Kemian tekniikan koulutusohjelma. Jenni Heikkinen

Kemian tekniikan koulutusohjelma Jenni Heikkinen MARJOJEN JA HEDELMIEN TERVEYSVAIKUTTEISET FENOLIT Kandidaatintyö 7.12.2015

Aalto-yliopisto, PL 11000, 00076 AALTO www.aalto.fi Tekniikan kandidaatintyön tiivistelmä Tekijä Jenni Heikkinen Työn nimi Marjojen ja hedelmien terveysvaikutteiset fenolit Koulutusohjelma kemiantekniikan koulutusohjelma Pääaine Bio- ja kemiantekniikka Pääaineen koodi CHEM3012 Vastuuopettaja Lauri Rautkari Työn ohjaaja(t) Päivi Laaksonen Päivämäärä 07.12.2015 Sivumäärä 34 Kieli suomi Tiivistelmä Tässä kandidaatin tutkielmassa tavoitteena on selvittää tutkimuskirjallisuuden pohjalta, millaisia fenoleita marjoissa ja hedelmissä esiintyy, millaista tieteellistä näyttöä niiden terveysvaikutuksista on olemassa ja millaisiin biokemiallisiin prosesseihin mahdolliset terveysvaikutukset perustuvat. Lisäksi selvitetään fenolien eristämistä ja rikastamista mahdollisiin teollisiin tarkoituksiin. Erilaisia fenoliyhdisteitä tunnetaan kymmeniä tuhansia. Fenoleista on olemassa kattava kansainvälinen luokittelu, joka helpottaa kemiallisten perusrakenteiden hahmottamista. Työssä luodaan katsaus fenolien luokitteluun ja rakenteisiin. Fenolien merkitystä kasvien kannalta selvitetään. Työssä tarkastellaan myös, mitä fenoleita marjoissa esiintyy. Lisäksi selvitetään fenolien eristämistä ja rikastamista. Fenolien eristämisen osalta on tarkasteltu neste-neste-uuttoa ja adsorptioerotusta. Osa fenoleista tuhoutuu helposti prosessoitaessa, joka ominaisuus tuo lisähaasteita fenolien eristämiseen. Työssä selvitetään fenoleiden terveysvaikutuksia ihmiselle ja toisaalta sitä, millaisiin mekanismeihin havaitut vaikutukset perustuvat. Tutkimuskirjallisuuden pohjalta havaitut vaikutukset voidaan jakaa tulehdusta lievittäviin vaikutuksiin ja antioksidatiivisuuteen. Uusimmissa tutkimuksissa polyfenolien on havaittu lievittävän tulehdusta elimistössä. Useat fenoliset yhdisteet ovat voimakkaita antioksidantteja. Ihmisen elimistön antioksidanttipuolustus ei riitä täydellisesti estämään hapettumisvaurioita, vaan terveyden ylläpitämiseksi antioksidantteja on saatava ravinnosta. Eräissä tutkimuksissa on havaittu, että marjayhdisteet estävät ihmisissä esiintyvien taudinaiheuttajabakteerien kasvua. Avainsanat polyfenoli, marja, flavonoidi, terveysvaikutus

Sisällys 1 Johdanto... 1 2 Fenoliyhdisteet... 2 2.1 Rakenne... 2 2.2 Fenolien luokittelu... 3 2.2.1 Flavonoidit... 4 2.2.2 Fenolihapot... 10 2.2.3 Lignaanit... 12 2.2.4 Stilbeenit... 13 2.2.5 Tanniinit... 14 3 Fenolien esiintyminen luonnossa... 16 3.1 Fenolien merkitys luonnossa... 16 3.2 Marjojen ja hedelmien fenolipitoisuudet... 18 3.3 Fenolien eristäminen... 21 4 Fenolien terveysvaikutukset... 22 4.1 Tulehdusta lievittävät vaikutukset... 23 4.2 Antioksidatiivisyys... 24 5 Yhteenveto... 27 Lähdeluettelo... 30

1 Johdanto Marjoja ja hedelmiä on jo kauan pidetty terveellisinä. Ravintoaineiden lisäksi marjoissa on muitakin bioaktiivisia aineita, jotka voivat vaikuttaa elimistön toimintaan ja terveyteen. 1900-luvun tutkimuksissa huomio kiinnittyi vitamiineihin, joiden pohjalta jo isovanhempamme tiesivät yleisesti marjojen ja hedelmien terveellisyydestä. Sittemmin on huomattu, että läheskään kaikkia terveysvaikutuksia ei voida selittää vitamiineilla. Nykytietämyksen mukaan elimistön toimintaan ja terveyteen vaikuttavia yhdisteitä ovat erityisesti erilaiset polyfenolit (fenoliyhdisteet), kuten flavonoidit, fenolihapot ja tanniinit. Julkisuudessakin on toistuvasti tuotu esille flavonoidit, joiden terveysvaikutuksista esitetään varsin usein erilaisia väitteitä tai tutkimusreferaatteja. Mikä on näiden väittämien tieteellinen pohja? Tässä kandidaatin tutkielmassa tavoitteena on selvittää tutkimuskirjallisuuden pohjalta, millaisia fenoleita marjoissa ja hedelmissä esiintyy, millaista tieteellistä näyttöä niiden terveysvaikutuksista on olemassa ja millaisiin biokemiallisiin prosesseihin mahdolliset terveysvaikutukset perustuvat. Lisäksi selvitetään fenolien eristämistä ja rikastamista. Luvussa 2 käydään läpi yleisimpien marjoissa esiintyvien polyfenolien rakenne ja luokittelu. Luvussa 3 selvitetään fenolien kasvitieteellistä merkitystä sekä eri marjojen ja hedelmien fenolipitoisuuksia. Lisäksi selvitetään fenolien eristämistä ja rikastamista. Luku 4 käsittelee fenolien terveysvaikutuksia tieteellisessä kirjallisuudessa esiintyvän näytön pohjalta. 1

2 Fenoliyhdisteet Fenoliyhdisteet ovat kasvien sekundäärisiä metaboliitteja sisältäen kymmeniä tuhansia tunnistettuja rakenteita (Primetta, 2014). Tässä luvussa keskitytään tarkastelemaan marjojen ja hedelmien fenoliyhdisteiden luokittelua ja rakennetta. 2.1 Rakenne Fenolit ovat orgaanisia yhdisteitä, joissa yksi tai useampi OH-ryhmä on kiinnittynyt suoraan aromaattiseen renkaaseen. Yksinkertainen fenoli C6H5OH tunnetaan myös nimillä fenyylialkoholi, karbolihappo ja hydroksibentseeni. Yksinkertaisen fenolin rakenne on esitetty kuvassa 1. Kuva 1. Yksinkertainen fenoli C6H5OH Fenolit esiintyvät kasveissa mono- tai dimeereinä tai fenolisina polymeereinä kuten ligniinit ja tanniinit. Vapaana esiintymisen lisäksi fenolit voivat olla liittyneinä lukuisiin muihin aineenvaihdunnan tuotteisiin kuten aminohappoihin, proteiineihin ja terpeeneihin. Fenolit ovat kemiallisesti reaktiivisia, usein happamia ja vesiliukoisia. (Keskitalo, 2001.) Yhdisteitä, jotka muodostuvat useista fenoliryhmistä kutsutaan polyfenoleiksi. Nykyisin tunnetuista fenoliyhdisteistä suurin osa muodostuu ainoastaan kasveissa, vaikka fenoleita esiintyy myös eläimillä ja mikro-organismeilla. (Keskitalo, 2001.) 2

