KATSAUS. In vitro -menetelmät ja kemikaalien turvallisuuden testaus. Kimmo Louekari, Lotta Salminen ja Hanna Tähti

KATSAUS In vitro -menetelmät ja kemikaalien turvallisuuden testaus Kimmo Louekari, Lotta Salminen ja Hanna Tähti Uusien kemikaalien turvallisuus pyritään nykyään varmistamaan, ennen kuin ne lasketaan markkinoille. Torjunta-aineiden, lääkkeiden ja kosmeettisten aineiden turvallisuustestaus on jo pitkään ollut käytössä lainsäädännön perusteella. Testauksessa käytetään OECD:n hyväksymiä ohjeita. Useimmat testit tehdään koe-eläimillä, tavallisesti jyrsijöillä, mutta jonkin verran kokeita tehdään myös koirilla, kissoilla ja kädellisillä. Viime vuosina koe-eläinten käyttöä on haluttu vähentää monista syistä. Tutkijat ottavat yhä enemmän huomioon muuttuneet eettiset käsitykset. Myös taloudelliset ja tieteelliset syyt puoltavat usein in vitro -menetelmien käyttöä. Ne ovat nopeampia ja halvempia kuin eläinkokeet, ja joissakin tapauksissa niillä voidaan saada täsmällisempää tietoa aineen vaikutusmekanismeista. Ennen kuin in vitro -testejä voidaan hyväksyä OECD:n virallisiin ohjeistoihin, ne validoidaan eli niiden käyttökelpoisuus arvioidaan monessa eri vaiheessa. Parhaillaan OECD:ssä valmistellaan in vitro -testejä mm. valoärsytyksen (fotoirritaation) ja ihonläpäisykyvyn tutkimiseksi. Kemikaalien toksikologisista vaikutuksista saadaan tietoja mm. eläinkokeissa ja in vitro -tutkimuksissa sekä työlääketieteellisissä selvityksissä. In vitro -tutkimuksilla tarkoitetaan menetelmiä, joissa käytetään viljeltyjä tai eristettyjä soluja, kudoksia tai elimiä koe-eläinten asemesta. Saatavilla on myös ihmisen soluja, esimerkiksi eri kudosten kasvaimista lähtöisin olevia solulinjoja. Toksikologinen kokeellinen tutkimus perustuu kuitenkin suuhavainnot Ihmisrimmaksi osaksi eläinkokeisiin. Viime aikoina on in vitro -menetelmien käyttö lisääntynyt, samalla kun koe-eläinten käyttöön liittyviin eettisiin kysymyksiin on kiinnitetty erityistä huomiota (kuva 1). Eläinkokeisiin liittyviä keskeisiä eettisiä tavoitteita ovat olleet testien kehittäminen ja In vivo -tutkimukset Toksikologian tietokannat In vitro -tutkimukset Kuva 1. Kemiallisen turvallisuuden arvioinnin menetelmät. Duodecim 114: 851 858, 1998 851

Yhdisteen kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet Solutestit Eläinkokeet Arviointivaihe ihmisen myrkytystiedostot Annos/vaste-arviointi Mekanismien arviointi solutesteillä solu- ja eläintulokset Seulontavaihe Toksisuusluokitus Ympäristöpitoisuudet Terveysriskien arviointi Kuva 2. Kaavio in vitro -testien käytöstä osana kokeellista toksikologista riskin arviointia. Aluksi käytetään in vitro -testiä (tai useampia testejä) erottelemaan haitalliset molekyylit. Testausta jatketaan in vivo -kokein molekyyleillä, jotka seulonnassa eivät aiheuttaneet haittaa. In vitro -testejä voidaan käyttää myöhemmässä vaiheessa mm. toksisen mekanismin tarkempaan selvittämiseen. parantaminen, eläinten käytön vähentäminen ja eläinkokeiden korvaaminen in vitro -kokeilla. Russel ja Burch esittivät tämän»kolmen R:n periaatteen» jo vuonna 1959. Myöhempi koeeläinten käyttöön liittyvä eettinen keskustelu perustuu paljolti tähän periaatteeseen. Kiinnostus vaihtoehtoisten toksisuuskokeiden kehittämiseen ja validointiin eli tieteellisesti päteväksi osoittamiseen ei ole kasvanut ainoastaan eettisistä syistä vaan myös siksi, että in