9. Toksisden ttkiminen ja arviointi Toksisden ttkiminen ja arviointi Lonnollisin tapa ttkia jonkin aineen toksistta olisi selvittää sen toksisden mekanismit ja tällä mekanismilla toksistta aihettavat annokset tai pitoisdet. Etenkään tta ainetta ttkittaessa ei toksisden mekanismeista kitenkaan yleensä tiedetä mitään, ja siksi toksisden ttkiminen sein nodattaa enemmän tai vähemmän kaavamaista järjestystä. Mm. lääkkeiden, ravinnon lisäaineiden, torjnta-aineiden ja sien kemikaalien myynti- ja käyttöönottolpien saanti edellyttää, että rekisteröivälle viranomaiselle on toimitett aineesta riittävät toksisstiedot. Ttkimsten harmonisoimiseksi on toksisden rtiinittkimksista laaditt ohjeistoja. Eroopassa on vallitsevana OECD:n ohjeisto, joka määrittelee minimistandardin yksittäisille toksisskokeille. Toksisden ttkimista säätelevät myös GLP-ohjeistot (Good Laboratory Practice), jotka ohjaavat ttkimsten teknistä sorittamista. Ttkimkset on nykyään tehtävä GLP-standardin mkaan, jotta ne olisivat hyväksyttäviä. Lotettavan tloksen saamiseksi toksiss on testattava kokonaisessa elimistössä, eettisistä syistä käytännössä koe-eläimillä. Toksisden kannalta tärkeät seikat, mm. aineen farmakokinetiikka ja metabolia, tlevat tällöin otetiksi homioon. Samoin hormonaalisen säätelyn, atonomisen hermoston ja immnologisen järjestelmän oss toksisdessa voi paljasta ainoastaan kokonaisessa elimistössä. Varsinkin pitempiaikaiset kokeet tehdään kahdella eläinlajilla, tavallisesti rotalla ja koiralla, mahdollisten lajierojen havaitsemiseksi. Toksisden rtiinittkims on lonteeltaan kartoittavaa. Se antaa yleiskvan aineen toksisdesta, toksisden kohde-elimistä ja toksistta tottavista annoksista, mtta toksisden mekanismeja rtiinittkims paljastaa vain harvoin. Ne on ttkittava spesifisemmillä ttkimsmenetelmillä. In vitro -kokeet ovat sein sopiva tapa selvittää yksityiskohtaisemmat mekanismit. Kaikille aineille ei tehdä kaikkia toksisskokeita, vaan ttkimksen laajs määräytyy aineen ja sen käytön laajden mkaan. Persteellisimmin ttkitaan lääkeaineet ja elintarvikkeiden lisäaineet. Kemikaaleista vaaditaan yleensä aktin toksisden kokeet ja sbkrooninen toksisskoe. Aineen toksisden täysimittainen selvitys maksaa seita miljoonia markkoja ja kestää vähintään 6 8 votta. 135
Yleisfarmakologiaa ja -toksikologiaa. Systemaattinen toksisden ttkims välitön toksiss m LD 50 Uden aineen ttkiminen aloitetaan selvittämällä ensin välitön (aktti) toksiss. Rotille, 1 3 eläimelle kerrallaan, annetaan sn katta ainetta vähintään kolmena kerta-annoksena. Seraava annostaso päätetään aina edellisen aihettamien oireiden persteella. Eläinten oireet kirjataan holellisesti annosta seraavien kahden viikon ajan. Kolevien ja kokeen loppn eläneiden eläinten elimet ttkitaan makroskooppisesti. Koe toistetaan tavallisesti toisella lajilla, hiirellä. Aktin toksisden kokeella kartoitetaan toksisden srslokka, eli millä annostasoilla toksiss ilmenee. Oireista voidaan päätellä myös jo toksisden lonnetta. Tloksista on sein laskettavissa myös LD 50 -arvo: annos, joka tappaa polet koe-eläimistä. Sen tarkkaan määrittämiseen ei enää pyritä, koska tieto toksisden srslokasta riittää jatkottkimksiin. Aktti toksisskoe on kitenkin välttämätön. Kmlatiivinen toksisen vasteen käyrä nodattaa :n motoa (kva 9-1). On syytä homata, että tämä käyrä esiintyy kahdessa eri merkityksessä, toisaalta esim. agonistin aihettaman solenspistksen kvaajana (asteittainen vaikts), toisaalta poplaatiossa ilmenevän vasteen esiintymistaajden kvaajana (kvantaalinen eli joko taityyppinen vaste, esimerkiksi kolevs, sairastminen). Kitenkin myös asteittaisessa vaiktksessa on perimmältään kysymys kvantaalisesta vaiktksesta, jos liikkeelle panevana tekijänä on esimerkiksi lääkeainemolekyylien kiinnittyminen reseptoreihin. Siksi tällainen annos-vasteshde on hyvin olennainen sekä farmakologiassa että toksikologiassa. Kolleisden lisäksi myös elinvarioista (esim. maksavario) ja syövän aihetmisesta saadaan samanlainen annos-vastekvaaja. Ei ole olemassa varsinaista (tarkkaa) rajaa, jota pienemmillä annoksilla vaiktsta ei lainkaan olisi, vaan normaalijakama periaatteessa lähestyy nollaa sitä koskaan saavttamatta. Siten kaikessa toksisdessa trvallinen raja on shteellinen eikä absolttinen käsite. Jos koe-eläinryhmää srennetaan, näennäinen haitattomden raja-arvo yleensä pienenee. Annos-vastekäyrän moto antaa viitteitä toksisden lonteesta. Jos käyrä on hyvin jyrkkä (eli osoittaa poplaation reagoivan hyvin homogeenisesti aineeseen), toksisden mekanismi on sein soraviivainen (esim. häkämyrkytys). Jos taas käyrä on hyvin laakea ja ehkä mtkikaskin, toksiss on sein epäsoraa tai seisiin tekijöihin perstvaa, jolloin on paljon mahdollisksia yksilöllisiin vaihtelihin. Josks kvitellaan, että jyrkkä toksisskäyrä osoittaa srta toksistta; näinhän ei tietenkään ole, vaan kysymys on vain poplaation homogeenisesta vasteesta. Pikemminkin aine, jolla on jyrkkä toksisden annos-vastekäyrä, on trvallinen, koska sen vaiktsten yksilöllinen vaihtel on pieni ja vaara on helppo arvioida. 136