2.2 Fenolien luokittelu Fenolit voidaan jakaa eri luokkiin yhdisteiden rakenteen perusteella. Marjoissa ja hedelmissä on paljon fenoleita, jotka voidaan luokitella viiteen ryhmään: flavonoidit, fenolihapot, lignaanit, stilbeenit ja polymeeriset tanniinit. Näiden lisäksi kasviperäisistä elintarvikkeista löytyviä yleisiä fenoleita ovat flavonit ja isoflavonoidit. Flavoneita esiintyy mm. lehtisellerissä, paprikassa ja persiljassa. Isoflavonoidien hyvä lähde on soijapavut (Jaakkola). Koska näitä fenoleita ei esiinny marjoissa ja hedelmissä niin, niitä ei käsitellä tässä työssä tämän tarkemmin. Kuvassa 2 on esitetty marjojen ja hedelmien tärkeimpien fenolisten yhdisteiden luokittelu edellä mainittuihin ryhmiin ja niiden alaryhmiin. Kuva 2. Marjojen ja hedelmien tärkeimpien fenolisten yhdisteiden luokittelu (Myllymäki, 2008; Primetta, 2014). 3

Flavonoideihin kuuluvat antosyaanit ovat yleisiä marja-aroniassa, mustikassa ja herukoissa, ja ne ovat väriaineita. Ellagitanniinit ovat monimutkaisia fenolisia polymeerejä, joita esiintyy mesimarjassa, vadelmassa, lakassa ja vähemmässä määrin myös mansikoissa. Yleisimmät fenolihapot marjoissa ovat kanelihapon tai hydroksibentsoehapon johdannaisia. Puolukka, mansikka ja karpalo ovat esimerkkejä marjoista, joissa on lignaaneja. Stilbeeneihin kuuluvaa resveratrolia esiintyy puolukassa (Rautiainen, 2012; Jaakola, 2010). Jatkossa esitellään viiden fenoliryhmän kemiallista perusrakennetta, ryhmään kuuluvia alaluokkia ja niihin kuuluvia yhdisteitä sekä ryhmän ominaisuuksia. Lisäksi jokaiselle ryhmälle pyritään löytämään parhaat lähteet marjoista ja hedelmistä. 2.2.1 Flavonoidit Erilaisia flavonoideja on tunnistettu yli 4000 kappaletta. Vain kasvisolut kykenevät tuottamaan flavonoideja, eläinsoluissa niitä ei muodostu (Törrönen, 1997). Kaikilla flavonoideilla perusrakenne on sama, difenyylipropaani, joka käsittää kaksi bentseenirengasta (A ja B) sekä niitä yhdistävän heterosyklisen renkaan C. (Törrönen, 1997). Ne voidaan jakaa ainakin kahteen ryhmään molekyylin sisältämän pyreenirenkaan hapettumisasteen mukaan. Flavonoidien yleinen rakennekaava kuvassa 3 (Vihakas, 2014). Eroavaisuudet eri flavonoidialaryhmien välillä havaitaan erilaisesta heterosyklisestä renkaasta ja alaryhmien sisällä hydroksyyliryhmien määrästä ja järjestyksestä. (Primetta, 2014.) Kuva 3. Flavonoidien yleinen rakennekaava (Vihakas, 2014). 4

Mikäli OH-ryhmä on kiinnittynyt renkaaseen C, yhdisteet ovat 3- hydroksiflavonoideja (antosyaanit, flavanolit ja flavonit). Jos OH-ryhmää ei ole renkaassa C, niin yhdisteet ovat 3-deoksiflavonoideja (flavanonit ja flavonit) (Hyvärinen, 2001). 3-Hydroksiflavonoidien ja 3-deoksiflavonoidien syntetisointireitti kasveissa on erilainen. (Törrönen, 1997.) Useimmat flavonoidit esiintyvät luonnossa vesiliukoisina glykosideinä eli sokerijohdannaisina. Flavonoideja esiintyy myös pieninä määrinä vapaina alkaneina eli sokeriosattomina flavonoideina. Sokerit ovat kiinnittyneet yleisemmin flavonoidiaglykonin 3, 5 tai 7 hiilen hydroksyyliryhmään. Tyypillisimmät sokerit ovat glukoosi, galaktoosi, ksyloosi ja ramnoosi. (Hyvärinen, 2001.) Monet fenoliset yhdisteet ovat voimakkaita antioksidantteja vähentäen vapaiden radikaalien muodostumista ja siepaten niitä. Polyfenolisten yhdisteiden rakenne vaikuttaa niiden antioksidatiivisuuteen. Antioksidatiivista aktiivisuutta aiheuttavat esimerkiksi seuraavat rakenneominaisuudet o- difenolinen ryhmä (B-renkaassa), 2-3 kaksoissidosta konjugoituneena karbonyyliryhmän kanssa C4:ssa ja hydroksyyliryhmät hiilissä 3 j a 5. Nämä mainitut rakenteet löytyvät esimerkiksi kvertsetiinin molekyylirakenteesta. (Hyvärinen, 2001.) Fenolisten yhdisteiden antioksidatiivisyyteen perustuvia terveysvaikutuksia käsitellään omassa alaluvussaan 4.2. Antosyaanit Antosyaanit ovat merkittävä flavonoidiryhmä ja niiden väri vaihtelee lohenpunaisesta punaiseen ja violetista tummansiniseen (Andersen, 2006). Väri riippuu molekyylin hydroksylaatio- ja metylaatioasteesta, ph:sta sekä metalli-ionien ja eräiden muiden aineiden läsnäolosta. Antosyanidit ovat amfolyyttejä, jotka ympäristön ph:sta riippuen toimivat joko happoina tai emäksinä, samalla niiden väri muuttuu. (Törrönen, 1997.) Antosyaanit ovat 5

vesiliukoisia glykosidejä eli yhdiste sisältää glykoni ja aglykoni osia. Antosyaaneja tunnetaan kaikkiaan 19 eri tyyppiä, mutta vain kuusi niistä on yleisiä hedelmissä. Tärkeimmät hedelmien antosyaanit ovat delfinidiini, malvidiini, pelargonidiini, peonidiini, petunidiini ja syanidiini. (Primetta, 2014.) Kuvassa 4 on esitelty antosyaanien kemiallinen perusrakenne, jossa merkinnät R1 ja R2 kuvaavat erilaisia vaihtuvia funktionaalisia ryhmiä. Kuva 4. Antosyaanien kemiallinen rakenne (Primetta, 2014). Taulukossa 1 on esitetty antosyaanien perusrakenteen funktionaaliset ryhmät R1 ja R2, joissa eri antosyaaneissa vaihtelevat funktionaaliset ryhmät H, OH ja OCH3. Taulukko 1. Erilaisten antosyaanien rakenne-eroavaisuudet (Primetta, 2014). Nimi R 1 R 2 Delfinidiini OH OH Malvidiini OCH3 OCH3 Pelargonidiini H H Peonidiini OCH3 H Petunidiini OCH3 OH Syanidiini OH H Marjoissa parhaita antosyaanien lähteitä ovat metsämustikat, marja-aroniat, variksenmarjat, saskaton ja mustaherukka. Hedelmissä antosyaaneja on viinirypäleissä, kirsikoissa ja luumuissa. (Määttä-Riihinen, 2004; Jaakkola.) 6

Flavanolit (Katekiinit) Flavanolit eli katekiinit ovat värittömiä ja vesiliukoisia yhdisteitä, jotka reagoivat herkästi hapen kanssa ja jo neutraaleissa olosuhteissa tapahtuu hapettumista ja polymeroitumista ruskeiksi yhdisteiksi. Entsyymien katalysoimaa ruskettumista tapahtuu mm. leikatulla päärynällä ja omenalla. (Hyvärinen, 2001). Katekiinit eivät esiinny kasveissa glykosyloituneena tai metyloituneena, mutta voivat esteröityä gallihapon kanssa. Kasveista on tunnistettu noin tusina erilaista kateliinaa. Katekiinit ovat määrällisesti suurin flavonoidiryhmä vihreissä kasveissa ja erityisen paljon niitä on teelehdissä, joista noin 30 % on monomeerista katekiinia (Törrönen, 1997). Marjoissa flavanoleja on puolukassa ja karpalossa (Määttä-Riihinen, 2004; Jaakkola). Flavanoleissa ei ole kaksoissidosta C2 ja C3 välissä eikä karbonyyliryhmää C- renkaassa toisin kuin useimmissa muissa flavonoideissa. Tämä ja C3 oleva hydroksyyliryhmä mahdollistavat flavanoleille kaksi kiraalista keskusta, joista toinen on C2:ssa ja toinen C3:ssa eli neljä mahdollista diastereomeria. (Primetta, 2014.) Kuvassa 5 on esitetty flavanolin kemiallinen perusrakenne, jossa vaihtuvia funktionaalisia ryhmiä on kuvattu merkinnöillä R1, R2, R3 ja R4. Taulukossa 2 on kuvattu (+)-Gallokatekiinin, (-)-Epigallokatekiinin, (+)-Katekiinin, (-)- Epikatekiinin, (+)-Afzelechinin ja (-)-Epiafzelechinin vaihtuvat funktionaaliset ryhmät ja yhdisteiden stereokemia. 7