vitro -menetelmät ovat seulontatesteiksi sopivia, taloudellisesti edullisia ja joissakin tapauksissa paras tapa selvittää toksisuuden mekanismeja. Rohkaistakseen vaihtoehtoisten testimenetelmien kehittämistä EU:n jäsenmaat ovat päättäneet pyrkiä vähentämään koe-eläintutkimuksia 50 %:lla vuoteen 2000 mennessä. Asiaa koskeva komiteanmietintö (86/609/EEC) esitettiin 24.11.1986. Sen artiklassa 7.2 todetaan:»koetta ei pidä tehdä, jos on käytettävissä tieteellisesti riittävä, tarkoitukseen sopiva menetelmä, jossa ei käytetä koe-eläintä.» Lisäksi EU:n kosmetiikkatuotteita koskeva direktiivi (93/35/EEC) kieltää eläinkokeiden käytön vuodesta 2000 lähtien, jos vaihtoehdoksi löytyy validoitu testimenetelmä (Rasmussen 1995). EU:n komission tekemän selvityksen mukaan suurissa jäsenmaissa kuten Saksassa, Ranskassa ja Isossa-Britanniassa käytetään vuosittain noin 2 3.5 miljoonaa koe-eläintä. Yli puolet koe-eläimistä käytetään lääkeaineiden turvallisuuden ja tehon tutkimukseen sekä perustutkimukseen. Muiden kuin lääkeaineiden testaamiseen käytetään noin 10 20 % koe-eläimistä (EU Commission 1994). In vitro -tutkimukset soveltuvat nykyään parhaiten toksikologiseen seulontaan ja mekanismien tutkimiseen (kuva 2). Kuluu useita vuosia, ennen kuin in vitro -menetelmät yleistyvät kemikaalien lakisääteisessä testauksessa. Seulontatyyppisiä soluviljelmätestejä käytetään sen sijaan teollisuuden laboratorioissa runsaasti, vaikka suurinta osaa niistä ei ole vielä hyväksytty OECD:n testimenetelmiksi. Tällaisia ovat mm. ihon ja silmän ärsytystä ja korroosiota selvittävät soluviljelmäkokeet. Tulevaisuudessa useampaa kuin yhtä solutyyppiä sisältävien soluviljelmien käyttö ja 852 K. Louekari ym.

useiden solutason biomerkkiaineiden ja biokemiallisten vasteiden tutkiminen saattavat korvata monimutkaisia eläinkokeita. Viljelmään voidaan lisätä mekanismeja, jotka vaikuttavat oleellisesti kemikaalin toksisuuteen in vivo. On mahdollista käyttää esimerkiksi maksasoluista eristettyjä mikrosomeja, jolloin testissä saadaan selville toksisten metaboliittien mahdolliset vaikutukset. Hermosoluviljelmään voidaan yhdistää veri-aivoesteviljelmä. Sen mallina on käytetty mm. endoteelisolujen viljelmää ja munuaistubuluksen epiteelisolujen viljelmiä, joissa solujen väliset tiiviit liitokset vastaavat veri-aivoesteen rakennetta. Tutkittava yhdiste joutuu läpäisemään tämän lisäviljelmän, ennen kuin se pääsee vaikuttamaan varsinaiseen neuroniviljelmään (Tähti ym. 1995). Eri kudoksille tyypillisten biomerkkiaineiden käyttö ja relevanttia toksisuutta osoittavien reaktioiden määritys on tutkimuksissa oleellisen tärkeää. Uusien in vitro -menetelmien löytäminen on mahdollista solubiologian ja molekyylibiologian tietämyksen lisääntyessä. Vaikutusmekanismien entistä täsmällisempi tuntemus auttaa vähentämään koe-eläinten määrää toksisuustutkimuksissa. OECD:n ohjeistot ja vaihtoehtoisten testien kehittäminen Kemikaalien rekisteröintiä varten tarvittavissa tutkimuksissa käytetään laajalti OECD:n hyväksymiä ohjeita. Jäsenmaiden viranomaiset ovat sitoutuneet hyväksymään myös muissa jäsenmaissa tehdyt tutkimukset, jos niissä on noudatettu OECD:n ohjeita. Tämä säästää huomattavasti aikaa ja varoja sekä johtaa laboratorioiden rajallisen kapasiteetin tehokkaaseen käyttöön. Samaan aikaan kun vaihtoehtoisia menetelmiä on kehitetty ja EU on ollut poliittisista ja eettisistä