjä muutoksia liitetyn leimausaineen määrän ja synteti- soidun gd-määrän lisäämiseksi. Kussakin kokeessa 10 pyörityskolvia (490 cm 2 ), joissa oli samanaikaisesti lisättyjä KB- ja BHK-soluja, infektoitiin 20 pfu:lla HSV-1:tä (kanta HF) tai 10 pfu:lla HSV-2:ta (kanta SAVAGE). Kaksi tuntia in- 30 fektoimisen jälkeen (ij) soluille kaadettiin 50 ml Eaglen Minimun Essential Mediumia (MEM), joka sisälsi 5 % vastasyntyneet vasikan seerumia (Dutchland Co.). Viisi tuntia ij väliaine poistettiin dekantoimalla yhdestä pyörityskolvista ja soluja pestiin lämmitetyillä (37 C) Hankin suoloilla ja 35 päälle kaadettiin 5,0 ml Hankin suoloja, jotka sisälsivät asianmukaisen radioisotoopin: 2 5 a7-metioniini (ominaisaktiivisuus yli 600 Ci/mmol) 1 mci: /2,3-3 I.CLarginiini (ominais-
19 aktiivisuus 15 Ci/mmol) 1 mci. 30 minuutin kuluttua soluille kaadettiin 25 ml esilämmitettyä, täydellistä MEM:iä ja kaikkia kolveja inkuboitiin vielä seitsemän tuntia. 12 tuntia ij leimattuja ja leimaamattomia soluja pestiin neljäs- 5 ti jäissä jäähdytetyllä keittosuolaliuoksella, joka oli 0,1 mmol fenyylimetyylisulfonyylifluoridin (PMSF) suhteen ja valmistettiin sytoplasmauutteita. Kuhunkin soluja sisältävään pyörityskolviin lisättiin 5 ml kylmää liuotuspuskuria (0,01-m trispuskuri, ph 7,5, joka sisälsi 0,15 moolia 10 NaC1:ää, 0,5 % Nonidet P-40:ä (HP-40), 0,5 % natriumdeoksikolaattia) ja soluja inkuboitiin n. viisi minuuttia 4 C:ssa. Lisättiin tolyylisulfonyylifenyylialanyylikloorimetyyliketonia (TPCK) ja N-0L-tosyyli-L-lysiinikloorimetyyliketonia (TLCK), kumpikin konsentraationa 0,1 mmol, protelyyttisen 15 aktiivisuuden estämiseksi. Liuotetut solut raaputettiin kolveista ja lingottiin 1200 rpm 10 minuuttia tumien poistamiseksi. Sytoplasma lingottiin 100 000 g tunti. Sytoplasmauutteet varastoitiin -70 C:ssa. 2. IgG:n puhdistaminen HD-1-askitesnesteestä 20 IgG puhdistettiin olennaisesti kuten ovat kuvanneet Montgomery et al., Biochemistry, 8 (1969) 1247-1258. Lyhyesti sanottuna 7 ml kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta, ph 7,0, lisättiin hitaasti 7 ml:aan askitesnestettä jäähauteessa, sekoitettiin kaksi tuntia ja lingottiin 15 000 g 30 mi- 25 nuuttia. Sakka suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan 0,01-m fosfaattipuskuria (PB), ph 7,3 ja dialysoitiin perusteellisesti PB:n suhteen. Immunoglobuliinin fraktiointia jatkettiin Whatman DE-52:11a. Saatiin 65 mg IgG:tä 7 ml:sta askitesnestettä. SDS PAGE-analyysi puhdistetulla IgG:= osoitti 30 vain kaksi väriaineella Coomassie blue värjäytynyttä vyöhykettä, jotka vastasivat IgG 2A-molekyylin raskasta ja kevyttä ketjua. 3. HD-1 immunoadsorbentin valmistus Valmistettiin 2 g syaanibromidilla aktivoitua 35 Sepharose 4B:tä (Pharmacia) seuraavasti: Geelin annettiin turvota tunti huoneen lämpötilassa 0,001-n HC1:ssä, pestiin
