Tymosyyttien negatiivinen selektio

Tymosyyttien negatiivinen selektio Kudosspesifisten geenien ilmentyminen kateenkorvassa ja tymosyytin viestintä Kandidaatintutkielma Biokemian koulutusohjelma Bio- ja ympäristötieteiden laitos Biotieteellinen tiedekunta Helsingin yliopisto 22.4.2005 Ilari Scheinin ilari.scheinin@helsinki.fi

Tiivistelmä T-solureseptoria koodaavien geenien uudelleenjärjestyminen somaattisella rekombinaatiolla on satunnaista ja tuottaa myös elimistön omiin antigeeneihin sitoutuvia molekyylejä. Autoreaktiivisen reseptorin omaavat T-solujen esiasteet, tymosyytit, ohjataan negatiivisessa selektiossa apoptoosiin autoimmuunisairauksien välttämiseksi. Negatiivisen selektion aiheuttavat mekanismit ovat monimutkaisia, eikä tapahtuman tarkka kulkua tunneta. Joitain siihen osallistuvia tekijöitä on selvitetty, mutta on myös aukkoja ja kiistanalaisia vaiheita. Korvaamaton rooli on kateenkorvan antigeenejä esittelevillä soluilla, jotka kykenevät niille ominaisten mekanismien avulla ilmentämään erittäin suurta joukkoa elimistön proteiineista. Näiden solujen pinnalla on MHC-molekyylien ja elimistön omien peptidien muodostamia komplekseja. Ne tymosyytit, jotka eivät lainkaan sitoudu näihin komplekseihin, kuolevat jäädessään ilman positiivista selektiota. Tästä syystä kaikki kypsät T-solut ovat spesifisiä elimistön omille MHC-proteiineille. Liian voimakas sitoutuminen taas johtaa negatiiviseen selektioon. Tymosyytin sitoutuminen T-solureseptorinsa välityksellä näihin komplekseihin johtaa mitogeeni-aktivoituvien proteiinikinaasien (ERK, JNK ja p38) aktivoitumiseen. Erottelu selektioiden välillä riippuu MAP-kinaasien aktivoitumiskinetiikasta, Jos sitoutuminen on liian voimakas, se johtaa ohjelmoituun solukuolemaan. Seurauksena transkriptiotekijät Nur77 ja NF-κB aktivoituvat käynnistäen tarvittavien geenien transkription. Bcl-2-perheen proapoptoottiset jäsenet Bim, Bak ja Bax vapauttavat mitokondrioista sytokromi-c:n sytosoliin. Tämä aktivoi edelleen kaspaaseja, jotka alkavat pilkkoa solun rakenteita. Myös kuolonreseptorit saattavat osallistua negatiivisen selektion signaalien välittämiseen. Sisällysluettelo Tiivistelmä...1 Sisällysluettelo...1 Kiitokset...2 Lyhenteet...2 Johdanto...3 Kateenkorvan antigeenejä esittelevät solut...5 Mitogeeni-aktivoituvat proteiinikinaasit...9 Transkriptiotekijät...12 Tymosyytin apoptoosi...13 Yhteenveto...15 Viitteet...17 1

Kiitokset Kiitos filosofian tohtori Matti Auterolle hänen neuvoistaan ja kommenteistaan. Lyhenteet Vaikka tämä tutkielma on kirjoitettu suomeksi, siinä on käytetty kirjallisuudessa vakiintuneita englannin kielestä johdettuja lyhenteitä. Tästä syystä käytetyistä lyhenteistä on listattu tähän niiden englanninkielinen alkuperä. Lisäksi suomenkielinen termi on annettu silloin, kun se on katsottu tarpeelliseksi. AIRE autoimmune regulator APC antigeenejä esittelevä solu, antigen presenting cell Apaf-1 apoptotic protease activating factor 1 APECED autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy CD cluster of differentiation ctec kateenkorvan kuorikerroksen epiteelisolu, cortical thymic epithelial cell DC dendriittisolu, dendritic cell DIG detergent-insoluble glycolipid-enriched microdomain DN kaksoisnegatiivinen, double negative DP kaksoispositiivinen, double positive ERK extracellular regulated kinase FADD Fas-associated protein with death domain Grb2 growth factor receptor-bound protein 2 HDAC histone deacetylase HEL kananmunan lysotsyymi, hen egg lysozyme HSR homogenously staining region IDDM2 insulin-dependent diabetes mellitus 2 ITAM immune receptor tyrosine-based activation motif Itk inducible T cell kinase JNK c-jun N-terminal kinase LAT linker for activation of T cells Lck lymphocyte-specific protein tyrosine kinase LXXLL L=leusiini, X=mikä tahansa aminohappo MAPK mitogen-activated protein kinase MEK MAP/ERK kinase MHC major histocompatibility complex MINK misshapen NIK-related kinase mtec kateenkorvan ydinkerroksen epiteelisolu, medullary thymic epithelial cell NIK Nck-interacting kinase PHD plant homeodomain-type pmhc MHC-molekyylin ja peptidin muodostama kompleksi, peptide:mhc complex Rlk resting lymphocyte kinase SAP serum amyloid P component SAND Sp100, AIRE-1, NucP41/75, DEAF-1 SH3 Src-homology 3 T H -solu auttaja-t-solu, helper T cell T C -solu tappaja-t-solu, cytotoxic T cell TCR T-solureseptori, T cell receptor TEC kateenkorvan epiteelisolu, thymic epithelial cell TNF tumor necrosis factor TRAIL tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand T R -solu säätelijä-t-solu, regulatory T cell ZAP-70 ζ-chain-associated protein 2