9. Toksisden ttkiminen ja arviointi Kva 9-1. Toisiaan vastaavat annos-vastekäyrä (kolevs kmlatiivisesti kyseisellä tai sitä pienemmällä annoksella), normaalijakama eli kellokäyrä (kolevs kyseisellä mtta ei sitä pienemmällä annoksella) sekä probiittikäyrä. Probiittikäyrä on johdett siten, että vasteen yksiköksi on valitt keskihajonnan (SD) kerrannainen. Kolevtta 16 % (LD 50 1 SD) vastaa probiitti 4, kolevtta 2 % (LD 50 2SD) vastaa probiitti 3, kolevtta 84 % (LD 50 + 1SD) probiitti 6 jne. Tällöin kvaajaksi tlee sora. Probiittisorasta saadaan myös graafisesti keskihajonta. LD 50 -arvon ja terapettisen annoksen avlla lasketaan sein lääkkeen ns. terapettinen indeksi (ks. lk 3). LD 50 :stä ja ED 50 :stä (annos, jolla on toivott vaikts polella koe-eläimistä) lasketn terapettisen indeksin ohella trvallisteen vaikttaa sresti kmpaakin osoittava käyrän jyrkkyys, koska se ratkaisee, menevätkö ääriannokset päällekkäin (kva 3-1). 137
Yleisfarmakologiaa ja -toksikologiaa m herkistävyys viivästynyt toksiss pitkäaikaistoksiss karsinogeeniss Myös iho- ja silmä-ärsytys ttkitaan kerta-annoksella. Ihoärsytyskokeessa ainetta aplikoidaan kaniinin iholle ja serataan ihon pnoitsta ja trvotsta. Silmä-ärsytys ttkitaan laittamalla ainetta kaniinin silmään ja serataan silmän reaktioita. Etkäteen syövyttäviksi tai vahvasti ärsyttäviksi tiedettyjä aineita ei ttkita eläinkokein. Aineen herkistävyyttä ttkitaan altistamalla marsn paljasta ihoa aineelle. Immnivasteen annetaan kehittyä pari viikkoa ja iho altistetaan delleen. Herkistyminen näkyy ihon pnoitksena ja trvotksena. Tärkein systeemisen toksisden paljastamiseksi tehtävä ttkims on sbkrooninen toksisskoe. Sillä pyritään selvittämään toksisden kohde-elimet, toksisden annos-vaiktsshteet ja mtosten pysyvyys. Koe tehdään tavallisesti rotalle ja beagle-koiralle, kmmallekin skpolelle. Koe kestää tavallisesti 90 vorokatta. Ainetta annetaan päivittäin kolmena erikokoisena annoksena. Srin annos pyritään valitsemaan niin sreksi, että toksiss tlee esille. Kokeen aikana eläinten painon kehitystä, rehn ja veden kltsta sekä oireita serataan holellisesti. Kokeen päättyessä verestä ja virtsasta tehdään hematologisia ja kliiniskemiallisia ttkimksia ja lähes kaikki elimet ttkitaan histologisesti. Kroonisen toksissttkimksen tavoitteena on selvittää hyvin pitkäaikaisen altistksen vaiktkset. Koe kestää rotalla 12 kk ja koiralla 6 12 kk. Mten se on samanlainen kin sbkrooninen toksisskoe. Eläimistä voidaan ottaa verinäytteitä myös kokeen klessa. Aineen karsinogeeniss ttkitaan srimmassa ja raskaimmassa toksisskokeessa, jossa eläimiä altistetaan aineelle koko niiden elinajan, rottia 24 kk ja hiiriä 18 kk. Ttkimksessa käytetään kolmea annostasoa, joista srimman pitäisi olla hieman toksinen. Koska tavoitteena on selvittää, aihettaako aine syöpää, tlee ryhmäkokojen olla sria, annosta kohti tavallisesti kmpaakin skpolta 50 eläintä. Kaikista kdoksista ja kasvaimista tehdään histopatologinen ttkims. Koska vanhoissa eläimissä on rnsaasti kasvaimia jo mtenkin, tlosten holellinen analysointi on tärkeää. Eläinten kolleiss on otettava tilastollisessa käsittelyssä homioon. Syöpää aihettava aine lisää joko kasvaimien ja pahanlaatisten kasvaimien määrää tai nopettaa niiden kehittymistä. Karsinogeenissttkimksissa on kaksi ongelmaa. Toinen on se, että vähäinenkään ilmaantvs ei ole hyväksyttävä, toinen se, että syövän kehittymiseen kl aikaa. Ihmisessä syöpä kehittyy 10 20 vodessa, koirassa ja apinassa parissa vodessa ja jyrsijöissä voimakkaiden karsinogeenien aihettamana 3 5 kkadessa. Ainoastaan jyrsijättkimkset ovat siis käytännössä mahdollisia. Niissäkin 50 100 koe-eläimen ryhmistä voidaan todeta varmasti vasta syövän sean prosentin ilmaantvs (kva 9-2). Sellaisenaan ttkims on siis erittäin epäherkkä, ja sellainenkin syövän insidenssi, joka ei ole mitenkään hyväksyttävissä (esim. yhdellä thannesta), jää todennäköisesti toteamatta. Ainoa mahdolliss on nodattaa toksikologian yleis- 138
