Histologinen valmiste/ 2012/ Solubiologia ja peruskudokset-jakso/ Biolääketieteen laitos/ anatomia Mikroskoopit ja histologinen valmiste (RP6 s1-17) Alberts et al.: Molecular Biology of The Cell 5.ed, 2008 Histologinen valmiste Valo- ja elektronimikroskooppien Garland Science ilman värjäystä vertailu Viljelty solu valomikroskoopissa Sama solu vaihevastakohta valomikroskoopissa Sama interferenssi (Nomarski)-optiikalla Lähde: Alberts Solun ääriviivat erottuvat vaivoin. Solun sisällä erottuu vain jokunen jyvänen Solun ja tuman ääriviivat erottuvat. Sytoplasman rakenteita erotettavissa. Samat asiat erottuvat, mutta muodostavat korkokuvan. silmä Elektronimikroskopiaa varten kudos värjätään raskasmetalleilla: - Osmium tetroksidi, - Uranyl asetaatti - Lyijysitraatti Raskasmetallikertymä pysäyttää elektronit tumma kohta. Elintä tai kudospalaa ei voi tarkastella sellaisenaan solukerrokset projisioituvat päällekkäin. Ratkaisu: Tehdään ohut leike ja värjätään se histologinen valmiste. Tässä kasvin juuren kärjen poikkileikkaus. Gartner-Hiat Gartner and Hiat: Color Textbook of Histology, Saunders Valomikroskooppi Läpäisy elektronimikroskooppi Histologisen valmisteen teko (RP6 s1-3; 5-6) Kudoksen rakenteen säilymisen varmistaminen: Kiinnittäminen taphtuu yleensä formaldehydin vesiliuoksella (=formaliini). Formaldhydi reagoi makromolekyylien kanssa, denaturoi ja liittää molekyylejä toisiinsa, jolloin ne sakkautuvat (eivät ole vesiliukoisia) ja jäävät näytteeseen. Kiinnittäminen ei pidättele kaikkia molekyylejä, pienet vesiliukoiset molekyylit katoavat, myös osa isommista molekyyleistä liukenee jatkokäsittelyissä pois näytteestä. Näytteessä oleva vesi korvataan ensin alkoholilla, sitten xyleenillä ja lopuksi kuumalla parafiinilla, joka jäähtyessään jähmettyy. Vaihtoehtoinen menettely: jääleike. Alkoholisarjat ja xyleeni ennen ja jälkeen parafiinin liuottavat tehokkaasti kaikki rasvat pois leikkeestä. Histologisen valmisteen teko 1) Kiinnittäminen - formaliiniliuos yleisin - jotta kudos kestäisi jatkokäsittelyt 2) Leikkaamisen valmistelu dehydraatio - alkoholisarja (50%,70%, 95%, abs, abs) paraffiinivalu - xyleenin kautta pehmeää kudosta ei voi leikata, parafiini kovettaa kudoksen 3) Leikkaaminen - 5-10 mikronia 4) Värjäyksen valmistelu = parafiinin poisto xyleenillä ja vesiliuokseen vienti (käänteinen alkoholisarja), koska parafiini estää värin tarttumisen 5) Värjääminen - esim. hematoksyliini-eosiini (HE) tapahtuu yleensä vesiliuoksessa 6) Kestovalmisteen teko - näyte päällystetään peitinlasilla Histologinen värjäys, hematoksyliini (HEvärjäyksen H) - Hematoksyliini (sininen) on emäksisesti käyttäytyvä väri, joka ionisoituu vesiliuoksessa positiiviseksi ioniksi (kationi) - Positiivisesti varautunut väriaineioni sitoutuu kudoksen negatiiviseen varaukseen. Hematoksyliini sitoutuu kohteeseensa suhteellisen pysyvästi - Kudoksessa erityisesti DNA ja RNA (A=acid) varautuvat negatiivisesti (fosfaattiryhmät) - Pääsääntö: Näytteessä DNA ja RNA värjäytyvät siten emäksisellä värillä (=basofiilisesti) - Värjäytymisen näkyminen valomikroskoopissa vaatii sen, että värjäytyvää yhdistettä on riittävän tiheästi pakkautuneena (suuri konsentraatio) laimea väri ei erotu. - myös happamat proteiinit ja esim. ruston glucosaminoglykaanien (GAG) sulfaatti ryhmät varautuvat negatiivisesti. Histologinen värjäys (Hematoksyliini) 1) Hematoksyliini (sininen) on emäksisesti käyttäytyvä väri, joka ionisoituu positiiviseksi ioniksi (kationi) 2) Kudoksessa erityisesti DNA ja RNA varautuvat negatiivisesti luovutettuaan H + :n 3) Positiivisesti varautuneet hematoksyliiniionit sitoutuvat kudoksessa negatiivisiin varauksiin 4) Näytteessä DNA ja RNA värjäytyvät siten hematoksyliinilla, (emäksisellä värillä basofiilisesti) Tässä erityisesti plasmasolujen tumat Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri DNA Väri Väri RNA Väri.