20 suodattamalla 400 ml:11a 0,001-n HC1:ää ja suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 0,2-m natriumkarbonaattipuskuria, ph 8,5, joka oli 1-m NaCl:n suhteen. Geelisuspensioon lisättiin 20 mg IgG:tä 5 ml:ssa PB:tä. Seosta sekoitettiin kak- 5 si tuntia huoneen lämpötilassa, suodatettiin ja suspendoi- tiin uudelleen 10 ml:aan 1-m etanoliamiinia, ph 8,0. Seosta sekoitettiin vielä kaksi tuntia ja pestiin peräkkäin suo- dattamalla 0,1-m natriumasetaatilla, ph 4,0, joka oli 1-m NaCl:n suhteen ja sitten 0,1-m natriumboraatilla, ph 8,0, 10 joka oli 1-m NaCl:n suhteen. Seos tasapainotettiin 4 C:ssa pesemällä puskurilla (0,01-m tris, ph 7,5, 0,1 % NP-40, 0,5-m NaC1 ja 0,1-mmol PMSF). Aktivoituun Sepharoseen sidotun IgG:n aktiivisuus oli yli 97 %. Seuraava esimerkki kuvaa gd-1:n ja gd-2:n puhdis- 15 tusta sekä saatujen valmisteiden puhtaustunnusarvoja. Esimerkki 2 Toimittiin koko ajan 4 C:ssa. Tyypillisessä kokeessa käytettiin lähtöaineina 55 ml leimaamatonta sytoplasmauutetta ja 5 ml radioaktiivisesti leimattua sytoplasmauutetta 20 (100-180 mg proteiinia). Uute lingottiin 100 000 g tunti, lisättiin immunoadsorbenttiin ja kierrätettiin viidesti pylvään läpi. Otettiin talteen 60 ml. Tätä fraktiota kutsuttiin läpivirtausfraktioksi (FT). Pylväs pestiin yli yön pesupuskuruilla ja gd eluoitiin 200 ml:11a 3-m KSCN:ää, ph 25 7,8. KSCN-fraktio konsentroitiin n. 100-kertaisesti käyttä- mällä gd-1:11e Amiconin kalvoa Pm-30 ja gd-2:11e kalvoa PM-10. Konsentroitu näyte dialysoitiin perusteellisesti modifioitua liuotuspurskuria (ML) vastaan (0,01-m tris. ph 7,5, 0,1 % NP-40, 0,15-m NaC1, 0,1 mmol PMSF). Puhdistetun 30 gd:n näytteet varastoitiin -70 C:ssa. Sama puhdistusmenet- tely sovellettiin leimaamattomiin, infektoimattomiin soluihin. SDS-PAGE-analyysi osoitti, että isäntäproteiinit eivät olleet merkittävässä määrin sitoutuneet immunoadsorbenttipylvääseen. 35 gd-1:n ja gd-2:n molekyylipainot vastasivat hyvin aikaisemmin ilmoitettuja arvoja. Puhdistetun gd-1:n ja gd-2:n
21 tryptiinipeptidiarysi suoritettiin aikaisemmin julkaistettujen menetelmien mukaisesti ja myös saadut profiilit osoit- tivat glykoproteiinien olevan erittäin puhtaita. Käytettiin kvantitatiivista radioimmuunipresipitaa- 5 tiomääritysmenetelmää (RIP) sytoplasma-, FT- ja KSCN-fraktioiden gd:n aktiivisuuden seulomiseksi. Tällä menetelmällä määritetään yksinkertaisella tavalla vasta-aineen sitoutuminen. Lisättiin HD-1-IgG:tä kasvavina määrinä vakiomäärään radioaktiivisesti leimattua, puhdistettua gd-l:tä tai gd-2:ta. 10 Seoksia inkuboitiin 20 minuuttia 37 C:ssa ja lisättiin S. aureusta immuunikompleksien ottamiseksi talteen. Kompleksi pestiin ja suspendoitiin SDS-hajotuspuskuriin. Kustakin näytteestä laskettiin rinnakkaisnäytteet tuikelaskimessa ja loput näytteestä analysoitiin SDS-PAGE:lla. Näin varmistau- 15 duttiin siitä, että HD-l:n sitoma radioaktiivisuus oli gd:ssä. Jotta tulokset voitaisiin ilmaista nanogrammoina sitoutunut- ta gd:tä, määritettiin ensin KSCN-fraktion proteiinimäärä. Käytettiin menetelmän Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, s. 265-275 modifikaatiota julkaisussa Dulley et al., Analyt. 20 Biochem., 64 (1975) 136-141 proteiinikonsentraation määrittämiseksi detergentin läsnäollessa. Sitten määritettiin alkuperäisnäytteestä leimatun, trikloorietikkahapolla (TCA) saostettavissa olevan gd:n osuus. Tämän jälkeen määritettiin puhdistetun, HD-1-IgG:hen sidotun gd:n määrä nanogrammoina 25 seuraavan yhtälön avulla: puhdistettua gd:tä sitoutunut ng = 30 vasta-aineeseen sidotussa gd CPM x puhdistetun gd n kokonais- TCA:lla saostuva gd CPM määrä ng Saadut tulokset osoittavat, että HD-1-IgG:hen sitou- tuneen gd-1:n tai gd-2:n määrä on suoraan verrannollinen sekä antigeenin että vasta-aineen konsentraatioon. Määritys oli lineaarinen alueella 25-200 ng gd-l:tä tai gd-2:ta ja 35 0,1-1,0 gg HD-1-IgG:tä. Leimatun antigeenin maksimisitoutuminen ylimäärään vasta-ainetta oli n. 48 % gd-1:11ä (kuu-