Kuva 5. Flavanolien kemiallinen perusrakenne (Primetta, 2014). Taulukko 2. Erilaisten flavanolien rakenne-eroavaisuudet (Primetta, 2014). Nimi Stereokemia R 1 R 2 R 3 R 4 (+)-Gallokatekiini 2,3-trans -2R,3S OH OH H OH (-)-Epigallokatekiini 2,3-cis -2R,3R OH OH OH H (+)-Katekiini 2,3-trans -2R,3S OH H H OH (-)-Epikatekiini 2,3-cis -2R,3R OH H OH H (+)-Afzelechin 2,3-trans -2R,3S H H H OH (-)-Epiafzelechin 2,3-cis -2R,3R H H OH H Flavanonit Flavanonit ovat joko värittömiä tai vaalean keltaisia. Flavanoneilla on C- renkaasta tyydyttynyt sidos C2 ja C3 välistä toisin kuin flavonoleilla. Flavanoneja on lähes yksinomaan sitrushedelmissä, tosin marjoista niitä on löydettävissä pihlajanmarjoista ja orapihlajanmarjoista (Peterson, 1998). Flavanonit esiintyvät tavallisesti diglykosideina, joissa C7:än OH-ryhmään on liittynyt rutinoosi tai neohesperidoosi (Törrönen, 1997). Flavanonien ryhmään kuuluvat mm. eriodiktyoli, hesperetiini ja naringeniini. Kuvassa 6. on esitetty flavanonien kemiallinen perusrakenne, jossa funktionaaliset vaihtuvat ryhmät on merkitty R1 ja R2. Taulukossa 3 on esitelty eroavaisuuksia eri flavanonien välillä. 8

Kuva 6. Flavanonien kemiallinen rakenne (Oregon State University). Taulukko 3. Erilaisten flavanonien rakenne-eroavaisuudet (Oregon State University). Nimi R 1 R 2 Eriodiktyoli OH OH Hesperetiini OH OCH3 Naringeniini H OH Flavonolit Flavonolit ovat yleensä vaaleankeltaisia huonoliukoisia yhdisteitä, joille on ominaista kaksoissidos C2:n ja C3:n välissä ja C-renkaan C3:ssa on OHryhmä. Flavonolit esiintyvät mono-, di- tai triglykosideina. (Törrönen, 1997.) Flavonolien ryhmään kuuluvat mm. isorhamnetiini, kemferoli, kvertsetiini, laricitrin, myrisetiini ja syringetin. Kuvassa 7 on esitelty flavonolien kemiallinen perusrakenne, jossa merkinnät R1 ja R2 kuvaavat erilaisia vaihtuvia funktionaalisia ryhmiä. 9

Kuva 7. Flavonolien kemiallinen perusrakenne (Primetta, 2014) Taulukossa 4 on esitetty flavonolien perusrakenteen funktionaaliset ryhmät R1 ja R2, joissa eri flavonoleissa vaihtelevat funktionaaliset ryhmät H, OH ja OCH3. Taulukko 4. Erilaisten flavonolien rakenne-eroavaisuudet (Primetta, 2014). Nimi R 1 R 2 Isorhamnetiini OCH3 H Kemferoli H H Kvertsetiini OH H Laricitrin OCH3 OH Myrisetiini OH OH Syringetin OCH3 OCH3 Flavonoleja löytyy omenista, viinirypäleistä, karpaloista, puolukoista, tyrnistä, mustaherukoista ja variksenmarjoista (Törrönen et al., 2013; Jaakkola). 2.2.2 Fenolihapot Yleisimmät fenolihapot marjoissa ovat kanelihapon tai hydroksibentsoehapon johdannaisia (Puupponen-Pimiä et al., 2005). Fenolihappoja on runsaasti mustikassa, lakassa, variksenmarjassa, mustaherukassa ja puolukassa sekä vähemmässä määrin appelsiinissa, omenassa, mansikassa ja karpalossa (Törrönen et al., 2013). 10

Hydroksibentsoehapot Hydroksibentsoehapon johdannaiset, kuten p-hydroksibentsoe-, syringa-, protokateku- ja vanilliinihappo esiintyvät pääsiassa glykosideinä. Gallushappo esiintyy poikkeuksellisesti esteröityneenä kiniinihappoon, katekiineihin tai kondensoituneisiin tanniineihin (Hyvärinen, 2001). Kuvassa 8 on esitelty hydroksibentsoehappojen kemiallinen perusrakenne, jossa merkinnät R1, R2, R3 ja R4 kuvaavat erilaisia vaihtuvia funktionaalisia ryhmiä, jossa hydroksibentsoehapoilla vaihtelevat funktionaaliset ryhmät H, -OH, OCH3. Taulukossa 5 on esitetty seitsemän eri hydroksibentsoehapon vaihtuvat funktionaaliset ryhmät. Kuva 8. Hydroksibentsoehappojen kemiallinen perusrakenne (Primetta, 2014). Taulukko 5. Erilaisten hydroksibentsoehappojen rakenne-eroavaisuudet (Primetta, 2014). Nimi R 1 R 2 R 3 R 4 Gallushappo H OH OH OH Syringiinihappo H OCH3 OH OCH3 Vanilliinihappo H OCH3 OH H Protokatekuhappo H OH OH H p-hydroksibentsoehappo H H OH H Gentisiinihappo OH H H OH Bentsoehappo H H H H 11

Hydroksikanelihapot Tunnetuimmat hydroksikanelihappojen johdannaiset, esimerkiksi feruulihappo, kahvihappo, p-kumariinihappo ja sinappihappo, eivät esiinny vapaana vahvoina pitoisuuksina vaan ovat useimmiten esteröityneenä glukoosiin tai kiniinihappoon (Hyvärinen, 2001). Kuvassa 9 on esitelty hydroksikanelihappojen kemiallinen perusrakenne ja taulukossa 6 kuvattu viiden hydroksikanelihapon vaihtuvat funktionaaliset ryhmät. Kuva 9. Hydroksikanelihappojen kemiallinen perusrakenne (Primetta, 2014). Taulukko 6. Erilaisten hydroksikanelihappojen rakenne-eroavaisuudet (Primetta, 2014). Nimi R 1 R 2 R 3 R 4 Sinappihappo H OCH3 OH OCH3 Ferulihappo H OCH3 OH H Kahvihappo H OH OH H p-kumariinihappo H H OH H Kanelihappo H H H H 2.2.3 Lignaanit Lignaanit ovat toinen kasviestrogeenien pääryhmä toinen on isoflavonoidit (Lehtonen, 2010). Lignaaneja ovat esimerkiksi matairesinoli ja sekoisolarisiresinoli. Niiden kemiallinen rakenne on esitetty kuvassa 10. Lignaaneja esiintyy suuremmissa kasveissa, yleensä juurissa, lehdissä kuorissa ja varren 12