9. Toksisden ttkiminen ja arviointi tä periaatetta: pyritään saamaan viitteitä annos-vasteshteista, ja srennetaan annosta sein monisatakertaiseksi todellisista käyttöannoksista. Useiden karsinogeenien selvä annos-vasteshde voidaankin osoittaa, ja tällöin on mahdollista ekstrapoloida riski srista annoksista pieniin (vrt. kva 9-1). Ongelmiksi jäävät heikot karsinogeenit, joille ei annos-vastekäyrää voida osoittaa sriakaan annoksia käytettäessä, sekä prokarsinogeenit, joiden aktiivisen metaboliitin määrä ei välttämättä lisäänny samassa shteessa kin kanta-aineen annosta lisätään. Karsinogeenisden testasta nykymodossaan on toisaalta kritisoit siitä, että srten annosten aihettama syöpä olisi serasta aineen epäspesifisestä toksisdesta. Kdosvario käynnistää korjaavan solproliferaation, joka voi edistää syövän kehittymistä. Siksi ainekohtainen syövän mekanismien selvittäminen on hyvin tärkeää. Ainetta, joka aihettaa syöpää ainoastaan koe-eläimissä toimivilla mekanismeilla, ei pidetä karsinogeenisena ihmiselle. Esimerkkinä tästä on lyijyttömän bensiinin aihettamat mnaiskasvaimet rosrotissa. Myös pienten annosten vaikts on kaiken kaikkiaan vielä kiistanalainen. Kn kemiallisesti on mahdollista analysoida yhä pienempiä vieraiden aineiden pitoisksia esim. ympäristöstämme, on lähivosien tärkeimpiä tavoitteita pyrkiä löytämään mielekäs pienten pitoisksien aihettamien vaarojen arviointimenetelmä. Jopa voimakkaiden karsinogeenien hyvin pienten pitoisksien aihettama riski on toistaiseksi epäselvä. Toiset ttkijat skovat kynnysarvoon lähinnä siksi, että elimistö kykenee tiettyyn rajaan saakka sitomaan aktiiviset metaboliitit mm. gltationiin inaktiivisessa modossa ja syöpään tarvitaan seita mtaatioita. Toiset lähtevät siitä, että riski lott lineaarisesti nollaan saakka. Tällöinkin tllaan kitenkin nopeasti aleelle, jossa vaara pienenee normaalia tastariskiä vähäisemmäksi (vrt. kva 9-1). Tällöin jodtaan kysymään, onko olemassa hyväksyttävä riskin raja (vrt. röntgensäteilyn aihettama syöpävaara). Ei-genotoksisilla aineilla skotaan olevan tietty kynnysannos tai -altists, jonka alapolella riskiä ei ole tai se on hyvin pieni. Ilmeisesti myös genotoksisille aineille on olemassa käytännössä kynnysannos eivätkä aineet tässä shteessa poikkea toisistaan (vrt. LD 50 edellä). Kva 9-2. Pienin mahdollinen syövän ilmaantvs, joka voidaan eläinkokeessa todeta tilastollisella varmdella (p < 0,025) eri eläinmääriä käytettäessä. Käyrän alle jäävää syöpien lkmäärää ei voida kokeessa saada esille. Teratogeenissttkimkset tehdään yleensä rotalla. Emoille annetaan ttkittavaa ainetta raskaden 6. 15. päivänä kolmena eri annostasona, joista srimman tlisi olla emolle lievästi toksinen. Ennen synnytystä tehdään keisarileikkas. Sikiöt ttkitaan (lkoiset epämodostmat, lstoanomaliat, pehmytkdosmtokset) ja pyritään selvittämään myös keskenmenoja osoittavat implantaation merkit. Toisena lajina käytetään tavallisesti kaniinia. Lisääntymiseen vaikttavaa toksistta ttkitaan altistamalla koiras- ja naarasrottia aineelle ennen parittela sksoljen kehittymisen ajan ja naarasrottia raskaden ja imetyksen ajan poikasten vieroitkseen asti. Kokeessa selviää aineen vaikts fertiliteettiin, synnytykseen ja poikasten kehitykseen. Koska vallitsevan teorian mkaan ainakin osa karsinogeenisista aineista (initiaattorit) vaikttaa genotoksisesti eli soln perimää mttaen, on pitkään kestävien karsinogeenissttkimsten teksi kehitetty mtageenisstestejä. Testit ovat selontatestejä, joilla alstava arviointi voidaan tehdä nopeasti. Mtageenisden selvitys onkin ensimmäisiä della lääkeainemolekyylilla tehtäviä kokeita, ja aineen selvä mtageeniss johtaa heti molekyylin hylkäämiseen. Myös mlle delle kemikaalille tehdään vähintään bakteerimtageenisskokeet. teratogeeniss fertiliteetti- ja reprodktiokokeet perinataali- ja postnataalitoksiss mtageenissttkimkset 139
Yleisfarmakologiaa ja -toksikologiaa Mtageenissttkimkset ovat pääasiassa in vitro -kokeita. Positiivinen tlos näissä varmistetaan myös in vivo -kokeilla. Tnnetin bakteerimtageenisstesti on Amesin ja työtovereiden kehittämä Salmonella typhimrimin mtanttia käyttävä takaisinmtaatiokoe (Amesin koe). Mtantilta ptt kyky syntetisoida histidiiniä, jolloin se siis kasvaa vain histidiiniä sisältävässä ympäristössä. Se palat kitenkin helposti mtageenisten aineiden vaiktksesta histidiiniä syntetisoivaksi kannaksi. Siirtämällä mtageenisella aineella käsitelty bakteeripoplaatio elatsaineeseen, josta histidiini ptt, on helppo laskea näiden mtaatioiden määrä. Prokarsinogeenien aktivoimiseksi (ks. lk 8) lisätään mkaan rotan maksan mikrosomeja, joiden toivotaan metaboloivan prokarsinogeenin aktiiviseksi molekyyliksi. Mtageenissttkimksia tehdään myös käyttäen nisäkkään solja solviljelmissä (kiinanhamsterin ovaariosolt, lymfosyytit). In vivo -ttkimksissa koe-eläimiä altistetaan lyhytaikaisesti ttkittavalle