22 si koetta) ja n. 53 % gd-2:lla (neljä koetta). Sitoutumattoman gd-1:n ja gd-2:n SDS-PAGE-analyysi osoitti, että proteiineilla ja sidotuilla glykoproteiineilla oli sama elektroforeettinen liikkuvuus. S. aureus -määrän lisääminen 5 ei lisännyt sitoutmeten gd:n määrää. Mutta lisättäessä anti- CP-1-seerumia (valmistettu yllä kuvatulla tavalla) sitoutumattomaan gd-1:een, immuunisakkautui vielä 7-10 % glykoproteiinia. Nämä tulokset, viittaavat siihen, että HD-1:n tunnistama determinantti on osaksi inaktivoitunut gd-1:n 10 ja gd-2:n puhdistuksen aikana. Kvantitatiivisen RIP-määrityksen tuloksia kuvaavien käyrien lineaariosan kulmakertoimien avulla voidaan gd-1:een ja gd-2:een sitotuvan HD-l:n yksikkö määritellä ng:na glykoproteiinia ug:aa kohti HD-l:tä. Tähän määritelmään nojau- 15 tuen määritettiin kvantitatiivisella RIP:llä jokaisen puhdistusmenetelmällä saadun fraktion gd-aktiivisuuden määrä. Saadut tulokset ilmenevät alla olevasta taulukosta 3. Tulokset osoittavat, että gdl:n aktiivisuus on kasvanut 421- kertaisesti ja gd-2:n aktiivisuus 198-kertaisesti. gd-l:n 20 aktiivisuussaanto (35 % lähtöaktiivisuudesta) oli suurempi kuin gd-2:n (16 %). Taulukon 3 arvot korostavat suuria saantoja (150.1(3 gd-1:äja 82 pg gd-2:ta) ja molempien glykoproteiinien ominaisaktiivisuutta.
Taulukko 3 HSV:stä saadun gd-1:n ja gd-2:n puhdistus immunoadsorbenttikromatografoimalla FRAKTIO Mitatut parametrit Sytoplasma Läpivir'taus KSCN gd - 1 gd- 2 0-1 gd- 2 gd -1 gd -2 Kokonaisproteiini (mg) ab 180 100 176 99 Kokonaisyksikköjä gd:tä 1714 1364 127 129 gd:n ominaisaktiivisuus C 9,5. 13,6 0,72 1,3 Ominaisaktiivisuuden kasvu 1 1 0,075 1,3 Aktiivisen gd:n kokonais- 0,205 0,270 0,015 0,025 määrä (mg) d gd-aktivuussaanto (%) 100 100 7,4 7,5 a Määritetty menetelmämodifikaatiolla Lowry et al. yllä. Yksikön määritelmä: ng sitoutunutta gd:tä /ug HD-1-IgG:tä. gd -1:llä 1 yksikkö = 120 1 yksikkö = 198 / ug. c Yksikköä/mg proteiinia. 0,150 0,082 600 222 4000 2700 421 198 0,072 0 044 35 16 ug; gd-2:lla [..) w KSCN-fraktion arvojen perusteella gd-1:11ä 48 % kokonaisprotennista ja gd-2:lla 53 % kokonaisproteiinista. Sytoplasma- ja KSCN-fraktioiden osalta oletettiin gd-1:n ja gd-2:n olevan 100-%:isesti aktiivisia. ("I co CO
24 Aminohappoanalyysi suoritettiin puhdistetun gd-1:n ja gd-2:n näytteillä. gd-1- ja gd-2-näytteet dialysoitiin perusteellisesti veden suhteen ja siirrettiin 6-m HC1:ään ja kuumennettiin vakuumissa 110 0C:ssa 24, 48 ja 72 tuntia. 5 Aminohapot kvantifioitiin Dionex D500 aminohappoanalysaattorilla. Seriinin ja treoniinin arvot laskettiin ekstrapoloimalla aikaan nolla. Isoleusiinin, leusiinin ja valiinin määrät laskettiin 48 ja 72 tunnin hydrolyysin perusteella. Kysteiini määritettiin permuurahaishappohapetuksen jälkeen. 10 Taulukosta 4 ilmenevät analyysitulokset osoittavat, että molempien puhdistettujenglykoproteiinien yleisrakenne oli samanlainen, muttei identtinen. Tämä havainto on yhtäpitävä arviointien kanssa, jotka perustuivat aikaisemmin kuvattuun tryptiinipeptidianalyysiin.
