Soluviljelyn uudet ulottuvuudet muovilta matriksiin

KATSAUS Johanna Partanen ja Juha Klefström Soluviljelyn uudet ulottuvuudet muovilta matriksiin Soluviljelmillä on usein ratkaiseva rooli selvitettäessä sairauksien geneettistä ja biokemiallista taustaa sekä tautien syntymekanismeja. Tavanomaisten muovimaljoilla kasvatettavien soluviljelmien rinnalle on tullut uusia kolmiulotteisia soluviljelymalleja, joissa solut kasvatetaan muovialustan sijaan geelimäisessä väliaineessa. Väliaine tarjoaa soluille luonnollista tyvikalvoa vastaavan kasvualustan, jossa solut pystyvät erilaistumaan ja muodostamaan samankaltaisia solukkorakenteita kuin kudosympäristössäkin. Näillä uusilla menetelmillä voidaan tutkia soluja ja niiden välistä toimintaa tavallisia soluviljelmiä fysiologisemmissa olosuhteissa, mikä tuo uusia mahdollisuuksia selvittää geneettisten tekijöiden yhteyksiä sairauksiin. Kolmiulotteisia soluviljelmiä käytetään syöpätutkimuksessa syöpägeenien toiminnan, angiogeneesin ja invaasion mekanismien selvittämiseen. Geneettisiin ja farmakologisiin tutkimuksiin hyvin soveltuvat ovat monipuolisia translationaalisen tutkimuksen työkaluja, joilla on nähtävissä tulevaisuudessa käyttöä syöväntutkimuksen lisäksi myös kantasolujen tutkimuksen ja lääkekehityksen parissa. 2444 Soluviljelytekniikat, joissa kudoksesta eristettyjä soluja kasvatetaan yksittäisinä rypäinä tai mattoina viljelymaljan pohjalla tai elatusnesteessä, yleistyivät laboratorioissa 1950-luvulla. Soluja kasvatettiin aluksi laboratorioissa hyvin käytännönläheisistä lähtökohdista niitä tarvittiin mm. virusten elatusalustaksi poliorokotteen tuotantoa varten. Soluviljelmiä käytetään edelleen biologisen materiaalin tuotantotehtaina, mutta tämän lisäksi ne ovat olleet jo pitkään myös tärkeimpiä solu- ja molekyylibiologisen sekä farmakologisen tutkimuksen työkaluja. Viljellyillä soluilla selvitetään solun toimintoihin esimerkiksi jakautumiseen, erilaistumiseen, apoptoosiin ja signaalinvälitykseen liittyviä mekanismeja. Niillä selvitetään myös sairauksien taustalla olevien proteiinien toimintaa, ja ensimmäiset selvitykset uusien lääkeaineiden vaikutuksista ja toksisuudesta tehdään viljellyillä soluilla. Soluviljelmien merkittävä etu tutkimuskohteena on hyvä kontrolloitavuus eli mahdollisuus muunnella helposti ja halutulla tavalla solujen elinympäristöä. On yksinkertaista muunnella viljelmien lämpötilaa tai kaasujen osapaineita sekä analysoida mikrotitterilevyillä yhdellä kertaa useiden kasvutekijä- tai lääkepitoisuuksien tai erilaisten tekijöiden yhteisvaikutuksia tutkittavaan soluvasteeseen. Uusilla geeninsiirtotekniikoilla voidaan lisäksi ilmentää tai vaimentaa (RNAi) haluttuja geenejä soluissa (Saksela 2002, Klefström ja Alitalo 2003), jolloin mahdollisuudet vaikuttaa solujen sisäiseen proteiinikoostumukseen ovat melkeinpä rajattomat. Niinpä suuri osa solun terveeseen tai häiriintyneeseen toimintaan tai lääkeaineiden vaikutuksiin liittyvästä tiedosta on lähtöisin soluviljelykokeista. Kykenevätkö muovimaljalla tai pullossa kasvavat soluviljelmät antamaan todellisen kuvan monimutkaisessa kudosympäristössä elävän erilaistuneen solun fysiologiasta? Entä kyke- Duodecim 2008;124:2444 51