Tuma Tuma sisältää värjäyksen kannalta tärkeät: kromatiini ja tumajyvänen (nukleolus) Aktiivisesti luettava kromatiini on avoin ja muodostaa löyhän rakenteen = eukromatiinin löyhästi pakattu eukromatiini värjäytyy heikosti suuri määrä eukromatiinia kertoo aktiivisesta solusta tuma on samalla iso ja siinä on iso tumajyvänen Passiivinen kromatiini on pakattu tiiviisti syrjään heterokromatiiniksi tiiviisti pakattu heterokromatiini sitoo paljon väriä tilavuusyksikköä kohti ja värjäytyy intensiivisesti hematoksyliinilla passiivisen solun kromatiini on pääosin tiiviisti pakattua, tuma on silloin pieni ja hyvin tumma Iso tumajyvänen, nukleolus kertoo runsaasta ribosomin osien valmistamisesta ja aktiivisesta solusta - ribosomin osaset sisältävät paljon RNA:ta joten nukleolus värjäytyy voimakkaasti hematoksyliinilla - erityisen hyvin iso nukleolus erottuu kun sen ympärillä on runsaasti eukromatiinia - kumpikin kertoo aktiivisesta solusta Tuman ja nukleoluksen rakenteita H = Heterokromatiinia E = Eukromatiinia H = Heterokromatiinia NL = Nucleolus. Tumajyväsen osia: F = Fibrillar, säikeinen osa G = Granular, jyväsellinen osa NOR = Nucleolar organizing region Eukromatiini ja heterokromatiini C = heterokromatiinia, tiiviisti pakattua DNAta, joka värjäytyy voimakkaan basofiilisesti. N=nucleus, tuma Nucleolus NL = nucleolus, tumajyvänen sisältää runsaasti r-rna:ta ja värjäytyy siksi basofiilisesti. Neuronin tumassa on runsaasti auki purkautunutta, luettavaa kromatiinia = eukromatiinia. Värjäytyvyys on heikko koska DNA on niin laimeana liuoksena. Karkeapintainen endoplasmakalvosto RER värjäytyy voimakkaasti basofiilisesti (hematoksyliinilla siniseksi) koska sisältää suuren määrän ribosomeja pienellä alueella. Isossa hermosolussa RER muodostaa sisternoiden kasaumia, jotka näkyvät histologisessa näytteessä läiskinä, Nisslin jyväsinä.