Johdanto T-lymfosyytit ovat tärkeä osa immuunijärjestelmää. Ne osallistuvat elimistön puolustautumiseen tunnistamalla vieraita antigeenejä T-solureseptoriensa (TCR, T cell receptor) avulla. T-solureseptori on rakenteeltaan heterodimeeri. Suurimmalla osalla T- soluista se koostuu α- ja β-ketjuista, mutta vähän alle prosentilla on γδ-reseptori. Näiden γδ-tsolujen biologinen tehtävä on erilainen, eikä niitä käsitellä tässä tutkielmassa. Jotta elimistö voi puolustautua hyvin erilaisia hyökkääjiä vastaan, täytyy sen pystyä tuottamaan suuri määrä erilaisia T-solureseptoreita. Tämän suuren vaihtelun mahdollistaa somaattinen rekombinaatio, jolla TCR:a koodaavat geenit uudelleenjärjestyvät kypsyvässä soluissa. β- ja δ-ketjuja koodaavat geenit koostuvat useista erilaisista V-, D- ja J- osista, α- ja γ-geenit taas V- ja J-osista. Näiden osien satunnainen yhdisteleminen tuottaa suuren määrän erilaisia T-solureseptoreita, joiden avulla elimistö pystyy tunnistamaan laajan joukon antigeenejä. T-solureseptori esiintyy solun pinnalla yhdessä proteiinikompleksin kanssa, joka tunnetaan nimellä CD3. Tämä kompleksi koostuu γ-, δ- ja kahdesta ε-polypeptidistä. Lisäksi TCR-CD3-kompleksiin on sitoutunut ζ-homodimeeri. Näissä apuproteiineissa olevat ITAMsekvenssit (immune receptor tyrosine-based activation motif) ovat välttämättömiä TCRvälitteiselle signaloinnille solun sisään. ζ-ketjussa on kolme ITAM-sekvenssiä ja muissa peptideissä yksi. TCR:n sitoutuessa nämä sekvenssit fosforyloituvat aktivoiden kinaaseja, jotka välittävät signaalin eteenpäin. Kunkin apuproteiinin transmembraanisen osan nettovaraus on -1, kun taas TCR:n nettovaraus on +3 (α-ketju +2 ja β-ketju +1). Tästä syystä on ajateltu, että kompleksissa on kaikkiaan kaksi TCR-heterodimeeriä yhdessä kuuden apupolypeptidin kanssa, jolloin varauksen kumoavat toisensa. T-solureseptorit eivät sitoudu vapaisiin antigeeneihin, vaan komplekseihin, joita ne muodostavat erityisten MHC-proteiinien (major histocompatibility complex) kanssa. MHC-proteiinit ovat kalvoproteiineja, joita esiintyy elimistön kaikkien tumallisten solujen pinnalla sitoutuneena antigeeniin, joka on yleensä peptidi. MHC-proteiineja on olemassa kahdenlaisia, tyypit I ja II. Tyypin I MHC löytyy kaikkien tumallisten solujen pinnalla, ja sen päätehtävänä on esitellä sytoplasmasta peräisin olevia peptidejä. Tyyppi II sitoo solun ulkopuolelta peräisin olevia peptidejä ja ilmentyy lähinnä hematopoieettisissa ja keskisen imukudoksen soluissa. T-solut ovat spesifisiä elimistön omille MHC-molekyyleille ja tulkitsevat vieraat MHC-proteiinit hyökkäykseksi aiheuttaen immuunivasteen. Koska MHC- 3

geeneistä on olemassa lukuisia erilaisia alleeleja, täytyy tämä ottaa huomioon elinsiirtojen yhteydessä. T-solut saavat alkunsa luuytimessä sijaitsevista kantasoluista, jotka siirtyvät verenkierron välityksellä kateenkorvaan, jossa ne alkavat erilaistua. Näitä kypsyviä soluja kutsutaan tymosyyteiksi. Kateenkorvasta voidaan erottaa lohkoja, jotka jakautuvat ulompaan kuorikerrokseen ja sisempään ydinkerrokseen. Kypsyessään tymosyytit kulkeutuvat kuorikerroksesta ytimeen ja siirtyvät lopuksi kerrosten liitoskohdasta pienten laskimoiden kautta verenkiertoon. Kateenkorvassa on erilaisia antigeenejä esitteleviä soluja (APC, antigen presenting cell), joiden pinnalla on runsaasti MHC-molekyylien ja elimistön omien peptidien muodostamia komplekseja (pmhc). Ne tymosyytit, jotka eivät lainkaan sitoudu näihin kompekseihin, kuolevat laiminlyönnin seurauksena (niin kutsuttu "death by neglect"). Tapahtuma tunnetaan nimellä positiivinen selektio ja se eliminoi tymosyyttipopulaatiosta sellaiset, joissa TCR:n geenien uudelleenjärjestyminen tuotti elimistön MHC-proteiineihin sitoutumattoman T-solureseptorin. Tämän ansiosta T-solut ovat spesifisiä elimistön omille MHC-molekyyleille.. Koska T-solureseptoria koodaavat geenit järjestyvät täysin sattumanvaraisesti, muodostuu myös sellaisia reseptoreita, jotka sitoutuvat tiukasti elimistön omien peptidien ja MHC-molekyylien muodostamiin kompekseihin. Jos tällaisten tymosyyttien annetaan kehittyä T-soluiksi asti, on seurauksena autoimmuunisairaus, jossa immuunijärjestelmä tuhoaa elimistön omia kudoksia. Negatiivisessa selektiossa annetaan tästä syystä pmhckompekseihin liian tiukasti sitoutuville tymosyyteille solukuolemaan johtava signaali. Positiivisen ja negatiivisen selektion seurauksena kypsät T-solut ovat spesifisiä elimistön omille MHC-molekyyleille, mutta eivät aiheuta imuunijärjestelmän hyökkäystä elimistön omia antigeenejä kohtaan. Häiriöt negatiivisessa selektiossa saattavat johtaa autoimmuunisairauksiin, kuten tyypin I diabetekseen. TCR-CD3-kompeksin lisäksi T-soluilla on solukalvollaan joko CD4- tai CD8- koreseptori, joiden perusteella T-solut voidaan jakaa eri tyyppeihin. Tappaja-T-soluilla (T C, cytotoxic T cell) on CD8-koreseptori, joka sitoutuu tyypin I MHC-molekyylin invarianttiin osaan. T C -solujen tehtävänä on tappaa patogeenien, kuten virusten, saastuttamia soluja. CD4- koreseptorin omaavia soluja kutsutaan auttaja-t-soluiksi (T H, helper T cell) ja niiden päätehtävänä on aktivoida immuunijärjestelmän muita soluja, kuten B-lymfosyyttejä ja 4

makrofaageja. CD4-koreseptori tunnistaa tyypin II MHC-proteiinin. Koreseptorit tehostavat TCR:n signalointia Lck-tyrosiinikinaasien avulla (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase). Lisäksi on olemassa säätelijä-t-soluja (T R, regulatory T cell), jotka sitoutuvat elimistön omiin antigeeneihin ja estävät muita soluja reagoimasta niihin. Niin kutsutuilla luonnollisilla T R -soluilla on CD4-koreseptori ja lisäksi niiden solukalvolla ilmentyy interleukiini-2-reseptorin α-ketju, CD25. Tästä syystä niitä kutsutaan myös CD4 + CD25 + - soluiksi. T R -solujen syntyyn johtavat mekanismit ovat huonosti tunnettuja. Siihen vaikuttavat TCR:n ja pmhc-kompleksin välisen affiniteetin lisäksi sytokiinit ja kostimulatiiviset molekyylit solujen pinnalla. Tymosyyttien kypsymisen alussa niillä ei ole kumpaakaan koreseptoria, ja niiden sanotaan olevan kaksoisnegatiivisia (DN, double negative). Tämän jälkeen ne alkavat ilmentää molempia koreseptoreja, eli niistä tulee kaksoispositiivisia (DP, double positive). Lopuksi ne menettävät toisen ja ilmentävät vain CD4- tai CD8-koreseptoria (SP, single positive). Kateenkorvan antigeenejä esittelevät solut Välttämätön tehtävä tymosyyttien kypsymisessä on kateenkorvan antigeenejä esittelevillä soluilla. Niiden pinnalla on runsaasti elimistön omia antigeenejä sitoutuneena MHC I ja II - molekyyleihin. Ne tymosyytit, jotka eivät lainkaan sitoudu näihin pmhc-kompekseihin, jäävät ilman positiivista selektiota ja kuolevat. Negatiivisella selektiolla joukosta karsitaan liian tiukasti sitoutuvat, jotka voisivat aiheuttaa autoimmuunisairauden. Antigeenejä esitteleviä soluja ovat kateenkorvan epiteelisolut (TEC, thymic epithelial cell) sekä veriperäiset dendriittisolut (DC, dendritic cell) ja makrofaagit. Epiteelisoluista voidaan erotella sijaintinsa mukaan kuori- (ctec, cortical thymic epithelial cell) ja ydinkerroksen epiteelisolut (mtec, medullary thymic epithelial cell). Näistä soluista negatiivisen selektion voivat aiheuttaa TEC- ja DC-solut, mutta eivät makrofaagit, joiden tehtävänä on ottaa apoptoosiin kuolevilta soluilta vapautuvat biomolekyylit muiden solujen käyttöön (Volkmann ym. 1997). Negatiivista selektiota tapahtuu sekä kateenkorvan ytimessä että kuorikerroksessa, mutta ytimessä huomattavasti enemmän (Volkmann ym. 1997, Zhang ym. 2003). Ytimen yli kymmenen kertaa voimakkaampaan negatiiviseen selektioon saattaa vaikuttaa eri APC-solujen erilaisten ominaisuuksien lisäksi se, että TCR ilmentyy aluksi vain vähäisessä määrin. Sen määrä solukalvolla kasvaa tymosyytin siirtyessä kateenkorvan kuorikerroksesta ytimeen tehostaen TCR-välitteistä signalointia. Ytimessä on myös suurempi 5

