(B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 85811 C (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 ' 10 C,1; A 61K 37/02, 39/145, C 12N 15/44 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 853320 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 29.08.85 (24) Alkupäivä Löpdag 29.08.85 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 01.03.86 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 28.02.92 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 30.08.84 US 645732 P (71) Hakija - Sökande 1. Smithkline Beckman Corporation, One Franklin Plaza, Philadelphia, Pa., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Young, James Francis, 10 Holbrook Road, Havertown, Pa., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Hybridipolypeptidin koodaussekvenssin sisältävä ONA-molekyyli DNA-molekyl innehållande en kodningssekvens för en hybridpolypeptid (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI A 841583 (A 61K 37/02), DE A 3200813 (A 61K 39/12) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Rokotepolypeptidit suojaamaan influenssavirusinfektioilta käsittäen HA-proteiinin HA2-alayksikön immunologisen paikan. Vaceinationspolypeptider för skydd mot influensavirusinfektion innefattande en immunogen determinant av ett HA-proteins HA2-underenhet.
1 85811 Hybridipolypeptidin koodaussekvenssin sisältävä DNA-molekyyli - DNA-molekyl innehållande en kodningsskevens för en hybridpolypeptid Tämä keksintö koskee DNA-molekyyliä käsittäen koodaussekvenssin hybridipolypeptidille, joka voi stimuloida immuunivastetta eläimissä influenssaviruksen aiheuttamalle infektiolle. Influenssavirusreaktio aiheuttaa äkillisen hengityselinsairauden ihmisellä, sialla, hevosilla ja siipikarjalla, joskus pandeemisissa mittasuhteissa. Influenssavirukset ovat ortomyksoviruksia ja näin ollen niillä on kuorellisia virioneja halkaisijaltaan 80-120 nanometriä ja kaksi erilaista glykoproteiiniuloketta. Kolme tyyppiä, A, B ja C, infektoivat ihmisiä. Tyypin A virukset ovat aiheuttaneet suurimman osan ihmisen epidemioista uuden historian aikana, vaikka on myös satunnaisesti puhjenneita B- tyypin infektioita. Tunnetut sian, hevosen ja siipikarjan virukset ovat kaikki olleet tyyppiä A. A-tyypin virukset on jaettu alatyyppeihin perustuen hemagglutiniini (HA) ja neuraminidaasi (NA) pintaglykoproteiinien antigeenisiin ominaisuuksiin. Tyypissä A, alatyypit Hl ("sikainfluenssa"), H2 ("aasialaisinfluenssa") ja H3 ("hongkongilaisinfluenssa") ovat vallitsevia ihmisen infektioissa. Geneettisestä evoluutiosta johtuen, joka suunnilleen vuoden välein vaikuttaa HA- ja NA-proteiinien antigeenipaikkoihin, ei ole ollut mandollista valmistaa "yleismaailmallista" influenssavirusrokotetta käyttäen tavanomaisia tapettuja tai heikennettyjä viruksia, so. rokotetta, joka ei ole lajispesifinen. Äskettäin on tehty yrityksiä valmistaa sellaisia yleismaailmallisia tai puoli-yleismaailmallisia rokotteita virusvalikoimasta, joka on valmistettu yhdistelemällä eri kantoja. Aivan äskettäin sellaisissa yrityksissä on käytetty yhdistelmä-dna-tekniikkaa tähdäten pääasiassa HA-proteiiniin. Winter et al., Nature, vol. 292, sivut 72-75 (1981) kuvaavat kannan A/PR/8/34 (H1N1) HA:n DNA-koodijärjestyksen. Tämän kannan HA1- ja HA2-alayksiköiden aminohappo- ja nukleotidijärjestysten