puuosassa. Lignaanit toimivat kasveissa puolustusmekanismina mm. kasvitauteja ja hyönteisiä vastaan. Marjoissa lignaaneja on runsaasti mm. mansikoissa ja karpaloissa. Hedelmistä lignaaneja löytyy mm. päärynöistä ja luumuista. (Hyvärinen, 2001.) Lignaanit ovat yleensä dimeerejä, joissa on dibentsyylibutaanirunko. Ne koostuvat kahdesta fenyylipropanoidiyksiköstä sivuketjujen keskimmäisten hiilien muodostamien molekyylien välisten sidosten avulla. (Keskitalo, 2001.) A B Kuva 10. Matairesinolin (A) ja sekoisolarisiresinolin (B) kemialliset rakenteet (Oregon State University). 2.2.4 Stilbeenit Stilbeenit ovat lukuisissa kasveissa esiintyviä molekyylipainoltaan pieniä (200 300 g/mol) yhdisteitä. Stilbeenit ovat kasveissa stressimetaboliitteja, joiden tehtävä on puolustaa kasveja viruksia ja mikrobeja vastaan sekä suojata ultraviolettisäteilyltä ja taudeilta. (Rautiainen, 2012.) Eniten tutkittu stilbeeni on resveratroli, jota on punaviinissä, pähkinöissä ja viinirypäleissä. Sitä tavataan myös vähemmässä määrin puolukasta, karpalosta ja mustikasta. Resveratrolia on pääasiassa viinirypäleiden ja marjojen pintaosissa. (Lehtonen, 2010.) Kuvassa 11 on esitetty resveratrolin trans- ja cis-muotojen kemialliset rakenteet. 13

Kuva 11. Resveratrolin trans- ja cis-muotojen kemialliset rakenteet (Oregon State University). 2.2.5 Tanniinit Tanniinit ovat vesiliukoisia suuri molekyylimassaisia fenolisia yhdisteitä, jotka voivat muodostaa liukenemattomia saostumia proteiinien ja alkaloidien kanssa (Vihakas, 2014). Monissa hedelmissä ja vihanneksissa tanniinit aiheuttavat syljen glykoliproteiinien saostumista ja suun voitelun vähentymistä, joka ilmenee kuivakkaana suutuntumana (astringent) (Neyres Zinia Taveira de Jesus et al., 2012). Tämä on havaittavissa esimerkiksi runsaasti tanniineja sisältävässä punaviinissä. Tanniineja ovat ellagitanniinit sekä oligo- ja polymeeriset proantosyanidiinit, jotka koostuvat katekiiniperusyksiköistä (Törrönen et al., 2013). Ellagitanniinit Ellagitanniinit ovat monimutkaisia fenolisia polymeerejä, joita on erityisesti lakassa, vadelmissa ja mesimarjoissa, mutta myös mansikoissa ja ruusunmarjoissa. Marjat ovat tärkein ellagitanniinien lähde, koska muualta ravinnosta niitä ei juurikaan saa. (Puupponen-Pimiä, 2005.) Kuvassa 12 on ellagitanniineihin kuuluvan kasuariktiinin kemiallinen rakenne. 14

Kuva 12. Esimerkkinä ellagitanniineista kasuariktiinin kemiallinen rakenne (Neyres Zinia Taveira de Jesus et al., 2012). Proantosyanidiinit Proantosyanidiinit ovat kemiallisesti katekiinien oligomeerejä. Yleisimmät proantosyanidiinit ovat prosyanidiinit. Ne koostuvat epikatekiinin, katekiinin ja näiden gallushappojen esterien muodostamista ketjuista (Hyvärinen, 2001). Hyviä proantosyanidiinilähteitä ovat karpalot, puolukat, mustaherukat, tyrni, variksenmarja ja mustikka. Hedelmistä omenassa ja banaanissa on myös proantosyanidiinejä, mutta vähemmässä määrin kuin edellä mainitussa marjoissa. (Törrönen et al., 2013.) Kuvassa 13 on esitetty proantosyanidiinien yleinen kemiallinen rakenne, jossa merkinnät R1 ja R2 kuvaavat erilaisia vaihtuvia funktionaalisia ryhmiä. Taulukossa 7 on esitelty eroavaisuuksia eri proantosyanidiinien välillä. 15

Kuva 13. Proantosyanidiinien kemiallinen rakenne (Oregon State University). Taulukko 7. Erilaisten proantosyanidiinien rakenne-eroavaisuudet (Oregon State University). Nimi R 1 R 2 Prosyanidiinit H OH Prodelfinidiinit OH OH Propelargonidins H H 3 Fenolien esiintyminen luonnossa Tässä luvussa selvitetään, mikä on fenoleiden merkitys kasvin kannalta ja toisaalta mitä fenoleita marjoissa esiintyy. Lisäksi selvitetään fenolien eristämistä ja rikastamista. 3.1 Fenolien merkitys luonnossa Kasvin aineenvaihduntaan kuuluu primäärinen ja sekundäärinen aineenvaihdunta. Primääriaineenvaihdunta ylläpitää kasvin välttämättömiä toimintoja, kuten kasvua ja energia-aineenvaihduntaa. Sekundäärinen aineenvaihdunta tuottaa yhdisteitä, joita ei katsota välttämättömiksi kasvin elossa pysymisen kannalta normaaliolosuhteissa. 16

Fenoliset yhdisteet ja terpeenit ovat kasvien sekundäärisiä aineenvaihduntatuotteita. Kasvin sekundäärisiä aineenvaihduntatuotteita on pitkään pidetty kasvin kasvun ja kehityksen kannalta merkityksettöminä. Viimeaikaiset tutkimukset kuitenkin osoittavat, että sekundääriaineet ovat mukana useissa tärkeissä kasvifysiologisissa ja biokemiallisissa toiminnoissa. (Keskitalo et al., 2001.) Fenoliset yhdisteet toimivat signaaleina erilaisissa fysiologisissa ja kemiallisissa tapahtumissa. Eräillä flavonoideilla on kasvunsäädetyyppistä vaikutusta. Fenoliset yhdisteet ovat tärkeitä kasvien kukkimisen yhteydessä. Kasvi tarvitsee fenoleita hedelmöittymiseen ja siitepölyn säilymiseen hedelmöittämiskykyisenä. Palkokasvit tuottavat juuristaan flavonoideja, jotka aktivoivat maaperässä elävien typpibakteerien kasvua ja niiden infektoitumista kasvin juuriin. Fenoleiden merkitys tulee esille kaikkialla, missä kasvi kohtaa ympäröivän ekosysteemin joko ilmasta, maan pinnalta tai maan kautta. (Keskitalo et al., 2001.) Hedelmien ja marjojen fenoliset yhdisteet sijaitsevat usein pintakerroksissa, johtuen niiden pääasiallisesta tehtävästä, joka on kasvin suojaaminen ympäristöä, stressiä ja patogeenejä vastaan (Nohynek et al., 2006). Fenolisia yhdisteitä syntyy yleensä kasvin normaalin kasvun yhteydessä, mutta on olemassa myös sekundääriyhdisteitä, joita muodostuu vasta ulkoisten ärsykkeiden tai stressitekijöiden seurauksena. Stressiä kasveille voivat aiheuttaa bioottiset tai abioottiset tekijät. Abioottisia tekijöitä ovat mm. valo, lämpötila, kosteus ja ravinteet. Bioottisia tekijöitä ovat mm. taudinaiheuttajat, hyönteiset ja kasvissyöjät. Ärsykkeiden seurauksena syntyviä yhdisteitä kutsutaan indusoituviksi yhdisteiksi. Indusoituvat fenoliset yhdisteet osallistuvat kasvin antioksidanttiseen puolustusmekanismiin. (Keskitalo et al., 2001.) 17