määrä erilaisia selektioon osallistuvia ligandeja. Faro ym. (2004) ovat esittäneet, että kuorikerroksessa näitä ligandeja on vain alle 60, kun taas ytimessä jopa tuhansia. Ydinkerroksessa jäljellä olevista tymosyyteistä noin 50-70 prosenttia (5-14 prosenttia kokonaismäärästä) kuolee negatiivisessa selektiossa. Valtaosa (74-90 prosenttia) kuolee kuitenkin kuorikerroksessa jäädessään ilman positiivista selektiota. Koska keskisen toleranssin syntyminen vaatii antigeenin läsnäoloa kateenkorvassa tymosyytin kypsyessä, sen ajateltiin pitkään kehittyvän vain verenkierrossa vapaasti kiertäville ja luonnostaan kateenkorvan soluissa ilmentyville proteiineille. On kuitenkin havaittu, että kateenkorva kykenee ilmentämään suurta joukkoa kudosspesifisiä geenejä, jotka normaalisti ekspressoituvat täysin eri tyyppisissä soluissa. Tämä geenien ilmentymisen promiskuiteetti näyttää olevan erityisesti ydinkerroksen epiteelisolujen (mtec) ominaisuus (Derbinski ym. 2001). Sitä ilmenee jossain määrin myös ctec- ja DC-soluissa, mutta niiden osallisuus on hiukan kiistanalainen (Pietropaolo ym. 2002, Pugliese & Diez 2002, Kyewski ym. 2002). Promiskuiteetti tuntuu tarkkaan säädellyn sijaan olevan lähinnä satunnaista, se ei ole riippuvainen esimerkiksi ajasta tai sukupuolesta. Vastasyntyneen kateenkorvassa ilmentyy esimerkiksi geenejä, jotka ekspressoituvat normaalisti vain vastakkaisessa sukupuolessa tai liittyvät yksilönkehitykseen murrosiässä. Kateenkorvassa ilmentyy myös "tarpeettomia" geenejä. Derbinski ym. (2001) esimerkiksi havaitsivat, että SAP (serum amyloid P component) ilmentyi hiirien mtec:issa, vaikka toleranssin syntymiseen riittää myös pelkkä verenkierrossa normaalisti esiintyvä SAP. Kaikki mtec:t eivät ilmennä kaikkia geenejä, vaan solujen joukosta voidaan paikantaa saarekkeita, joissa ilmenee tietyn tyyppisiä geenejä. Edellä mainitussa tutkimuksessa havaittiin kutakin antigeeniä ilmentävien mtec:ien osuuden olevan 1/20-1/200 kaikista mtec:ista. Kateenkorvassa on keskimäärin noin 22 000 mtec:ia, jolloin tiettyä antigeeniä ilmentäviä soluja on kaikkiaan 100-1000 kappaletta. Ilmentyvien antigeenien jakautuminen mtec-populaatiossa on johtanut pohdintaan siitä, muodostuuko solujen joukossa eri kudoksia vastaavia alueita, jotka erikoistuvat kyseisen kudoksen geenien ilmentämiseen sille ominaisten mekanismien avulla. Yhdessä nämä saarekkeet muodostaisivat koko eliön antigeenejä vastaavan mosaiikin (Farr & Rudensky 1998). Toisaalta on osoitettu myös mtec:ssa ilmentyvien geenien kerääntyminen ryppäiksi lähelle toisiaan samassa kromosomissa (Gotter ym. 2004). Tällaisten ryppäiden 6

olemassaolo viittaa epigeneettisiin mekanismeihin geenien ilmentymisen säätelyssä. Näitä mekanismeja ovat esimerkiksi DNA:n metylointi ja histoneiden asetylointi. Eri tyyppisten APC-solujen hieman erilaisista rooleista kertoo tutkimus, jossa on vertailtu liukoisen ja kalvoon sitoutuneen proteiinin eroja negatiivisen selektion aiheuttamisessa (Zhang ym. 2003). Tutkimuksessa käytettiin siirtogeenisiä hiiriä, joihin oli siirretty kananmunan lysotsyymiä (HEL, hen egg lysozyme) koodaava geeni αa-krystalliinin promoottorilla. Proteiinista käytettiin kahta eri muotoa, joista toinen oli liukoinen ja toinen kalvoproteiini. Siirtogeenien todettiin ilmentyvän silmien lisäksi myös kateenkorvan epiteelisoluissa. Nämä hiirilinjat risteyttiin siirtogeenisen, HEL-spesifisen TCR:n omaavan kannan kanssa. Jälkeläisissä havaittiin suuri määrä negatiivisesti selektoituvia soluja kateenkorvan ytimessä. Negatiivinen selektio oli liukoisen siirtogeenin omaavassa kannassa tehokkaampaa, vaikka geenin ilmentyminen oli heikompaa kuin kalvoproteiinikannassa. Syynä tähän on, että epiteelisolujen ilmentämä liukoinen proteiini erittyy myös dendriittisolujen saataville. Ne ovat tehokkaita negatiivisen selektion aiheuttamisessa, mutta geenien ilmentymisen promiskuiteetti on niissä epiteelisoluja vähäisempää. Mikä saa aikaan kudosspesifisten geenien ilmentymisen kateenkorvassa? Eräs promiskuiteettia aiheuttava tekijä on AIRE (autoimmune regulator). Mutaatio kyseisesä geenissä aiheuttaa autoimmuunisairauden, joka tunnetaan nimellä autoimmuunipolyendokrinopatia-kandidaasi-ektodermidystrofia (APECED). Kyseisessä oireyhtymässä monet elimistön kudokset joutuvat immuunijärjestelmän hyökkäyksen kohteeksi. AIRE suojaa sairaudelta vaikuttamalla kudosspesifisten geenien ilmentymiseen kateenkorvassa (Ramsey ym. 2002, Liston ym. 2003). AIRE:n rakenne viittaa sen tehtävään transkriptiotekijänä. Proteiinissa on kahden PHD-sinkkisormen ja mahdollisesti DNA:han sitoutuvan SAND-domeenin lisäksi neljä tumareseptoreihin sitoutuvaa LXXLL-motiivia, mahdollisesti dimerisaatiota aiheuttava HSR-domeeni sekä proliinirikas alue. AIRE muodostaa homodimeereja ja -tetrameereja in vitro ja in vivo. Se voidaan fosforyloida in vitro proteiinikinaasi A:lla tai C:llä, jolloin proteiini dimerisoituu. Tämä saattaa olla myös in vivo säätelymekanismi. (Kumar ym. 2001) AIRE:n vaikutuksesta mtec:issa ilmentyy noin 200-1200 eri tyyppistä geeniä: transkriptiotekijöitä, hormoneja sekä rakenne-, kalvo- ja erittyviä proteiineja. Tuntuu epäuskottavalta, että näillä kaikilla olisi AIRE-spesifinen promoottori. Todennäköisempää onkin, että AIRE vaikuttaa monien muiden transkriptiotekijöiden aktiivisuuteen ja sitä kautta 7