aineelle ja ttkitaan esimerkiksi pnasoljen mikrotmat (mikrotmatesti) tai lymfosyyttien sisarkromatidivaihdokset. Eri menetelmin pyritään myös löytämään merkkejä DNA-korjasmekanismin käynnistymisestä. Klastogeenisia vaiktksia eli sria mikroskooppisesti näkyviä kromosomimtoksia voidaan ttkia myös ihmisen solista, esim. lymfosyyteistä. DNA:n vario pystytään seimmiten myös tnnistamaan molekyylibiologisin menetelmin. kinetiikka Positiivinen tlos mtageenissttkimksissa osoittaa, että aine vaikttaa DNA:han ja saattaa siten toimia initiaattorina. Aineen farmakokinetiikka ja monet mt tekijät vaikttavat siihen, onko aine loplta syöpää aihettava. Karsinogeeneiksi todetista aineista srin osa on mtageenisia, mtta kaikki mtageeniset aineet eivät ole karsinogeenisia eläinkokeissa. Negatiivinen tlos mtageenissttkimksissa ei takaa, etteikö aine aihettaisi syöpää, mtta todennäköisesti se ei ole syövän potentti initiaattori. Farmakokinetiikan ttkiminen on todett tärkeäksi toksisden arvioimisen kannalta. Vesilikoinen tai helposti ja nopeasti konjgoitva yhdiste, joka erittyy nopeasti mtamien tntien klessa elimistöstä menemättä jri solihin sisään, on aivan eri asemassa kin lipidilikoinen aine, joka pääsee helposti solihin ja lisäksi pyrkii kmloitmaan elimistöön. Useat toksisden modot (etenkin keskshermostotoksiss) soranaisesti edellyttävät riittävää rasvalikoistta ilmetäkseen. Myös lajikohtaiset erot ilmenevät sein nimenomaan kinetiikassa, etenkin eri lajien kyvyssä metaboloida ainetta; samoin eri metaboliittien shteellinen määrä on hyvin lajikohtainen. Tämän takia vasta tarkka farmakokineettinen selvitys oikettaa tekemään päätelmiä jossakin lajissa aihetvista vaaroista toisen lajin ttkimsten persteella. Kinetiikan selvitys onkin oleellinen osa toksissttkimsta. Sitä varten on ttkimksissa erikseen eläinryhmiä, joiden verestä tai virtsasta määritetään ttkittavan aineen pitoisdet. Toksissttkimsten rajoitkset ja ennstearvo toksiss ei tle esille Onko aine sitten trvallinen, kn se on läpäissyt säädetyt toksissttkimkset? Näin ei välttämättä ole. Ensiksikin toksiss voi 140
9. Toksisden ttkiminen ja arviointi TIETORUUTU L9 SYÖPÄRISKIN ARVIOINTI Syöpäriskin arvioimisessa painotetaan yhä enemmän karsinogeenisden mekanismin ymmärtämis- tä. Mekanismiltaan hyvin ymmärretyn tapahtmaketjn toivotaan antavan hyvät edellytykset myös kvanti- tatiiviselle riskin arvioimiselle. Syöpäriskin arvioinnissa on kitenkin se ongelma, että tie karsinogeenisesta kemikaalista syöpään on pitkä, monitekijäinen ja monipolvinen. Arvio mistttaa siksi sään ennstamista ja edellyttää pikemminkin monien eri Pääsy tmaan sntiin vaikttavien yhtäikaisten tekijöiden hyväksymistä kaaosteoria-analyysiin kin soraviivaisia loogisia oletksia. Oheinen vokaavio pyrkii havainnollistamaan moninaisia vaiheita karsinogeenisesta molekyylistä syövän manifestoitmiseen. Kaaviosta selviävät mm. seraavat seikat: 1) Aineen karsinogeeniss sinänsä ei määrää riskiä, vaan edellytyksenä on sen pääsy elimistössä kriittiseen kohtaan. Siksi käyttäytyminen lonnossa (esim. kiinnittyminen tikasti maapartikkeleihin) ja farmakokineettiset ominaisdet (esim. imeytymi- elinkelpoisen nen ja epäsorien karsinogeenien metabolia) ovat keskeisiä. 2) Jos elimistö on varatnt metaboloimaan tai mten eliminoimaan aineen tehokkaasti, riski pienenee ratkaisevasti tai rajoitt tiettyihin kdoksiin (esim. formaldehydi on nenän limakalvokarsinogeeni hiiressä hyvin srina pitoisksina). 3) Mtageeniss ei johda atomaattisesti karsinogeenisteen, koska mtaatio voidaan korjata tai se johtaa apoptoosiin (ohjelmoitneeseen solkolemaan); tärkeää on se, aihetko mtaatio kriittiseen kohtaan, esimerkiksi p53-kasvnrajoitegeenin kmaan aleeseen. 4) Soljen jakaantminen on yhtä tärkeää syövän kehittymiselle kin mtaatiokin, koska vasta soljen jakaantminen kiinnittää varion. Nopea soljen jakaantminen myös estää varion korjaamista. Siksi ei ole itsestäänselvää, että genotoksiset karsinogeenit olisivat vaarallisempia kin ei-genotoksiset kdosta ärsyttävät tai soljen lisääntymistä aihettavat aineet. 