syistä asiassa aloitteellinen, OECD (1990) on mm. julkaissut monografian in vitro -menetelmien validoinnin tieteellisistä kriteereistä. OECD on myös pyytänyt jäsenmaita täydentämään kansallisten asiantuntijoiden ryhmiä siten, että myös in vitro -menetelmien asiantuntemus olisi riittävää. Edelleen se on käynnistänyt eräiden in vitro -testien valmistelun; näitä ovat: perkutaanisen absorption testi, vaihtoehtoinen in vitro -testi osana fotoirritaatiokoetta sekä solutransformaatiotesti niiden kemikaalien toteamiseksi, joilla saattaa olla ei-mutageeninen karsinogeeninen vaikutus. Myös muiden vaihtoehtoisten ja in vitro -testien kehitys on ollut viime vuosina nopeaa. LD 50 -testi Isossa-Britanniassa julkaistujen tietojen mukaan välittömän myrkyllisyyden tutkimuksiin käytetään 29 % kaikista koe-eläimistä (APC 1994). OECD on viime vuosina hyväksynyt joitakin LD 50 -testiä korvaavia tutkimuksia, jotka tehdään pienemmällä eläinmäärällä. Nämä testit ovat myös»korvaavia», koska ne vähentävät oleellisesti koe-eläinten käyttöä. Niillä ei kuitenkaan saada tarkkaa LD 50 -arvoa. Tulosten perusteella aineet voidaan kuitenkin luokitella välittömän myrkyllisyyden suhteen, ja tuloksia voidaan käyttää myös pitkäaikaistestien annosten valinnassa. Esimerkiksi»up and down» -menetelmässä käytetään aluksi vain yhtä annostasoa ja koe-eläinryhmää. Tuloksen mukaan annosta suurennetaan tai pienennetään, kunnes löydetään pienin välittömästi myrkyllinen annos. Koska uusia menetelmiä pidetään riittävinä, OECD:n kokouksissa on jo keskusteltu LD 50 -testiohjeen poistamisesta tarpeettomana (OECD 1997). Ihmissoluviljelmillä tehdyt toksisuustutkimukset saattavat tulevaisuudessa korvata osan eläinkokeista. Ihoabsorptiotesti Ihoabsorption tutkiminen in vitro on perusteltua, koska tärkein imeytymistä rajoittava kudos on kuollutta solukkoa (marraskesi). In vitro -testissä mitataan kemikaalin passiivista diffuusiota iholeikkeen läpi kammioon, josta kemikaalin pitoisuus voidaan mitata. Tässäkin menetelmässä on tyypillisiä in vitro -kokeen rajoituksia: kuolleessa ihossa ei ole normaalia aineenvaihduntakapasiteettia eikä kykyä parantua. Monet tekijät, kuten ihonäytteen kunto, lämpötila ja kantajaaineet, vaikuttavat imeytymiseen (Frankild 1997). Siksi kokeet tehdään kontrolloiduissa oloissa, jotka määritetään tarkasti OECD:n ohjeluonnoksessa. In vitro -menetelmät ja kemikaalien turvallisuuden testaus 853

Genotoksisuus ja karsinogeenisuustestit OECD on hyväksynyt useita in vitro -testiohjeita genotoksisuuden tutkimiseen. Tunnetuin näistä kokeista on Amesin (1973) testi, jossa osoitetaan aineen genotoksisuus salmonellaviljelmän avulla. Näiden testien kustannukset ovat hyvin alhaiset verrattuna koe-eläimillä tehtäviin, noin kaksi vuotta ja satoja eläimiä vaativiin kokeisiin. Genotoksisuustestistä saatavaa positiivista tulosta pidetään yleensä käyttökelpoisena seulontatietona mm. harkittaessa eläinkokeen tarpeellisuutta. Näyttää siltä, että in vitro -genotoksisuustestien alhainen hinta ja verrattain hyväksi todettu korrelaatio in vivo -vasteisiin ovat johtaneet niiden laajaan hyväksymiseen ja käyttöön. In vitro -genotoksisuustesteissä ei kuitenkaan voida havaita ei-mutageenisia karsinogeenisia vaikutuksia eikä epäsuorasti karsinogeenisia vaikutuksia (esim. solujen väliseen kommunikaatioon tai solunsisäisiin signaalijärjestelmiin ja geenien säätelyyn