Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 1 / 5 Elatusaineiden timivuuden varmistamiseen käytettävien mikrbisuspensiiden (SkimMilk) 1. Periaate Työhjeen tarkittamat mikrbi (bakteeri)suspensit vat rasvattman (kuritun) maidn ja bakteeriviljelmän seksia, jissa bakteerien lukumäärä n määritetty. Niitä vidaan hyödyntää mm. elatusaineiden kvantitatiivisessa laadunvarmistuksessa tai validintikkeissa (tarkasti määritetty bakteerilisäys). Valmistettaessa suspensiita, bakteerikanta viljellään ensin tureeksi pakastusputkestaan (vertailukannan stkkiputki ) ja siirrstetaan ei-selektiiviseen rikastusliemeen. Viljellyn rikasteen mikrbipitisuus määritetään laimennssarjan ja maljaviljelyn avulla rikasteen dttaessa jääkaappilämpötilassa. Kun selvillä n suspensin teka varten spiva laimennstas ja maitn siirrstettava tilavuus, tehdään jääkaapissa säilytetystä rikasteesta uusi laimennssarja. Laimennssarjan viimeinen laimenns (haluttu pitisuus maitputkissa) tehdään rasvattmaan maitn. Maitsuspensi pipetidaan pakastusputkiin ja säilytetään -80 C:ssa. Näin valmistetut maitampullit säilyvät stabiileina bakteerilajista riippuen yleensä vuden (Schijven ym. 1994). Kuvattu menettely ei sellaisenaan svi tiettyjen pakastamisen kannalta herkkien bakteerilajien kuten Campylbacter ja Clstridium säilyttämiseen. Kampylbakteerisuspensiiden ja pakastus n hjeistettu tässä hjeessa erikseen. 2. Työturvallisuus Mikrbilgisessa labratrissa työskenneltäessä nudatetaan timintahjetta LAB 223. Valmistettaessa suspensiita STEC-kannista nudatetaan lisäksi timintahjetta LAB 741.
Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 2 / 5 3. Laitteet ja välineet 1) Mikrbilginen perusvälineistö 2) Pakastin -80 C 3) 4 ± 2 C jääkaappi 4) Lämpökaapit 25 C±1 C, 30 C±1 C, 37 C±1 C, 44 C±1 C riippuen bakteerin kasvuvaatimuksista 5) DiluShaker 4. Elatusaineet ja reagenssit 1) Veriagar tai TSA-agar 2) TSB-, BHI- tai BPW-liemi (bakteerin kasvuvaatimuksista riippuen vidaan krvata myös jllain muulla ei-selektiivisellä rikastusliemellä, esim. kampylbakteereille BRULIE) 3) 9 ml peptni-sulalius (PEPSU) tai 9 ml Dilucup 4) rasvatn (kurittu) mait (skim milk) 20 %, (Skim milk lius, 20 %) 50/100 ml 5) 2,0 ml pakastusputket 5. Suritus Alla leva hje sveltuu suurimmalle salle mikrbikantja. Kampylbakteerisuspensiiden n kuvattu tämän työhjeen khdassa 6. Päivä 0 1. Tee pakkasstkista puhdasviljelmä verimaljalle tai TSA:lle ja inkubi kannalle spivassa, menetelmähjeen mukaisessa lämpötilassa 18 24 h. Viljeltyjä maljja saa käyttää vain mikrbisuspensiiden valmistukseen. Päivä 1 2. Siirrsta bakteeripesäke 1 µl silmukalla 10 ml:aan ei-selektiivistä rikastuslientä (TSB, BHI tai BPW) ja inkubi kuten edellä. Bakteerin kasvuvaatimuksista riippuen vidaan krvata myös jllain muulla valikimattmalla rikastusliemellä, esim. kampylbakteereille BRULIE (khta 6). Päivä 2 3. Tee liemestä laimennssarja -8 asti (tai bakteerin tunnetun kasvun mukaan) ja viljele klmesta suurimmasta peräkkäisestä laimennksesta 0,1 ml, jllin määrä maljilla vastaa laimennksia -7, -8 ja -9. Viljele laimennkset kahdelle rinnakkaiselle maljalle (TSA/veriagar). Säilytä liemiviljelmä 4 ± 2 C:ssa siihen asti, kunnes viljelyn tuls n selvillä. Inkubi kannalle spivassa, menetelmähjeen mukaisessa, lämpötilassa bakteerista riippuen 24 tai 48 h.
Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 3 / 5 Päivä 3 1. Määritä rikastusliemen pitisuus laimennssarjasta tehtyjen maljjen perusteella. 2. Saadun tulksen perusteella määritetään spiva laimenns, jlla rikastusliemestä vidaan valmistaa halutun vahvuinen maitsuspensi. - Elatusaineiden tuttavuustestauksen testikannat: 60 120 pmy/0,1 ml - Elatusaineiden kvalitatiivinen, selektiivisyys- ja spesifisyystestaus: 10 4 pmy/0,1 ml Lisättävän rikasteen suus saa lla maksimissaan 10 % maitsuspensin kknaistilavuudesta. Laimennsten laskemiseen ja suspensiiden valmistamisen dkumentintiin käytetään lmaketta LAB 7497. Täytä lmake ja tulsta se työkirjaksi ja dkumentiksi. 4. Valmista maitsuspensi: Tee rikastusliemestä uusi laimennssarja ja lisää edellä määritettyä laimennsta spiva tilavuus. Pipetitavan tilavuuden vi pyöristää lähimpään 10 µl:aan. Js kannan tiedetään rikastuvan kylmäsäilytyksen aikana (esimerkiksi Listeria mncytgenes, Yersinia pseudtuberculsis), tilavuuden vi pyöristää alaspäin lähimpään 100 µl:aan. Merkitse tekemäsi muutkset lmakkeelle LAB 7497. 5. Sekita hyvin, ja jaa pakastettava maitsuspensierä pakastusputkiin 1,5 ml:n eriin. Sekita suspensiita pipetinnin aikana sillin tällöin. 6. Suspensin pitisuuden määrittämiseksi pipeti TSA:lle/veriagarille - Tuttavuustestaus (60 120 pmy/0,1 ml): viljele 0,1 ml suspensita neljälle rinnakkaiselle maljalle. - Vahvat suspensit (10 4 pmy/0,1 ml): valmista suspensista laimennssarja 10 4 asti. Viljele laimennksista -2, -3 ja -4 100 µl kahdelle rinnakkaiselle maljalle (maljalla -3, -4, -5). Inkubi kuten edellä (päivä 2). 7. Pakasta välittömästi -80 C:een. Suspensi n pakastettava viimeistään 2 h kuluessa sen ten alittamisesta, ja sitä n säilytettävä jääkaappilämpötilassa js työ keskeytyy.
Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 4 / 5 Päivä 4 1. Laske valmistetusta mikrbisuspensista viljellyt maljat. Tulsten laskeminen - - Tuttavuustestaus (60 120 pmy/0,1 ml): neljän maljan keskiarv - - Vahvat suspensit (10 4 pmy/0,1 ml): laske suspensin pitisuus timintahjeen LAB 703 mukaisesti. Humaa, että laskemasi tulksen yksikkö n pmy/1 ml. Muuta tuls pitisuuteen pmy/100 µl jakamalla saamasi tuls 10:llä. 2. Merkitse maitsuspensin tteutunut pitisuus työpapereihin ja serverillä ylläpidettävään elatusainetestauksen mikrbisuspensilistaan. Kun tarvitset mikrbisuspensita, sulata sitä huneenlämmössä krkeintaan 30 minuuttia. Vaihtehtisesti sulata suspensita yön yli jääkaapissa tai esim. +37 C lämpökaapissa krkeintaan 30 minuuttia. 6. Kampylbakteerisuspensiiden Päivä 1 Siirrsta bakteeripesäke 10 ml:aan brusella-lientä (BRULIE). Inkubi 24 tuntia 37 C:ssa mikraerbisissa lsuhteissa. Päivä 2 Pipeti 0,1 ml liemiviljelmää 30 ml:aan BHI-lientä. Lisää sekseen 3 ml steriiliä glyserlia (pitisuuteen 10 %). Pakasta ses 1,5 ml:n erissä -80 C:een. Kampylbakteerien määrä seksessa vähenee pakastuksen yhteydessä humattavasti. Tämän takia seksen knsentraati määritetään vasta pakastetusta suspensista. Päivä 3 Sulata kaksi putkea. Tee mlemmista putkista laimennussarja 10-4 :een ja viljele kaikki laimennkset kahdelle rinnakkaiselle verimaljalle viljelmän pitisuuden määrittämiseksi. Odtettu pitisuus n nin 10 2 10 3 pmy/100 µl Tulsten perusteella valitaan laimennustas, jhn sulatettu suspensi laimennetaan siten, että saadaan pitisuudeksi 50 100 pmy /100 µl. Merkitse laimennshje niihin työkirjihin, jissa kampylbakteerisuspensiita tarvitaan. Pakastetun seksen knsentraati pysyy muuttumattmana ainakin kuusi kuukautta.
Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 5 / 5 7. Viitteet Schijven, J.F., Havelaar, A.H. ja Bahar, M. 1994. A simpele and widely applicable methd fr preparing hmgenus and stable quality cntrl samples in water micrbilgy. Applied and envirnmental micrbilgy: Nv. s. 4160-4162. SFS-EN ISO 11133:2014. Elintarvike-, rehu- ja vesimikrbilgia. Kasvualustjen, tutant, säilytys ja timivuuden testaus Niemelä, S. HAMBI 220: Sisäisen vertailunäytteen. Pakastusmenetelmä. 18.10.1996. 8. Muutkset edelliseen versin 11.9.2018 Pistettu maininta suspensiiden ELMO-kirjauksesta. 11.9.2018 Tarkennettu suspensiiden käyttökhteet ja muutettu Elatusaineiden kvalitatiivinen, selektiivisyys- ja spesifisyystestauksen knsentraati 10 5 pmy/0,1 ml:sta 10 4 pmy/0,1 ml. 11.9.2018 Lisätty kampylbakteerisuspesiiden hje. 11.9.2018 Tarkennettu suspensiiden hjetta 15.11.2018 Tarkennettu hjeen nimeä 15.11.2018 Tarkennettu pitisuuksien laskemisen hjeistusta 15.11.2018 Tarkennettu kampylbakteerisuspensiiden hjetta 15.11.2018 Pieniä krjauksia kieliasuun 14.12.2018 Ylätunniste päivitetty rganisaatimuutksen (1.1.2019) mukaisesti. Tekninen päivitys.