5) Monimttjatilanteessa ei ole todennäköistä, että yksi ekstrapolaatiomalli olisi yleispätevä kaikille karsinogeeneille. Joissakin tilanteissa annos-vastekvaaja onkin erittäin jyrkkä ja selvästi lineaarisesta poikkeava (esim. formaldehydi), jolloin yleisesti käytetty lineaarinen ekstrapolaatio liioittelee riskiä selvästi. Olisikin tärkeää määrittää aineittain annos-vastekäyrän motoja. Esiintyminen ympäristössä Imeytyminen verenkiertoon Pääsy soln sisään Metabolinen aktivaatio Sitotminen DNA-ketjn Soln mttminen syöpäsoln aiheeksi Syövän manifestoitminen Promootio edistää Detoksifikaatio lonnossa Eritys Detoksifikaatio Eritys Inaktivaatio Sitotminen proteiineihin jne Soln kolema Varion korjas Mn kin syöpägeenin mtos Soln thotminen elimistön polstsmekanismin avlla Genotoksiset variot ovat hyvin yleisiä. Mm. happiradikaalien on arvioit aihettavan hiiren jokaisessa solssa 100 000 DNA-variota vorokadessa. Näistä 99 % korjat, mtta 1 000 variota vorokadessa jää korjaamatta, eli hiiren elinaikana kertyy noin miljoona variota sola kohti. Siten initiaatioita tapaht rnsaasti ilman lkoisia karsinogeenejakin, ja on ymmärrettävää, että myös ei-genotoksinen aine (esim. promoottori) voi yksinkin aihettaa syöpää. Karsinogeenien riskiä on siis arvioitava lisäriskinä olemassa olevaan tastariskiin eikä erillisenä tapahtmana. Siten tärkeää on riskin srs eikä teoreettinen olemassaolo. Samoin syövän torjnnassa on tärkeää paitsi karsinogeenikorman vähentäminen, myös elimistön polstskyvyn parantaminen esimerkiksi terveillä elämäntavoilla ja hyvällä ja monipolisella rokavaliolla. Joko Tomisto 141
Yleisfarmakologiaa ja -toksikologiaa m m m harvinainen m m hidas lajierot yhteisvaikts erityisryhmät paljastminen markkinoinnin jälkeen olla harvinainen ilmiö, eikä se tle esiin sen enempää toksisskokeissa kin lääkkeiden kliinisissä kokeissakaan. Esimerkki tästä on kloramfenikolin aihettama lydinvario. Sitä tavataan noin yhdellä 50 000 100 000 hoidetsta potilaasta. Aine oli laajassa käytössä kaksi votta, ennen kin sivvaikts homattiin. Harvinainen sivvaikts voi persta allergisiin mekanismeihin, geneettisiin poikkeavksiin tai josks aineen epäphtaksiin. Sivvaiktksen ilmitlon voi estää myös vaiktksen hidas ilmeneminen. Eräiden nerotoksisten aineiden sivvaiktkset ilmenevät vasta aineen pitkäaikaisen käytön jälkeen. Syöpä on tyypillinen esimerkki sivvaiktksesta, jonka kehittyminen kestää vosia. Lajierot ovat tyypillinen syy siihen, ettei toksiss tle esille. Eläinlajeilla on fysiologisia eroja (esim. rotta ei oksenna), eikä toiminnallisia keskshermosto-oireita (depressio, psykoosi, päänsärky) voi osoittaa eläimiltä. Usein metabolia on eri lajeilla erilainen; tämä koskee sekä myrkyllisten metaboliittien syntyä että aineen detoksikaatiota. Lajierot ovat kitenkin seimmiten kvantitatiivisia eivätkä kvalitatiivisia. Usein sivvaiktsten edellytyksenä on kahden aineen yhteisvaikts. Tällainen ei kokeissa seinkaan tle esille, ellei mekanismia nimenomaan epäillä. Tyypillisiä esimerkkejä ovat MAO:n estäjät ja tyramiini sekä metronidatsoli ja alkoholi. Ttkimsvaiheessa altistetaan harvoin erityisryhmiä. Erityisesti lapset, vanhkset, astmaatikot sekä mnais- ja maksasairaksia sairastavat ovat sivvaiktsten shteen ongelmaryhmiä. Niinpä lääkeaineella on yleensä enemmän sivvaiktksia kin markkinoille totaessa lllaan ja midenkin kemiallisten aineiden käytössä paljast välillä epämiellyttäviä yllätyksiä, joten sien aineiden käyttöönotossa on varovaiss ja terve epällo tarpeen. Toisaalta on epävarmaa, olisiko hyvin tikkojen ennakkovaatimsten aikana pystytty tomaan markkinoille penisilliiniä (teratogeeninen, marslle hyvin myrkyllinen) tai D-vitamiinia (voimakkaasti teratogeeninen srina annoksina). Liika varovaisskin voi siis tappaa tai estää jonkn parantmisen. Toksisden ttkiminen takaa kitenkin kohtllisen trvallisden aineen käytölle ja on käytännössä ainoa tapa selvittää toksistta etkäteen. Voimakas toksiss paljast ja aineeseen voidaan shtata sen mkaan. Enää shteellisen harvoin on tarpeen vetää si lääkeaine kokonaan pois markkinoilta. Toksisden arvioiminen Toksikologiassa jodtaan sein lähtemään siitä, että saat tieto on riittämätöntä ehdottomien päätelmien tekoon. Siksi on sanott, että paras toksikologi on se, joka arvaa parhaiten. Ennen mta jodtaan arvioimaan ihmiselle aihetvia vaaroja ilman, että käytettä- 142
9. Toksisden ttkiminen ja arviointi vissä olisi ihmistä koskevia tietoja. Toksikologia on siis srelta osin ekstrapolaatiota, määräolettamksiin perstvaa ennstamista tosiasiallisen tietämyksen lkopolelle. Tämän takia se vaatii taitoa ja tasapainoistta ja on epäonnistessaan alttiina hyvin kriittiselle arvostellle. Helppo ratkais toksikologian kannalta on tomita jokainen aine, jossa on vähänkin epäilyttävää. Tässä lähestymistavassa on kaksi ongelmaa. Ensimmäinen on se, että tarpeeksi tarkkaan katsottaessa lähes kaikissa aineissa on jotakin epäilyttävää (myös normaaleissa roka-aineissa, vitamiineissa ja hivenaineissa). Tällöin siis arviointi tlee mielivaltaiseksi ja riskit saatetaan priorisoida pahasti väärin: ne aineet, joita syystä tai toisesta ttkitaan tarkoin, tlevat seimmin tomitiksi, eivätkä resrssit anna myöten tarkastella kaikkia