nevätkö soluviljelmät ennustamaan in vivo vasteita? Ovatko soluviljelmien vasteet lääkeaineisiin tai geenin vaimennukseen samanlaiset kuin eliön kudoksen solujen? Hyvinkin miljoonan taalan kysymyksiä, kun ajatellaan soluviljelmien käytön laajuutta biolääketieteellisessä perustutkimuksessa, soveltavassa ja lääketeollisessa tutkimuksessa. Aina viime vuosikymmenelle saakka valtaosa ihmisen solulinjoista oli lähtöisin geneettisesti epänormaaleista ja kasvutavoiltaan häiriintyneistä syöpäsoluista. Näitä jo lähtökohtaisesti sairaita soluja kasvatetaan tyypillisesti ravintonesteessä, johon lisätään solujen jakautumista vauhdittamaan sekä tunnettuja että tuntemattomia kasvutekijöitä sisältävää vasikan seerumia. Lisäksi soluja vaivaavat maljalla useat stressitekijät, kuten hyperoksia ja tietysti keinotekoinen muovinen tartuntapinta. Näilläkin häiriintyneillä ja stressatuilla soluilla on kuitenkin saatu arvokkaita vastauksia moniin solubiologian ja molekyylilääketieteen peruskysymyksiin. Vuosituhannen taitteessa soluviljelytekniikoissa tapahtui huomattavaa edistystä. Tällöin havaittiin, että telomeraasientsyymin avulla voidaan ylläpitää normaalista ihmiskudoksesta eristettyjen solujen kasvupotentiaalia soluviljelymaljalla (Hahn 2002). Vasikan seerumia korvaamaan on kehitetty myös erilaisia kasvutekijäsisällöltään tunnettuja synteettisiä ravintonesteitä. Jos kuitenkin ajatellaan mitä tahansa kiinteää kudosta, vaikka epiteelikudosta, niin toisin kuin soluviljelmässä pääosa kudoksen erilaistuneista soluista ei suinkaan jakaudu vilkkaasti vaan hoitaa erilaisia fysiologisia tehtäviä, kuten hormonineritystä. Lisäksi kudoksen solut elävät tiukasti organisoituneessa soluyhteisössä, jossa ne vastaanottavat toimintaansa ohjaavia signaaleja verenkierron kautta ja solujen mikroympäristöstä: naapurisoluilta, tyvikalvolta ja soluväliaineesta. Kolmiulotteisissa eli 3D-soluviljelmissä solut kykenevät erilaistumaan ja muodostamaan kudoksenkaltaisen organisoituneen yhteisön. Kolmiulotteisten viljelmien erilaistuneiden soluorganisaatioiden toiminta voi hämmästyttävällä tavalla muistuttaa niiden alkuperäisiä toimintoja kudoksessa (Yamada ja Cukierman 2007). Solut järjestyvät rakenteiksi kolmiulotteisessa tyvikalvomatriksissa Kolmiulotteisessa soluviljelyssä solut kasvatetaan joko geelimäisen väliaineen eli matriksin päällä taikka kokonaan tai osittain sen sisällä (kuva 1). Nämä geelit mallintavat soluväliainetta, useimmiten juuri tyvikalvoa. Tyvikalvo on järjestynyttä soluväliainetta, eräänlainen Kaksiulotteinen soluviljelmä Kolmiulotteinen soluviljelmä Kuva 1. Kaksi- ja kolmiulotteisen epiteelisoluviljelmän vertailu. Petrimaljalla solut kasvavat mattona muovimaljan pohjalla. Kolmiulotteisessa viljelmässä solut kasvat väliaineessa muodostaen epiteelisoluille tyypillisiä liitoksia solujen välille ja tyvikalvoon, mikä mahdollistaa erilaistuneiden pallomaisten epiteelirakenteiden muodostumisen. 2445 Soluviljelyn uudet ulottuvuudet muovilta matriksiin

KATSAUS 8 8 8 8 2446 YDINASIAT Kolmiulotteisessa soluviljelmässä soluja kasvatetaan muovimaljan sijaan geelimäisessä tyvikalvon komponentteja sisältävässä väliaineessa. Epiteelisolut erilaistuvat tyvikalvogeelissä ja muodostavat putkimaisia tai rauhasmaisia epiteelirakenteita ja hoitavat solutyypille ominaisia fysiologisia tehtäviä. Kolmiulotteisilla viljelmillä voidaan selvittää syövän geenimuutosten yhteyksiä pahanlaatuiseen kasvuun erilaistuneessa epiteelirakenteessa. Kolmiulotteisilla malleilla on tulevaisuudessa käyttöä translationaalisessa tutkimuksessa mm. lääketutkimuksen ja kudosterapian alueilla. erikoistunut rakenne, joka liittää mm. epiteelija endoteelisolut ympäröivään soluväliaineeseen. Lisäksi tyvikalvon sisältämät rakenneproteiinit ja kasvutekijät säätelevät solujen jakautumista, erilaistumista, apoptoosia ja solujen migraatiota