SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihellitus Patent- och registerstyrelsen (71)Behringwerke Aktiengesellschaft, Förbundsrepubliken Tyskland(DE) Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta- (72)Othmar Ackermann, Marburg/Lahn, Helmut Stegnann, Rilchenbach, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä rokotteen valmistamiseksi kissaeläinten parvovirus-panleukopeniaa vastaan - Förfarande för framställning av vaccin mot parvovirus-panleukopeni hos felider Keksinnön kohteena on menetelmä rokotteen valmistamiseksi kudosviljelmässä kissaeläimien parvovirus-panleukopeniaa vastaan. Kissarutto eli maha-suolitulehdus on kissaeläimille ominainen virussairaus. Elektronimikroskopian mukaan sen aiheuttajan, erään parvoviruksen koko on 20-25 nm. Virus tarttuu hengitys- ja ruoansulatustiehyiden kautta ja poistuu nenäerityksen ja ulosteiden mukana. 2-6 päivän inkubointiajan kuluttua sairaus alkaa ruokahaluttomuutena, kuumena, oksennuksena, yleensä ripulina, lisääntyvänä sätvn voimattomuutena omtoutn ja anseuat nestehukasta johtuvana otvn kuivumisena. uvmsn.tnuoasao Tunnusomaista on erittäin rtän voimakas viaa yleisvalkosolukato livloouao(aluoei) (panleukopenia). Kuolleisuus ulesu on njp jopa 900% %. Sairaudesta aruet parantuneet aatne kissat istoa ovat immuuneja. munj.triadnvl- Ternimaidon välityksellä yslän ne voivat ovtsitävsaania siirtää vasta-aineita nuoriin noinksohn kissoihin. Mutta nämäkin knoa ovat pian insoatma suojattomia, koska ok äidistä iit peräisin eäsnoea olevat vasta-aineet at-iet ää hajoavat hjaa vähitellen. äieln Kissarutto isrtoo on levinnyt eintkikal kaikkialle maapallolle, aplol,j ja sen e aiheuttajan ietaa tarttuvuus atuusj ja patogeenisuus aoensu on neiti erittäin suuri. ur.stnksa Siten kissat ovat vt sille slehvnatit. hyvin alttiita.
60408 Aikaisemmin on jo yritetty saada elävän kissaruttorokotteeri valmistukseen sopiva heikennetty virus kudosviljelmäsarjan avulla (ks. US-patentti 2 293 130). Vähintään kuusi, muttei edes 10-30 vaiheita kuitenkaan riitä pysyvän heikennetyn, rokotteen tehoaineena toimivan viruksen saamiseksi. On nimittäin havaittu, että rokotevirus voi erittyä rokotetusta eläimestä ja joutua muihin kissoihin. Viruksen siirtyessä eläimestä toiseen voi tapahtua takautuvia mutaatioita. Heikennetyn kissaruttoviruksen valmistamiseen on käytetty myös kissan sikiökudosta. Kissan sikiöistä saadaan kuitenkin hyvin vähän kudosta, joten taloudellisista syistä tämä menetelmä on sopimaton. On myös tunnettua pienentää mandollisesti esiintyvä kontaminaatio muilla kissan viruksilla siten, että heikennetty panleukopeniavirus siirretään frettisoluviljelmällä (US-patentti 3 892 627). Nyt on keksitty menetelmä panleukopeniarokotteen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että patogeenista panleukopeniavirusta siirretään sarjana vähintään 80 kertaa kissan munuaissoluilla, ja sitten vähintään 18 kertaa kissaeläimen tai turkiseläimen pysyvillä kudossolulinjoilla, edullisesti Crandell-soluilla, ja viljellään näin saatua heikennettyä virusta kissan sikiösolulinjoilla, jolloin mandollisesti saanto korjataan useita kertoja, jonka jälkeen otetaan heikennetty virus, joka on talletettu merkinnällä CNTCC AO 3/77 laitokseen "Institut fur Hygiene und Epidemiologie", Praha, Tsekkoslovakia, talteen ja työstetään se tavanomaisella tavalla rokotteksi. Heikentämisen ensimmäinen vaihe, joka sopivimmin sisältää 80-100 viljelyvaihetta, suoritetaan kissan munuaissoluviljelmällä. Viljely voi tapahtua tavanomaisissa soluviljelyravinnealustoissa. Soluviljely voidaan suorittaa sekä solupäällys- että solususpensioviljelmänä. Lämpötila pidetään 35 0-39 0 C:ssa, edullisesti 36,5-37,5 C:ssa. Tällainen viljelmä voidaan tartuttaa