aineita samalla tavoin. Toinen on se, että toksikologia menettää skottavtensa. Tämä on osittain tapahtnt Yhdysvalloissa ns. Delaneyn lasekkeen takia. Laseke edellyttää, ettei roan lisäainetta voida sallia, jos se aihettaa syöpää ihmisessä tai eläimessä tai jos sen havaitaan asianmkaisten kokeiden persteella aihettavan syöpää ihmisessä tai eläimessä. Se siis edellyttää joko tai-vastasta. Tämän persteella kiellettiin 1969 syklamaatti ja 1977 sakariini, mtta yleisen mielipiteen painostksesta kongressi on toistvasti lykännyt sakariinia koskevan kiellon toimeenpanoa, koska se on tärkeä kaloriton maketsaine. Ongelma srenee entisestään, kn kemiallisin analyysimenetelmin pystytään osoittamaan yhä pienempiä määriä heikkoja mahdollisesti syöpää aihettavia ja mita toksisia aineita ravinnossa ja ympäristössämme. Homattava osa tällaisista aineista on lonnontotteita. Myrkyllisyyden arvioinnissa ei riitä eikä edes ole olennaista se, onko jokin myrkyllistä vai ei, vaan se, kinka myrkyllistä se on ja missä oloshteissa sen myrkyllisyydestä on haittaa. On ymmärrettävä, että myrkyllisyys sinänsä ei ole samaa kin vaara. Vaarallisimmat aineet eivät välttämättä ole myrkyllisimpiä, eikä myrkyllisen aineen käyttö ole aina vaarallista; myrkyllisyyden lisäksi aineen haitallisteen vaikttavat monet seikat, kten haihtvs (liottimet, metallinen elohopea), pysyvyys (metyylielohopea, lyijy), kertyminen elimistöön (lyijy, kadmim, DDT) ja mt samanaikaiset aineet (pöly ja kostes rikkidioksidin kanssa). Jos taas katsotaan eri aineiden aihettamia todellisia haittoja yhteisknnassa, on arviointiin otettava mkaan irrationaalisiakin sosiologisia ja arvoasetelmaongelmia. Niinpä kaksi ainetta, joiden toksiset vaiktkset aihettavat sairatta ja kolemaa enemmän kin kaikkien mitten yhteensä, ovat tpakansav ja alkoholi, joiden käyttö on yksilön itsensä säätelemää. Shtatminen toisaalta vapaaehtoisesti otettihin riskeihin (tpakka, alkoholi) ja toisaalta vaaroihin, joihin yksilö ei voi soraan itse vaikttaa (ravinnon lisäaineet), onkin erilainen. Tämä shtatmistavan ero jodtaan säätelevässä toksikologiassa ottamaan homioon. Toksisden arvioinnin ja siitä johtvien toimenpiteiden selventämiseksi on viime aikoina rvett jakamaan tapahtma selvästi kahteen vaiheeseen: riskin arviointiin, joka on tieteellinen, toksikologinen prosessi, sekä päätöksentekoon riskin hyväksyttävyydestä, joka on hallinnollinen tai poliittinen prosessi. Riskin arviointivaiheessa tlee toksikologisen koltksen saaneen henkilön arvioida paitsi aineen toksiss sinänsä, myös toksisden käytännön merkitys ja tästä seraavat mahdolliset vaarat. Sen sijaan ei ole hänen asiansa päättää toisten polesta sitä, otetaanko riski vai ei (esim. kivi- myrkyllisyys vaara riskin arviointi päätöksenteko 143
Yleisfarmakologiaa ja -toksikologiaa hiilen poltto tai torjnta-aineen käyttö, joihin vaikttavat myös monet ekologiset, kansantalodelliset ja jopa epäsorat terveydelliset ja ravitsemkselliset serannaisvaiktkset). Tämän päätöksen siirtäminen mille edellyttää kitenkin vaaran mahdollisimman tarkkaa määrittämistä: kyllä ei-vastaksesta ei päätöksentekijälle ole apa. Jos thannesta mtageenisesta aineesta kymmenen aihettaa 90 % kemikaalien aihettamista syövistä, on toki asetettava kontrollin painopiste sinne, missä srin hyöty on mahdollista saavttaa. Vähemmän tärkeän asian ylenmääräisessä painottamisessa on vaarana todella tärkeän asian jääminen liian vähälle homiolle. Kva 9-3. Ekstrapolaatio pieniin annoksiin. Yläkva on tavanomainen annoksen logaritmia vastaan piirretty vaste neljän aineen karsinogeenisdesta. Alakvassa samat tlokset on piirretty logaritmi-logaritmiasteikkoon ja asteikkoa on laajennett aleelle, josta matemaattisilla malleilla haetaan vastaksia. Alakva osoittaa selvästi, että riskitasolle yksi miljoonasta (10 6 ) ei ole mahdollista saada matemaattisesti täsmällisiä riskiarvioita saadista kokeellisista käyristä. Kemikaaleihin liittyvän terveysriskin arviointi perst käytännössä kokeellisen ttkimksen tloksiin ja mahdolliseen epidemiologiseen tietoon aineen haitoista. Jos altisteesta on käytettävissä lotettavaa epidemiologista tietoa, sillä on sri painoarvo. Useimmiten näin ei kitenkaan ole, vaan arvio on tehtävä eläinkokeiden persteella. Ongelmana on, että eläinkokeet on toksisden karakterisoimiseksi tehty srilla annoksilla, mtta arvioitavan altisteen srs on seimmiten kertalokkia pienempi. Ihmiselle trvallisena pidettävät annokset ja riski jodtaan ekstrapoloimaan. Esimerkiksi elintarvikkeiden epäphtaksille määritellään sein ylin annos, jota ei tlisi ylittää (srin sallitt päivittäinen saanti eli ADI, Allowable Daily