Genomi- ilmentymisen säätely Samuel Myllykangas, FT Biolääke=eteen laitos Helsingin yliopisto 21.1.2014 Geeni- ilmentyminen Johdanto Säätely Tutkimusmenetelmät Luennon runko 1
Johdanto Monisoluisen organismin kaikissa soluissa on sama DNA Johdanto Monisoluisen organismin kaikissa soluissa on sama DNA 2
Johdanto Eri solutyypeissä ilmentyvät eri geenit RNA:n ilmentyminen (mikroarray) Proteiinien ilmentyminen (2D gel electrophoresis) - - - - - Yleiset prosessit (RNA polymeraasi) Erityiset prosessit (Hemoglobiini) 30-60% geeneistä ilmentyy soluissa Geeni- ilmentymisen taso vaihtelee Proteiini- ilmentymisen erot ovat suuria Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Johdanto Ympäristö vaikuuaa geenien ilmentymiseen Sisäises=: - Kasvutekijät - Hormonit - Metabolii=t - Signaaliproteiinit - Kemikaalit Ulkoises=: - Kemikaalit - Lääkkeet - Lämpö=la - Valo 3
Johdanto Geeni- ilmentymistä säädellään useilla mekanismeilla Johdanto Monisoluisen organismin kaikissa soluissa on sama DNA Eri solutyypeissä ilmentyvät eri geenit Ympäristö vaikuuaa geenien ilmentymiseen Geeni- ilmentymistä säädellään useilla mekanismeilla 4
Geeni- ilmentymisen säätely 1. Transkrip=o 2. RNA:n prosessoinnin säätely 3. RNA:n kuljetuksen säätely 4. Translaa=on säätely 5. mrna:n hajotuksen säätely 6. Proteiinin ak=ivisuuden säätely 1.- 5. Ei- koodaavat RNA:t Transkrip=on jälkeinen säätely Transkrip=on säätely Geeneissä on ilmentymistä sääteleviä sekvenssejä Säätelyproteiinit sitoutuvat DNA:han DNA heliksi DNA sekvenssi Proteiinirakennetunnistus Sp1: 5 - GGGCGG 3 3 CCGGCC 5 GATA1: 5 TGATAG 3 3 ACTATC P53: 5 GGGCAAGTCT 3 3 CCCGTTCAGA 5 Transkrip=otekijät tunnistavat sekvenssin DNA kaksoiskierteen ulkokehältä 5
21/01/14 Transkrip=on säätely Geenien säätelyproteiinit sitoutuvat DNA:han Heliksi- mutka- heliksi Homeodomain Sinkki- sormiproteiinit Heliksi- luuppi- heliksi B- laskos Transkrip=on säätely Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla E. colin tryptofaanikytkin - Tryptofaanin synteesin geenien operoni - Yksi promoouori - Säätelyelemen\ OperaaUori - Tryptofaanirepressori 6
Transkrip=on säätely Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla Transkrip=on säätely Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla DNA- luupit lisäävät säätelyproteiinien välistä vuorovaikutusta Bakteereissa säätely toimii yksinkertaisten DNA luuppien välityksellä 7
Transkrip=on säätely Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla Eukaryoo\solujen geenien ilmentymistä säädellään monimutkaisten kytkimien avulla Eukaryoo=t Bakteerit 5 yleistä transkirp=otekijää Sigma- yksikkö YksiUäisten geenien säätely Satoja säätelyproteiineja MediaaUori Kroma=ini Operonit Muutama säätelyproteiini - - Transkrip=on säätely Eukaryoo\nen transkrip=on säätely on monimutkaista DNA sekvenssi - PromooUori - Säätelyalueet - Enhancer- alueet Proteiinit - Yleiset transkrip=otekijät - Säätelyproteiinit - RNA pol II - MediaaUori Säätelyproteiinien synergia - DNA:han sitoutuminen - Repressorit - Ak=vaaUorit - InsulaaUorit 8