2 85811 homologiaprosenttia verrattiin alatyyppejä H2, H3 ja H7 edustavien kantojen vastaaviin. Baez et al., Nucl. Acids Res., vol. 8, sivut 5845-5857 (1980) kuvaavat kannan A/PR/8/34 ei-rakenneproteiinin (NS) DNA-koodijärjestyksen. Young et al., kirjassa The Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, edit. W.G. Laver, Elsevier Science Publishing Co., Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 80, sivut 6105-6109 (1983) kuvaavat cdna:n kloonauksen E. coli'ssa olevan kannan A/PR/8/34 kaikista kandeksasta RNA-segmentistä ja kuvaavat E. colissa olevan NS1-proteiinin korkean asteen ilmenemisen. US-patenttijulkaisussa 4 357 421 esitetään influenssaviruksen HA-geenin koodijärjestyksen kloonaus ja ilmeneminen ja että HApolypeptidi on antigeeni, jota voidaan antaa rokotustarkoituksiin. The Morbidity and Mortality Weekly Report, vol. 33, numero 19, sivut 253-264, tarkastelee kaikkein viimeaikaisimpia influenssavirusten ehkäisy- ja kontrollistrategioita, mukaan lukien HAproteiinia sisältävien ihmisrokotteiden annostus- ja antamistapaprotokolla. Davis et al., Gene, vol. 21, sivut 273-284 (1983) raportoivat immuunivasteista hiirellä HA-peräisiä polypeptidejä vastaan. Lisäviitteet raportoivat A/PR/8/34 ja muiden kantojen HA, NS ja muiden kantojen influenssavirusgeenien kloonausta ja ilmenemistä. Joitakin sellaisia viitteitä on siteerattu seuraavassa. Keksinnön mukaista DNA-molekyyliä hyödyntäen voidaan valmistaa.. rokote, joka stimuloi eläimillä suojan influenssavirusinfektiota.- vastaan, joka rokote käsittää polypeptidin, muun kuin HA-proteii- nin, jossa on HA-proteiinin HA2-alayksikön immunogeeninen paikka. Keksinnön mukaisella DNA-molekyylillä saadaan aikaan polypeptidi, muu kuin HA-proteiini, joka käsittää HA2-alayksikön immunogeenisen paikan, jota polypeptidiä voidaan käyttää edellä mainitussa
3 85811 rokotteessa. Keksinnön tässä mielessä edullista suoritusmuotoa referoidaan C13-proteiiniksi. Keksintö koskee siis DNA-molekyyliä käsittäen koodaussekvenssin hybridipolypeptidille, joka sisältää influenssavirus HA-proteiinin HA2-alayksikön immunogeenisen determinantin, joka proteiini on johdettu tyyppi A influenssaviruksen H1-, H2- tai H3-alatyypistä, joka on muu kuin HA-proteiini, fuusioituna muun kuin E. colista peräisin olevan polypeptidin kanssa. Keksinnölle on tunnusomaista se, että se käsittää noin 80 NS1-proteiinin N-pään aminohappoa, jotka aminohapot on fuusioitu HA2-alayksikön N- päähän saaden aikaan C13-proteiinin, joka aiheuttaa HA2-immunogeeniselle determinantille immunogeenisen konfiguraation edellyttäen, että HA2-alayksikön immunogeenistä determinanttia koodaa jokin muu aminohappokoodaussekvenssi kuin se, joka koodaa HA2- alayksikön N-pään 1-80 aminohappoa. Usein immunogeeniset paikat eivät stimuloi immuunisuojavastetta. Tämän uskotaan johtuvan suurelta osin siitä, ettei immunogeenisen paikan sijoittuminen isännän kehon puolustusjärjestelmään sopivassa konfiguraatiossa onnistu. Kuten on saatettu julki ja täysin kuvailtu jäljempänä, HA-proteiinin HA2-alayksikön immunogeeninen paikka (joka saattaa sisältää yhden tai useamman vierekkäisiä tai erillisiä hapteeneja), yllättäen indusoi sytotoksisen T-soluvasteen alkuperäisen alatyypin eri kantoja vastaan. Näin ollen HA2-immunogeeninen paikka voi aiheuttaa suojaavan immuunivasteen, jos se annetaan immunogeenisessä konfiguraatiossa, joka on alatyyppispesifinen mieluummin kuin lajispesifinen. Esimerkiksi HA2-immunogeeninen paikka voidaan ottaa mukaan rokotepolypeptidiin, jossa on HA2-alayksikkö, so. valtaosin HA-proteiinin koko HA2-alayksikkö, yhdistettynä toiseen polypeptidiin, joka antaa immunogeeniselle paikalle immuunivasteen aiheuttamalla HA2-alayksikölle immunogeenisen konfiguraation. Edullisesti polypeptidi, joka antaa sellaisen immuunivasteen HA2-immunogeeniselle paikalle, käsittää aminohappojärjestyksen, joka ilmenee suuressa määrin rekombinantti-isännässä, pro-