aikaisin ja viimeistään, kun solut ovat kasvaneet n. 75-%:sesti. Tartuntaväliaineena voidaan käyttää edellisen tartutetun soluviljelmän päällä olevaa nestettä. Uuteen soluviljelmään sitä lisätään suhteessa 1 : 5-1 : 20. Päällä oleva neste voidaan erottaa 2-6 päivää tartuttamisen jälkeen ja siirtää seuraavaan soluviljelmään. Kun kuvatulla tavalla on suoritettu 80-100 siirtoa, viruspitoinen, viljelmän päällä oleva neste siirretään kissaeläimien tai turkiseläimien (Mustelidae) pysyvälle kudossoluviljelmälle. Nämä pysyvät viljelmät ovat tunnettuja kirjallisuudesta. Esimerkki tällai-
3 60408 sista pysyvistä soluviljelmistä on Grandell-solu, joka on kissan pysyvä munuaissolu. Tämän soluviljelmän tartuttaminen tartutetun soluviljelmän päällä olevalla nesteellä ja edelleenkäsittely suoritetaan yllä kuvatulla tavalla. Kun virusta on siirrostettu vähintään 18 kertaa pysyviin kudosviljelmiin, se on heikentynyt riittävästi. Se on täysin tautia aiheuttamaton, vaaraton ja hyvin siedettävissä. Heikennys ei vaikuta immunointikykyyn, ja viruksesta valmistetulla rokotteella on erinomaiset immunointiominaisuudet. Heikennetty virus, jonka tieteellinen nimitys on "Panleukopenia-virus, kanta BW 103", on deponoitu numerolla CNTCC AO 3/77 (Institut fiir Hygiene und Epidemiologie, Praha). Tällä tavalla heikennettyä virusta voidaan lisätä kissan sikiöiden kudosviljelmissä. Erityisen sopivia ovat sikiöt, jotka on erotettu elinten kehitysvaiheessa, so. raskauden viimeisellä kolmanneksella. Kudosviljelmissä voidaan käyttää koko sikiötä tai osia siitä. On suositeltavaa, että soluviljelmässä ei käytetä raajoja, päätä tai ihoa. Solut käsitellään tavalliseen tapaan esim. trypsinisoimalla kiinteänä viljelmänä, pyöritysviljelmänä tai suspensioviljelmänä ja viruksen lisäämiseksi solut tartutetaan yllä kuvatulla tavalla. Tuote erotetaan 2-6 päivän kuluttua. Tartutettuja soluviljelmiä voidaan viljellä edelleen lisäämällä uutta ravinneliuosta. Tämä vaihe voidaan toistaa useita kertoja, esim. kiinteissä v.iljelmissä vähintään 4-6 kertaa ja pyöritysviljelmissä vähintään 20-25 kertaa. Tämän jälkeen solut on yleensä käytetty loppuun. Viimeisessä käsittelyvaiheessa solut voidaan saannon parantamiseksi tuhota esim. syväjäädyttämällä tai ultraäänikäsittelyllä. Tällä tavalla saatiin ensimmäisen kerran sellainen heikennetty panleukopeniavirus, joka ei enää ollut patogeeninen kissa- ja turkiseläimille ja joka ei pystynyt levittämään sairautta. Lisäksi osoittautui, että kissan munuaissolulinja oli yllättävän kestävä; heikennettyä virusta voitiin ottaa talteen lukuisia kertoja, jopa 20-25 kertaa. Lisääntymisviljelmiä käsittelemällä saatu aines voidaan tavalliseen tapaan käsitellä rokotteeksi. On suositeltavaa lisätä stabilisaattori, esim. gelatiinia, lihauutetta tai peptoni- tai sokeriliuoksia erityisesti silloin, kun tarkoituksena on lyofilisoida
60408 rokote. Tämä on suositeltavaa paremman kestävyyden saavuttamiseksi. Haluttaessa voidaan lisätä tavanomaisia apuaineita. Kun lyofilisoidussa muodossa oleva rokote on liuotettu sopiviin liuottimiin, se voidaan antaa ihon alle tai lihakseen. Tunnettuihin rokottei isiin verrattuna sillä on seuraavat edut: 1) Vasta-aineiden suuri puhtaus. 2) Koska virus lisääntyy homologisessa kudoksessa, vieraiden proteiinien aiheuttamia reaktioita ei esiinny. Annettaessa toistuvasti ei ilmene shokkireaktioita eikä allergisia reaktioita. 3) Rokotevirus on tasalaatuista ja puhdasta, koska se lisääntyy yhtenäisellä, tutkitulla solualustalla. 