eli kykyä vaeltaa väliaineeseen (Yamada ja Cukierman 2007). Syöpäsoluille tyvikalvo muodostaa merkittävän esteen väliaineeseen tunkeutumiselle eli invaasiolle (Bono ja Salmi 2004). Erilaisia tyvikalvomatrikseja on käytetty selvittämään solujen adheesio-ominaisuuksia ja invasiivisuutta (Sahai 2005). Solujen tehokas tunkeutuminen väliaineeseen edellyttää soluilta nopean liikuntakyvyn lisäksi myös kykyä pilkkoa tai muokata väliainetta esimerkiksi matriksin metalloproteinaasien vaikutuksella. Siksi invasiiviset solut etenevät matriksissa ripeimmin. Varsinaisesti kolmiulotteisilla viljelmillä kuitenkin tarkoitetaan tyvikalvomatriksissa muodostuvia erilaistuneita solukkorakenteita, jotka muistuttavat muodoltaan ja toiminnaltaan niitä kudosrakenteita, joista solut alun perin on eristetty (kuva 1). Tyvikalvomatriksi saa aikaan mm. verisuonten ja imusuonten endoteelisolujen sekä epiteelisolujen erilaistumisen. Erilaistumiseen liittyy erikoistuneiden liitosten kuten vyö- eli adheesioliitosten, tiiviiden liitosten ja desmosomien muodostuminen vierekkäisten solujen välille ja hemidesmosomien muodostuminen tyvikalvoon. Solujenväliset liitokset antavat mekaanista tukea ja lisäksi ohjaavat solupolaarisuuden muodostumista eli tiettyjen proteiinien ja lipidien epäsymmetristä järjestymistä solun apikaali- ja basaalipuolelle (Martin-Belmonte ja Mostov 2008). Tällaiset solut organisoituvat eli muodostavat useista soluista koostuvia järjestäytyneitä rakenteita. Endoteelisolut esimerkiksi järjestyvät suonia muistuttaviksi tubulusrakenteiksi, joiden sisään muodostuu erilaistumisprosessin aikana tyhjä ontelo eli luumen solunsisäisten vakuolien sulautuessa yhteen (Davis ja Camarillo 1996). Endoteelikasvutekijöiden ja tuumorisolujen vaikutusta endoteelin muodostumiseen on selvitetty mm. matrigeelityynykokein (matrigel plug). Tässä liukoiseen matrigeeliin lisätään angiogeenisia tekijöitä (soluja, kasvutekijöitä) ja näin rikastettu matrigeeli ruiskutetaan hiiren ihon alle. Matrigeeliin lisätyt tekijät houkuttelevat endoteelisoluja vaeltamaan matrigeelityynyn sisään ja muodostamaan siinä verisuonen kaltaisia rakenteita (Norrby 2006). Tyyny voidaan poistaa ja siihen kasvaneiden suonten määrä ja laatu analysoida tavanomaisin histologisin menetelmin. Useimmat epiteelisolutyypit, kuten suolen, maksan, sylkirauhasen, munuaisen, eturauhasen ja rinnan epiteelisolut, myös erilaistuvat ja muodostavat kolmiulotteisia rakenteita tyvikalvogeelissä (Kleinman ja Martin 2005). Tyvikalvokontakti saa epiteelisolut muodostamaan pallomaisia rauhasen kaltaisia tai putkimaisia tubuluksen kaltaisia rakenteita (kuva 2). Moniin epiteelisolurakenteisiin muodostuu niiden kehityksen aikana luumen, ja polaarisuuden ansiosta solut osaavat erittää liukoisia tekijöitä oikeaan suuntaan eli juuri luumeniin. Erilaistumisprosessi saa epiteelisolut ilmentämään monia niille tyypillisiä fysiologisia piirteitä ja toimintoja. Esimerkiksi päinvastoin kuin petrimaljaviljelmissä, rintaepiteelisoluista kasvatetut kolmiulotteiset rakenteet ilmentävät erilaistuneille epiteelisoluille tyypillisiä proteiineja, kuten estrogeenireseptoria (No- J. Partanen ja J. Klefström