Stressitilanteessa kasvissa muodostuu vapaita happiradikaaleja, esimerkiksi vetyperoksideja ja happimolekyylejä. Tämän johdosta kasvit tuottavat puolustukseksi antioksidantteja, jotka torjuvat radikaalien vaikutuksia. Esimerkiksi antosyaanin arvellaan estävän omenan kuorisolukon hapettumista. Kasvien pintasolukoissa fenolit suojaavat kasvia ulkoisilta uhkatekijöiltä, joita ovat mm. UV-säteily, kasvissyöjät, hyönteiset ja taudinaiheuttajat. (Keskitalo et al., 2001.) Fenolien avulla kasvi on myös vuorovaikutuksessa ympäröivään ekosysteemiin. Vuorovaikutus voi olla puolustusta, symbioosin aikaansaamista tai houkuttelua. Lisaksi fenolit toimivat kasvissa kasvihormonien tapaan ja ovat mukana kasvin muissa sisäisissä viestitapahtumissa. (Keskitalo et al., 2001.) 3.2 Marjojen ja hedelmien fenolipitoisuudet Marjojen fenolisten yhdisteiden pitoisuuksiin vaikuttavat monet tekijät, kuten lajike, kasvupaikan maantieteellinen sijainti, sääolosuhteet ja kypsyysaste (Myllymäki et al., 2008). Fenolisten yhdisteiden pitoisuuserot saattavat olla suuria eri lajikkeiden välillä, sillä lajikevalintaa tehtäessä fenolisten yhdisteiden määrä on harvoin ollut valintakriteerinä. Viinirypäleillä esimerkiksi vaalean viinirypäleen kuoresta puuttuu antosyaanit kokonaan ja tummakuorisissa rypäleissä niitä on puolestaan runsaasti. (Keskitalo et al., 2001.) Kasvupaikka tai maantieteellinen sijainti ei ole määriteltävissä yksiselitteisesti omaksi tekijäkseen vaan se on mm. lämpötila-, maalaji-, ravinne-, valaistus- ja kosteustekijöiden summa. Suomessa on havaittu kasvupaikan vaikuttavan kvertsetiinipitoisuuksiin puolukalla mutta ei mustikalla ja lakalla. Myrisetiinin osalta pitoisuus oli länsisuomalaisissa mustikoissa matalampi kuin itäsuomalaisissa marjoissa. Marjojen kypsyysaste on saattanut vaikuttaa havaittuihin eroihin. (Keskitalo et al., 2001.) 18

Valon voimakuuden ja määrän on todettu vaikuttava erityisesti antosyaanien määrään, mutta myös muiden fenoliyhdisteiden muodostumiseen. Valon määrän lisäyksen on havaittu lisäävän fenoliyhdisteiden määrää edellyttäen, että myös muut olosuhteet ovat suotuisat yhteyttämiselle. Liukoisia fenoleja on todettu muodostuvan yli kaksi kertaa enemmän voimakkaassa valossa kuin himmeämmässä. Lämpötilalla on vaikutusta kasvien sekundääriaineiden muodostumiseen ja siksi esimerkiksi viileys saattaa edistää mm. antosyaanien ja muiden fenolisten yhdisteiden synteesiä. (Keskitalo et al., 2001.) Pensasmustikoilla on havaittu kokonaisflavonoidi- ja antosyaanipitoisuuksien kasvavan mustikan kypsyessä. Hedelmien hedelmälihassa flavonoidipitoisuus yleensä laskee ja kuorissa lisääntyy kypsymisen edetessä. Viinirypäleissä on havaittu flavonoidien pitoisuuksien kasvavan kypsymisen edetessä. (Keskitalo et al., 2001.) Kuva 14 Marjojen polyfenolien pitoisuuksien vertailu hedelmiin ja tomaattiin (Törrönen et al., 2013). Kuvassa 14 on esitetty kahdeksan marjan (karpalo, puolukka, mustikka, variksenmarja, mustaherukka, tyrni, mansikka ja lakka) ja kolmen yleisimmin 19

käytetyn hedelmän (omena, appelsiini ja banaani) sekä tomaatin polyfenolien yhteismäärä. Kuvasta 14 havaitaan, että marjoissa polyfenolien yhteismäärä on selkeästi suurempi kuin tavallisimmissa tuontihedelmissä ja tomaatissa. Tarkastellaan seuraavaksi marjojen polyfenolikoostumusta tarkemmin antosyaanien, flavonolien, katekiinien, hydroksikanelihapon ja ellagitanniinien osalta. Kuvasta 15 nähdään, että antosyaaneja esiintyy hyvin monissa marjoissa, joskin parhaat lähteet ovat luonnonmustikka, marja-aronia, mustaherukka ja variksenmarja. Ellagitanniineja on runsaiten kerrannaisluumarjoissa kuten lakassa, vadelmassa ja mesimarjassa. Flavanoleja on eniten juolukassa ja tyrnissä, jossa se on pääasiallinen fenoliyhdiste. Katekiinien määrä marjojen polyfenoleista on suhteellisesti pienin. Eniten katekiineja on puolukassa. Hydroksikanelihappojen parhaita lähteitä marjoista ovat marja-aronia ja makeapihlaja. Kuva 15. Fenoliyhdisteiden pitoisuudet kotimaisissa marjoissa (Jaakola, 2010; Määttä-Riihinen et al., 2004; Riihinen, 2005). 20

3.3 Fenolien eristäminen Fenolisten yhdisteiden erotusprosessin uutossa käytetään joko pelkkää vettä, jonka ph on säädetty happamalle alueelle, veden ja orgaanisen liuottimen seosta, tai orgaanista liuotinta. Elintarvikeprosesseissa orgaanisena liuottimina kyseeseen tulee lähinnä etanoli. (Myllymäki et al., 2008.) Prosessointimenetelmien vaikutuksista marjojen fenolisiin yhdisteisiin ei ole tutkittu kunnolla kuin muutamien marjojen flavonoidien ja ellagitanniinien osalta. Erityisesti antosyaanien osalta puuttuu tietoa. Antosyaanien tiedetään tuhoutuvan flavonoideja ja ellagitanniineja helpommin hilloa valmistettaessa. Marjojen fenolisia yhdisteitä eristettäessä on usein tarkoituksenmukaista, että rikastettavat yhdisteet säilyvät mahdollisimman muuttumattomina ja että käytetyt prosessit soveltuvat elintarvikekäyttöön. (Myllymäki et al., 2008.) Tässä työssä tarkasteltavat fenolisten yhdisteiden erotusprosessit jakautuvat kahteen eri pääryhmään. Pääryhmät ovat neste-neste-uutto ja adsorptioerotus. Molemmissa prosessityypeissä erotusprosessia alkaa uutolla. Uutossa käytetään joko pelkkää ph:ltaan happamaksi säädettyä vettä, veden ja orgaanisen liuottimen seosta tai orgaanista liuotinta, joka elintarviketeollisuudessa on lähinnä etanolia. (Myllymäki et al., 2008.) Neste-neste uutossa fenoliset yhdisteet uutetaan raaka-aineestaan happamaan vesipohjaiseen liuokseen ja liukenematon aines suodatetaan uutteesta (Myllymäki et al., 2008). Fenolisten yhdisteiden adsorptioon perustuvat rikastusprosessit voidaan toteuttaa kahdella eri tavalla. Yleisemmin teollisuudessa käytetään mallia, jossa fenoliset yhdisteet adsorboituvat kiintofaasiin epäpuhtauksien eluoituessa nopeasti kolonnin läpi. Tässä tavassa toteuttaa prosessi on etuna yleensä suurempi erotuskolonnin kapasiteetti, mutta haittapuolena on riski laimenemiseen, sillä fenoliset yhdisteet on eluoitava kolonnista sopivalla liuottimella. Toinen tapa toteuttaa adsorptioerotus on malli, jossa 21