laajan geenimäärän ilmentymiseen. Voidaan kuitenkin myös havaita, että tietyn geenin ilmentyminen rajoittuu vain pieneen osaan mtec:ista. AIRE ei siis voi yksin selittää promiskuiteettia (Anderson ym. 2002). Sen vaikutus ei myöskään ole tarpeeksi kattava riittääkseen säätelemään koko elimistön kaikkia antigeenejä kattavaa toleranssia. On mahdollista, että on myös muita vastaavia proteiineja. Negatiivisen selektion tehokkuus on riippuvainen geenien ilmentymisen tasosta kateenkorvassa. Tietyn kynnystason alle jääminen johtaa puutteellisen selektion takia autoimmuunisairauksiin. Tämä geeniekspression voimakkuuden vaikutus on osoitettu esimerkiksi tyypin I diabeteksen kohdalla. IDDM2-lokus (insulin-dependent diabetes mellitus) vaikuttaa diabeteksen syntyyn osallistumalla insuliinin ilmentymisen säätelyyn kateenkorvassa. Luokan III alleeli suojaa diabetekseltä, toisin kuin luokan I alleeli. Tyypissä I on 30-60 toistoa jaksosta ACAGGGGTCTGGGG, ja tyypissä III 100 tai enemmän. Välimuotoa näiden kahden tyypin välillä ei ole löydetty. Suojaavan alleelin vaikutus perustuu voimakkaampaan insuliinin ilmentymiseen. Chentoufi ja Polychronakos (2002) ovat hiirimallin avulla tutkineet geeniekspression voimakkuuden vaikutusta negatiiviseen selektioon ja edelleen diabeteksen syntyyn. Hiirillä on kaksi insuliinia tuottavaa geeniä: Ins1 ja Ins2. Tutkijat risteyttivät Ins1 -/- - ja Ins2 -/- -hiiriä viillityyppisten kanssa tuottaen hiiriä, joilla on yksi, kaksi, kolme tai neljä insuliiniä tuottavaa alleelia. Haimassa insuliinin tuotto oli kaikilla samansuuruista, koska eritystä säätelee veren sokeripitoisuus. Kateenkorvassa vastaavaa säätelymekanismia ei ole, ja ilmentymisen havaittiinkin olevan riippuvainen alleelien lukumäärästä. Tymosyyttien negatiivinen selektio taas oli riippuvainen geeniekspressiosta, ja autoreaktiivisia T-soluja havaittiin sitä enemmän, mitä vähemmän insuliinia kateenkorvassa ilmentyi. Ilmentymisen voimakkuuden vaikutus on havaittu myös tutkimuksessa, jossa tutkittiin insuliini- ja tyroglobuliinipromoottoreiden säätelyn alaisena olevia transgeenejä (Liston ym. 2004). Molempien ilmentymisen todettiin olevan riippuvainen Airesta heiketen Aire +/- -kannassa, ja edelleen Aire -/- -hiirissä. Mutaatio yhdessä alleelissa vähentää Airen ilmentymistä, ja tämä vaikutus ulottuu kaikkiin Airen säätelemiin geeneihin ja edelleen myös negatiiviseen selektioon. Ilmentyminen haimassa ja kilpirauhasessa oli kuitenkin normaali myös Aire-mutanteilla, koska niitä säätelevät muut mekanismit. Tyroglobuliinipromoottori oli kateenkorvassa insuliinipromoottoria tehokkaampi ja sen todettiin aiheuttavan vähemmän sairastumisia Aire +/- -hiirissä. 8

Useissa tutkimuksissa (Andersson ym. 2002, Liston ym. 2004) on todettu negatiivisen selektion toimivan normaalisti niiden antigeenien kohdalla, joiden ilmentymiseen Aire ei vaikuta. Hiljattain on kuitenkin havaittu, että Aire saattaa osallistua muutenkin kuin toimimalla transkriptiotekijänä (Kuroda ym. 2005). Tutkijat havaitsivat α-fodriinin ilmentyvän Aire -/- -hiirien kateenkorvassa normaalisti mutaatiosta huolimatta. Negatiivinen selektio kuitenkin häiriintyi. Onkin mahdollista, että Aire osallistuu negatiiviseen selektioon muutenkin kuin transkriptiota säätelemällä. Airen on todettu olevan myös E3- ubikvitiiniligaasi ja se saattaa tämän aktiivisuutensa avulla osallistua antigeenien prosessointiin ja esittelyyn TEC:issa. Mitogeeni-aktivoituvat proteiinikinaasit Heikko sitoituminen TCR:n ja pmhc-kompleksin välillä johtaa tymosyytille välttämättömään positiiviseen selektioon. Liian voimakas sidos taas aiheuttaa negatiivisen selektion. Miten tymosyytti pystyy erottelemaan näiden signaalien välillä, kun ne molemmat ovat lähtöisin samalta T-solureseptorilta? Ilmiö on monimutkainen ja siihen voi vaikuttaa useita eri tekijöitä: (1) reseptorin affiniteetti pmhc-kompleksiin, (2) sitoutumisen aviditeetti, johon affiniteetin lisäksi vaikuttavat TCR:n ja pmhc:n määrät solukalvoilla, (3) signaalin kesto, (4) tymosyytin kypsymisvaihe ja (5) APC:n solutyyppi. T-solureseptorin sitoutuessa CD3-kompleksin sytoplasmisessa osassa olevat ITAM-sekvenssit fosforyloituvat, mikä johtaa proteiinikinaasien välityksellä mitogeeniaktivoituvien proteiinikinaasien (MAPK, mitogen-activated protein kinase) aktivoitumiseen. MAP-kinaasit ovat signaalinvälitysproteiineja, jotka osallistuvat monien solun toimintaa säätelevien ärsykkeiden viestintään. Selektiosignaalien välitykseen tiedetään osallistuvan kolme erilaista MAP-kinaasia: ERK (extracellular-regulated kinase), JNK (c-jun N-terminal kinase) ja p38. Eräs hypoteesi on, että näistä ERK aiheuttaa positiivisen selektion, JNK:n ja p38:n liittyessä negatiiviseen. Tällöin erottelun positiivisen ja negatiivisen selektion välillä voisi selittää erilaiset aktivoitumistasot. Kaikkien kolmen MAP-kinaasin aktivoitumiseen osallistuu adaptoriproteiini Grb2 (growth factor receptor-bound protein). Käyttäen Grb2 +/- -mutantteja hiiriä on osoitettu, että ERK vaatii aktivoituakseen alhaisemman signaalin kuin JNK tai p38. Grb2 +/- -hiirillä Grb2:n ilmentymistaso on vain noin 40 prosenttiä villityyppiin verrattuna. Tämä heikentää JNK1/2- ja p38-signalointireittejä, mutta sen ei todettu vaikuttavan ERK:in. Seurauksena havaittiin häiriintynyt negatiivinen selektio positiivisen toimiessa normaalisti. TCR:n heikko 9