4 85811 karioottisessa tai eukarioottisessa, yhtyneenä suuressa määrin koko 11A2-alayksikön N-päähän. Erityisen edullinen on polypeptidi, joka on peräisin influenssavirus-proteiinista. Rokotepolypeptidi ei ole HA-proteiini, koskå immuunisuojavaste HA-proteiinia kohtaan näyttää olevan lajispesifinen. Sellaisen rokotepolypeptidin ilmenemiseksi, jolla on 11A2- immunogeeninen paikka E. coli'ssa, on polypeptidi, joka antaa immuunivasteen 11A2-immunogeeniselle paikalle, edullisesti NS1-influenssaproteiinin N-pää. Erityinen ja edullinen suori'tusmuoto siitä on proteiini, jota tässä nimitetään C13. C13-proteiinissa on 81 NS1-proteiinin ensimmäistä aminohappoa yhtyneenä HAl:stä peräisin olevien seriinin ja arginiinin välityksellä koko HA2-alayksikköön. Rokotepolypeptidiä voidaan valmistaa kemialli- silla synteesimenetelmillä. Edullisesti kuitenkin, sitä valmistetaan tunnetuilla yhdistelmä-dna-menetelmillä kloonaamalla ja ilmentämällä isäntämikrobissa tai solussa DNA-kappale, jossa on polypeptidin koodijärjestys. Edullinen isäntä on E. coli, koska sitä voidaan käyttää halutun proteiinin suurten määrien tuottamiseksi turvallisesti ja edullisesti. HA2, NS1 ja muita influenssaviruksen virusproteiineja voidaan valmistaa synteettisesti tai voidaan erottaa virus RNA:sta tunnetuilla menetelmillä tai saatavilla olevista cdna:ta sisältävistä plasmideista. Esimerkiksi, yllä esitettyjen viitteiden lisäksi A/Japan/305/57-kannan HA:n DNA-koodijärjestyksen kloonasi, sekventoi ja raportoi Gething et al., Nature, volyymi 87, sivut 301-306 (1980): kannan A/NT/60/68 HA-koodijärjestys kloonattiin kuten raportoivat Sleigh et al., ja Both et al., kumpikin sarjassa Developments in Cell Biology, Elsevier Science Publishing Co., sivut 69-79 ja 81-89, 1980; kannan A/WSN/33 HA-koodijärjestys kloonattiin kuten raportoivat Davis et-a1 7, Gene, volyymi 10, sivut 205-218 (1980) ja Miti et al., Virology, volyymi 111, sivut 119-124 (1981). Kanarutto-
5 85811 viruksen HA-koodijärjestys kloonattiin kuten raportoivat Porter et al., ja Emtage et al., kumpikin sarjassa Development in Cell Biology, joka yllä mainittiin, sivuilla 39-49 ja 157-168. Influenssaviruksia, mukaanlukien muita kantoja, alatyyppejä ja tyyppejä, on myös saatavilla kliinisistä näyt- teistä ja yleisistä kantakokoelmista kuten American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Systeemit rokotepolypeptidin kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi eri mikrc-organismeissa ja soluissa, mukaanlukien esimerkiksi, E. coli, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces ja nisäkäs- ja hyönteissolut, tunnetaan ja ovat saatavissa yksityisistä ja julkisista laboratorioista ja kantakokoelmista ja kaupallisilta toimittajilta... Keksinnön mukaisella DNA-rnolekyylillä aikaansaatu rokote käsittää yhden tai useamman keksinnön mukaisen rokotepolypeptidin ja kantajan tai. laimentajan sitä varten. Esimerkiksi sellainen rokote voi sisältää huomattavan suuren osan kunkin lukuisan alatyypin koko HA2-alayksiköstä kukin liittyneenä NS1-proteiinin N-pään aminohappoihin, joka rokote on pääosin säilöttynä normaaliin saliiniin tai muuhun fysiologiseen liuokseen. Apuaineen käyttö, kuten alumii- nihydroksidi, voi osoittautua toivottavaksi. Edullinen rokote.. käsittää kolme rokotepolypeptidiä kukin sisältäen huomattavan suuren osan koko HA2-alayksiköstä, peräisin yhdestä 111-, H2-. ja H3 -alatyypistä, yhtyneenä NS1-proteiinin noin 80:een... ensimmäiseen aminohappoon kuten tapauksessa C13-proteiini. Vaihtoehtoisesti polyvalenttia rokotetta voidaan valmistaa yhdestä tai useammasta keksinnön mukaisesta polypeptidistä. yhdistettynä lisäimmunogeeneihin, jotka ovat peräisin influenssaviruksesta tai muista patogeeneista, kuten alayksikkö- tai polypeptidiantigeenit tai tapetut virukset tai bakteerit, rokotteen tuottamiseksi, joka voi stimuloida suojan influenssa- virusta vastaan kuten myös muita tunkeutuvia organismeja tai viruksia vastaan. Menetelmät sellaisten rokotteiden muodostamiseksi ovat hyvin tunnettuja. Esimerkiksi rokotepolypeptidi ja muut immunogeenit yhdistelmärokotteen tapauksessa voidaan lyofilisoida myöhempää saliiniin tai muuhun fysiologiseen liuokseen liuottamista varten.