4) Nopea suojavaikutus. Keksinnön mukaan valmistetun elävän panleukopeniarokotteen ominaisuuksia, siedettävyyttä, vaarattomuutta ja tehoa testattiin useissa laboratoriotutkimuksissa ja -kokeissa sekä eläinkokeilla. Kokeita ja tuloksia Vaarattomuus Vaarattomuuskokeet suoritettiin valkoisilla hiirillä ja marsuilla. Viidelle hiirelle annettiin kullekin 0,5 ml uudelleenliuotettua rokotetta ihon alle ja kandelle marsulle kummallekin 2 ml vatsaonteloon. Koe-eläimien oli pysyttävä terveinä 10 päivän tarkkailuajan. Erityistä huomiota kiinnitettiin kissalla suoritettuihin vaarattomuus- ja siedettävyyskokeisiin. Tähän saakka on kontrolloiduissa laboratorio- ja kenttäkokeissa annettu keksinnön mukaisesti valmistettua rokotetta ihon alle tai lihakseen pääasiassa eristettynä pidetylle 962 kissalle ja 174 suurelle kissaeläimelle, esim. leijonille, tiikereille ja gepardeille. Tavallinen tarkkailuaika oli 14 päivää ja osaksi useita viikkoja. Paikallis- ja yleisreaktioiden tarkkailun lisäksi laboratoriokokeissa laskettiin valkosolujen määrä. Todettiin, että keksinnön mukaisesti valmistettu rokote oli vaaraton. Siedettävyys oli hyvä (ks taulukko 5). Myös ST-kissojen (ST = spesifisesti patogeeniton), joista osa oli pidetty eristettynä yli kaksi vuotta, rokottaminen ei antanut aihetta huomautuksiin.
6 0 4 0 8 Säilyvyys Keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen hyvän tehon säilymiseksi on viruspitoisuuden ohella tarpeen sen hyvl. slyminkyky. Tämä testattiin määrittämällä rokoteviruksen pltoisuw:, Vdt - toitaessa rokotetta eri lämpötiloissa 24 kuukauteen saakka. v a lmistuksesta. Saadut vasta-ainepitoisuudet ilmenevät taulukosta 1. Taulukko 1 Rokotteen säilyvyyskoe varastoitaessa eri lämpötiloissa. Lähtöpitoisuus valmistuksen jälkeen: 10 4 ' 633 ID /ml 50 Varastointiaika + 37 C Viruspitoisuus LD 50 varastointilämpötilassa 1 viikko 10 3 ' 833 3 viikkoa 10 3 ' 375 1 kuukausi 10 3 ' 375 10 4,166 2 kuukautta 101,50 10 4 ' 37 ' 3 kuukautta 10 1 ' 375 1 0 4 ' 37 ' 104'833 104,833 4 kuukautta ei virusta 10 4,166 6 kuukautta 10 3 ' " 104'833 10 4,625 10 4,833 9 kuukautta 3 ' " 10 10 12 kuukautta 10 3 ' 5 10 4,625 10 4,833 10 4,833 18 kuukautta 10 2,625 104,625 10 4 ' 833 10 4 ' 833 24 kuukautta 102,625 104'5 10 4,833 10 4,833
60408 Teho ja siedettävyys Keksinnön mukaisesti valmistettua tuotetta testattiin sarjalla kissalla suoritettuja immunisointikokeita. Suoritettaessa kokeita karanteenissa pidetyillä kissoilla on otettava huomioon panleukopeniaviruksen ja muiden kissaeläinten taudinaiheuttajien laaja levinneisyys. Vieraiden tartuntojen estämiseksi ja tarkkojen koetulosten saamiseksi on syytä käyttää spesifisesti patogeenittomia, ns. ST-kissoja. Eläinkoe n:o 1 Ensimmäisessä eläinkokeessa testattiin esimerkin mukaisesti valmistetun rokotteen (valmistuksessa käytetty Crandell-soluja) tehoa ja siedettävyyttä kuudella ST-kissalla. Yhteisessä eristystilassa olleista kissoista neljälle annettiin rokote ihon alle. Kaksi kissaa toimi rukottamattomina vertailukohteina. Yleisen terveydentilan tarkastuksen lisäksi kiinnitettiin erityistä huomiota siihen, alensiko rokote selvästi valkosoluarvoja rokottamattomiin kissoihin verrattuna. Näin ei tapahtunut tässä eikä seuraavissa kokeissa. Tehoa testattiin serologisesti laskemalla vastaainepitoisuus ja tämän jälkeisellä kuormitustartunnalla. Tämän kokeen tulokset ilmenevät taulukosta 2. Taulukosta ilmenee, että ennen rokotusta kissat olivat alttiita panleukopenialle. Jo kaksi viikkoa myöhemmin rokotetut kissat olivat serologisesti immuuneja ja kuormitettavissa, vertailukditeet sitävastoin olivat suojattomia ja kuolivat tartuntaan. Taulukossa 3 on esitetty sellaisen keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen neutralointikokeen tulokset, joka on valmistettu käyttäen turkiseläimen munuaissoluja Crandell-solujen sijasta (Panleukopeniavirus siirrettiin 86 kertaa kissan munuaissoluilla ja sen jälkeen 19 kertaa turkiseläimen munuaissoluilla).