Histologinen värjäys, eosiini (HE-värjäyksen E) (punainen) on hapan väriaine, joka ionisoituu vesiliuoksessa negatiiviseksi ioniksi (anioni). Negatiivisesti varautunut eosiini sitoutuu kudoksen positiivisiin varauksiin Histologinen värjäys () (punainen) on hapan väriaine, joka ionisoituu negatiiviseksi ioniksi (anioni) - - - - - - proteiini - - Kudoksen proteiinien aminoryhmät varautuvat vesiliuoksessa positiivisesti. Pääsääntö: Näytteessä proteiinit värjäytyvät happamalla väriaineella (=asidofiiisesti) eli HE-värjäyksessä eosinofiilisesti. Tässäkin tapauksessa väriaineen näkymisen mikroskoopissa määrää yhdisteen määrä ja pitoisuus ainoastaan riittävän iso määrä riittävän tiheässä kerää tarpeeksi väriainetta näkyäkseen. Kudoksen proteiinien aminoryhmät varautuvat positiivisesti Negatiivisesti varautunut eosiini sitoutuu kudoksen positiivisiin varauksiin. Näytteessä proteiinit värjäytyvät eosinofiilisesti (=asidofiiisesti) Tässä lihassolun proteiinit Sytoplasma - sisältää runsaasti proteiineja ja värjäytyy punaiseksi eosiinilla (eosinofiilisesti) Soluväliaineen proteiinit (kollageeni) - värjäytyvät eosinilla Sileäpintainen endoplasmakalvosto - sisältää kyllä proteiineja, mutta ei runsaammin kuin sytoplasma, joten jää värjäytymättä tai vaaleaksi Mitokondriot - sisältävät runsaasti proteiineja; mitokondriokertymät värjäytyvät eosinofiilisesti; esim. steroideja syntetisoivat solut Eritejyväset - värjäytyvät sen mukaan mitä sisältävät - proteiinit (kuten haiman zymogeenijyväsissä) värjäytyvät jälleen punaisiksi eosiinilla Rasva - neutraalit rasvat liukenevat pois näytteestä voimakkaiden rasvaliuottimien (alkoholi ja xyleeni) takia - rasvat saadaan säilymään erikoiskäsittelyillä (glutaraldehydi-osmiumtetroksidi fiksaatio ja erikoisvärjäykset, myös jääleiketekniikka) Rasvapisarat liukenevat tavallisesti pois Rasvasolun sytoplasma erottuu ohuena juosteena kadonneen rasvapisaran ympärillä. Verisuoni Erikoismenetelmillä rasva saadaan säilymään ja voidaan värjätä. Lähde: N = rasvasolun tuma T = triglyseridejä; V = verisuoni
Hiilihydraatit PAS värjäys (RP5 s6-7) - esimerkkinä pikarisolu, jonka eritejyväset erottuvat värjäytymättöminä läiskinä epiteelissä - maksasolun glykogeenikaan ei normaalisti erotu HEväjäyksessä - histokemiallinen PAS-värjäys (Perjodihappo-Schiff) on yleisin värjäysmenetelmä hiilihydraateille. Siinä perjodihappo aiheuttaa aldehydi-ryhmien muodostumisen hiilihydraatti- molekyyleihi. Schiffin reagenssi reagoi aldehydiryhmien kanssa ja värjään siten hiilihydraatit. Hiilihydraatit eivät värjäydy hematoksyliini-eosiinivärjäyksellä. Pikarisolujen erite näyttäytyy epiteelin värjäytymättömänä alueena. PAS-värjäys PAS-värjäys (Perjodihappo-Schiff) on histokemiallinen värjäysmenetelmä hiilihydraateille. Se värjää pikarisolun eritteen kirkkaan punaiseksi. Värjää myös tyvikalvon glykoproteiinit ja glykokalyksin punertavaksi Erikoisvärjäyksiä - elastiinille (Weigert van Gieson trikromivärjäys) - retikuliinisäikeille hopeavärjäys - May-Grunwald-Giemsa sivelyvalmisteille Erikoisvärjäyksellä voidaan erottaa elastiini kollageenista ja solun sisäisistä proteiineista Elastiini- ja retikuliinisäikeiden värjäyksiä Hopeavärjäys värjää hennot retikuliinisäikeet imusolmukkeen tukikudoksessa Lähde: Lähde: S = sileälihassolun sytoplasma; C = kollageeni; Nuolet = elastiinilevyissä olevat aukot Immunohistokemia (RP6 sivut 7-10) Immunohistokemiassa käytetään hyväksi elimistön immuunipuolustusjärjestelmän tuottamia vasta-aineita (antibody). Kukin vasta-aine tunnistaa tietyn molekyylirakenteen (antigeenin) hyvin spesifisesti ja sitoutuu vain siihen kudosnäytteessä. Sitoutunut