Intake,). Toksisskokeista on todettavissa annostaso, joka ei vielä aiheta eläimissä toksistta (NOAEL). Tästä ekstrapoloidaan laskennallisesti ADI jakamalla NOAEL trvamarginaalilla 100 1 000. Trvamarginaalissa oletetaan, että toksisden vaihtel lajin sisällä on 10-kertainen ja lajien välillä 10 100-kertainen. Riskin arviointiin on kehitetty lkisia matemaattisia malleja, mtta mitään niistä ei ole todett vielä yleispäteväksi. Pisimmälle kehitetyt mallit ottavat homioon myös aineen farmakokinetiikan. Syöpäriskin matemaattinen arviointi on erityisen vaikeaa, koska siinä ekstrapolaatioväli on laaja ja todennäköisyydet yleensä hyvin pienet. Nykyiset syöpäriskin matemaattiset arviointimallit antavat hyvin vaihtelevia arvioita saman riskin srdesta. Koe-eläinten käyttö toksikologian ja farmakologian ttkimksessa tieteelliset ongelmat Farmakologian ja toksikologian tietämys siis perst hyvin srelta osin koeeläinttkimksiin. Koe-eläinttkimksiin liittyy monia tieteellisiä ongelmia (mm. tietojen sovellettavs ihmiseen), elämänkatsomksellisia ja filosofisia ongelmia (esim. shtatminen kokeiden aihettamaan kipn) sekä informaationklk- ja tietämättömyysongelmia (esim. mielikvitkselliset tarinat trhista ja tahallisista eläinten kidttamisista). Tieteelliseltä kannalta tärkein näkökohta on koe-eläinttkimksen kelvolliss siihen tarkoitkseen, mihin sitä käytetään. Useimmiten tällöin on kyse siitä, missä määrin koe-eläimellä saat tlos on sovellettavissa ihmiseen tai josks myös toiseen eläinlajiin (eläinlääketiede). Toksissttkimksien osalta tätä kysymystä on jo käsitelty edellä. Soveltamiseen on selvästikin shtadttava tieteellisen varovaisesti, mtta toisaalta on hyvä katsoa taaksepäin historiaan ja arvioida, mikä olisi tilanne ilman koe-eläinttkimsta. Länsimaisen lonnontieteen ttkimksen klmakivi on esittää hypoteesejä ja teorioita, joiden oikeelliss voidaan kokeellisesti varmistaa. Parhaiten kokeellista ttkimsta serannt kehitys näkyy ehkä atonomisen hermoston aleella. Sen ymmärtämisessä päästiin 1800-lvlta alkaen nopeasti knnioitettaviin tloksiin, joita ei olisi ollt mitään mahdollistta selvittää ilman koe-eläimiä tai niiden kdoksia. Edelleenkin nopea kehitys näkyy selvästi biokemiallisen nerofarmakologian alalla samoin kin endokrinologiassa. Yhtäläisyydet kahden nisäkkään välillä ovat verratto- 144
9. Toksisden ttkiminen ja arviointi masti sremmat kin niiden erot, ja saata tietoa voidaan sein jopa sellaisenaan soveltaa käytännön lääketieteeseen. Elämänkatsomksellinen kysymys on, onko ihminen periaatteessa srempiarvoinen, niin että eläintä voidaan käyttää hyväksi ja hrata se tieteen edistämiseksi tai ihmisen trvallisden tai terveyden parantamiseksi. Filosofiset ja elämänkatsomkselliset vaikedet pysyvät tietenkin ratkaisemattomina, ja jos jok on vilpittömästi sitä mieltä, ettei eläintä saa käyttää ihmisen hyväksi, mielipide on sinänsä täysin knnioitettava. Tältä shtatmiselta voidaan kitenkin vaatia johdonmkaistta. Eläinkokeiden tomitsemiselta elämänkatsomksellisin perstein ptoaa pohja pois, jos lämmittelee eläimen trkissa, phmattakaan eläimien syömisestä. Edelliseen liittyvä filosofinen vaikes on rajanveto eri eläinlajien välille. Jos ihminen ei ole eläintä srempiarvoinen, silloin ei liioin toinen eläin ole toista srempiarvoinen. Tällöin jodtaan lääketieteelliseen mpikjaan, ja voidaan kysyä, onko oikein hävittää rottia, täitä tai lapamatoja myrkyllä. On helppo vaststaa simpanssin käyttöä kokeissa, koska se on niin inhimillinen, ja sama koskee osin kissaa ja koiraa. On kitenkin kyseenalaista tehdä tällaisin perstein eroa eläinlajien välille. Koe-eläinasets vetää rajan selkärankaisten ja selkärangattomien väliin. Tällä rajalla on se et, että se on helppo ja yksiselitteinen. Raja on kitenkin mielivaltainen ja herättää kysymyksiä esimerkiksi kalastksen ja kalattkimsten välillä. Eettisistä kysymyksistä on tärkein se, missä määrin koe-eläimille saa aihettaa hätää, kipa ja tskaa. Koe-eläinasets tekee selvän eron niiden kokeiden välille, jotka eivät aiheta merkittävää kipa ja tskaa (II lokka), ja niiden välille, jotka aihettavat (I lokka). Kaikki eläinkoesnnitelmat käsitellään koe-eläintoimiknnassa, jossa on edstajana ttkijoita, koe-eläinhoitajia, mta henkilökntaa ja yleensä myös eläintensojelijoiden edstaja tai kokonaan lkopolinen henkilö. Kivttomat kokeet saa hyväksyä laitoksen koe-eläintoimiknta, kn sen sijaan kivliaiksi arvioidt kokeet (I lokka) menevät edelleen arvioitavaksi ja päätettäviksi lääninhallitkseen. Siten säännökset ovat erittäin tikat. On tärkeää ymmärtää kaksi asiaa. Honosti harkitt tai snnitelt koe, jonka tlos on epälotettava tai tarpeeton, on