25 Taulukko 4 Aminohappokoostumus Aminohappo Tähteitä/molekyyli a gd-1 gd-2 5 Asp 40 35 Thr b 24 23 Ser b 46 62 Glu 53 59 Pro 35 27 10 Gly 47 51 Ala 37 44 Vale 23 20 Met 5 6 Ilee 23 19 15 Leue 38 32 20 Tyr 15 7 Phe 11 5 His 8 11 Lys 16 22 Arg 22 16 Cyst Trp 12 ND d II ND 25 agd-1:11e aminohappojen kokonaismääräksi arvioitiin 455 (keskimääräinen molekyylipaino 110). gd-2:lle aminohappojen koko- naismääräksi arvioitiin 450 (keskimääräinen molekyylipaino 110). gd-1:n miinus hiilihydraatti molekyylipainoksi arvioitiin 50 000. gd-2:n miinus hiilihydraatti mclekyylipainoksi 30 arvioitiin 49 500. b Arvot ekstrapoloitu aikaan nolla. c Perustuu 48 ja 72 tunnin hydrolyysin keskiarvoon. Ei määritetty.
26 Joskin keksinnön yllä oleva yksityiskohtainen kuvaus käsittelee "luonnon"-lähteistä eristettyjen Herpes simplex -virusglykoproteiinien gd-1 ja gd-2 käyttöä, ammattimiehelle on selvää, että käsiteltävänä olevaan keksintöön kuulu- 5 vat myös glykoproteiinikerranteet, glykoproteiinien fragmentit tai glykoproteiinikerranteiden fragmentit, joilla on in vitro ja in vivo "kokonaisten" glykoproteiiniyhdisteiden antigeeniluonne. On esim. todennäköistä, että tehokkaita rokotekoostumuksia voidaan valmistaa ei-glykosyloiduista 10 tai osaksi glykosyloiduista polypeptideistä, jotka itse voidaan valmistaa rekombinointimenemin (ks. esim. Cohen et al., US-patenttijulkaisu 4 237 224) tai jopa syntetisoimalla. (Ks. esim. Zuckerman, "Developing Synthetic Vaccines", Nature, 295, nro 5845, s. 98-99 (1982) ja Dreesman et al., 15 "Antibody to Hepatitit B Surface Antigen After a Single Inoculation of Uncoupled Synthetic HBsAG Peptides", Nature, 295, nro 5845, s. 158-160 (1982)). Viime aikoina on julkaistu useita samantapaisia raportteja, jotka käsittelevät synteettisten polypeptidien 20 immunologista aktiivisuutta, jotka ovat luonnossa esiintyvien proteiinien, glykoproteiinien ja nukleoproteiinien kerranteita (ts. näissä proteiineissa olevien aminohapposekvenssien lähes täydellisiä kandentumia). Täsmällisemmin sanottuna on havaittu, että suhteellisen pienimolekyyliset 25 polypeptidit ottavat osaa immuunireaktioihin, jotka kestol- taan ja laajuudeltaan vastaavat fysiologisesti merkittävien proteiinien, kuten virusantigeenien, polypeptidiharmonien ja vastaavien immuunireaktioita. Tällaisten polypeptidien immuunireaktioihin kuuluu spesifisten vasta-aineiden muo- 30 dostuksen indusoiminen immunologisesti aktiivisissa eläimissä. Ks. esim. Lerner et al., Cell. 23 (1981) 309-310; Ross et al., Nature, 294 (1981) 654-656; Walter et al., P.N.A.S. (USA), 77 (1980) 5197-5200; Lerner et al., P.N.A.S. (USA), 78 (1981) 3403-3407; Walter et al., P.N.A.S. (USA), 35 78 (1981) 4882-4886; Wong et al., P.N.A.S. (USA), 78 (1981) 7412-7416; Green et 28(1982) 477-487; Nigg et al.,