6 85811 Protokollaa annostuksesta ja antamistavasta voidaan optimoida standardi rokotuskäytännön mukaisesti. Tyypillisesti rokote tullaan antamaan lihaksen kautta, vaikkakin muita antamisreittejä voidaan käyttää kuten suun kautta antaminen, silmän ja nenän kautta antaminen. Perustuen siihen, mitä tiedetään muista polypeptidirokotteista, on odotettavissa, että hyödyllinen yksittäisannos keskiverto aikuiselle ihmiselle on alueella 1,5-150 mikrogrammaa, edullisesti 10-100 mikrogrammaa. Rokote voidaan antaa aluksi myöhäiskesällä tai varhaissyksyllä ja voidaan antaa uudelleen kandesta kuuteen viikkoa myöhemmin niin haluttaessa tai määräajoin, kun immuniteetti heikkenee, esimerkiksi joka toinen tai viides vuosi. Seuraavat esimerkit ovat keksintöä valaisevia, eikä sitä rajoittavia. Esimerkki 1. Plasmidi pm30 Plasmidi papr701 on pbr322-peräinen kloonausvektori, jossa on koodialueet Ml ja M2 influenssavirusproteiineille (A/PR/8/34). Sitä kuvaavat Young et al., kirjassa The Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, W.G. Laver'in toimittama, Elsevier Publishing Co. Plasmidi papr801 on pbr322-peräinen kloonausvektori, jossa on NS1-koodialue (A/PR/8/34). Sitä kuvaavat Young et al., siteerattuna yllä. Plasmidi pasl on pbr322-peräinen ilmentämisvektori, joka sisältää PL-promoottorin, N-hyödyntämispaikan (helpottamaan transkriptionaalisia polaarisia vaikutuksia N-proteiinin läsnäollessa) ja cii-ribosomisidospaikan sisältäen cii-translaatioaloituskoodin, jota seuraa välittömästi Bam HI-paikka. Sitä kuvaavat Rosenberg et al., Methods Enzymol., volyymi 101, sivut 123-238 (1983). Plasmidi pasldeltaeh valmistettiin poistamalla pas1:stä ei-välttämätön pbr322-peräinen Eco RI-Hin diii-alue. papr801:n 1236 emäsparia sisältävä Bam HI-palanen, jossa on NS1-koodialue virusperäisenä 861:ssä emäsparissa ja 375 emäsparia
7 85811 pbr322-peräisenä, liitettiin pasldeltaeh:n Bam HI-paikkaan. Syntynyt plasmidi, pasldeltaeh/801 ilmentää alkuperäisen NS1:n (230 aminohappoa). Tässä plasmidissa on Nco I-paikka aminohappojen 81 ja 82 kodonien välissä ja Nru I-paikka 3' NS järjestyksille. Bam HI-paikka aminohappojen 1 ja 2 välissä on jäljellä. 571:n emäsparin kappale, jossa on koodijärjestys Ml-proteiinin C-pään 50:11e aminohapolle, saatiin katkaisemalla papr701 Nco I:n ja Eco R5:n kanssa. Tämä kappale liitettiin plasmidin pasldeltaeh/801:n Nco I:n ja Nru I:n väliin tuon kappaleen poistamisen jälkeen plasmidista. Syntyneessä plasmidissa pm 30 on koodi yhdistyneelle proteiinille, joka käsittää NS1:n 81 ensimmäistä amonohappoa yhdistyneenä Ml:n 50:een viimeiseen aminohappoon. Nco I ja Bam HI jäävät jäljelle. Esimerkki 2. Plasmidi pc13 Plasmidi pjz102 on pbr322-peräinen kloonausvektori, jossa on koko HA-proteiinin (A/PR/8/34) koodialue. Sitä kuvaavat Young et al., siteerattu esimerkissä 1. Plasmidi pbgl II on pbr322-peräinen kloonausvektori, jossa on Bgl II-linkkeri pbr322:n Nru I-paikassa. pjz102 katkaistiin Mn I:llä. Bgl II-linkkerit liitettiin kaikkiin päihin ja HA2:n sisältämä kappale pistettiin paikalleen. Syntyneen plasmidin 5' liitoskohta, pbgl II/HA2, sekventoitiin seuraavasti: 1 2 3 5' AGATCTG TCCAGA GGT 3' Alue 1 on peräisin Bgl II-linkkeristä ja koodaa asparagiinin ja leusiinin. Alue 2 on peräisin HAl:stä ja koodaa seriinin ja arginiinin. Alue 3 on peräisin HA2:sta ja koodaa kaikki HA2-alayksikön aminohapot. Liitoskohta 3' sekventoitiin seuraavasti: 3 4 5 6 5' ATATGCATC TGA GATTAGAATTTCA CAGATCT