aina epäeettinen, vaikka sen aihettama kärsimys olisi vähäinenkin. Toiseksi eläimen hätä liittyy sreksi osaksi käsittelytaitoon. Taitamaton ja kömpelö käsittely hätäännyttää eläintä ja sein myös rihtominen aihettaa kipa enemmän kin seimmat kokeet sinänsä. Siksi koltksen hankkiminen on myös eettinen kysymys, ja koltksen ohjaaminen on soritettava hyvin. Toisaalta eläinkokeet on todett hyvin opettavaisiksi esim. farmakologian opetksessa. Siksi niitä voidaan pitää eettisesti yhtä hyväksyttävinä kin ttkimkseen käytettyjä kokeita edellyttäen, että jokaisen kokeen hyöty ja mahdolliset haitat harkitaan holellisesti. Srta yksimielisyyttä kivn aihettamisen oiketksesta ei yleensä saavteta, koska jotkt ihmiset katsovat, ettei kipa saisi aihettaa lainkaan. Kaikessa lääketieteessä (myös hammaslääketieteessä ja eläinlääketieteessä) jodtaan kitenkin sorittamaan toimenpiteitä, jotka aihettavat kipa potilaalle ja josks jopa terveelle lähimmäiselle (esim. mnaisen lovttaminen sklaiselle). Olennaiseksi eroksi jää siis vain se, että ihmiselle kip aihetetaan hänen sostmksellaan. Toinen ero on lonnollisesti se, että koe-eläin kokeen yhteydessä tai jälkeen yleensä lopetetaan. Eläinten lopettamista ei ole kitenkaan missään mssa yhteydessä (esim. terasts ravinnoksi) yhteisknnassamme asetett kyseenalaiseksi. On myös mistettava se kip ja tska, jota tadit aihettavat. Eläinkokeista saata hyötyä lääketieteelle niin ihmisten kin eläintenkin sairaden ja kärsimysten poistamisessa on mahdotonta kiistää. Siten on vaikea ymmärtää, kinka kkaan voisi valmistata vakavalla mielellä lääketieteen ammatteihin ja samalla kiistää eläinkokeiden oiketksen, vaikka osaan kokeista liittyisi kipakin. Oma lknsa ovat monenlaiset väärinkäsitykset ja harhallot, joita vallitsee eläinkokeista. Vastoin yleistä lloa koe-eläin ei ole yleensä kissa eikä apina, eikä kovin sein koirakaan. Kissat ja koirat kasvatetaan koe-eläimiksi, niitä ei siis kerätä kadlta. Yli 90 % koe-eläimistä on jyrsijöitä (tavallisin hiiri, toisena rotta). Homattava osa ttkimksista tehdään in vitro joko eläimen solkoilla tai eristetyillä elimillä. Eläin ei siis elinaikanaan kärsi ja sen lopettaminen ei poikkea msta hyväksyttävästä eläinten lopettamisesta. Voidaan siis hyvinkin sanoa, että koe-eläimeksi syntynyt hiiri tai rotta mitä todennäköisimmin kärsii vähemmän kipa ja tskaa elämässään kin sen vapaana syntynyt serkk. On mahdotonta tietää, merkitseekö vapas sinänsä jotakin kotieläimeen verrattaville laboratoriossa syntyneille koe-eläimille (tai ihmisen pitämille mille kesyille eläimille). Solviljelmien ja miden in vitro -tekniikoiden mahdollisdet tnnetaan yleensä honosti. Sol- ja bakteeriviljelmät eivät seimmiten ole eläinkokeiden vaihtoehtoja, elämänkatsomkselliset ongelmat eettiset ongelmat m I ja II lokan kokeet m käsittely m kip tiedon pte 145
Yleisfarmakologiaa ja -toksikologiaa vaan kmmallakin on omat tehtävänsä. Pelkistetyillä kokeilla pyritään ennen kaikkea biokemiallisten ja solbiologisten mekanismien selvittelyyn. Tässä työssä on edellytyksenä, että mttjia on mahdollisimman vähän. Siten voidaan ttkia yhden tai harvan mttjan merkitystä kerrallaan. Tästä ei kitenkaan voida soraan tehdä kokonaistta koskevia johtopäätöksiä. On selvää, että esimerkiksi hermoston, endokriinisten rahasten ja verenkiertoelimistön fysiologiaa tai farmakologiaa ei voida milloinkaan ttkia pelkästään solkokein. Phtaan tietämättömyyden ohella informaatio on josks myös ilmeisen tarkoitshakkista, mitä kvaa se, että samat valokvat tskallisista eläinkokeista kiertävät maasta toiseen ja josks ilmeisesti vosikymmeniä. Eläintensojelssa tarvittaisiin molemmin polin hyvää tahtoa ja asiallistta, niin että ttkijoiden ja eläintensojelijoiden yhteistyön myötä päästäisiin mahdollisimman hyvään tlokseen. Tavoitteet ovat monista ennakkolloista holimatta yhteiset. Eläinten käyttöä opetksessa ja ttkimksessa on koko ajan vähennetty, mtta on raja, jonka alle siinä ei voida mennä. Esimerkiksi toksisden testasohjelmistot sosittelevat minimissään jo niin pieniä eläinmääriä, että niitä tarkasti nodatettaessa tlos alkaa olla kyseenalainen. Jos ttkimksessa on liian vähän eläimiä, aineen vaiktkset hkkvat biologiseen variaatioon. Toksisden ttkimiseen kehitetään koko ajan eläimiä korvaavia in vitro -menetelmiä ja tlevaisdessa niitä käytetään yhä enemmän eläinkokeiden rinnalla, kn ne on ensin validoit. Silmä- ja ihoärsytystesteissä ollaan jo pitkällä. Opetksessa eläinten käyttö on rajatt harjoitstöihin, joita ei voida mten opettaa, ja vain niille opiskelijoille, jotka sitä tlevan ammattinsa polesta tarvitsevat. Hann Komlainen ja Joko Tomisto 146