Taulukko 2 Rokotteen teho ST-kissoihin. Kissa n:o PL-vasta-aine- Rokote Kliininen kehitys PL-vasta-ainepitoisuus Kuormitustar_ Tartunnm pitoisuus ennen 14 päivään saakkand /ml 14 päivää 50 Lunta tulokset rokotusta r.a.j. r.a.j. 59 0 keksinnön mukainen rokote e.m. 681 1 ml/kg kehonpainoa e.m. 62 0 1 annos = 1 ml e.m. 1 466 tautia aiheuttavaa 65 0 e.m. 1 466 e.m. e.m. 67 0 ihon alle e.m. 3 162 PL-virusta e.m. 61 0 kontrollit e.m. 0 suun kautta sai.t 64 0 e.m. 0 sai. r.a.j. = rokotteen annon jälkeen PL = yleisvalkosolukato e.m. = ei merkittävää ND = 50 %:sti neutraloiva loppuarvo 50 sai. = sairastunut yleisvalkosolukatoon sai.t = sairastunut ja kuollut yleisvalkosolukatoon
60408 Taulukko 3 Kissa n:o 256 257 Seeruminäyte ennen rokottamista Ei löydetty panleukopeniavasta-aineita 11 Seeruminäyte 3 viikon kuluttua) rokottamisesta 10 4,625. 42 176 ND 50 /ml 10 4 ' 833 = 68 130 ND 50 /ml ND 50 = 50 % neutraloiva annos Eläinkoe n:o 2 Rokotteet, jotka sisältävät eläviä, tautia aiheuttamattomia panleukopeniaviruksia, johtavat yleensä nopeaan rokotussuojaan, jonka ennen kaikkea voidaan katsoa johtuvan yhteisvaikutusilmiöstä. Tällöin rokotevirus estää tautia aiheuttavan viruksen lisääntymisen isäntäsolussa. Kandellatoista nuorella kissalla kokeiltiin, olivatko ne jo 72 tuntia keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen annon jälkeen riittävästi suojattuja kuormitustartuntaa vastaan. Tämän tutkimuksen tulokset ilmenevät taulukosta 4. Koe osoittaa, että rokote pystyy lyhyen ajan, so. kolmen päivän kuluttua suojaamaan panleukopenialta. Ennen rokotusta kaikki kissat olivat suojattomia. Jo kolme päivää myöhemmin rokotetut eläimet kestivät tautia aiheuttavalla panleukopeniaviruksella suoritettua kuormitustartuntaa. Laskemalla päivittäin yli kanden viikon ajan valkosolujen määrä kuormitustartunnan jälkeen voitiin havaita, että kissat olivat erittäin terveitä eikä niissä voitu todeta selvää valkosolumäärän laskua. Kokeen aikana saadut lähtö- ja minimiarvot ilmenevät taulukosta 4. Yleensä valkosolujen väheneminen alle 2000/mm 3 on panleukopenian tunnusomainen sairausoire. Rokottamattomat kissat sairastuivat panleukopeniaan ja neljä eläintä kuudesta kuoli tartuntaan.