8 85811 Alue 4 on HA2-loppukodoni. Alueella 5 on virusperäisiä 3' ei-koodaavia järjestyksiä. Alue 6 on peräisin Bgl II-linkkeristä. Kappale, jossa on 691 emäsparia ja HA2-koodijärjestys, saatiin katkaisemalla pbgl II/HA2 Bgl II:11a. Kappale täytettiin päästä DNApolI (KLenow):11a ja liitettiin pas1delta EH/801:een, joka oli katkaistu Nco I:llä ja samoin päästä täytetty (Klenow). Syntynyt plasmidi on pc13. NS1-HA2, tasapäinen liitoskohta sekventoitiin seuraavasti: 7 1 2 3 5' AAAATGACCATG GATCTG TCCAGA GGT 3' Alue 7 on peräisin NS1-geenistä. Alueet 1, 2 ja 3 ovat kuten yllä on kuvattu. Esimerkki 3. C13-proteiinin tuottaminen E. coli isäntäkanta N5151, lämpötilaherkkä lambda lysogeeni (ci857) transformoitiin pc13:n kanssa. Transformantteja kasvatettiin 32 C:ssa keskilogaritmivaiheeseen (A 260 =0,6) LB-liemessä, johon oli lisätty 100 mikrogrammaa/ml ampisilliinia. Viljelmät siirrettiin sitten 42 C:een ci:n inaktivoimiseksi ja siten C13-proteiinin synteesin indusoimiseksi. Kanden tunnin kuluttua 42 C:ssa bakteerit otettiin talteen sentrifugoimalla (3500 kierr/min, 20 min) ja bakteeripelletti jäähdytettiin -20 C:ssa. Pelletti sulatettiin sitten ja suspendoitiin puskuriin A (50 mm Tris-HC1, ph 8,0, 2 mm EDTA, 1 mm diotiotreitoli, 5 % (tilavuus/tilavuus) glyseroli). Lysotsyymiä lisättiin niin, että loppupitoisuus oli 0,2 mg/ml, ja seosta inkuboitiin jäähauteella 20 min. Seosta käsiteltiin sen jälkeen Waringsekoittajalla suurella nopeudella kuusi jaksoa kukin 15 s. Suspensiota sonikoitiin sitten yksi min Branson'in värähtelijäsonikaattorilla. Seos sentrifugoitiin sen jälkeen (15 000kierr/ min, 30 min). Pelletti suspendoitiin uudelleen puskuri A:han sonikoiden (4 x 15 sekunnin jaksoa). Seos tehtiin sen jälkeen 0,1 %:seksi
9 85811 deoksikolaatin suhteen, ja sitä sekoitettiin yksi tunti 4 C:ssa. Seosta sentrifugoitiin (15 000 kierr/min, 30 min) ja proteiini pelletoitui. Deoksikolaattikäsittely uusittiin ja syntynyt pelletti suspendoitiin puskuri A:han sonikoiden. Suspensio tehtiin sitten 1 %:seksitriton X-100:n suhteen, ja sitä sekoitettiin yksi tunti 4 C:ssa. Seos sentrifugoitiin jälleen (15 000 kierr/min, 30 min) ja proteiinipelletti otettiin talteen. Proteiini suspendoitiin uudelleen sonikoiden, ja proteiini 'luotettiin ureaan (4M loppukonsentraatio). Tätä liuosta sentrifugoitiin partikkeliaineksen poistamiseksi (15 000 kierr/min, 30 min), ja supernatantti otettiin talteen ja dialysoitiin vasten kolmea yhden litran erää 10 mm Tris- HC1:ää, ph 7,5, 1 mm EDTA, urean poistamiseksi. Proteiiniliuosta sentrifugoitiin jälleen partikkeleiden poistamiseksi (15 000 kierr/min, 30 min), ja supernatantti, joka sisälsi C13-proteiinin otettiin talteen ja käytettiin määrityksiin. Esimerkki 4. T-solumääritys C13-proteiinin kykyä indusoida sytotoksinen T - soluvaste in vitro-määrityksessä verrattiin muiden proteiinien vastaavaan myös A/PR/8/34 alkuperää. Muut proteiinit on oheisena identifioitu näin: C7 Delta 7 C36 Delta 13 NS1 (täydellinen HA) (HAl:n ja HA2:n 80 N-terminaaliset jäännökset) (HA2) (NS1:n 80 N-terminaaliset jäännökset ja HA2:n 80 N-terminaaliset jäännökset) (NS1) NS2 (NS2) M30 (NS1 ja M) (katso esimerkki 1) Molekyylit, jotka sisälsivät kullekin näistä koodijärjestyksen, saatiin kuten kuvasivat Young et al., kirjassa The Origin of Pandemic Influenza Viruses, 1983, edit. W.G. Laver, Elsevier Science Publishing Co., ja ilmenivät pasldeltaeh:ssa suuresti, kuten yllä on kuvattu. Proteiinia tuotettiin huomattavasti, kuten on yllä kuvattu, påitsi että bakteeripelle-