A B Päivä 1 5 10 15 >15 Kuva 2. Asinusrakenteen muodostuminen kolmiulotteisessa viljelmässä. A) Rintaepiteelisolut muodostavat tyvikalvogeelissä solunjakautumisen, apoptoosin ja erilaistumisen kautta asinusta muistuttavia onttoja, pallomaisia epiteelirakenteita. Solupolaarisuuden kehitys alkaa jo rakenteen muodostumisen alkuvaiheessa (punainen väri). Kuvassa tämä on osoitettu basaalisten proteiinien (punainen väri) järjestymisenä tyvikalvoa vasten olevalle solun basaalipuolelle. Rakenteen sisällä olevat solut tuhoutuvat apoptoosin kautta, ja näin syntyy luumen. Lopulta solujen jakautuminen lakkaa ja syntynyt rakenne on toiminnallisesti valmis esimerkiksi tuottamaan hormonaalisen käsittelyn johdosta maitoproteiineja luumeniin. B) Konfokaali-immunofluoresenssimikroskoopilla otettu läpileikkauskuva kehityksen loppuvaiheessa olevasta kolmiulotteisesta asinusrakenteesta. Kuvassa näkyvät solupolaarisuutta osoittava a6-integriiniproteiinin järjestyminen solujen basaalipuolelle (punainen rengas asinuksen ympärillä), siniset tumat, jotka osoittavat solujen paikat, sekä vihreänä apoptoosissa oleva solu luumenin alueella. varo ym. 2003), sylkirauhasen epiteelisolujen tyvikalvossa muodostamat rauhasenkaltaiset rakenteet tuottavat amylaasia (Kleinman ja Martin 2005). Hiiren rintaepiteelisolujen muodostamat rakenteet saadaan prolaktiinistimulaatiolla jopa erittämään maitoproteiineja rakenteiden sisään muodostuneeseen luumeniin (Muschler ym. 1999). Tekotyvikalvot ja yhdistelmäviljelmät Tyvikalvo toimii monien kasvutekijöiden varastona, ja sen koostumus vaikuttaa liukoisten aineiden diffuusionopeuteen ja saatavuuteen soluille (Griffith ja Swartz 2006). Myös tyvikalvon joustavuus aiheuttaa solun tukirankaan vaikuttavan jännitteen, mikä vaikuttaa oleellisesti solujen kasvuun ja käyttäytymiseen (Discher ym. 2005). Tyvikalvo ei siis ole vain passiivinen kasvu- ja rakennusalusta soluille vaan dynaaminen kokonaisuus, joka on jatkuvassa vuorovaikutuksessa solujen kanssa ja siksi tyvikalvon koostumuksella on tärkeä merkitys kolmiulotteisissa malleissa. Kolmiulotteisissa soluviljelmissä käytetään keinotekoisia väliaineita, jotka sisältävät yhtä tai useampaa tyvikalvolle ominaista proteiinia (reconstituted basement membrane, tekotyvikalvo). Yleisesti käytettyjä tekotyvikalvoja ovat erilaiset kollageenigeelit. Lähimmäs luonnollisen tyvikalvon koostumusta päästään kuitenkin uuttamalla tyvikalvoa suoraan biologisesta lähtömateriaalista kuten hiiressä kasvavasta Engelbreth Holm Swarmin (EHS) sarkoomasta (Kleinman ja Martin 2005). Kasvainmateriaalista saadaan kemiallisella uutolla matrigeeliksi kutsuttua väliainetta, joka sisältää runsaasti erilaisia tyvikalvon komponentteja, mm. laminiinia, tyypin IV kollageenia, heparaanisulfaattiproteoglykaaneihin kuuluvaa perlekaania, entaktiinia sekä tyvikalvon tavallisia kasvutekijöitä, kuten fibroblasti- ja epidermaalista kasvutekijää sekä TGF-β-proteiinia (Norrby 2006). Matrigeeli on biologisesti hyvin aktiivinen väliaine, joka kykenee edistämään voimakkaasti haiman, suoliston sekä rinta-, sylki- ja eturauhasen epiteelisolujen erilaistumista (Kleinman ja Martin 2005). 2447 Soluviljelyn uudet ulottuvuudet muovilta matriksiin

KATSAUS 2448 Matrigeelin käytössä tyvikalvon korvikkeena on kuitenkin huomioitava muutamia seikkoja. Vaikka matrigeelin komponentit ja niiden pitoisuudet ovat melko tarkkaan tunnettuja, koostumusta ei ole määritetty tarkasti. Lisäksi matrigeeli edustaa tuumorin tuottamaa tyvikalvoa, joten tyvikalvoproteiinien ja kasvutekijöiden pitoisuudet voivat poiketa merkittävästi normaalista. Käytännön laboratoriotyössä matrigeelin käyttöä myös hankaloittaa tuote-erien vaihteleva kyky saada aikaan haluttuja biologisia vasteita, kuten solujen erilaistumista. Matrigeelin rinnalle on kehitteillä erilaisia synteettisiä hydrogeelejä, joissa itsestään järjestyvistä peptideistä