Taulukko 4 Rokotteen teho 72 tuntia rokotuksen jälkeen. Kissa PL-vasta-aine n:o ennen roko- Rokote tusta Kuormitus 72 tuntia rokotuksen jälkeen Kuormitustartunnan tulokset valkosoluarvot 2 viikkoon saakka rokotuksen jälkeen yleiskunto lähtöarvot minimiarvot 268 0 596 599 602 604 606 0 innön mukaisesti 1 ml = 100 ID /kg, almistettu rokote 50 0 kehonpainoa tautia 1 annos = 1 ml aiheuttavaa 0 0 0 ihon alle PL-virusta n:o 1 suun kautta e.m. e.m. e.m. e.m. e.m. e.m. L'.00 10 200 mm 3 10 600 mm 3 12 100 5 600 mm 3 10 300 mm 3 10 100 mm 3 3 10 200 269 600 601 i 0 IL 0 605 603 n Kontrollit sai. sai. sai. sai. sai. 12 300 1C 600 600 mm 3,-;_t 3 _ 5 700 mm H4 3 _ 1 200 mm 1 200 mm 3 4 200 mm 3 607 0 sai. 15 SOO 3 E00 mmj e.m. = ei merkittävää sai. = sairastunut panleukopeniaan = kuollut panleukopeniaan ID 50 = 50 %:sti tartuttava annos
10 60408 Eläinkoe n:o 3 Eläinkokeen 2 tulosten mukaan keksinnön mukaisesti valmistettu rokote suojasi kissoja panleukopeniatartunnalta jo kolme päivää rokotuksen jälkeen. Jotta voitaisiin tutkia saman rokotteen kykyä suojata panleukopeniatartunnalta jo ennen kolmatta päivää rokotuksen jälkeen suoritettiin seuraava koe. Kuusitoista panleukopenialle altista kissaa rokotettiin kukin yhdellä annoksella rokotetta, ja nämä jaettiin neljäksi, neljä eläintä sisältäväksi ryhmäksi. Yksi ryhmä tartutettiin tautia aiheuttavalla panleukopeniaviruksella välittömästi rokotuksen jälkeen ja muut ryhmät peräkkäin päivän välein. Kuusi käsittelemätöntä vertailukissaa ja viimeinen ryhmä tartutettiin kolme päivää rokotuksen jälkeen. Kuten taulukosta 4 ilmenee, tämä koe osoittaa, että rokote pystyi jo päivän kuluttua rokotuksesta suojaamaan osaa rokotetuista kissoista sairastumasta panleukopeniaan. Ko. ryhmän neljästä kissasta vain yksi eläin sairastui ja kuoli panleukopeniaan kolmen muun eläimen pysyessä terveenä. Eläimistä, jotka tartutettiin kaksi päivää rokotuksen jälkeen, vain yhdessä neljästä kissasta havaittiin neljäntenä ja viidentenä päivänä tartunnan jälkeen lievää valkosolujen vähenemistä (arvoihin 4200 ja 5100/mm 3 ). Kissat, jotka tartutettiin kolme päivää rokotuksen jälkeen, kestivät tartunnan reaktioitta. Kaikki vertailukissat kuolivat panleukopeniaan. Lisäyksityiskohtia löytyy taulukosta 5.
aulukko 5 Teho 0, 1, 2 ja 3 päivää rokotuksen jälkeen. Kissa n:o PL-vasta-aine ND 50 /ml ennen rokotusta Rokotus vrk. rokotuksen jälkeen Kuormitustartunta Tartunta Tulos 1017 0 + (7 p.t.j.) 1022 32 1 ml PL-virusta + (12 p.t.j.) 1028 0 1 ml rokotetta 0 + (8 p.t.j.) 1166 0 + (10 p.t.j.) ihon alle 1018 0 e.m. 1023 0 1029 0 1 + (9 p.t.j.) 1167 0 1019 0 e.m. 1024 0 1 ml PL-virusta, e.m. 1160 0 2 laimennettu 1 : 5, L(4 2 00)(4 p.t.j.) 1168 0 e.m. 1 kg kehonpainoa 1020 0 e.m. kohti, suun kautta 1025 0 e-m. 3 1165 0 e.m. 1169 0 e.m. 1021 0 + (6 p.t.j.) 1031 0 Kontrollit + (6 ;p.t.j.) 1158 0 3 + (6 p.t.j.) 1159 0 + (6 p.t.j.) 1163 0 + (6 p.t.j.) 1164 0 + (8 p.t.j.) + = kuollut panleukopeniaan L = valkosolujen väheneminen (alin valkoe.m. = ei merkittävä soluarvo) p.t.j. = päivää tartunnan jälkeen