10 85811 tin uudelleen suspendoinnin, lysotsyymikäsittelyn, sonikoinnin ja sentrifugoinnin jälkeen NS1-proteiini pysyi supernatantissa. Supernatantti tehtiin 100 mm:ksi MgC1 2 :n suhteen, ja sitä sekoitettiin yksi tunti 4 C:ssa. Liuos sentrifugoitiin sitten (15 000 kierr/min, 30 min) NS1:n saamiseksi pellettiin. Pelletti suspendoitiin puskuri A:han ja käsiteltiin jälleen 100 mm MgC1 2 :lla NS1-proteiinin uudelleensaostamiseksi. Sentrifugoinnin jälkeen pelletti suspendoitiin puskuri A:han ja dialysoitiin vasten kolmea yhden litran erää 10 mm Tris-HC1, ph 7,5, 1 mm EDTA. Liuos sentrifugoitiin sitten jälleen kaikkien partikkeleiden poistamiseksi, ja supernatantti, jossa oli NS1-proteiini otettiin talteen ja käytettiin määrityksiin. Sytotoksinen T - solumääritys suoritettiin pääosin seuraavasti. Pernasoluja eristettiin virus-immuuneilta ja ei-immuuneilta hiiriltä ja viljeltiin in vitro. Solut jaettiin eriin ja altistettiin eri antigeeneille 90 minuutin ajaksi in vitro. Antigeenit poistettiin sitten soluja toistuvasti pesten, ja soluja viljeltiin sitten viisi päivää antaen stimuloitujen populaatioiden laajentua. Stimuloidut solut, so. efektorisolut, sekoitettiin virusinfektoiduilla tai ei-infektoiduilla P815-kohdesoluilla, jotka oli esikäsitelty 51 Cr:llä. Merkittävä 51 Cr:n vapautuminen kasvualustaan osoitti sekundääristen sytotoksisten T-solujen läsnäolon (2 CTL), jotka olivat muodostuneet in vitro antigeenistimulaatiossa. Tappamisen spesifisyyttä tutkittiin kandella tavalla: (1) kohdesoluilta, jotka oli infektoitu eri antigeeneillä testattiin tappokyky ja (2) pernasoluja eristettiin hiiristä, jotka oli immunisoitu eri viruksilla. Määrityksen lineaarisuutta tutkittiin käyttäen erilaista kohdetta: efektorisolusuhteita ja käyttäen eri antigeenimääriä, kuten on esitetty seuraavassa taulukossa, jotka osoittavat kuvaavia tuloksia. Alla listatut tulokset osoittivat efektorikohdesolujen suhteita, jotka olivat 30:1 ja 10:1. Taulukoiden arvot on esitetty prosentteina 51 Cr:n vapautumisesta alustaan verrattuna 51 Cr:n kokonaismäärään soluissa
1 1 85811 määritettynä solujen detergenttiliuotuksella. Merkittävät positiiviset tulokset on laatikoitu. Määrityksissä käytetyt virukset olivat: A/PR/8/34 (HIN1) A/Port Chalmers/174 (H3N2) A/Brazil/178 (H2N1) A/Singapore/157 (H2N2) ("PR8") ("A/PC") ("A/B2") ("A/Sing") Taulukko 1 2 CTL:n vasteen stimulointi E. coli-peräisillä polypeptideillä 2 :een stimulointiin käytetty antigeeni PR8-P815 Ei-infektoitu P815 30 10 30 10 PR8 36,0 27,21 0,2-5,2 C13 24 ug/ml 10,7 10,71 0,5-4,4 12 ug/ml 10,6 8,1 0,5-3,6 6 ug/ml 9,5 4,4 1,4-4,1 NS 2 24 i ug/m1 0,4 2,8-4,0-2,7 12 / ug/ml -1,8-1,5 0,2-4,1 6 / ug/ml -0,5-2 1 0-0,3-5,2 M30 24 ug/ml -1,0-3,9-1,6-3,3 12 ug/ml -1,8-1,2-1,9 1,1 6 ug/ml 5,7-1,5-3,6-6,2 No -2,7-4,1-4,7-4,0
12 85811 Taulukko 2 2 o CTL:n vasteen stimulointi E. coli-peräisillä polypeptideillä* 2 :een stimulointiin käytetty PR8-P815 Ei-infektoitu P815 antigeeni 30 10 30 10 PR8** 160,5 NS 1-5,2 C13 r,.,-,--51- A13-8,6 A 7-3,2 No -5,4 37,41 6,7 2,6-8,7 4,3 0,0-1,1 0,5-0,5-10,1-1,3 0,0-7,4 2,9-0,9-2,0 1,9 3,2 * Pernasoluja otettuna PR8-immuunilta hiireltä stimuloitiin in vitro antigeeneillä (5 / ug/ml). ** PR8-infektoidut syngeeniset pernasolut.