muodostuvat nanokuidut tarjoavat soluille biologisesti aktiivisen kontaktipinnan (Zhang ym. 2005). Näiden synteettisten tekotyvikalvojen etu orgaanisiin tekotyvikalvoihin nähden on vähäinen vaihtelu, ja lisäksi synteettisen valmistustavan vuoksi voidaan tuottaa edullisesti suuria määriä tekotyvikalvoa kerralla. Uusissa synteettisissä tekotyvikalvoissa solujen on havaittu käyttäytyvän hyvin samankaltaisesti kuin matrigeelissä eli ne muodostavat rakenteita, erilaistuvat ja erittävät solutyypille spesifisiä proteiineja (Wang ym. 2008). Kudoksessa tyvikalvoa saartaa strooma, joka sisältää mm. endoteelisoluja, sidekudossoluja, adiposyyttejä eli rasvasoluja sekä immuunijärjestelmän soluja. Strooman solujen tuottamat proteiinit muokkaavat aktiivisesti tyvikalvoa ja vaikuttavat monin eri tavoin epiteelisolujen biologiaan. Usean eri solutyypin yhdistelmäviljelmät eli heterotyyppiset kolmiulotteiset viljelmät pyrkivät mallintamaan mm. strooman ja epiteelin välisiä interaktioita (Schmeichel ja Bissel 2003). Yhdistelmäviljelmillä on osoitettu mm. strooman sidekudossolujen laadun vaikuttavan rintaepiteelin erilaistumiseen ja tuumorista eristetyillä sidekudossoluilla (carcinoma associated fibroblasts, CAF) olevan suuri merkitys rinnan epiteelisolujen kykyyn aiheuttaa pahanlaatuista kasvua (Kalluri ja Zeisberg 2006). Epiteelin ja strooman interaktioiden mallintaminen in vitro olosuhteissa on merkittävä ja haasteellinen tutkimusalue, jonka odotetaan valaisevan lisää esimerkiksi epiteelisyöpien syntyprosessia. Kolmiulotteisilla asinuksilla rintasyövän geenejä metsästämässä Suomessa naisten yleisin syöpä on rintasyöpä, johon sairastuu vuosittain lähes 4 000 naista (www.cancerregistry.fi/tilastot/). Huomattavasti kehittyneet geneettiset seulontamenetelmät mm. perinnöllisen rintasyövän alttiusgeenien löytämiseksi väestöstä ja mikrosiruihin pohjautuvat genominlaajuiset RNA-ekspression profiloinnit ovat tuottaneet valtavasti aineistoa rintasyöpään liittyvistä uusista geneettisistä tekijöistä (Nevanlinna ja Kallioniemi 1999, Monni ym. 2002, Kallioniemi 2003, Erkko ym. 2007). Toisaalta tämä aineiston runsaus on myös luonut usein hyvinkin hypoteettisten syöpägeeniehdokkaiden suman, koska menetelmät, joilla sumaa voitaisiin purkaa eli selvittää suoria syy-yhteyksiä geenien toimintojen ja syövän synnyn välillä, ovat hitaita ja kalliita. Siksi esimerkiksi eläinkokeiden rinnalle olisi tärkeää saada solumalleja, joilla voitaisiin tehokkaasti paljastaa syöpägeeniehdokkaiden mahdollisia yhteyksiä syöpään liittyviin solutai kudosmuutoksiin. Alan pioneeri Mina Bissell ja viime aikoina myös Joan Brugge ryhmineen ovat mielenkiintoisella tavalla valottaneet syövän ja geenimuutosten syy-yhteyksiä kolmiulotteisissa rintaepiteelimalleissa (Debnath ja Brugge 2005, Vargo-Gogola ja Rosen 2007). Rintasyövissä usein havaittuja geenimuutoksia ovat mm. sykliini D1:n, AKT:n ja Her-2:n yliekspressio. Sykliini D1:n yliekspressiolla on melko heikko vaikutus rintaepiteelisoluista kasvatetussa kolmiulotteisessa asinusmallissa. Se saa aikaan lisääntynyttä soluproliferaatiota ja apoptoosia, mutta varsinainen epiteelirakenne ja luumen säilyvät muuttumattomina. Yliekspressoituneella ja yliaktiivisella AKT:llä on näyttävämpiä vaikutuksia. Se vilkastaa huomattavasti solunjakautumista ja kasvattaa solujen kokoa, ja lopputuloksena muodostuu epäsäännöllisiä transformoituneita asinusrakenteita. Rakenteiden kasvu kuitenkin lopulta pysähtyy, eli jonkinlainen epiteelirakenteeseen liittyvä kasvunrajoitus toimii tässäkin tilanteessa. Her-2:lla on merkittävimmät vaikutukset, J. Partanen ja J. Klefström