sitoutuminen siis voisi aiheuttaa ERK-signaalin ja positiivisen selektion. Vahva sitoutuminen taas johtaisi myös JNK- ja p38-reittien aktivaatioon ja negatiiviseen selektioon. (Gong ym. 2001) Tätä hypoteesia tukevat tutkimukset, joiden mukaan ERK:lla ei ole osallisuutta negatiiviseen selektioon. Muun muassa Alberola-Ila ym. (1996) ovat todenneet tämän käyttämällä dominantisti negatiivista mutaatioita ERK-reittiin osallistuvista MEK:stä, Ras:sta tai molemmista. Positiivinen selektio väheni kummankin yksittäisen mutaation johdosta noin 60 prosenttia ja molempien mutaatioiden kanssa 90 prosenttia. Vaikutusta negatiiviseen selektioon ei havaittu. On kuitenkin osoitettu myös ERK:n osallistuvan negatiiviseen selektioon. Tutkimuksessaan Bommhardt ym. (2000) havaitsivat, että ERK-reittiin kuuluvan MEK:n inhiboiminen farmakologisella inhibiittorilla johtaa häiriöihin negatiivisessa selektiossa. Inhibiittorin seurauksena normaalisti negatiivisen selektion aiheuttavan ärsykkeen todettiin muuttuneen heikentyneen ERK-aktivaation seurauksena positiiviseksi selektioksi. Tekijät arvelivat monien muiden tutkimusten kanssa ristiriitaisen tuloksen johtuvan siitä, että he lisäsivät inhibiittoreita suhteellisen suuressa konsentraatiossa 2-3 päivän ajan. Tutkimuksissa, joissa oli todettu negatiivisen selektion olevan riippumaton ERK:sta, oli käytetty pienempää konsentraatiota ja lisäystä vain alussa. Kirjoittajat katsoivat, että ERK-inhibitio ei tällöin välttämättä ollut riittävä. Käytetyt inhibiittorit olivat PD98059 ja UO126, joista jälkimmäinen on tehokkaampi. Suurten UO126-konsentraatioiden todettiin estävän myös positiivinen selektio. Kummankaan inhibiittorin ei todettu vaikuttaneen JNK- tai p38-map-kinaaseihin, joten negatiivisen selektion estymisen täytyy johtua ERK:sta. ERK:n osuus negatiiviseen selektioon on havaittu myös toisessa tutkimuksessa, jossa käytettiin samoja inhibiittoreita (Mariathasan ym. 2001). Ratkaisevaksi tekijäksi positiivisen ja negatiivisen selektion välillä osoittautui signaalin voimakkuus ja kesto. Jatkuva, alhainen ERK-aktivaatiotaso johtaa positiiviseen selektioon, kun taas lyhytaikainen ja korkea aiheuttaa negatiivisen selektion. Heikko signaali voidaan saada aikaan ligandilla, jonka affiniteetti reseptoriin on heikko, tai vaihtoehtoisesti alhaisena konsentraationa voimakkaamman affiniteetin ligandia. Suuri konsentraatio vahvasti sitoutuvaa ligandia taas johtaa tymosyytin apoptoosiin. Samassa tutkimuksessa osoitettiin myös, että negatiivisen selektion aiheuttavat vuorovaikutukset johtivat TCR:n siirtymiseen solukalvolta solun sisään siinä määrin, että 10

TCR-välitteinen signalointi estyi kokonaan. Tämä saattaa selittää ERK-aktivaation lyhytikäisyyden negatiivisessa selektiossa. ERK:n aktiivisen, fosforyloidun muodon konsentraation todettiin laskevan jo viiden tunnin jälkeen, kun taas positiivisesti selektoituvissa soluissa konsentraation todettiin olevan taustatasoon nähden hieman koholla vielä 16 tunnin jälkeenkin. On mahdollista, että jatkuva, alhainen ERK-taso suojaa tymosyyttiä muilta apoptoottisilta signaaleilta. Tätä hypoteesia tukevat myös havainnot siitä, että sekä positiivisen että negatiivisen selektion aiheuttavat ligandit aktivoivat JNK- ja p38- reitit samanlaisella kinetiikalla (Werlen ym. 2000). Osittain ristiriitaisia tuloksia ERK:n osallisuudesta negatiiviseen selektioon selittää myös Tec-perheen kinaaseilla Itk (inducible T cell kinase) ja Rlk (resting lymphocyte kinase) tehty tutkimus (Schaeffer ym. 2000). Nämä kinaasit osallisuvat ERK-reitin signaalinvälitykseen. itk -/- -hiirillä havaittiin positiivisen selektion häiriintymisen seurauksena hieman normaalia vähemmän T-soluja. rlk -/- itk -/- -hiirillä taas T-solujen lukumäärä kasvoi. Tämä selittyy negatiivisen selektion muuttumisena positiiviseksi. Tutkijat esittivät, että positiivinen selektio saattaa olla negatiivista herkempi reagoimaan pieniin häiriöihin signaalinvälityksessä. Pienikin vaimeneminen positiivisen selektion signaalissa saa sen putoamaan alle kynnystason, jolloin solu kuolee. Negatiivisen selektion signaali taas ei välttämättä ole yhtä herkkä pienille häiriöille. Tämän takia itk -/- -hiirillä havaittaan häiriintynyt positiivinen selektio, mutta molempia mutaatioita kantavilla hiirillä vaikutus ulottui myös negatiiviseen selektioon, muuttaen sen positiiviseksi. Tec-kinaasit vaikuttavat ERKaktivaatioon ilmeisesti fosfolipaasi C:n ja proteiinikinaasi C:n kautta. Tämä reitti on riippumaton Grb2:sta, joka osallistuu ERK:n lisäksi myös JNK- ja p38-reitteihin. Tecmutaatioiden ei todettu vaikuttavan p38-aktivaatioon, mutta vaikutusta JNK-reittiin ei tutkittu. McCarty ym. (2005) ovat hiljattain todenneet MINK-kinaasin (misshapen NIKrelated kinase) ilmentymisen kasvavan 20-kertaiseksi DN-tymosyttien siirtyessä DPvaiheeseen ja laskevan jälleen SP-soluissa. Tämä antoi aiheen olettaa sen vaikuttavan tymosyyttien selektioon. Mutanttikokeet osoittivat sen osallistuvan negatiiviseen, mutta ei positiiviseen selektioon. MINK säätelee JNK:n aktivoitumista ja edelleen proapoptoottisen Bim:n ilmentymistä, mutta se ei vaikuta ERK:n aktivoitumiseen. JNK:n aktivoituminen saattaa johtua MINK:n kinaasiaktiivisuudesta, mutta toinen vaihtoehto on, että se toimii soviteproteiinina kuten sen kanssa homologinen NIK (Nck-interacting kinase ). (Palmer 2005) TCR välittää sitoutumisensa affiniteettin solun sisään aktivoimalla eri MAPkinaasit eri tavalla. Vaikka jotkut molekyylit, kuten Grb2, osallistuvat kaikkiin kolmeen 11