Transkrip=on säätely Eukaryoo\nen transkrip=on säätely on monimutkaista Transkrip=on aloitus Transkrip=on säätely (enhancers, repressors) Yksilönkehitys (mm. HOX- geenit) Tumareseptorit (estrogeenireseptori) Reagoin= ympäristötekijöihin, esim. solustressi (heat shock faktori) Solusyklin säätely (onkogeenit, kasvaimenestäjägeenit, esim. MYC, p53) 1/3 ihmisen kehityshäiriöistä johtuu transkrip=ofaktoreiden häiriintyneestä toiminnasta Transkrip=on säätely Eukaryoo\nen transkrip=on säätely on monimutkaista DNA on pakaku histoneihin - Säätelyproteiinit eivät sitoudu DNA:han - Kroma=inia muokataan aukaisemalla pakkaus - Pakkaus palautuu vaihtelevas= transkrip=on jälkeen - RNA pol II avaa histonipakkausta edellä ja sulkee jäljessä 9
Transkrip=on säätely Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Prokaryooteilla useita genee\siä mekanismeja Faasimuuntelu (Geenien ilmentymiseen vaikuuavat DNA muutokset) Pariutuminen (Geenien vaihtoa bakteerisolujen yhdistymisessä) Kahden proteiinin piiri (lambda phage prophage - > ly=c) Eukaryoo\solujen erilaistuminen Solumuis= (järjestäytyneet kudokset ja erilaistuneet solut) Säätelypiirit Luupit Loogiset operaa=ot Transkrip=on säätely Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Feedback loopit Ajallisia muutoksia 10
Transkrip=on säätely Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Proteiinit säätelevät useiden geenien ilmentymistä Yksi proteiini voi aloikaa lihassolun erilaistumisen Transkrip=on säätely Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Epigenee\set vaihtelut aiheuuavat muutoksia geenien ilmentymisessä Kovalen\siä muutoksia DNA:n rakenteessa muua DNA:n sekvenssi ei muutu (epi- = päällä, ulkona, ympärillä) Vakaita ja pitkäaikaisia vaikutuksia, jotka voivat siirtyä tytärsoluille (epigenee\nen periytyminen) Cytosine 5- Methylcytosine 11
Transkrip=on säätely Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä EpigeneeOset merkit muukuvat elämän aikana EpigeneOset muutokset Erilaiset solut Muutostekijät Transkrip=on säätely Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä EpigeneeOset mekanismit Sukupolvien väliset epigeneeoset vaikutukset 12
Transkrip=on säätely Geenien säätelyproteiinit sitoutuvat DNA:han Geeni- ilmentymistä säädellään kytkimien avulla Eukaryoo\nen transkrip=on säätely on monimutkaista Erikoistuneiden solujen muodostuminen vaa=i tarkkaa geeni- ilmentymisen säätelyä Transkrip=on jälkeinen säätely 13
Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Alkukantainen geenisäätely Ribokytkimet Transkrip=o pysähtyy Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Vaihtoehtoinen RNA:n silmukoin= 14
Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Pilkkominen Vasta- aine- erityksen säätely - - - Membraaniproteiini (pitkä) EriteUy proteiini (lyhyt) CstF alayksikkö Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n prosessoinnin säätely Editoin= Lukuraamin ja sekvenssin muutokset U nukleo=dejä voidaan lisätä mitokondrion RNA:han Emäsmuutokset Adeniinin deaminaa=o - > Inosine Cytosiinin deaminaa=o - > Uracil 15
Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n kuljetuksen säätely Transkrip=on jälkeinen säätely Translaa=on säätely 5 ja 3 ei- transloidut alueet (UTR) Aloitustekijä fosforylaa=o UTR säätely Lämpösensori Ribokytkin An=sense RNA 16
Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n hajotuksen säätely Eksonukleaasit hajouavat nopeas= RNA:ta Alkaa poly- A:sta 5 hupun poisto 3 UTR sekvenssit sitovat suoja- tai proteiineja Transkrip=on jälkeinen säätely RNA:n prosessoin= RNA:n kuljetus Translaa=on säätely RNA:n hajotuksen säätely 17