Kuva 3. Transformoituneita epiteelisoluja kaksi- ja kolmiulotteisissa viljelmissä. Syöpägeenit aiheuttavat soluissa morfologisia muutoksia eli transformaatiota. Kaksiulotteisissa viljelmissä (2D) syöpägeenien aiheuttamat muutokset ovat usein heikosti havaittavissa esimerkiksi solujen muuntuneena morfologiana. Kolmiulotteisessa viljelmässä koko epiteelirakenne muuttuu syöpägeenien toiminnan vaikutuksesta. Kuvassa c-myc-syöpägeeni on aiheuttanut selkeitä muutoksia rintaepiteelisolujen asinusrakenteissa: rakenteiden koko on kasvanut, muoto on muuttunut epäsymmetriseksi ja luumen on kasvanut täyteen soluja. Samankaltaisia muutoksia havaitaan rinnan in situ vaiheen karsinoomissa. Immunofluoresenssikuvissa tumat näkyvät sinisinä ja basaalista solupolaarisuutta osoittava a6- integriini punaisena. Normaalit solut 2D Normaalit solut 3D Transformoituneet solut 2D Transformoituneet solut 3D sillä sen yliaktiivisuus saa aikaan huomattavasti transformoituneen ilmiasun, jossa kolmiulotteisten rakenteiden solut ovat menettäneet polaarisuutensa, jakautuminen on huomattavasti lisääntynyt ja apoptoosi on estynyt. Näiden tekijöiden yhteisvaikutuksena Her-2:ta yliekspressoivat rintaepiteelisolut muodostavat massiivisia epäsäännöllisiä rakenteita, joissa luumen on kasvanut umpeen (Debnath ja Brugge 2005). Tulokset korreloivat mielenkiintoisesti kyseisten geenimuutosten aiheuttamaan syöpävasteeseen siirtogeenisissä hiirissä. Sykliini D1:n yliekspressio aiheuttaa hiirissä yksittäisiä rintakasvaimia, mutta vasta pitkän latenssiajan jälkeen (Hutchinson ja Muller 2000). Sykliini D1:n yksin on siis melko heikko syöpägeeni. AKT ei myöskään yksin altista merkittävästi hiiren rintakudosta syövälle vaan tarvitsee muiden syöpägeenien apua kasvaimenmuodostukseen (Hutchinson ja Muller 2000). Her- 2:n yliekspressio, joka ihmisen rintasyövissä korreloi usein vaikean taudin, huonon ennusteen ja lääkeresistenssin kanssa, taas aiheuttaa hiiren rinnassa invasiivisten adenokarsinoomien muodostumista (Hutchinson ja Muller 2000, Vargo-Gogola ja Rosen 2007). Nämä esimerkit havainnollistavat kolmiulotteisten viljelmien mahdollisuuksia pyrittäessä erottelemaan syövissä tavattavien geenimuutosten sumasta merkityksettömiä muutoksia ja toisaalta jakamaan pahanlaatuista kasvua aiheuttavat muutokset heikkoihin ja vahvoihin»syöpäajureihin». Jyvien seulonta akanoista kolmiulotteisissa viljelmissä auttaa esimerkiksi lääketeollisuutta keskittämään tutkimustaan merkityksellisiin syöpäajureihin. 2449 Soluviljelyn uudet ulottuvuudet muovilta matriksiin

KATSAUS Epiteelirakenne pitää syöpägeenin kurissa Entäpä c-myc, joka on voimakkaasti soluproliferaatiota ohjaava proteiini ja tunnettu vaikuttaja monien eri syöpien synnyssä (Pelengaris ym. 2002)? Soluviljelmissä c-myc:n yliekspressio saa solut kasvamaan hallitsemattomasti, ja hiiren rintakudoksessa tämä johtaa pahanlaatuisiin muutoksiin, kuten adenokarsinoomien muodostumiseen ( Jamerson ym. 2004). Yllättäen karsinoomat muodostuvat kuitenkin vasta pitkän ajan kuluessa, ja siten on selvää, että kudoksessa on tekijöitä, jotka kykenevät jarruttamaan syövän kehitystä. Apoptoosi rajoittaa merkittävästi c-myc:n kykyä synnyttää syöpää. Entä onko olemassa joitakin epiteelirakenteessa piileviä kasvunrajoitteita? Banaanikärpäsillä tehdyt kokeet ovat aiemmin paljastaneet epiteelirakenteella olevan merkittäviä proliferaatiota hillitseviä ominaisuuksia. Viimeaikaiset