liittyviä). Pitkäkestoisia karsinogeenisuuskokeita on vaikea korvata lyhyellä in vitro -testillä. Vuonna 1996 käynnistyneessä pohjoismaisessa projektissa arvioidaan ei-mutageenisen karsinogeenisuuden mekanismeja ja menetelmien nykytilaa. Ei-mutageenisten karsinogeenien merkitys kasvaa, sillä mutageenit seuloutuvat nykyään jo tuotekehityksen varhaisessa vaiheessa pois. Kaikki karsinogeenit eivät kuitenkaan ole mutageeneja. Ei-mutageeniset karsinogeeniset aineet voivat esimerkiksi kiihdyttää solunjakautumista, ehkäistä solujen välistä kommunikaatiota tai vaikuttaa geenien säätelyyn (Wärngård ja Pelin 1995). Näitä aineita on kutsuttu myös promoottoreiksi tai epigeneettisiksi karsinogeeneiksi. In vitro -testien kehittäminen näiden aineiden havaitsemiseksi on suotavaa, koska nykyisin ei-mutageeniset karsinogeenit voidaan havaita vain eläinkokeilla, jotka ovat erittäin kalliita, kestävät kauan ja laajasti käytettyinä ruuhkauttaisivat täysin maailman testilaboratoriot. On arvioitu, että koe-eläinten käytössä saataisiin aikaan suurin vähennys, jos karsinogeenisuustestaus voitaisiin tehdä vain yhdellä eläinlajilla (Purchase 1997). Toistaiseksi ei-mutageenisten karsinogeenien testausmenetelmiä ei ole hyväksytty OECD:ssä, joskin solutransformaatiota koskevasta menetelmästä on valmistettu testiohjeluonnos. Solujen välisen kommunikaation (gap junctional intercellular communication) estyminen on ilmeisesti se mekanismi, jonka vuoksi esimerkiksi geneettisesti muuttuneiden solujen jakautuminen voi kiihtyä ilman, että ympäröivien solujen viestit tavoittaisivat ne. Menetelmät, joita käytetään solutransformaation ja solujen välisen kommunikaation tutkimiseen, ovat verrattain laajalti käytössä, ja niitä pyritään parhaillaan validoimaan. Muita ei-mutageenisia mekanismeja ovat mm. proteiinifosfataasien estoa seuraavat muutokset solun tukirangassa, solunsisäisen signaalijärjestelmän muutokset, solunjakautumisen nopeutuminen sekä oksidatiivisen stressin vaikutukset geenien ilmentymiseen. On todennäköistä, että lähivuosina virallisiin ohjeistoihin ei vielä hyväksytä menetelmiä, joilla näitä vaikutuksia voidaan havaita. Ihoärsytys, ihokorroosio ja silmäärsytystestit OECD:n asiantuntijakokouksessa on laadittu ehdotukset ihoärsytystä ja -korroosiota sekä silmä-ärsytystä koskeviksi testausstrategioiksi. Näille strategioille on yhteistä se, että rakenneaktiivisuusanalyysit (SAR) ja rakenneominaisuusanalyysit (SPR) sekä ph ovat testauksen pohjana. Jos nämä tiedot riittävät osoittamaan, että aine on ärsyttävä tai syövyttävä, lisätestausta ei tarvita. Seuraavaksi kyseisiä ominaisuuksia tutkitaan validoiduilla in vitro -testeillä. Tässä on huomattava, ettei sellaisia vielä ole silmä-ärsytyksen testaamiseksi. Validaatiotutkimukset, joissa vertailukohtana on käytetty Draizen testiä (Draize ym. 1944), eivät ole tuottaneet hyväksyttäviä tuloksia arvioitaessa in vitro -silmä-ärsytystestien pätevyyttä (Balls ym. 1995b, Brantom ym. 1997). Tavoitteena on, että tulevaisuudessa silmä- ja ihoärsytyksen koe-eläintestit aloitetaan vasta in vitro -testien jälkeen ja aluksi vain yhdellä eläimellä. Jos tulos on positiivinen, in vivo -testausta ei jatketa, ja jos se on negatiivinen, käytetään vielä 1 2 eläintä tuloksen varmistamiseen (kuva 2). OECD:n testiohjeet (404 ja 405) ihoärsytyksen ja -korroosion tutkimiseksi antavat jo nykyi- 854 K. Louekari ym.