Pienet ei- koodaavat RNA:t 22 nt pitkä >1000 mirna:ta Säätelevät 60% geenejä Emäspariutuminen mrna:n translaa=on heikentyminen mrna:n hajotus Evoluu=ossa konservoituneet Ei- koodaavat RNA:t Pitkät ei- koodaavat RNA:t >200 nt pitkä 80% transkripteista 35 000 transkrip=a 10 000 lncrna lokusta MuistuUaa rakenteellises= mrna:ta muua ei sisällä avointa lukuraamia Evoluu=ossa ei- konservoituneet Pieni osa toistaiseksei osoiteuu toiminnalliseksi Ei- koodaavat RNA:t 18
Geeni- ilmentymisen tutkimusmenetelmät RNA- DNA hybridisaa=o PCR Kroma=ini immunopresipitaa=on DNA mikroarray Uuden polven sekvensoin= RNA häirintä (RNAi) Molekyylibiologian keskeinen oppi Epigenetic modification DNA Replication MiRNA Reverse Transcription Translation RNA Transcription RNA replication Protein 19
DNA:n tutkimusmenetelmät Publications in PUBMED 40,960 20,480 10,240 5,120 2,560 1,280 640 320 160 DNA Genome ISH DNA sequencing Southern blot RFLP PCR DNA fingerprinting CGH 80 Bioinformatics 40 20 10 Microarray NGS 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 Year Publications in PUBMED 40,960 20,480 10,240 5,120 2,560 1,280 640 320 160 DNA:n tutkimusmenetelmät DNA structure Biochemistry Central dogma Molecular biology Human genome project GENOMICS Human genome DNA Genome ISH DNA sequencing Southern blot RFLP PCR DNA fingerprinting CGH 80 Bioinformatics 40 20 10 1950 1960 1970 1980 Year 1990 2000 2010 Microarray NGS Genome- wide technologies 20
RNA- DNA hybridisaa=o Northern blot Hybridisaa=o (A- T/U, C- G) RNA:n tunnistaminen - Leimatuilla DNA- koe\milla - Elektroforeesi - Nucleiinihappojen siirto kalvolle - Visualisoin= Polymeraasiketjureak=o (PCR) Exponen=al amplifica=on of targets - Heat- stable DNA polymerase - Specific primers (fwd and rev) - Thermal cycling - dntps 21
Kroma=ini- immunopresipitaa=o DNA:n ja proteiinien vuorovaikutusten tutkiminen - Transkrip=otekijät - > promoouori - RNA polymeraasi - > geeni - Histone - > DNA - Perustuu spesifisiin vasta- aineisiin DNA mikroarray DNA- DNA hybridisaa=o DNA mikroarray Geeni- ilmentyminen DNA mikroarraykoe 22
Uuden polven sekvensoin= Sanger DNA sekvensoin= Geeli- elektroforeesisekvensoin= Genomic DNA Fragmented DNA Sequencing library Kapillaarisekvensoin= Immobilization Polony array Cycles Next-generation sequencing A C C G T A T G C T G T A A G C Illumina Genome Analyzer sequencing Library immobilization Bridge amplification *T Reversible terminator nucleotides *T TTTT Dye termina=on sequencing - Single reac=on - Fluorescent dyes - Capillary electrophoresis *T *T TTTTTTTTTTTTT TTTT *T TTTTTTTTTTTTT TTTT T TTTTTTTTTTTTT Uuden polven sekvensoin= Sekvensoin=kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Prepara=on Genomic DNA Fragmented DNA Cloning Amplification Capillary electrophoresis Sanger sequencing Sekvensoin=keskus - Robo=ikkaa - 3 M emästä/päivä 23