12 60408 Eläinkoe n:o 4 Suoja-ajan arvioimiseksi ST-kissoilla suoritettiin lisäkoe. Kissat pidettiin tarkoin eristettyinä. Kymmenestä ST-kissasta kandeksan sai rokoteannoksen ihon alle. Rokoteviruksen erittymisen ja mahdollisen edelleenleviämisen arvioimiseksi molemmat rokottamattomat vertailukissat asetettiin samaan huoneeseen. Kaikista kissoista otettiin verinäytteet vasta-ainemääritystä varten. Tämän tutkimuksen tulokset ilmenevät taulukosta 6. Koe osoittaa, että rokote aiheuttaa aktiivisen immuniteetin ja suuren vasta-ainepitoisuuden, mikä antoi rokotetuille kissoille koko tarkkailuajaksi luotettavan suojan panleukopeniaa vastaan. Lisäksi se osoittaa, että vertailukissoihin ei muodostunut vasta-aineita. Tämä merkitsee sitä, että kokeen aikana ei tapahtunut rokoteviruksen edelleenleviämistä, mikä rokotetuissa eläimissä olisi johtanut luonnolliseen voimistumiseen tai vertailukohteina olleiden eläinten sairastumiseen ja sitä seuraavaan vastaainekehitykseen. Koska koekissoja tarkkailtiin päivittäin, voitiin todeta, että koko koeaikana ei ilmennyt reaktioita, jotka olisi voitu tulkita epäsiedettäviksi tai haitallisiksi.
Tauluko 6 Suojan kesto ST-kissoissa rokotuksen jälkeen. Kissa n:o Rokote Ennen rokotusta Panleukopenia-vasta-ainepitoisuus ND 50 /m1 1/2 k.r.j. 1 k.r.j. 2 k.r.j. 4 k.r.j. 6 k.r.j. 8 k.r.j. 151 1 annos = 0 4 217 6 813 4 210 6 813 3 162 6 813 1 ml keksin 152 nön mukaista 0 3 162 3 162 6 813 3 152 3 162 3 162 rokotetta 154 ihon alle 0 3 162 6 813 1 466 4 217 1 466 x) 155 0 4 217 14 660 6 813 3 162 2 371 4 217 156 0 4 217 4 217 4 217 3 162 2 371 3 162 157 0 3 162 6 813 4 217 3 162 3 162 4 217 158 0 3 162 6 813 14 660 4 217 6 813 4 217 159 0 14 660 23 710 23 710 4 217 2 371 6 162 153 Kontrollit 0 0 0 0 0 0 0 160 0 0 0 0 0 0 0 k.r.j. = kuukautta rokotuksen jälkeen. x). kissa kuollut sydänpunktioon
Taulukko 6 (jatkoa) Kissa n:o 11 k.r.j. 14 k.r.j. 17 k.r.j. 23 k.r.j. 26 k.r.j. 151 3 162 422 2 371 1 466 6 813 152 3 162 1 466 3 162 3 162 3 162 154 155 4 217 316 422 1 466 4 217 156 3 162 1 466 1 466 3 162 3 162 157 3 162 2 371 3 162 6 813 6 813 158 14 660 3 162 3 162 6 813 6 813 159 6 813 2 371 4 217 4 217 6 813 153 0 0 0 0 0 160 0 0 0 1-1-/ 0 1-1: 1 = kuollut tänä aikana
15 60408 Eläinkoe n:o 5 Taulukossa 7 on esitetty sellaisen keksinnön mukaisesti valmistetun rokotteen siedettävyyskokeen tulokset, joka on valmistettu käyttäen turkiseläimen munuaissoluja Crandell-solujen sijasta (Panleukopeniavirus siirrettiin 86 kertaa kissan munuaissoluilla ja sen jälkeen 19 kertaa turkiseläimen munuaissoluilla). Rokotteen siedettävyys Taulukko 7 Kissa Valkosoluarvo n:o 0 1 3 mm /vrk rokottamisen 2 3 jälkeen x ) 4 5 6 254 255 256 257 15 13 900 600 16 12 12 14 400 500 300 600 16 9 11 13 800 600 200 200 12 7 10 8 700 700 700 200 9 8 8 7 000 200 600 500 8 7 5 9 500 300 900 100 9 10 4 8 200 100 200 200 Kissa Valkosoluarvo mm 3 /vrk rokottamisen jälkeen x) n:o 7 8 9 10 11 12 13 254 10 600 12 400 15 800 15 900 16 300 13 400 16 800 255 7 000 9 800 18 200 16 300 16 700 18 000 16 800 256 6 000 4 200 9 600 10 400 15 300 13 400 11 800 257 4 600 9 800 11 200 8 000 16 300 11 300 10 700 Kissa Valkosoluarvo n:o 14 15 mm 3 /vrk 16 rokottamisen 17 18 jälkeen 19 x) 20 21 254 16 400 - - - - - - - 255 20 000 - - - - - - - 256 20 000 12 100 16 400 13 500 12 400 14 400 11 300 12 400 257 10 500 10 700 12 600 12 100 10 700 12 400 10 500 14 200 x) Kissat rokotettiin 1 ml:lla panleukopeniavirussuspensiota.