reittiin, niillä on myös spesifisiä aktivaattoreita. Edellä mainittu MINK sisältää proliinirikkaita alueita, ja saattaa niiden kautta sitoutua adaptoriproteiini Nck:n SH3- domeeneihin (Src-homologia 3). Myös CD3ε sisältää proliinirikkaita alueita, ja Nck saattaa toimia linkkinä CD3ε:n ja MINK:n välillä. MAP-kinaasien aktivoitumismekanismit voivat myös olla erilaisia positiivisessa ja negatiivisessa selektiossa. Werlen ym. (2000) osoittivat, että mutaatio TCR:n α-ketjussa esti ERK-aktivaation positiivisessa, mutta ei negatiivisessa selektiossa. Villityyppisessä tymosyytissä TCR:n sitoutuminen positiivisesti selektoivaan ligandiin aiheutti tyrosiinikinaasien Lck ja ZAP-70 (ζ-chain-associated protein) kerääntymiseen DIGlipidilautan (detergent-insoluble glycolipid-enriched microdomain) yhteyteen. Tämä johti edelleen adaptoriproteiini LAT:n (linker for activation of T cells) fosforylaatioon ja ERK:n aktivaatioon. Mutantissa kannassa nämä kinaasit eivät siirtyneet DIG-signalosomiin, ja siinä oleva LAT jäi fosforyloimatta. Viesti TCR-CD3-kompleksilta ERK:lle kulkee luultavasti ζ- ketjun lisäksi CD3ε-peptidin kautta. Transkriptiotekijät Nisäkässoluissa osa apoptoottisista reiteistä ei vaadi geenien ilmentymistä, kun taas esimerkiksi tymosyyttien negatiivinen selektio vaatii. Tästä syystä siihen luultavasti osallistuu transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät apoptoottisten geenien ilmentymistä. Yksi apoptoosiin johtava transkriptiotekijä on Nur77, joka ilmentyy negatiivisen selektion yhteydessä. Nur77 on siitä harvinainen geeni, että sen säätely tapahtuu pelkästään histonien asetylaation avulla. Histonien olessa deasetyloituneita, geeni ei ilmenny. Asetylaatio taas johtaa geeniekspressioon. Geenin promoottorialueella on kaksi MEF2-sitoutumiskohtaa. Kypsissä T-soluissa niihin kiinnittyneet MEF2D-molekyylit sitoutuvat kabiini-1:n avulla histonideasetylaaseihin HDAC1 ja HDAC2. Tämä aiheuttaa geeniealueen histonien deasetylaation ja estää geenin ilmentymisen. Mutaatio kabiini-1:ssä ei kuitenkaan vaikuta tymosyyttien kehittymiseen. Niistä onkin löydetty myös toinen MEF2D:hen sitoutuva molekyyli, HDAC7, joka ilmentyy erityisesti tymosyyttien DP-vaiheessa. Joko kabiini-1:n ja HDAC7:n tehtävät ovat päällekkäiset, tai sitten ne kumpikin vastaavat omista, erillisistä vaiheista solun kypsyessä. TCR-aktivaation vaikutuksesta HDAC7 fosforyloituu, minkä seurauksena se irtoaa MEF2D:istä ja siirtyy tumasta sytosoliin. Tämä johtaa histonien paikalliseen 12

hyperasetylaatioon, ja Nur77:n ilmentymisen kautta apoptoosiin. Myös HDAC-inhibiittori TSA johti Nur77:n ilmentymiseen, joten geenin säätely tapahtuu pelkästään histonien asetylaation avulla. (Dequiedt ym. 2003) Tutkijat esittivät, että tämä mekanismi saattaa osallistua myös erotteluun positiivisen ja negatiivisen selektion välillä. Positiivisessa selektiossa vaimea signaali johtaa vain vähäiseen HDAC7:n fosforylaation, mikä ei ole vielä riittävä Nur77:n ilmentymisen käynnistymiseksi. Voimakkaampi negatiivisen selektion signaali taas saa aikaan geenin ilmentymisen ja apoptoosin. Myös NF-κB-perheeseen kuuluvat transkriptiotekijät osallistuvat negatiiviseen selektioon. Ne ovat dimeerisiä proteiineja, joiden toimintaa säätelevät inhibiittoriset IκBproteiinit. Yksittäisiin NF-κB-proteiineihin kohdistuvat geenien poistot eivät sanottavasti vaikuta tymosyyttien kypsymiseen, joten niiden toiminta on luultavasti ainakin osittain päällekäistä. Kypsissä T-soluissa NF-κB-proteiinien toiminta liittyy solun selviytymiseen, mutta tymosyyteissä ne osallistuvat negatiiviseen selektioon. TCR-aktivaatio pilkkoo sytosolissa IκBα:n vapauttaen siihen sitoutuneen NF-κB:n. Seurauksena NF-κB siirtyy tumaan ja käynnistää apoptoottisten proteiinien transkription. Mutaation IκBα:ssa on havaittu häiritsevän negatiivista selektiota. (Mora ym. 2001) Toinen negatiiviseen selektioon osallistuva NF-κB:n inhibiittori on IκBNS. Sen ei ole havaittu ilmentyvän perustasolla tai positiivisesti selektoituvissa soluissa, vaan se näyttää olevan spesifinen ainoastaan negatiiviselle selektiolle. Sen näennäisesti käänteinen rooli IκBα:an verrattuna selittyy sen erilaisella toimintaperiaatteella. IκBNS sitoutuu inaktiivisiin p50- ja p52-homodimeereihin ja saa ne irtoamaan DNA:sta mahdollistaen niiden inhiboimien geenien ilmentymisen. (Fiorini ym. 2002) Tymosyytin apoptoosi Ohjelmoituun solukuolemaan, eli apoptoosiin tiedetään johtavan kaksi erilaista reittiä. Toinen näistä signaaleista on lähtöisin solun sisältä. Tätä sisäistä reittiä säätelevät Bcl-2-perheeseen kuuluvat proteiinit ohjailemalla sytokromi-c:n vapautusta mitokondrioista. Sytokromi-c:n vapautuminen sytosoliin saa soviteproteiini Apaf-1:n välityksellä aikaan prokaspaasi-9:n pilkkomisen aktiiviseksi kaspaasi-9:ksi, joka edelleen aktivoi muita kaspaaseja. Kaspaasit ovat apoptoosiin liittyviä proteaaseja, jotka hajottavat useita solun proteiineja. Toinen 13