Uuden polven sekvensoin= Sekvensoin=kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Prepara=on Genomic DNA Fragmented DNA Cloning Amplification Capillary electrophoresis Sanger sequencing Genomic DNA Fragmented DNA Sequencing library Immobiliza=on Polony array Cycles Next-generation sequencing Laboratorio: 300 000 M/päivä A C C G T A T G C T G T A A G C Uuden polven sekvensoin= Sekvensoin=kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Light microscopy Single molecule Nonop=c In progress Available R&D phase Gnubio Stratos Genomics Halcyon ZS Gene=cs Bionanomatrix Lightspeed Nanophotonics Biosci Base4Innova=on GenizonBioSci LaserGen GE Global Genovoxx Visigen/Starlight Genapsys Mobius Genomics Raveo Nanopore sequencing Nabsys Oxford Nanopore Electronic Biosciences IBM- Roche Genia NobleGen 24
Uuden polven sekvensoin= Sekvensoin=kapasitee\ on lisääntynyt massiivisen parallelisoinnin ansiosta Menetelmät parantuvat ja kustannukset alenevat Illumina MiSeq Virtauskenno (flow cell) Uuden polven sekvensoin= Sekvensoinnin avulla voidaan tutkia geenien ilmentymistä 25
21/01/14 Genomiikan menetelmät siirtyvät lääke=eteen valtavirtaan Genome sequencing CNVs Methylation profiling SNPs Epigenetic modification Reverse Transcription Transcription MiRNA Replication DNA RNA RNA replication Gene expression Translation Protein mirna profiling DNA-protein interactions Koh= yksilöllisiä kohdenneuuja syöpähoitoja Kasvaimesta tunnistetaan hoitokohdemutaa=ot Uuden polven sekvensoin= (DNA, RNA) Bioinforma=ikka (Mutaa=ot) Tulkinta (Hoitokohteet) Heterogeeniset kasvaimet Monimutkaiset muutokset Kohdennetut hoidot 26
Perinnöllisten tau=en diagnos=ikka Hypertrofinen kardiomyopa=a Sydänlihassairaus Voi johtaa äkkikuolemaan Autosomaalises= ja dominan=s= periytyvä History of hypertrophic cardiomyopathy 22 vuo=as nainen Po=lastapaus Diagnoosi 11 vuo=aana Isällä HCM ja 1/5 veljellä johtoratasairaus Geenisekvensoin= paljas= PRKAG2 geenin mutaa=on AiheuUaa johtoratasairauden, vasemman kammion hypertrofian ja AV blokin Lähes 100% penetranssi Tyypillises= ilmenee 20-30 vuoden iässä Korkea äkkikuolemariski ennen 40 vuoden ikää 3500 3331 3000 2500 2000 1500 1000 902 693 1159 1094 500 0 39 189 71 33 71 9 21 27
RNA häirintä (RNAi) Mekanismi RNAi = RNA interference, RNA:n hiljentäminen Molekyylit, jotka hiljentävät RNA:n sirna = small interfering RNA Täydellinen pariutuminen kohde mrna- molekyylin kanssa johtaa mrna:n hajoamiseen mirna = microrna Täydellinen tai epätäydellinen pariutuminen kohde mrna:n kanssa johtaa mrna:n hajoamiseen tai proteiinisynteesin estoon Kokeelliset työvälineet laboratoriossa geenien hiljentämiseen sirna = small interfering RNA shrna = small hairpin RNA RNA häirintä (RNAi) Geenin hiljentäminen RNAi:n avulla Green and red lines show cell index values for two different sirnas the light blue line shows the control without sirna the dark blue and pink lines show controls with inac=ve sirnas. 28
Geeni- ilmentymisen tutkimusmenetelmät RNA- DNA hybridisaa=on avulla voidaan tunnistaa transkripteja PCR:n avulla pystytään monistamaan ja eristämään =euyjä sekvenssejä genomista Kroma=ini- immunoprosipitaa=o mahdollistaa proteiinien ja DNA:n välisten vuorovaikutusten tutkimuksen DNA mikroarrayn avulla voidaan tutkia kaikkien ihmisen geenien RNA- tason ilmentymistä Uuden polven sekvensoin= on kehiuynyt viime vuosina huimas= ja on syrjäyuämässä DNA mikroarrayn Genomiikan menetelmät mahdollistavat yksilölliset hoidot RNAi mahdollistaa =euyjen geenien hiljentämisen koe- eläimessä 29