16 60408 Esimerkki 1) Kissan sikiökudosviljelmän valmistus Kantava kissa tapettiin kivuttomasti ja sikiöt poistettiin steriileissä olosuhteissa. Sikiöstä poistettiin pää, raajojen päät ja iho ja loput ruumiista leikattiin saksilla n. 2-4 mm:n suuruisiksi paloiksi. Palat asetettiin 0,25-%:iseen trypsiiniliuokseen, ja seos lämmitettiin sekoittaen 37 C:seen. Noin 10-20 minuutin välein trypsiiniliuos ja siihen suspendoituneet solut erotettiin, ja ne korvattiin uudella trypsiiniliuoksella. Erotetusta solusakasta lietettiin 6 ml laimennuksena 1:300 seuraavaan väliaineeseen: 10 % Eaglen väliainetta (kymmenkertainen) 10 % pässin tai vasikan veriheraa 2 % laktalbumiinihydrolysaattia (5 %:inen) 1 % NSP-liuosta (nenmysiini-streptomyslini-penisilliini, 50 pg/ml vast. 20 000 IE/mi) 2 % natriumvetykarbonaattia (5 %:inen) kaksi kertaa tislattua vettä ad 100 %. Seos siirrettiin viljelykolveihin ja pidettiin 37 C:ssa. Toisena, neljäntenä ja seitsemäntenä päivänä ravinneliuos uusittiin. Kymmenentenä päivänä ravinneliuos erotettiin kaatamalla soluista ja korvattiin liuoksella, jossa oli 95 % trypsinoimisväliainetta, 1 % dinatriumdivetyetyleenidiamiinitetra - asetaatin 1 %:ista liuosta, 1 % 1 %:ista trypsiiniliuosta ja 3 % 5 %:ista natriumvetykarbonaattiliuosta.
17 60408 Trypsinoimisväliaine sisälsi: 1 1 kaksi kertaa tislattua vettä 7,27 g natriumkloridia 0,36 g kaliumkloridia 0,91 g dekstroosia Solusidokset katkeavat tässä liuoksessa, jolloin vapautuu yksittäissoluja tai pieniä ryhmiä. Näin saatuja soluja viljeltiin useita kertoja yllä kuvatulla tavalla. 2) Panleukopeniarokoteviruksen valmistus Kissa tartutettiin patogeenisella panleukopeniaviruksella, joka oli eristetty panleukopeniaan sairastuneesta ja kuolleesta kissasta, ja se tapettiin seitsemän päivää myöhemmin vaikeasti sairaana valko- solumäärän ollessa 200/mm 3. Munuaiset poistettiin ja käsitelti.in edel- lä kuvatulla tavalla 25 %:isessa trypsiiniliuoksessa solususpension saamiseksi. suhteessa 1 : Saatu virussuspensio saostettiin ja sakka suspendoltlin 300 seuraavaan viljelyväliaineeseen: 52,2 % Hanksin väliainetta 5,8 % laktalbumiinihydrolysaattia 20,0 % kudosviljelmäväliainetta 199 20,0 % vasikan veriheraa 1,0 % natriumvetykarbonaattia (5-%:inen) 1,0 % NSP-liuosta Suspensiota pidettiin 37 0 C:ssa. Tällöin panleukopeniavirus lisääntyi soluissa. Virus voidaan osoittaa siirtämällä viljelmän päällä oleva liuos terveisiin kissoihin. Viruksen edelleenviljely tapahtuu seuraavasti. Terveistä kissoista erotetaan munuaiset, trypsinoidaan yllä kuvatulla tavalla ja suspendoidaan ravinneliuokseen. Kun solukerros on kasvanut n. 75 %, se tartutetaan panleukopeniavirusviljelmän päällä olevalla viruspitoisella nesteellä. Tällöin päällysnesteeseen sekoitetaan tuoretta ravinnealustaa suhteessa 1 : 10 ja levitetään soluille. Neljän päivän kuluttua viljelmän päällä oleva lisääntynyttä panleukopeniavirusta sisältävä neste erotetaan kaatamalla. Noin 80 siirrostuksen jälkeen kissan munuaissolut korvataan Crandellin mukaisella pysyvällä kissan munuaissolulinjalla ja siirrostukset toistetaan vielä 17 kertaa. Kissan pysyvien munuaissolujen viljelyssä käytetään seuraavaa väliainetta:
18 10 % Eaglen väliainetta 10 % vasikan veriheraa 1,5 % natriumvetykarbonaattia (5-%:inen) 1,0 % NSP-liuosta kandesti tislattua vettä ad 100 % 60408 Viruksella tartutettaessa veriheran osuus vähennetään 3 %:iin. Kun on käyty läpi 103 siirrostusta, virus on menettänyt patogeenisuutensa mutta sen hyvät immunisoivat ominaisuudet ovat säilyneet. Sitä voidaan käyttää rokotteen valmistukseen. Edellä mainitun Crandellin pysyvän kissan munuaissolulinjan sijasta voidaan käyttää vastaavaa turkiseläimen solulinjaa. 3) Rokotteen valmistus Kohdan 1) mukaan lisätty kissan sikiösoluviljelmä suspendoitiin seuraavaan väliaineeseen: 10 % Eaglen väliainetta (kymmenkertainen) 10 % vasikan veriheraa 2 % laktalbumiinihydrolysaattia (5-%:inen) 2 % natriumvetykarbonaattia (5-%:inen) 1 % NSP-liuosta 75 % kandesti tislattua vettä Yhden tai kanden päivän kuluttua ravinneliuos vaihdettiin. Kun solukerros oli kasvanut 50-75 %, soluviljelmälle pipetoitiin kohdan 2) mukaan saatua 10-%:ista virussuspensiota. Neljän päivän kuluttua viruspitoinen, viljelmän päällä oleva neste erotettiin kaatamalla ja soluviljelmää viljeltiin edelleen lisäämällä uutta ravinneliuosta. Päällä olevan nesteen viruspitoisuus oli n. 10 5 ID 50 /ml. Lisäämällä seuraava stabilisaattori tämä viruspitoinen, viljelmän päällä oleva neste käsiteltiin rokotteeksi. 4 osaa 2-%:ista gelatiini-lihalientä 1 osa 50-%:ista glukoosia Rokote lisättiin 1 ml:n annoksina 3 ml:n rengasreunapulloihin, kylmäkuivattiin ja suljettiin tyhjössä. Virusten lisääminen yllä kuvatulla tavalla voidaan myös suorittaa pyöritys- tai suspensioviljelmänä.
19 Patenttivaatimus: 60408 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi kudosviljelmässä kissaeläimien parvovirus-panleukopeniaa vastaan, t u n n e t t u siitä, että patogeenista panleukopeniavirusta siirretään sarjana vähintään 80 kertaa kissan munuaissoluilla ja sen jälkeen vähintään 18 kertaa kissaeläimen tai turkiseläimen pysyvillä kudossolulinjoilla, edullisesti Crandell-soluilla, ja viljellään näin saatua heikennettyä virusta kissan sikiösolulinjoilla, jolloin mandollisesti saanto korjataan useita kertoja, jonka jälkeen otetaan heikennetty virus, joka on talletettu merkinnällä CNTCC AO 3/77 laitokseen "Institut för Hygiene und Epidemiologie", Praha, Tsekkoslovakia, talteen ja työstetään se tavanomaisella tavalla rokotteeksi. Patentkrav: Förfarande för framställning av ett vaccin i en vävnadskultur mot parvovirus-panleukopeni hos felider, k ä n n e t e c k n a t därav, att man passagerar patogent panleukopeni-virus minst 80 gånger på kattnjurceller, därefter minst 18 gånger på permanenta vävnadscellinjer från en felid eller en mustelid, lämpligen på Crandellceller, förökar det så erhållna attenuerade viruset på kattfetalceller, varvid man möjligen skördar utbytet flera gånger, varefter man utvinner det attenuerade viruset, som har deponerats under beteckningen CNTCC AO 3/77 i anstalten "Institut för Hygiene und Epidemiologie", Prag, Tjeckoslovakien, och upparbetar det på sedvanligt sätt till ett vaccin. Viitejulkaisuja-Anförda publikationer Patenttijulkaisuja:-Patentskrifter: Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) 2 444 299 (A 61 K 39/12).