epäpuhtaudet adsorboituvat kiintofaasiin fenolisten yhdisteiden kulkeutuessa kolonnin läpi. (Myllymäki et al., 2008.) Rikastus voidaan toteuttaa yksivaiheisena, jolloin se käsittää latauksen ja eluoinnin tai monivaiheisena, jolloin vaiheita ovat lataus ja eluointi useassa osassa erilaisilla liuotin koostumuksilla. Monivaiheisella prosessilla voidaan saavuttaa korkeampi saanto. Monivaiheista prosessia voidaan käyttää myös kun halutaan erotella muodostuvat fenoliset yhdisteet esimerkiksi polymeroitumisasteen mukaan. (Myllymäki et al., 2008.) Adsorptioprosessissa käytetään pystyasennossa olevaa kolonnia, johon on pakattu adsorbenttipeti. Adsorbentti on fenolisten yhdisteiden erotuksessa tyypillisesti hydrofobinen neutraali polymeerihartsi esimerkiksi styreenin tai divinyylibentseenin kopolymeeri. (Myllymäki et al., 2008.) Fenoleita sisältävä nestevirta ohjataan joko pumppaamalla tai gravitaation avulla kolonniin ja se kulkeutuu kolonnin läpi tuplavirtauksena. Fenoliset yhdisteet kiinnittyvät hartsin pinnalle kun taas polaariset ei-fenoliset yhdisteet eivät kiinnity hartsiin vaan ne on helppo pestä pois hartsipediltä happamalla vesiliuoksella. Pesun jälkeen fenoliset yhdisteet eluoidaan hartsista vesietanoli-liuokseen. Eluoinnin jälkeen etanoli haihdutetaan ja jäänyt vesiliuos kuivataan usein kantaja-aineen kanssa. Tuloksena saadaan jauhemainen jae, jonka fenolipitoisuus voi olla 70-75%. (Myllymäki et al., 2008.) 4 Fenolien terveysvaikutukset Tässä luvussa selvitetään fenoleiden terveysvaikutuksia ihmiselle ja toisaalta sitä, millaisiin mekanismeihin havaitut vaikutukset perustuvat. Tutkimuskirjallisuuden pohjalta havaitut vaikutukset voidaan jakaa tulehdusta lievittäviin vaikutuksiin ja antioksidatiivisuuteen. 22

4.1 Tulehdusta lievittävät vaikutukset Polyfenolien, flavonoidien ja antosyaniidien terveysvaikutuksien on uskottu perustuvan niiden antioksidatiivisiin vaikutuksiin. Uusimmissa tutkimuksissa näiden yhdisteiden on kuitenkin havaittu toimivan myös muilla tavoin; niiden on esimerkiksi havaittu lievittävän tulehdusta. (Joseph et al., 2014.) Tulehdus on immuunisysteemin normaali ja yleensä väliaikainen reaktio vammaan tai taudinaiheuttajia vastaan. Krooninen tulehdus voi seurata toistuvasta ärsykkeestä tai tehottomasta säätelystä. Yleisesti tunnettujen tulehdusärsykkeiden, kuten bakteerien lisäksi tulehdus voi myös aiheutua liiallisesta kehon rasvakudoksesta tai huonosta ruokavaliosta. Liikalihavuus on havaittu krooniseksi tulehdustilaa ylläpitäväksi tekijäksi. Rasvakudos toimii paitsi rasvavarastona, myös aktiivisena erittäjäkudoksena erittäen runsaasti erilaisia hormoneja ja sytokiineja. (Joseph et al., 2014.) Jatkuva tulehdustila on tärkein tekijä kroonisten sairauksien kehittymiseen, etenemiseen ja komplikaatioihin. Tällaisia kroonisia sairauksia ovat esimerkiksi sydän- ja verisuonisairaudet, Alzheimerin tauti ja tyypin 2 diabetes. Väestötutkimuksista saadun tiedon mukaan runsaasti vihanneksia ja hedelmiä sisältävällä ruokavaliolla on yhteys vähäisempään tulehdukselliseen rasitukseen. (Joseph et al., 2014.) Koeputkikokeissa marjoilla ja niiden uutteilla on havaittu olevan hyvä kyky absorboida hapen radikaaleja. Lisäksi niiden on havaittu vähentävän oksidatiivista stressiä. Ravinnosta saatavien polyfenolien tiedetään toimivan sekä antioksidantteina että tulehdusta ehkäisevinä molekyyleinä. Täten polyfenolit mahdollisesti suojaavat elimistöä kroonisia tulehdusperäisiä sairauksia vastaan. (Joseph et al., 2014.) Mitattavissa olevaa tulehdusvastetta kuvataan tulehduksesta aiheutuvien molekyylien ja vastakkaista viestiä immuunisoluille lähettävien sytokiinien tuotannolla. Sytokiinit ovat immuunimukautuvia ja säätelevät tulehdusvastetta. 23

Tumatekijä kappa B (NF-κB), pelkistymisherkkä kopiointitekijä, on keskeisessä roolissa tulehdusvasteen synnyssä. Kun NF-κB aktivoituu, se saa useat geenit toimimaan, mukaan lukien sytokiinien, kemokiinien ja adipokiinien tuotannosta vastaavat geenit. Muita tärkeitä viestinvälittäjiä tulehdusreaktiossa ovat esimerkiksi tunnistusreseptorit, kinaasit. Tulehdusvasteen voi laukaista ärsyke, kuten endotoksiinit, virukset, muutokset reaktiivisen hapen tasoissa, solun hapetusaste, rasvahapot, sytokiinit, kasvutekijät tai karsinogeenit. Tutkimuksissa on saatu viitteitä siitä, että fenolit vaikuttaisivat solujen viestinvälitysketjuun siten, että tulehdusta aiheuttava viesti sammuu tai vaimenee. (Joseph et al., 2014.) Useat tutkimukset osoittavat, että marjayhdisteet estävät ihmisissä esiintyvien taudinaiheuttajabakteerien kasvua. Karpalolla, hillalla, vadelmalla, mansikalla ja metsämustikalla on selvä kasvua estävä tai haittaava vaikutus esimerkiksi salmonella- ja stafylokokki-bakteereja vastaan. Marjoissa esiintyvät yhdisteet voisivat tarjota esimerkiksi vaihtoehtoisen hoitomuodon antibiooteille vastustuskykyisten bakteerien aiheuttamien tulehdusten hoitamiseksi. (Puupponen-Pimiä et al., 2005.) 4.2 Antioksidatiivisyys Solut tuottavat ja varastoivat laajan valikoiman voimakkaita antioksidantteja, kuten A, C ja E -vitamiinit sekä entsyymejä, esimerkiksi superoksidi-dismutaasi (SOD), katalaasi ja glutationiperoksidaasi (GPx). Ei-entsymaattisia antioksidantteja, joita solut voivat käyttää ovat glutationi (GSH) ja ruokavaliosta saatavat vapaiden radikaalien kerääjät, kuten karotenoidit ja polyfenolit, edellyttäen että niitä saadaan riittävän korkeina pitoisuuksina. (Goszcz et al., 2015.) Polyfenolit voivat vaikuttaa verisuonisairauksiin toimimalla antioksidantteina sekä ehkäisemällä tulehdusta ja verisuonien tukkeutumista. Polyfenolien arvellaan suojaavan verenkiertoelimistön endoteelisoluja reaktiivisten happiyhdisteiden aiheuttamia vahinkoja vastaan, estäen siten LDL-oksidaation ja 24