sin mahdollisuuden käyttää vaihtoehtoisia testejä, joita ei vielä ole muodollisesti validoitu. Testiohje 404:ssä todetaan:»saattaa olla tarpeetonta testata eläinkokeissa sellaisia aineita, joiden kudosta syövyttävät ominaisuudet voidaan ennakoida in vitro -testien perusteella.» Varsinkin kosmetiikkateollisuuden käyttöön on etsitty testejä ja testisarjoja, joilla eläinkokeita voitaisiin korvata (Ohno ym. 1995). Uudet silmätoksisuutta arvioivat testit Koska validoinnissa ei ole löytynyt silmä-ärsytystä mittaavaa hyvää vaihtoehtoista menetelmää, on kehitettävä parempia in vitro -testejä tai muutettava validointimenetelmiä. Validoinnista vastaavat tahot (ECVAM) ovatkin korostaneet, että arviointeihin tulee saada mukaan enemmän kliinistä asiantuntemusta. Toisaalta validoinnissa»huonon tuloksen» saavuttaneet Draizen silmäärsytystestin vaihtoehdot, esimerkiksi HET-CAM (menetelmä, jossa käytetään kanan alkion allantoiskalvoa) ja EYTEX (kaupallinen koeputkitesti), eivät todennäköisesti mittaa kemikaalien silmä-ärsytyksen herkimpiä merkkiaineita (Brantom ym. 1997). Silmätestauksen tarve ei rajoitu ärsytyskokeeseen. Varsinkin lääkehoidon yhteydessä silmän sisäosan kudoksissa voi ilmetä haittavaikutuksia (Grant 1986), joita on vaikea ennakoida eläinkokeiden perusteella. Verkkokalvon eri soluilla suoritetut in vitro -testaukset ovat sopiva seula toksisuuden ennakoimiseksi ja myös paras tapa selvittää toksisuuden mekanismeja. Silmätoksisuustestien tarve kasvaa silmälääkityksen kehittyessä»täsmähoidoksi», jossa lääkkeet, esimerkiksi mikrobilääkkeet ja solunsalpaajat, annetaan suoraan silmän sisään lasiaisinjektioina tai silmänsisäisten lääkeannostelijoiden avulla. Uudet antotavat on kuitenkin otettu käyttöön riittämättömien eläinkokeiden jälkeen, ja potilaille on aiheutettu lukuisia vakavia haittavaikutuksia, kun turvallisina pidettyjä lääkkeitä on annettu lasiaiseen. Campochiaro ja Conway (1991) raportoivat 93 verkkokalvon keskiosan infarktitapausta, jotka oli todettu sen jälkeen, kun potilaiden lasiaiseen oli ruiskutettu gentamisiinia tai muita aminoglykosideja yleisesti turvallisina pidettyinä annoksina. Lisäksi useita lääkkeitä saatetaan käyttää samanaikaisesti, jolloin in vitro -tutkimukset ovat taloudellisesti edullisin vaihtoehto eri lääkeyhdistelmien testaamiseksi. Myös muiden elinten esimerkiksi aivojen»täsmähoidon» kehittyessä tullaan tarvitsemaan lukuisten erityyppisten bioteknisesti tuotettujen lääkeaine-ehdokkaiden testausta. Tämä toteutuu parhaiten käytettäessä asianomaisen kudoksen tai solukon viljelmiä. Testejä kehittävät kansainväliset yhteisöt OECD:n lisäksi myös eräät muut kansainväliset yhteisöt ovat vahvasti mukana vaihtoehtoisten testimenetelmien kehittämisessä, mm. Vaihtoehtoisten menetelmien validoinnin eurooppalainen keskus (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM), joka koordinoi testimenetelmien validointia EU:ssa. ECVAM määrittää myös testiprotokollat, joita validoinnissa käytetään, ja järjestää laboratorioiden välisiä validointitutkimuksia (Balls ym. 1995a, Bruner ym. 1996). ECVAM on äskettäin saanut valmiiksi in vitro -fototoksisuustestin validoinnin (Spielman ym. 1998). Tärkeä taho on myös koe-eläintestien vaihtoehtojen keskus John Hopkins -yliopistossa Yhdysvalloissa. Sen tehtävänä on etsiä tieteellisesti hyväksyttäviä vaihtoehtoja eläinkokeille. Pohjoismainen MEIC-projekti (Multicenter Evaluation of In Vitro Cytotoxicity) on tehnyt uraauurtavaa työtä in vitro -menetelmien käyttökelpoisuuden ja luotettavuuden selvittämiseksi. MEIC-projektissa 30 laboratoriota on tutkinut 50 referenssikemikaalin toksisuutta eri in vitro -menetelmillä. Siinä verrattiin myrkytyskeskusten tietoja sekä 30 laboratorion solutoksisuustuloksia tietyistä aineista (Bondesson ym. 1989). Kuolemaan johtaneissa myrkytystapauksissa verestä mitattuja aineen pitoisuuksia verrattiin vastaaviin in vitro -tutkimuksissa saatuihin solutoksisiin pitoisuuksiin. Vertailu osoitti, että tämä korrelaatio on parempi kuin eläinkokeiden ja ihmiselle tappavien pitoisuuksien välinen korrelaatio. Poikkeuksena ovat aineet, jotka läpäisevät helposti veri-aivoesteen. Nämä aineet ovat paljon myrkyllisempiä kuin ei-neuraalisten solutestien perusteella voidaan päätellä, sillä keskushermosto on In vitro -menetelmät ja kemikaalien turvallisuuden testaus 855