apoptoottinen signaali saa alkunsa solun ulkopuolelta. Solun pinnassa olevat kuolonreseptorit välittävät sille käskyn itsemurhaan. Ligandin sitoutuminen kuolonreseptoriin johtaa sen solunsisäisen kuolemandomeenin ja adaptoriproteiini FADD:n välityksellä prokaspaasi-8:n pilkkomiseen ja aktivoimiseen. Kaspaasi-8 taas aktivoi edelleen muita kaspaaseja. Tymosyyttien negatiiviseen selektioon osallistuu näistä kahdesta apoptoottisesta reitistä ainakin sisäsyntyinen, mitokondrioista riippuvainen reitti, mutta myös ulkoisen reitin osallisuudesta on viitteitä. Sekä kaspaasi-8:n että kaspaasi-9:n on havaittu pilkkoutuvan kolme tuntia anti-cd3-vasta-aineen lisäyksen jälkeen, mikä viittaa molempien reittien osallisuuteen (Lamhamedi-Cherradi ym. 2003). Sisäsyntyistä apoptoosia säätelevään Bcl-2-perheeseen kuuluu sekä solun selviytymistä edistäviä, antiapoptoottisia jäseniä että proapoptoottisia proteiineja. Tymosyyttien negatiivisessa selektiossa tärkeäksi on osoittautunut proapoptoottinen Bim, joka on homologinen vain Bcl-2:n BH3-domeenin kanssa. Bim -/- -mutanteissa hiirissä negatiivinen selektio häiriintyi merkittävästi ja yhdenkin alleelin puuttuminen heikensi sitä. Normaalisti Bim on kiinni solutukirangassa sitoutuneena dyneiinin L-ketjuun LC8. Jokin ärsyke vapauttaa sen tästä kompleksista, jolloin se sitoutuu antiapoptoottisiin Bcl-2-perheen jäseniin estäen niiden solun selviytymistä edistävän toiminnan. Näiden antiapoptoottisten tekijöiden (Bcl-2 ja Bcl-X L ) yliekspressointi suojaa tymosyyttiä apoptoosilta, mutta vaikutus on pienempi kuin Bim:n puuttumisesta johtuva suoja. Negatiivisen selektion aiheuttava signaali saattaa siis Bim:n aktivoimisen lisäksi inaktivoida antiapoptoottisia proteiineja. Lisäksi Bim -/- -hiirillä havaittiin villityyppiin verrattuna seitsemänkertainen kasvu autoreaktiivisten DP-tymosyyttien määrässä, mutta kypsissä T-soluissa vain kolminkertainen. Joko jokin toinen mekanismi on johtanut näiden autoreaktiivisten DP-tymosyyttien negatiiviseen selektioon ennen niiden vapautumista kateenkorvasta, tai sitten osa autoreaktiivista soluista on kuollut vasta kateenkorvan ulkopuolella muiden mekanismien seurauksena. (Bouillet ym. 2002) Bim:n aktivaatiosta on osin ristiriitaista tietoa. Ylläolevassa tutkimuksessa havaittiin Bim:n kahden eri muodon (Bim L ja Bim EL ) konsentraation kohoavan kolminkertaiseksi anti-cd3-vasta-aineen injisoinnin jälkeen, mutta mrna-tason todettiin pysyvän tasaisena. Tämä viittaisi siihen, että säätely ei tapahdu transkription tasolla. Szegezdi ym. (2003) kuitenkin havaitsivat Bim:n indusoituvan sekä proteiini- että mrna-tasolla anti- CD3-vasta-aineen tai sopivan spesifisen antigeenin lisäyksen seurauksena. He tutkivat retinoiinihapporeseptori α:n negatiivista selektiota inhiboivaa vaikutusta. Reseptorin 14

synteettisen agonistin (CD336) todettiin hillitsevän apoptoosia inhiboimalla Bim:n synteesiä ja estämällä Nur77:a sitoutumasta DNA:han. Suoraa yhteyttä Nur77:n osuudesta transkriptiotekijänä Bim:n synteesiin ei kuitenkaan havaittu. Bcl-2-perheeseen kuuluvista proapoptoottisista molekyyleistä myös Bak ja Bax osallistuvat tymosyyttien negatiiviseen selektioon. Niiden tehtävät ovat ilmeisesti ainakin osittain päällekkäisiä, koska kummankaan poisto yksinään ei aiheuta merkittäviä seurauksia, mutta molempien poisto yhdessä estää mitokondriovälitteisen apoptoosin. bak -/- bax -/- -hiirten solut ovat vastustuskykyisiä monille normaalisti solukuolemaan johtaville ärsykkeille, kuten säteilytykselle, DNA:ta vauroittaville aineille ja BH3-proteiineille (mukaanlukien Bim). (Rathmell ym. 2002) Sisäsyntyisen apoptoottisen reitin lisäksi kuolonreseptoreiden osallistumisesta tymosyyttien negatiiviseen selektioon kertoo TRAIL-mutanteilla (tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand) hiirillä tehty tutkimus. TRAIL on TNF-perheeseen (tumor necrosis factor) kuuluva ligandi, joka sitoutuu R4- ja R5-kuolonreseptoreihin. Negatiivisen selektion todettiin häiriintyneen TRAIL -/- -hiirissä. Mutaation tarkka molekulaarinen vaikutus ei kuitenkaan ole tiedossa, koska TRAIL voi R4- ja R5-kuolonreseptoreiden kautta aktivoida sekä mitokondrioriippuvaisen että -riippumattoman apoptoottisen reitin. Lisäksi mikrosirutekniikalla havaittiin TRAIL:n aktivoivan useita apoptoosin säätelyyn osallistuvia geenejä, muuun muassa NF-κB-perheeseen kuuluvia. (Lamhameni-Cherradi ym. 2003) Yhteenveto Tymosyyttien negatiivinen selektio on monimutkainen tapahtuma, ja kaikkia siihen osallistuvia tekijöitä ei vielä tiedetä. Sieltä täältä tunnetaan saarekkeita, mutta kokonaiskuvassa on vielä aukkoja. Kateenkorvan antigeenejä esittelevät solut pystyvät niille ominaisten mekanismien avulla ilmentämään suurta joukkoa kudosspesifiä geenejä. Tämä geenien ilmentymisen promiskuiteetti on erityisesti kateenkorvan ydinkerroksen epiteelisolujen ominaisuus. Kattavan geeniekspression seurauksena solujen pinnalla esiintyy MHCmolekyyleihin sitoutuneena laaja joukko elimistön omia antigeenejä, mikä mahdollistaa autoreaktiivisten tymosyyttien negatiivisen selektion ja edelleen keskisen toleranssin syntymisen. 15

Tymosyytin sitoutuminen antigeenejä esittelevien solujen pmhc-komplekseihin johtaa TCR-CD3-kompleksin ITAM-sekvenssien fosforyloitumisen ja proteiinikinaasien välityksellä MAP-kinaasien aktivoitumiseen. Negatiiviseen selektioon osallistuvia MAPkinaaseja tunnetaan kolme: ERK, JNK ja p38. Näistä etenkin ERK:n aktivoitumiskinetiikka on tärkeä erottelussa positiivisen ja negatiivisen selektion välillä. Voimakkaasta sitoutumisesta seuraava lyhyt ja voimakas aktivaatio johtaa tymosyytin apoptoosiin. Seurauksena transkriptiotekijät Nur77 ja NF-κB aktivoituvat ja käynnistävät solukuolemaan johtavien geenien ilmentämisen. Proapoptoottiset Bcl-2-perheen jäsenet Bim, Bak ja Bax aiheuttavat sytokromi-c:n vapautumisen mitokondrioista sytosoliin, mikä johtaa edelleen kaspaasien aktivoitumiseen. Kaspaasit ovat proteaaseja ja ne alkavat pilkkoa solun rakenteita. Myös kuolonreseptorivälitteinen, mitokondrioista riippumaton apoptoottinen reitti saattaa osallistua negatiiviseen selektioon. 16