00 t 11. 11 001.11.0, Taulukko 3 Polypeptidi C13:ta stimuloima CTL-virusspesifisyys Efektori 1 o * 2 0 PR8 -P815 A/PC -P815 30 10 30 10 Ei-imfektoitu 30 10 P815 PR8 PR8 159,41 172,81 155,81 A/PC 17 7, 91 176,11 74,2 159,31 C13 24 ug/ml 12 ug/ml 6 ug/ml 133,21 11 1, 0 ' 18,0 114,81 3,9 1,2-0,4-0,7 2,4-2,4 2,3 2,3 4,2 0,2 2,3 2,1 1,7 1,3 4,4-1,4 0,8 0,4 A/PC PR8 196,01 172,91 174,31 157,51 A/PC 192,31 175,6 85,1 80,01 9,8 1,8 10,2 3,8 C13 24 12 6 / u g/ml 6,7 1,0 4,3-5,0 / ug/ml 4,6-1,2 1,2-3,7 ug/ml 5,2 1,5-0,2-6,3 2,6 0,2 2,4-0,3 3,1-1,5 * Pernasolut eristettiin hiiristä, jotka oli esi-immunisoitu esitetyillä viruksilla
.. : : : ' ii.. ' Taulukko 4 Polypeptidi C13:ta stimuloima Tc-virusspesifisyys Efektori A/PR/8(H1N1) A/BZ A/SING A/PC Ei-infektoitu 1 o 2 0 30 10 30 10 30 10 30 10 30 10 PR8 PR8 76,5 77,0 82,8 75,5 30,6 17,8 92,8 79,0 8,4 3,0 C13 48 / ug/ml 60,9 42,6 65,5 41,3 5,8 0,0 5,7 7,5 4,1 3,0 24 / ug/ml 70,1 46,5 63,5 46,2 9,5 5,6 9,2 9,3 8,8 0,6 12 / ug/ml 50,7 24,0 45,0 18,4 2,0 4,4 10,3 8,5 2,0 1,1 No PR8 10,6-0,8 14,0 16,3 15,3 6,7 13,2 5,6 2,0 1,5 C13 48 / ug/ml -0,8-0,6 8,4 3,6 4,6 3,7 2,5 2,3 2,3-2,9 24 / ug/ml 0,7 0,3 7,6 7,3 5,2 6,7 4,8 4,6 5,1-2,0 12 /,ug/m1 1,8-0,9 10,9 2,9 3,6 2,5 4,9 2,9 5,1 8,3
15 85811 Kuten on osoitettu edeltävissä taulukoissa, indusoi C13 sekundäärisen sytotoksisen T-soluvasteen käytettäessä hiirien immuuneja pernasoluja, jotka on aikaisemmin infektoitu PR8- viruksen sub-letaaleilla annoksilla. Kaikki muut peptidijohdannaiset, joita tutkittiin, käsittäen NS1:n, delta7:n, deltal3:n tai M30:n, NS2:n ja C36:n, eivät pystyneet indusoimaan sellaista vastetta kuin on tietyillä hemagglutiinirakenteilla. C13-peptidin aiheuttama vaste on annoksesta riippuvainen ja tasot 5-24 mikrogrammaa/ml indusoivat sekundääriset sytotoksiset T-soluvasteet. Havaittujen vasteiden virusspesifisyys on huomiota herättävä siinä suhteessa, että C13 stimuloi hiirien immuuneja pernasoluja, jotka aikaisemmin oli infektoitu H1N1-viruksilla mutta eivät stimuloineet hiirien immuuneja pernasoluja, jotka aikaisemmin oli infektoitu H3N2-viruksella (A/PC). Tämä on toisin kuin alatyyppiristireaktiiviset sytotoksiset T-lymfosyyttivasteet, joita havaitaan stimuloitaessa samoja pernasoluja elävillä viruksilla johtuen ainakin osittain ristireaktiivisista sisäisistä antigeeneistä. Lisäksi C13:n aiheuttama stimulaatio on ristireaktiivinen H1N1-alatyypin viruskannoilla; PR8- immuunit pernasolut, jotka C13 oli stimuloinut, kykenivät tunnistamaan ja tappamaan kohdesoluja, jotka oli infektoitu PR8:lla (H1N1-kanta vuodelta 1934) kuin myös kohdesoluja, jotka oli infektoitu A/Brazil-kannalla (H1N1-kanta vuodelta 1978) annosmäärinä 12-48 mikrogrammaa ja suurella sytotoksisuusaktiivisuudella. Perustuen