suojellen verisuonia laajentavia typpioksideja hapettumiselta. Polyfenolien verisuonien rasvoittumista estävät vaikutukset perustuvat rasvojen peroksidaation estämiseen ja hapettuneen LDL:n sieppaamiseen makrofagien avulla, typpioksidin luonnollisen saatavuuden lisäämiseen ja pelkistymisherkkien geenien toiminnan vähentämiseen. (Goszcz et al., 2015.) Kuvassa 16 on kaaviollisesti esitetty antioksidanttien suojavaikutus endoteelin (verisuoniston sisäpintasolukon) toiminnassa sekä LDL-kierto (matalatiheyksinen lipoproteiini), tulehdusreaktio ja tukkeutuminen. Oksidatiivisen rasituksen vaikutuksesta endoteelisolukko vaurioituu ja menettää typpioksidin suojavaikutuksen. Tehostunut LDL-peroksidaatio kumuloituu ylläpitämään tulehdustilaa, joka johtaa rasvan kertymiseen valtimon seinämään. (Goszcz et al., 2015.) Flavonoidien on todettu vaikuttavan erilaisten entsyymien toimintaan, olevan antikarsinogeenisia ja estävän sydän- ja verisuonitauteja. Flavonoidien antikarsinogeenisyyttä ei tosin ole osoitettu epidemiologisin kokein yhtä selvästi kuin niiden sydän- ja verisuonitauteja estävää vaikutusta. Flavonoidien on myös muun muassa todettu estävän virusten, bakteerien ja sienten lisääntymistä sekä lievittävän allergioita. Fenolisilla hapoilla voi olla samanlaisia vaikutuksia kuin flavonoideilla, mutta näiden yhdisteiden tutkimus on ollut vähäisempää. Useat fenoliset yhdisteet ovat voimakkaita antioksidantteja. Fenolisten yhdisteiden sydän- ja verisuonitauteja estävät vaikutukset perustuvat nimenomaan niiden antioksidatiivisuuteen. (Hyvärinen, 2001.) Lignaanien on osoitettu vaikuttavan ihmisten leukemiasyöpäsolujen jakautumista ja kasvua estävästi (Hyvärinen, 2001). Tutkimusten mukaan resveratroli voi estää syöpää, verisuonitauteja, virusinfektioita, Alzheimerin tautia sekä suojata hermostoa. Resveratroli on antibakteerinen ja - fungaalinen. Se on myös antioksidantti, sillä se suojaa alhaisen tiheyden lipoproteiineja (LDL) oksidaatiolta. (Rautiainen, 2012.) 25

Kuva 16. Antioksidanttien suojavaikutukset endoteelin toiminnassa (Goszcz et al., 2015). Merkinnät: CAM, solun kiinnittymismolekyyli; NOX, NAD(P)H -oksidaasi; enos, endoteelinen NO-synteesi; inos, indusoituva NO-synteesi; NF-kB, tumatekijä kb; SOD, superoksididismutaasi; ET-1, endooteeli-1; CAT katalaasi; GSH, Glutationi; GPx, glutationiperoksidaasi; LDL, matalatiheyksinen lipoproteiini; ox-ldl, hapettunut LDL; ONOOperoksinitriitti; O2.-, superoksidi; NO, typpioksidi. 26

Resveratrolin biologisten ja farmakologisten ominaisuuksien otaksutaan johtuvan sen antioksidanttisuudesta, joka on havaittu useissa tutkimuksissa. Antioksidanttisuuden vuoksi resveratrolin uskotaan suojaavan sydän- ja verisuonitaudeilta. Mahdollisesti se antaa suojaa myös syöpää vastaan. Lisäksi resveratroli näyttää suojaavan diabetesta sekä aivorappeumaa vastaan. (Donnez et al., 2009.) Happiradikaalit indusoivat muutoksia geneettiseen materiaaliin hapettamalla tiettyjä DNA:n emäksiä. Tuotettu toiminnallinen vaurio saattaa aiheuttaa mutageneesiä tai karsinogeenisiä vaikutuksia. LDL:n (low density lipoprotein) hapettumisen otaksutaan käynnistävän ihmisillä sydän- ja verisuonitautien muodostumisen. Ihmisen elimistön antioksidanttipuolustus (katalaasi, superoksididismutaasi ja metalleja sitovat proteiinit) ei riitä täydellisesti estämään hapettumisvaurioita, vaan terveyden ylläpitämiseksi antioksidantteja on saatava ravinnosta. Useat fenoliset yhdisteet ovat voimakkaita antioksidantteja. Fenoliset antioksidantit vaikuttavat kelatoimalla hapettumista katalysoivia metalli-ioneja ja muuttaen vapaita radikaaleja vähemmän agressiivisiksi fenoksiradikaaleiksi. Lisäksi ne sammuttavat vapaita radikaaleja hapettumisen loppuvaiheessa. (Hyvärinen, 2001.) 5 Yhteenveto Erilaisia polyfenoleita on olemassa valtava määrä, joten niihin liittyvä tutkimuskenttäkin on erittäin laaja. Fenoleista on olemassa kattava kansainvälinen luokittelu, joka helpottaa kemiallisten perusrakenteiden hahmottamista. Fenolit ovat kasvien sekundääriaineenvaihduntatuotteita, joita pidettiin pitkään kasvien kasvun ja kehityksen kannalta merkityksettöminä. Sittemmin on huomattu, että sekundääriaineet ovat mukana useissa tärkeissä kasvifysiologisissa ja biokemiallisissa toiminnoissa. Fenolit muun muassa 27

suojaavat kasvia taudinaiheuttajilta ja kasvissyöjiltä. Indusoituvat fenoliset yhdisteet osallistuvat kasvin antioksidanttiseen puolustusmekanismiin. Fenolien merkitys tulee esille lähes kaikessa kasvin vuorovaikutuksessa ympäröivän ekosysteemin kanssa. Suomessa kasvaa useita fenolitutkimuksen kannalta kiinnostavia marjoja: Esimerkiksi mustikassa, marja-aroniassa ja mustaherukassa on korkeat antosyaanipitoisuudet, kun taas mesimarjassa, vadelmassa ja lakassa on runsaasti ellagitanniineja. Fenolien eristäminen on niiden laajemman hyödynnettävyyden kannalta kiinnostava tutkimuskohde. Tässä työssä tarkasteltavat erotusprosessit perustuvat joko neste-neste-uuttoon tai adsorptioerotukseen. Osa fenoleista tuhoutuu helposti prosessoitaessa, joka ominaisuus tuo lisähaasteita fenolien eristämiseen ja myös esimerkiksi aivan tavalliseen marjojen säilömiseen. Marjoissa ja hedelmissä fenolit esiintyvät yleensä monien eri fenoliyhdisteiden kombinaatioina, joten aina ei ole täysin selvää, että mikä tai mitkä yhdisteet saavat aikaan mahdollisesti havaittavia terveysvaikutuksia elimistössä. Tunnetuimmat fenolien terveysvaikutukset perustuvat erityisesti niiden antioksidatiivisyyteen. Flavonoidien on todettu vaikuttavan erilaisten entsyymien toimintaan, olevan antikarsinogeenisia ja estävän sydän- ja verisuonitauteja. Flavonoidien antikarsinogeenisyyttä ei tosin ole osoitettu epidemiologisin kokein yhtä selvästi kuin niiden sydän- ja verisuonitauteja estävää vaikutusta. Uusimmissa tutkimuksissa polyfenolien, flavonoidien ja antosyaniidien on havaittu lievittävän tulehdusta elimistössä. Jatkuva tulehdustila on tärkein tekijä kroonisten sairauksien kehittymiseen, etenemiseen ja komplikaatioihin. Tällaisia kroonisia sairauksia ovat esimerkiksi sydän- ja verisuonisairaudet, Alzheimerin tauti ja tyypin 2 diabetes. 28

Eräissä tutkimuksissa on havaittu, että marjayhdisteet estävät ihmisissä esiintyvien taudinaiheuttajabakteerien kasvua. Karpalolla, hillalla, vadelmalla, mansikalla ja metsämustikalla on selvä kasvua estävä tai haittaava vaikutus esimerkiksi salmonella- ja stafylokokki-bakteereja vastaan. 29