herkempi toksisille vaikutuksille kuin muut kudokset (Ekwall ym. 1997). Projektin johtajan Björn Ekwallin päätelmänä on, että solututkimukset ennustavat jonkin aineen ihmiselle vaarallisia pitoisuuksia paremmin kuin eläinkokeet ja että välitöntä toksisuutta mittaavat eläinkokeet voitaisiin korvata soluviljelyillä. Validointi ja testausstrategiat OECD järjesti vuonna 1996 työryhmäkokouksen vaihtoehtoisten toksisuustestien validoinnista ja hyväksyttävyyden kriteereistä. Siinä saavutettiin laaja kansainvälinen yhteisymmärrys niistä periaatteista, joita noudattaen in vitro -testien validointi eli tieteellisesti luotettavaksi osoittaminen tulisi suorittaa. Kokouksessa pohdittiin myös, mitä vaiheita testin validointiin tulisi kuulua ja miten in vitro -testit tulisi liittää eläinkokeisiin ja testausstrategiaan (Draft Group Reports of the OECD Workshop 1996). Viralliseksi testiohjeeksi hyväksyminen edellyttää, että testin tulokset soveltuvat riskin arvioinnin välineeksi terveys- ja ympäristöhaittojen ehkäisemisessä. OECD:n asettamat kriteerit toksisuustestien hyväksynnälle (pätevät luonnollisesti myös in vitro -testeihin) ovat:»ehdotetun testin/tutkimusmenetelmän tulee läpäistä kriittinen arviointi, joka koskee testin tieteellistä perustaa/oikeutusta, herkkyyttä ja toistettavuutta, ja sisältää mahdollisuuksien mukaan vertailevaa tutkimusta, joka tukee testimenetelmän validiteettiä.» Kaavio OECD:n testiohjeen kehittämisen vaiheista on esitetty kuvassa 3. In vitro -kokeiden validoinnille asetetaan yleisesti varsin suuret vaatimukset. Vaatimukset lienevät suuremmat kuin in vivo -kokeilta on aikanaan edellytetty. In vivo -kokeiden validoinnissa ongelmana on luotettavan vertailukohdan ja -aineiston löytäminen. Esimerkiksi jyrsijäkokeiden tuloksia ei useimmiten voi verrata ihmisellä tehtyjen kokeiden tuloksiin, koska jälkimmäisiä ei läheskään aina ole käytettävissä. Siksi in vivo -kokeita ei ole voitu aina validoida muodollisesti. Pohdittaessa in vitro -testien validointia on muistettava, että myös in vivo -testi, johon tuloksia verrataan, saattaa olla epäluotettava. Esimerkiksi Draizen silmä-ärsytys- ja korroosiotesti Aloitteet kansallisilta koordinaattoreilta, tiedeyhteisöiltä tai OECD:n sihteeristöltä Kansallisten koordinaattorien kokous Tieteellinen katsaus testimenetelmiin Testiohjeluonnos OECD:n sihteeristöltä Kommenttikierros ja asiantuntijakokoukset Kansallisten koordinaattorien ja OECD:n ympäristökomitean hyväksyntä Kuva 3. OECD:n testiohjeen kehittäminen kemikaalien turvallisuuden tutkimista varten (Koëter 1995). eivät ole täysin luotettavia, koska löydösten arviointi ja pisteitys on subjektiivista. On siis mahdollista, että joissakin tapauksissa in vitro -testin validointi epäonnistuu vertailukohtana käytettävän in vivo -testin epätarkkuuden takia. Validoinnin kriteerit OECD:n piirissä on päätetty, että kemikaalien turvallisuustestaukseen tarkoitetun metodin tulee täyttää mm. seuraavat kriteerit: 1) Menetelmän tulee olla tieteellisesti ja hallinnollisesti perusteltu. 2) On osoitettava, että in vitro -testissä mitataan samoja biologisia ja toksisia vaikutuksia kuin in vivo -testissä. 3) Validointi tulee dokumentoida yksityiskohtaisesti, jotta se voidaan tarvittaesssa toistaa. 4) Menetelmällä saatujen tulosten pitää olla toistettavissa samassa laboratoriossa ja muissa laboratorioissa. 5) Menetelmän käyttökelpoisuus on osoitettava referenssikemikaaleilla. 6) Menetelmän herkkyys ja vaikutuksille herkät lajit tulee arvioida. Hallinnollisen hyväksymisen kriteerit Hallinnollinen hyväksyminen riippuu tieteellisen validoinnin tuloksesta. Hyväksyntää nopeut- 856 K. Louekari ym.