huomattavaan määrään tietoja, jotka osoittavat, että sytotoksiset T-lymfosyytit näyttävät myötävaikuttavan toipumiseen influenssavirusinfektiosta hiirien systeemeissä, ja että sellaiset lymfosyyttivasteet voidaan havaita sekä immuuneissa hiirissä että ihmisissä (ks. Ennis et al., Microbiology - 1984, sivut 427-430, Amer. Soc. Microbiology). C13-proteiinin kyky indusoida sellainen sytotoksinen T-soluvaste poikki lajien osoittaa sen käyttökelpoisuuden, ja HA2-immunogeenisen paikan käyttökelpoisuuden indusoida immuunivaste, joka on vastustuskykyinen influenssavirusinfektioille; vaste on
16 85811 puoliuniversaalinen siinä suhteessa, että se on alatyyppivaan ei lajispesifinen. Keksintöä ja sen edullisia suoritusmuotoja on täysin esitelty yllä. Keksintö ei kuitenkaan ole rajoittunut sellaisiin spesifisesti esitettyihin suoritusmuotoihin. Paremminkin siihen kuuluu kaikki modifikaatiot ja vaihtelut, jotka esiintyvät seuraavissa patenttivaatimuksissa.
17 85811 Patenttivaatimukset 1. DNA-molekyyli käsittäen koodaussekvenssin hybridipolypeptidille, joka sisältää influenssavirus HA-proteiinin HA2-alayksikön immunogeenisen determinantin, joka proteiini on johdettu tyyppi A influenssaviruksen Hl-, H2- tai H3- alatyypistä, joka on muu kuin HA-proteiini, fuusioituna muun kuin E. colista peräisin olevan polypeptidin kanssa, tunnettu siitä, että se käsittää noin 80 NS1-proteiinin N- pään aminohappoa, jotka aminohapot on fuusioitu HA2-alayksikön N-päähän saaden aikaan C13-proteiinin, joka aiheuttaa HA2-immunogeeniselle determinantille immunogeenisen konfiguraation edellyttäen, että HA2-alayksikön immunogeenistä determinanttia koodaa jokin muu aminohappokoodaussekvenssi kuin se, joka koodaa HA2-alayksikön N-pään 1-80 aminohappoa. 2. Ilmentymisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin. Patentkrav 1. DNA-molekyl omfattande en kodnigssekvens för en hybridpolypeptid, som innehåller en immunogenisk determinant av ett influensavirus HA-proteins HA2-underenhet, vilket protein är härlett från ett Hl-, H2- eller H3-underenhet av typ-a influensavirus, vilket enhet är annat än HA-protein, fusionerat med en polypeptid härstammande från annan än E.coli, kännetecknad av att den innefattar cirka 80 N- terminala aminosyror av NS1-proteinet, vilka aminosyror är fusionerade till HA2-underenhetets N-terminal åstadskommande ett C13-protein, som föranleder en immunogenisk konfiguration till HA2-immunogenisk determinant förutsatt, att HA2-underenhetets immunogeniska determinant kodas av någon annan aminosyrakodningssekvens än den, som kodar HA2-underenhetets N-terminala 1-80 aminosyror. 2. Expressionsvektor, kännetecknad av att den innehåller en DNA-molekyl enligt patentkravet 1.