Lähdeluettelo Andersen, Øyvind; Markham, Kenneth. 2006. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications. Taylor & Francis Group. 1237 s. ISBN 0-8493- 2021-6. Donnez, David; Jeandet, Philippe; Clément, Christophe; Courot, Eric. 2009. Bioproduction of resveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms. Trends in Biotechnology, vol. 27:12. S. 706-713. ISSN 0167-7799. Goszcz, Katarzyna; Deakin, Sherine; Duthie, Garry; Stewart, Derek; Leslie, Stephen; Megson, Ian. 2015. Antioxidants in cardiovascular therapy: panacea or false hope? Frontiers in Cardiovascular Medicine. Vol. 2. S. 1-22. http://dx.doi.org/10.3389/fcvm.2015.00029. Hyvärinen, Helena. 2001. Kasviperäiset biomolekyylit fenoliset yhdisteet ja terpeenit. Kirjallisuuskatsaus. Maa ja elintarviketalouden tutkimuskeskus, julkaisuja sarja A 100. 97 s. ISBN 951-729-629-0 (Painettu) ISBN 951-729- 630-4 (Verkkojulkaisu). Jaakkola, Laura. Marjojen terveysvaikutukset. Esitelmä, Climate laboratorium, University of Tromsø & Bioforsk Nord. Jaakola, Laura. 2010. Luonnonmarjojen tutkimus ja hyödyntämismahdollisuudet. Esitelmä19.5.2010. Oulun yliopisto. Joseph, SV.; Edirisinghe, I. ; Burton-Freeman, BM. 2014. Berries: Antiinflammatory Effects in Humans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 62:18. S. 3886 3903. Saatavissa: DOI:10.1021/jf4044056. 30

Keskitalo, Marjo; Hyvärinen, Helena; Pihlava, Juha-Matti. 2001. Yleistä fenolisista yhdisteistä. Julkaisussa: Hyvärinen Helena (toim.), 2001. Kasviperäiset biomolekyylit - fenoliset yhdisteet ja terpeenit. Kirjallisuuskatsaus. Maa ja elintarviketalouden tutkimuskeskus, julkaisuja sarja A 100. 97 s. ISBN 951-729-629-0 (painettu) ISBN 951-729-630-4 (verkkojulkaisu). Kylli, Petri. 2011. Berry phenolics: isolation, analysis, identification, and antioxidant properties. Väitöskirja. Helsingin yliopisto, Elintarvike- ja ympäristötieteiden laitos. Helsinki. 90 s. ISBN 978-952-10-7114-0 (painettu) ISBN 978-952-10-7115-7 (pdf; http://ethesis.helsinki.fi). Lehtonen, Henna-Maria. 2010. Berry Polyphenol Absorption and The Effect of Northern Berries on Metabolism, Ectopic Fat Accumulation, And Associated Diseases. Väitöskirja. Turun yliopisto, Biokemian ja elintarvikekemian laitos. Turku. 57 s. ISBN 978-951-29-4433-0 (painettu) ISBN 978-951-29-4434-7 (pdf). Myllymäki, Olavi; Mokkila, Mirja; Sainio, Timo. 2008. Selvitys marjojen fenolisten yhdisteiden eristämisen teknologiasta. Sitran julkaisu. Helsinki. 17 s. ISBN 978-951-563-625-6 (pdf:http://www.sitra.fi). Määttä-Riihinen, Kaisu; Kamal-Eldin, Afaf; Mattila, Pirjo; Gonzalez-Paramas, Ana; Törrönen, Riitta. 2004. Distribution and Contents of Phenolic Compounds in Eighteen Scandinavian Berry Species. Journal of Agricultural and Food Chemistry Chemistry. Vol. 52:14. S. 4477-4486. Määttä-Riihinen, Kaisu. 2005. Phenolic compounds in berries. Väitöskirja. Kuopion yliopisto, Luonnontieteiden ja ympäristötieteiden tiedekunta. Kuopio. 97 s. ISBN 951-27-0345-9 ISBN 951-27-0440-4 (PDF). 31

Neyres Zinia Taveira de Jesus; Heloina de Souza Falcão; Isis Fernandes Gomes; Thiago Jose de Almeida Leite; Gedson Rodrigues de Morais Lima; Jose Maria Barbosa-Filho; Josean Fechine Tavares; Marcelo Sobral da Silva; Petrônio Filgueiras de Athayde-Filho; Leonia Maria Batista. 2012. Tannins, Peptic Ulcers and Related Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. Vol. 13:3. S. 3203-3228. ISSN 1422-0067. Saatavana: DOI: 10.3390/ijms13033203. Nohynek, L; Alakomi, H-L; Kähkönen, M; Heinonen, M, Helander I.M; Oksman- Caldentey K-M; Puupponen-Pimiä R-H. 2006. Berry phenolics: Antimicrobial properties and mechanisms of actions against severe human pathogens. Nutrition and Cancer. Vol. 54:1. S. 18-32. Saatavilla: DOI: 10.1016/S0271-5317(98)00169-9. Oregon State University, Linus Pauling Institute, Micronutrient Information Center: Flavonoids, http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/ [Viitattu 29.10.2015]. Peterson, Julia; Dwyer, Johanna, 1998. Flavonoids: Dietary Occurrence and Biochemical Activity, Nutrition Research, Vol. 18:12. S. 1995-2018. ISSN 0271-5317. Primetta, Anja. 2014. Phenolic Compounds in the Berries of the Selected Vaccinium Species. Väitöskirja, Itä-Suomen yliopisto, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta. Kuopio. 104 s. ISBN: 978-952-61-1359-3 (painettu) ISBN: 978-952-61-1360-9 (PDF). Puupponen-Pimiä, R; Nohynek, L; Alakomi, H-L; Oksman-Caldentey, K-M. 2005. Bioactive berry compounds novel tools against human pathogens. Appl Microbiol Biotechnol. Vol. 67:1. S. 8 18. ISSN 0175-7598 (painettu) ISSN 1432-0614 (Online). 32

Puupponen-Pimiä, R-H; Nohynek, L.J; Meier, C; Kähkönen, M; Heinonen, M; Hopia, A; Oksman-Caldentey, K-M. 2001. Antimicrobial properties of phenolic compounds from berries. Journal of Applied Microbiology. Vol. 90:4. S. 494-507. ISSN 1365-2672 (Online). Saatavilla: DOI: 10.1046/j.1365-2672.2001.01271.x. Puupponen-Pimiä, R.; Nohynek, L. ; Alakomi, H-L; Oksman-Caldentey, K-M. 2005. The action of berry phenolics against human intestinal pathogens. BioFactors. Vol. 23:4. S. 243 251. ISSN 1872-8081 (Online). Saatavilla: DOI: 10.1002/biof.5520230410. Rautiainen, Maarit. 2012. Pinosylviinin vaikutus Listeria monocytogenes - bakteerin lisääntymiseen Caco-2 solumallissa, Pro gradu -tutkielma, Itä- Suomen yliopisto, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta. Joensuu. 59 s. Törrönen, Riitta; Sarkkinen, Essi; Karvonen, Henna; Tapola, Niina.2008. Yhteenveto tieteellisestä näytöstä koskien mustikan, karpalon ja puolukan ravitsemus- ja terveysvaikutuksia. Kuopion yliopisto, Elintarvikkeiden terveysvaikutustentutkimuskeskus. Oy Foodfiles Ltd. 65 s. ISBN 978-951-563-626-3 (pdf: http://www.sitra.fi). Törrönen, R., Elintarvikkeiden flavonoidit. Helsinki 1997. Elintarvikeviraston julkaisuja 5/1997, 44 s. ISSN 1235-2764. Törrönen, Riitta; Riihinen, Kaisu; Sarkkinen, Essi; Feodoroff, Riitta. 2013. Selvitys marjojen terveysvaikutusten kliinisestä tutkimusnäytöstä. Itä-Suomen yliopisto, Kansanterveystieteen ja kliinisen ravitsemustieteen yksikkö. Oy Foodfiles Ltd, 99 s. 33

Vihakas, Matti. 2014. Flavonoids and other phenolic compounds: characterization and interactions with lepidopteran and sawfly larvae. Väitöskirja. Turun yliopisto, Matemaattis -luonnontieteellinen tiedekunta. Turku. 135 s. ISBN 978-951-29-5905-1 (painettu) ISBN 978-951-29-5906-8 (PDF). 34