vasta-aine voidaan tämän jälkeen tehdä näkyväksi, jolloin antigeeninkin sijainti paljastuu. Vasta-aineen tuottaminen: 1. eristetään ja puhdistetaan tutkittava molekyyli, yleensä proteiini tai peptidi 2. rokotetaan vasta-ainetta tuottava eläin, esim. kani tällä antigeeni-preparaatilla (+tehoste) 3. annetaan tehosterokotteita kunnes vasta-ainetuotanto on riittävää 4. otetaan rokotetulta verta, eristetään ja puhdistetaan vasta-aineet. Saadaan saaliiksi polyklonaalinen vasta-aine (useita eri vasta-ainemolekyylejä saman proteiinin eri osia vastaan) Monoklonaalisen vasta-aineen (vain yksi vasta-ainemolekyyli proteiinin yhtä osaa vastaan) tuottaminen tapahtuu edellisten vaiheiden jälkeen soluviljely- ja hybridiaatiotekniikoita käyttäen. Värjääminen: Suora immuunireaktio: Kudosleikettä käsitellään sopivan vahvuisella vasta-aineliuoksella. Vasta-aine tarttuu spesifisesti antigeeniinsä. Kun vasta-aineeseen on jo aiemmin liitetty merkkiaine, esim. fluoresceiini-molekyyli voidaan näytettä tarkastella ultraviolettivalaistuksessa fluoresenssimikroskoopilla, jolloin merkkiaine loistaa vihreänä tummaa taustaa vasten niissä kohdissa, joihin vasta-aine on sitoutunut eli etsittävän antigeenin sijaintipaikalla. Epäsuorassa immuunireaktiossa spesifisyyttä on pystytty parantamaan sillä että primaarivasta-aineeseen ei liitetä merkkiainetta vaan primaarisen vasta-aineen sijainti osoitetaan toisella, helpommin tuotettavissa olevalla ja sopivasti merkityllä vasta-aineella, esim lampaassa tuotettu anti-kani-igg vasta-aine. Ks oheinen kuva.
Epäsuoran immunohistokemiallisen tekniikan perusta antigeenissa oleva antigeeninen rakenne A Lähde: Alberts et al.: Molecular Biology of The Cell, Garland Science Kuvassa primaarisena vasta-aineena on kanin tekemät vasta-aineet antigeeni A:ta kohtaan. Nämä vasta-aineet sitoutuvat antigeenin kahteen eri epitooppiin (kohtaan). Kuvan sekundaariseen vasta-aineeseen on kiinnitetty fluoresoiva merkkimolekyyli. Sekundaarinen vasta-aine on tehty lampaassa ja se tunnistaa kanin vasta-ainemolekyylin Fc-osan (toinen pää). Markkerina voi olla vasta-aineeseen kytketty fluorokromi tai entsyymimolekyyli tai kultapartikkeli. Virtanen, Ismo Ihmisen munuaisen putkiston tyvikalvo on tässä kuvassa visualisoitu käyttäen hyväksi vasta-ainetta laminiinin alfa1-ketjua vastaan. Värjäys näyttää tyvikalvon punaisena nauhamaisena rakenteena. Alkaalinen fosfataasi anti-alkaalinen fosfataasi(apaap) menetelmä. Virtanen, Ismo Lasilevyllä viljeltyjä ihmisen fibroblasteja, jossa kynsimäiset tarttumispisteet (focal plaque) on saatu näkyviksi käyttäen anti-taliini vasta-ainetta. Sekundäärinen vasta-aine on fluoreseiini-konjugoitu. Mikrofilamenttien aktiiniproteiini pn värjätty punaiseksi rodamiini-falloidiini-koettimella. Hybridisaatiotekniikat (RP6 sivut 10-12) Perustuu siihen, että yksinkertainen RNA tai DNA ketju (probe, koitin) sitoutuu spesifisesti vastinsekvenssiinsä kohteessa (DNA, mrna). Reaktio tapahtuu niin liuoksessa kuin keinotekoisella alustalla, esim. nitroselluloosakalvolla tai geelissä. Kun reaktion annetaan tapahtua kudosleikkeessä puhutaan in situ hybridisaatiosta. Koittimet merkitään merkkiaineella, usein fluoresoivalla. Kun kukin koitin voidaan merkitä erilaisella fluoresoivalla molekyylillä voidaan samasta näytteestä osoittaa suurikin määrä DNA:n osasia, ks. kirjan kuva 3.3 sivulla 76. Kudoksissa voidaan tällä tekniikalla osoittaa tietyn mrna:n esiintyminen, mikä merkitsee, että solu parhaillaan valmistaa sitä vastaavaa proteiinia. Immunokemialla voidaan osoittaa proteiinin esiintyminen solussa, mutta silloin ei ole tietoa milloin proteiini on valmistettu.