Testin vaihe Kehittelyvaihe Prevalidointi Validointivaihe 1 Validointivaihe 2 Asiantuntijaryhmän käsittely Ohjeistoihin hyväksyminen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aika vuosina menetelmän julkaisemisesta Kuva 4. OECD:n ohjeistoihin tarkoitetun toksisuustestin kehittämisen ja validoinnin aikataulu (Purchase 1997). taa, jos hallinnollinen taho otetaan mukaan validointiprosessiin jo varhaisvaiheessa. Seuraavat kriteerit ovat tärkeitä harkittaessa testimenetelmän hyväksymistä kansainvälisiin, esimerkiksi OECD:n ohjeistoihin: 1) Menetelmän tulisi ennustaa vaikutuksia paremmin kuin aiemmin hyväksytyt menetelmät. 2) Menetelmän tulee tuottaa riskin arviointiin entistä parempaa aineistoa. 3) Ennen hyväksymistä riittävä määrä kemikaaleja pitää testata kyseisellä menetelmällä. 4) Testin tulee olla tehokas ja eri laboratorioihin soveltuva. Tarvittavien erityislaitteistojen ja tekniikoiden pitää olla käytössä useissa laboratorioissa. 5) Tulee esittää tieteellinen, eettinen ja taloudellinen perustelu testin valinnalle aikaisempien menetelmien sijasta. On noudatettava»kolmen R:n periaatetta» (reduce, refine, replace). Testausstrategioiden periaatteet Testausstrategia tarkoittaa useiden testien muodostamaa kokonaisuutta, jossa tietystä tuloksesta päätellään mm., mitä muita kokeita on tarpeen tehdä. Testausstrategioilla pyritään mm. siihen, että selvästi toksiset kemikaalit voidaan seulontatesteillä havaita mahdollisimman aikaisin, jolloin voidaan vähentää koe-eläinten käyttöä. Testausstrategioiden periaatteita ovat mm. seuraavat: 1) Olemassa olevia tietoja fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista, rakenneaktiivisuusanalyyseista ja eri alojen toksikologisista tietokannoista tulee käyttää ennen testauksen aloittamista. 2) On painotettava vähemmän kipua aiheuttavia testejä ja koe-eläinten käytön vähentämistä. 3) Strategian tulosten tulee täyttää riskin arvioinnin tarpeita ja muita hallinnollisia tarpeita. 4) Strategian tulisi sisältää testejä, jotka perustuvat tunnettuihin ja tärkeisiin vaikutusmekanismeihin. 5) Testausstrategiassa tulee suosia ihmissoluviljelmien käyttöä tai muita ihmisillä tehtäviä mittauksia, sikäli kuin se on eettisesti hyväksyttävää. 6) Testausstrategian tuloksista pitäisi pystyä ennakoimaan haitalliset vaikutukset ja annos-vastesuhteet. Tulevaisuuden näkymät Vaihtoehtoisen menetelmän kehittäminen on pitkä prosessi, johon kuuluvat testin kehittäminen, prevalidointi ja validointi, asiantuntijaryhmien lausuntovaihe sekä testin hyväksyminen ohjeistoihin (kuva 4). Testien validointivaihe on hidas. Validoinnissa arvioidaan testin tarkoituksenmukaisuus, luotettavuus ja toistettavuus. Vaiheiden toteuttamiseen kuluu keskimäärin kymmenen vuotta. On arvioitu, että parhaillaan kehitettäviä tai validoitavana olevia vaihtoehtoisia menetelmiä tulisi ohjeistoihin seuraavassa järjestyksessä: ihoabsorptiotesti, akuutti ihokorroosiotesti ja valotoksisuustesti vuosien 1998 2000 aikana, akuutti ihoärsytystesti vuosina 2002 2004, akuutti silmä-ärsytystesti 2005 2007, vaihto- In vitro -menetelmät ja kemikaalien turvallisuuden testaus 857

ehtoinen testi korvaamaan akuuttia toksisuustestiä (oraalinen LD 50 ) 2008 2010 (Purchase 1997). Nopeus, jolla korvaavia testejä voidaan odottaa ohjeistoihin, on ennen muuta riippuvainen in vitro -toksikologian ja validointitutkimuksen edistymisestä. Vastuu kemikaalien ja lääkkeiden turvallisuudesta on tärkein huomioonotettava eettinen tekijä. Jos vaihtoehtoiset menetelmät yhdessä tavanomaisten eläintestien kanssa käytettyinä takaavat turvallisuuden, ne tulisi hyväksyä osaksi toksikologista turvallisuustutkimusta. Kirjallisuutta Ames B N, Durston W E, Yamasaki E, Lee F D. Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation of bacteria for detection. Proc Natl Acad Sci USA 1973; 70: 2282 5. APC, Animal Procedures Committee Report to the Home Secretary on Regulatory Toxicity. London, Home Office Publications, 1994. Balls M, Blauboer B J, Fentem J H, ym. Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. ATLA 1995a; 23: 129 47. Balls M, Botham P A, Bruner L H, Spielmann H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro 1995b; 9: 871 929. Bondesson I, Ekwall B, Hellberg S, ym. MEIC a new international multicenter project to evaluate the relevance to human toxicity of in vitro cytotoxicity tests. Cell Biol Toxicol 1989; 5: 331 47. Brantom P G, Bruner L H, Chamberlain M, ym. A summary report of the COLIPA international validation study on alternatives to Draize rabbit eye irritation test. Toxicol in Vitro 1997; 11: 141 79. Bruner L H, Carr G J, Chamberlain M, Curren R D. Validation of alternative methods for toxicity testing. Toxicol in Vitro 1996; 10: 479 501. Campochiaro P A, Conway B P. Aminoglycoside toxicity A survey of retinal specialists. Implications for ocular use. Arch Ophthalmol 1991; 109: 946 50. Draize J H, Woodard G K, Calvery H O. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol Exp Ther 1944; 82: 377 90. Ekwall B, Clemedson C, Crafoord B, ym. Correlation between in vivo and in vitro acute toxicity tests: results of the MEIC project. Kirjassa: Louekari K, Tiberg Ebba, toim. Development of ecotoxicity and toxicity tests. TemaNord, Environment 1997: 524. Copenhagen: Nordic Council of Ministers, 1997. EU Commission. The Commissions first report to the Council and the European Parliament on statistics concerning the number of animals used for experiments and other scientific purposes. Com(94) 195. Brussels, 1994 Frankild S. In vitro percutaneous absorption test. Kirjassa: Louekari K, Tiberg Ebba, toim. Development of ecotoxicity and toxicity tests. TemaNord Environment 1997: 524. Copenhagen: Nordic Council of Ministers, 1997. Grant W M. Toxicology of the eye. Illinois USA: Charles Thomas, 1986. Koëter H. International harmonisation of test methods for hazard characterisation and risk assessment. Kirjassa: Louekari K, Tiberg E, toim. Development of (eco)toxicity tests. TemaNord, Environment 1995: 623. Copenhagen: Nordic Council of Ministers, 1995, s. 3 6. OECD Scientific Criteria for Validation of in Vitro Toxicity Tests. Paris: OECD Environment Monograph, No. 36. 1990. OECD Guidance Document for the Development of OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris: OECD, Environment Monograph, No. 76, 1993. OECD The role of OECD Test Guideline Programme in the international harmonisation of Validation Criteria for Alternative Test Methods. Paris: ENV/MC/CHEM/TG(94)6, 1994. OECD Draft Group Reports of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods in Solna, Sweden, 22 24 January 1996. OECD Test Guideline Programme. Progress report for the period september 1996 march 1997. Environment Directorate, Chemicals Group and Management Committee, Paris: ENV/ MC/CHEM/TG(97)2, 1997. Ohno Y, Kaneko T, Kobayashi T, ym. First Phase Inter-Laboratory Validation of the In Vitro Eye Irritation Tests for Cosmetic Ingredients: (1) Overview, organization and results of the validation study. Aatex 1995; 3: 123 36. Purchase I F H. Prospects for reduction and replacement alternatives in regulatory toxicology. Toxicol in Vitro 1997; 11: 313 9. Rasmussen E S. Prospects for Use of in Vitro Methods for Assessment of Human Safety. National Food Agency of Denmark, February 1995. Russel W M S, Burch R L. The Principles of Humane Experimental Technique. London: Methuen, 1959. Spielman H, Balls M, Dupuis J, ym. The international EU/ COLIPA in vitro phototoxicity validation study: results of Phase II (blind trial); part 1: the 3T3 NRU test for phototoxic pontential. Toxicol in Vitro, 1998 (painossa). Tähti H, Vaalavirta L, Toimela T. In vitro methods as a tool in neurotoxicity studies. 1995; ATLA 23: 491 6. Wärngård L, Pelin K. Conclusions of the non-genotoxic and related mechanisms -session. Kirjassa: Louekari K, Tiberg E. Development of (eco)toxicity tests. TemaNord, Environment 1995: 623. Copenhagen: Nordic Council of Ministers, 1995. KIMMO LOUEKARI, FT, erikoistutkija Työterveyslaitos, työhygienian ja toksikologian osasto Topeliuksenkatu 41a A, 00250 Helsinki Jätetty toimitukselle 11.12.1997 Hyväksytty julkaistavaksi 5.3.1998 LOTTA SALMINEN, professori, tulosyksikön johtaja TAYS:n silmätautien klinikka PL 2000, 33521 Tampere HANNA TÄHTI, dosentti, tutkimusjohtaja Tampereen yliopisto, lääketieteen laitos PL 607, 33101 Tampere 858