omat tutkimuksemme kolmiulotteisilla soluviljelmillä ovat osoittaneet, että sama näyttäisi pätevän myös ihmisen epiteelirakenteeseen. Olemme nimittäin havainneet että c-myc:n aktivaatio asinusrakenteiden muodostumisen aikana aiheuttaa hallitsematonta proliferaatiota ja johtaa kolmiulotteisten rakenteiden transformoitumiseen (kuva 3). c-myc:n kyky aiheuttaa näitä pahanlaatuisia muutoksia kuitenkin yllättäen häviää rinnan epiteelisolujen muodostettua erilaistuneita kolmiulotteisia asinusrakenteita. LKB1-tuumorisuppressorigeenin vaimentaminen puolestaan johtaa epiteelirakenteen rikkoutumiseen, mikä palauttaa c-myc:n kyvyn aiheuttaa hallitsematonta proliferaatiota kehittyneissä asinusrakenteissa (Partanen ym. 2007). Mielenkiintoista on, että epiteelirakenteen rikkoutumisen on pitkään tiedetty korreloivan syöpäsolujen pahanlaatuisuuden lisääntymisen ja invaasiokyvyn kanssa. Myös monen tunnetun tuumorisuppressorigeenin kuten esimerkiksi E-kadheriinin ja PTEN:n toiminta kytkeytyy läheisesti epiteelirakenteen säätelyyn (Wodarz ja Näthke 2007). Siten soluproliferaatiota ja epiteelirakennetta säätelevät mekanismit näyttäisivät kytkeytyvän merkittävällä, joskin vielä melko tuntemattomalla tavalla toisiinsa. Kolmiulotteiset viljelmät antavat uusia mahdollisuuksia selvittää näiden mekanismien liittymistä syövän syntyyn. Lopuksi Epiteelikudoksessa solujen merkittävimmät fyysiset vuorovaikutukset ulkomaailman kanssa tapahtuvat solujenvälisten ja solu-tyvikalvoliitosten välityksellä. Näiden solujen verkostojen merkitys solubiologialle ja yhteydet sairauksiin ovat vasta hiljalleen valkenemassa, ja tätä tutkimusaihepiiriä kolmiulotteiset soluviljelymallit tulevat huomattavasti vauhdittamaan. Kolmiulotteisia viljelmiä käytettäneen tulevaisuudessa myös alentamaan kynnystä erilaisten laajojen geneettisten tai farmakologisten soluseulontojen ja in vivo eläinkokeiden välillä. Esimerkiksi lääkeainetutkimuksissa havaitaan usein, että solukokeet eivät ennusta kovinkaan hyvin lääkeaineiden vaikutuksia prekliinisissä, in vivo- tai kliinisissä tutkimuksissa. Kolmiulotteiset soluviljelmät voivat osoittautua lääkeainetestauksessa huomattavasti perinteisiä solumalleja informatiivisemmiksi ja ennustavammiksi. Näyttöä tästä ovat antaneet mm. Weaver ym. (2002) osoittamalla, että kolmiulotteisella mallilla voidaan todentaa lääkeaineiden kyky tappaa selektiivisesti syöpäsoluja. Kolmiulotteisia soluviljelymalleja tullaan varmasti hyödyntämään myös kantasolututkimuksessa. Erilaisilla väliaineilla on tärkeä rooli alkion kantasolujen erilaistumisessa, ja väliainetta muuntelemalla voitaneen tulevaisuudessa ohjelmoida kantasolujen erilaistumista haluttuun suuntaan (Engler ym. 2006). Yksi näkymä onkin kolmiulotteisten soluviljelmien käyttö tulevaisuudessa tavanomaiseen teolliseen tarkoitukseen eli terapeuttisen biologisen materiaalin tuotantoon, jolloin tässä tapauksessa tuotannon kohteena olisivat solut itse. 2450 J. Partanen ja J. Klefström

Kirjallisuutta Bono P, Salmi M. Solun pinnan adheesiomolekyylit ja syöpä. Duodecim 2004; 120:1211 8. Davis GE,Camarillo CW. An alpha 2 beta 1 integrin-dependent pinocytic mechanism involving intracellular vacuole formation and coalescence regulates capillary lumen and tube formation in three-dimensional collagen matrix. Exp Cell Res 1996;224:39 51. Debnath J, Brugge JS. Modelling glandular epithelial cancers in threedimensional cultures. Nat Rev Cancer 2005;5:675 88. Discher DE, Janmey P, Wang YL. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science 2005;310:1139 43. Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell 2006;126:677 89. Erkko H, Xia B, Nikkilä J, ym. A recurrent mutation in PALB2 in Finnish cancer families. Nature 2007;446:316 9. Griffith LG, Swartz MA. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol 2006;7:211 24. Hahn WC. Immortalization and transformation of human cells. Mol Cells 2002; 13:351 61. Hutchinson JN, Muller WJ. Transgenic mouse models of human breast cancer. Oncogene 2000;19:6130 7. Jamerson MH, Johnson MD, Dickson RB. Of mice and Myc: c-myc and mammary tumorigenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2004;9:27 37. Kallioniemi A. Geenisirut kristallipalloina. Duodecim 2003;119:1101 2. Kalluri R, Zeisberg M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer 2006;6:392 401. Klefström J, Alitalo K. Lentivirukset hyötykäyttöön. Duodecim 2003;119:1917 9. Kleinman HK, Martin GR. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol 2005;15:378 86. Martin-Belmonte F, Mostov K. Regulation of cell polarity during epithelial morphogenesis. Curr Opin Cell Biol 2008; 20:227 34. Monni O, Hautaniemi S, Kallioniemi O. Geenisirutekniikka ja siihen liittyvä bioinformatiikka. Duodecim 2002;118:1157 66. Muschler J, Lochter A, Roskelley CD, Yurchenco P, Bissell MJ. Division of labor among the alpha6beta4 integrin, beta1 integrins, and an E3 laminin receptor to signal morphogenesis and beta-casein expression in mammary epithelial cells. Mol Biol Cell 1999;10:2817 28. Nevanlinna H, Kallioniemi OP. Perinnöllisen rintasyövän alttiusgeenit Suomessa. Duodecim 1999;115:2365 74. Norrby K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med 2006;10:588 612. Novaro V, Roskelley CD, Bissell MJ. Collagen-IV and laminin-1 regulate estrogen receptor alpha expression and function in mouse mammary epithelial cells. J Cell Sci 2003;116:2975 86. Partanen JI, Nieminen AI, Mäkela TP, Klefström J. Suppression of oncogenic properties of c-myc by LKB1-controlled epithelial organization. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:14694 9. Pelengaris S, Khan M, Evan G. c-myc: more than just a matter of life and death. Nat Rev Cancer 2002;2:764 76. Sahai E. Mechanisms of cancer cell invasion. Curr Opin Genet Dev 2005;15:87 96. Saksela K. RNA-interferenssi virustautien torjuntaan? Duodecim 2002;118:2191 8. Schmeichel KL, Bissell MJ. Modelling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci 2003; 116:2377 88. Vargo-Gogola T, Rosen JM. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer 2007;7:659 72. Wang S, Nagrath D, Chen PC, Berthiaume F, Yarmush ML. Three-dimensional primary hepatocyte culture in synthetic self-assembling peptide hydrogel. Tissue Eng Part A 2008;14:227 36. Weaver VM, Lelievre S, Lakins JN, ym. Beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell 2002;2:205 16. Wodarz A, Nathke I. Cell polarity in development and cancer. Nat Cell Biol 2007; 9:1016 24. Yamada KM, Cukierman E. Modelling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell 2007;130:601 10. Zhang S, Gelain F, Zhao X. Designer selfassembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin Cancer Biol 2005;15:413 20. JOHANNA PARTANEN, FM JUHA KLEFSTRÖM, akatemiatutkija Helsingin yliopiston biolääketieteen laitos ja genomibiologian tutkimusohjelma Biomedicum Helsinki 00014 Helsingin yliopisto Sidonnaisuudet: Tutkimusryhmälle on myönnetty tutkimusapuraha Orion Oyj:n rahastosta. Orion ei osallistu ryhmän tekemän tutkimuksen suunnitteluun eikä toteutukseen.