Viitteet Alberola-Ila J, Hogquist KA, Swan KA, Bevan MJ & Perlmutter RM (1996) Positive and negative selection invoke distinct signaling pathways. Journal of Experimental Medicine 184(1): 9-18. Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, Chen Z, Berzins SP, Turley SJ, von Boehmer H, Bronson R, Dierich A, Benoist C & Mathis D (2002) Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science 298(5597): 1395-1401. Bommhardt U, Scheuring Y, Bickel C, Zamoyska R & Hunig T (2000) MEK activity regulates negative selection of immature CD4+CD8+ thymocytes. Journal of Immunology 164(5): 2326-2337. Bouillet P, Purton JF, Godfrey DI, Zhang LC, Coultas L, Puthalakath H, Pellegrini M, Cory S, Adams JM & Strasser A (2002) BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature 415(6874): 922-926. Chentoufi AA & Polychronakos C (2002) Insulin expression levels in the thymus modulate insulin-specific autoreactive T-cell tolerance: the mechanism by which the IDDM2 locus may predispose to diabetes. Diabetes 51(5): 1383-1390. Dequiedt F, Kasler H, Fischle W, Kiermer V, Weinstein M, Herndier BG & Verdin E (2003) HDAC7, a thymusspecific class II histone deacetylase, regulates Nur77 transcription and TCR-mediated apoptosis. Immunity 18(5): 687-698. Derbinski J, Schulte A, Kyewski B & Klein L (2001) Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nature Immunology 2(11): 1032-1039. Faro J, Velasco S, Gonzalez-Fernandez A & Bandeira A (2004) The impact of thymic antigen diversity on the size of the selected T cell repertoire. Journal of Immunology 172(4): 2247-2255. Farr AG & Rudensky A (1998) Medullary thymic epithelium: a mosaic of epithelial "self". Journal of Experimental Medicine 188(1): 1-4. Fiorini E, Schmitz I, Marissen WE, Osborn SL, Touma M, Sasada T, Reche PA, Tibaldi EV, Hussey RE, Kruisbeek AM, Reinherz EL & Clayton LK (2002) Peptide-induced negative selection of thymocytes activates transcription of an NF-kappa B inhibitor. Molecular Cell 9(3): 637-648. Gong Q, Cheng AM, Akk AM, Alberola-Ila J, Gong G, Pawson T & Chan AC (2001) Disruption of T cell signaling networks and development by Grb2 haploid insufficiency. Nature Immunology 2(1): 29-36. Gotter J, Brors B, Hergenhahn M & Kyewski B (2004) Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly diverse selection of tissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters. Journal of Experimental Medicine 199(2): 155-166. Kumar PG, Laloraya M, Wang CY, Ruan QG, Davoodi-Semiromi A, Kao KJ & She JX (2001) The autoimmune regulator (AIRE) is a DNA-binding protein. Journal of Biological Chemistry 276(44): 41357-41364. Kuroda N, Mitani T, Takeda N, Ishimaru N, Arakaki R, Hayashi Y, Bando Y, Izumi K, Takahashi T, Nomura T, Sakaguchi S, Ueno T, Takahama Y, Uchida D, Sun S, Kajiura F, Mouri Y, Han H, Matsushima A, Yamada G & Matsumoto M (2005) Development of autoimmunity against transcriptionally unrepressed target antigen in the thymus of Aire-deficient mice. Journal of Immunology 174(4): 1862-1870. Kyewski B, Derbinski J, Schulte A & Klein L (2002) Response. Nature Immunology 3(4): 336. Lamhamedi-Cherradi SE, Zheng SJ, Maguschak KA, Peschon J & Chen YH (2003) Defective thymocyte apoptosis and accelerated autoimmune diseases in TRAIL-/- mice. Nature Immunology 4(3): 255-260. Liston A, Lesage S, Wilson J, Peltonen L & Goodnow CC (2003) Aire regulates negative selection of organspecific T cells. Nature Immunology 4(4): 350-354. Liston A, Gray DH, Lesage S, Fletcher AL, Wilson J, Webster KE, Scott HS, Boyd RL, Peltonen L & Goodnow CC (2004) Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. Journal of Experimental Medicine 200(8): 1015-1026. 17

Mariathasan S, Zakarian A, Bouchard D, Michie AM, Zuniga-Pflucker JC & Ohashi PS (2001) Duration and strength of extracellular signal-regulated kinase signals are altered during positive versus negative thymocyte selection. Journal of Immunology 167(9): 4966-4973. McCarty N, Paust S, Ikizawa K, Dan I, Li X & Cantor H (2005) Signaling by the kinase MINK is essential in the negative selection of autoreactive thymocytes. Nature Immunology 6(1): 65-72. Mora AL, Stanley S, Armistead W, Chan AC & Boothby M (2001) Inefficient ZAP-70 phosphorylation and decreased thymic selection in vivo result from inhibition of NF-kappaB/Rel. Journal of Immunology 167(10): 5628-5635. Palmer E (2005) Signaling negative selection: is MINK the missing link. Nature Immunology 6(1): 9-10. Pietropaolo M, Giannoukakis N & Trucco M (2002) Cellular environment and freedom of gene expression. Nature Immunology 3(4): 335; author reply 336. Pugliese A & Diez J (2002) Lymphoid organs contain diverse cells expressing self-molecules. Nature Immunology 3(4): 335-6; author reply 336. Ramsey C, Winqvist O, Puhakka L, Halonen M, Moro A, Kampe O, Eskelin P, Pelto-Huikko M & Peltonen L (2002) Aire deficient mice develop multiple features of APECED phenotype and show altered immune response. Human Molecular Genetics 11(4): 397-409. Rathmell JC, Lindsten T, Zong WX, Cinalli RM & Thompson CB (2002) Deficiency in Bak and Bax perturbs thymic selection and lymphoid homeostasis. Nature Immunology 3(10): 932-939. Schaeffer EM, Broussard C, Debnath J, Anderson S, McVicar DW & Schwartzberg PL (2000) Tec family kinases modulate thresholds for thymocyte development and selection. Journal of Experimental Medicine 192(7): 987-1000. Szegezdi E, Kiss I, Simon A, Blasko B, Reichert U, Michel S, Sandor M, Fesus L & Szondy Z (2003) Ligation of retinoic acid receptor alpha regulates negative selection of thymocytes by inhibiting both DNA binding of nur77 and synthesis of bim. Journal of Immunology 170(7): 3577-3584. Volkmann A, Zal T & Stockinger B (1997) Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. Journal of Immunology 158(2): 693-706. Werlen G, Hausmann B & Palmer E (2000) A motif in the alphabeta T-cell receptor controls positive selection by modulating ERK activity. Nature 406(6794): 422-426. Zhang M, Vacchio MS, Vistica BP, Lesage S, Egwuagu CE, Yu CR, Gelderman MP, Kennedy MC, Wawrousek EF & Gery I (2003) T cell tolerance to a neo-self antigen expressed by thymic epithelial cells: the soluble form is more effective than the membrane-bound form. Journal of Immunology 170(8): 3954-3962. 18