TURUN YLIOPISTO. Biologian laitos

Transkriptio

1 i TURUN YLIOPISTO Biologian laitos NIKKINEN, LAURI: Karotenoidien vaikutus talitiaisen (Parus major) poikasten höyhenpuvun väritykseen ja menestymiseen saastuneessa ympäristössä [The effect of carotenoids on plumage colour and success of great tit (Parus major) in a polluted environment] Tutkielma, 53 s. Ekologia Kesäkuu 2005 Ympäristön saasteet, kuten raskasmetallit, heikentävät eliölajien mahdollisuuksia menestyä niiden luontaisessa elinympäristössä. Lintuihin raskasmetallien on todettu vaikuttavan sekä suoraan että epäsuorasti. Harjavallassa raskasmetallit ovat vähentäneet talitiaiselle soveltuvan ravinnon määrää, ja karotenoidipitoisten toukkien määrän ja talitiaisen poikasten värityksen välillä on havaittu positiivinen korrelaatio. Talitiaisen höyhenpuvun väritys perustuu toukkaravinnosta saataviin karotenoideihin. Karotenoidien käytön välillä vallitsee allokaatioristiriita, sillä värinmuodostuksen lisäksi niitä käytettään elimistön antioksidantteina ja ne vähentävät raskasmetallien aiheuttamaa oksidatiivista stressiä. Koska karotenoideja kuluu antioksidanttitoiminnassa, on epäselvää, johtuuko talitiaisen poikasten höyhenpuvun värityksen vaaleneminen karotenoidipitoisen ravinnon vähyydestä vai saasteiden aiheuttamasta karotenoidien kulutuksen lisääntymisestä. Tähän kysymykseen pyrin tutkimuksessani hakemaan vastausta. Lisäksi tarkastelen, onko karotenoidien lisäruokinnalla vaikutusta poikasten elossasäilyvyyteen, kuntoon ja terveydentilaan. Talitiaisen pesäpoikasilla suoritettiin lisäruokintakoe, jossa poikasille syötettiin karotenoidipitoista nestettä koko poikaskauden ajan. Jokaisessa pesässä poikaset oli jaettu käsittely- ja kontrolliryhmään, ja pesiä oli sekä saastuneella alueella että puhtaalla tausta-alueella. Poikasten kuntoa ja terveydentilaa arvioitiin painon mittauksin ja verinäytteestä saadun hematokriitin avulla. Poikasilta kerättiin ulostenäytteet ravinnon raskasmetallimäärien selvittämiseksi. Lisäksi poikasilta mitattiin plasman karotenoidimäärä ruokinnan aikana, ja höyhenten sisältämä luteiinipitoisuus ja höyhenpuvun väri ruokinnan loputtua. Ruokintakäsittelyllä oli selvä vaikutus plasman ja höyhenten karotenoidipitoisuuksiin ja höyhenpuvun väriin: ruokitut poikaset olivat keltaisempia poikasajan lopussa kuin poikaset, joita ei ruokittu. Vaikutus oli samanlainen sekä saaste- että tausta-alueella. Elossasäilyvyyteen, kuntoon ja terveydentilaan käsittelyllä ei ollut vaikutusta. Poikasten kunto oli parempi tausta-alueella. Tulokset antavat viitteitä siitä, että karotenoidien saatavuus rajoittaa värityksen ilmentymistä ja että saasteiden aiheuttamalla oksidatiivisella stressillä on vähäinen merkitys värityksen määräytymisessä ja poikasten selviytymisessä pesäpoikasaikana. Ravinnon määrä vaikuttaa keskeisesti poikasten menestymiseen ja sen laatu värityksen ilmentymiseen. Näin ollen on ilmeistä, että raskasmetallien epäsuorat vaikutukset korostuvat tarkasteltaessa syitä talitiaisen pesimämenestyksen muutoksiin saastuneessa ympäristössä.

2 ii SISÄLLYSLUETTELO 1. JOHDANTO KAROTENOIDIT JA NIIDEN TEHTÄVÄT KAROTENOIDIEN KÄYTÖN ALLOKAATIORISTIRIITA RASKASMETALLIEN VAIKUTUKSET TUTKIMUKSEN TARKOITUS AINEISTO JA MENETELMÄT TUTKITTAVA LAJI TUTKIMUSALUEET RUOKINTAKOE JA AINEISTON KERUU KAROTENOIDIRUOKINTA VÄRITYKSEN MITTAAMINEN JA DIGITAALINEN ANALYSOINTI AINEISTON TILASTOLLISET KÄSITTELYT TULOKSET ULOSTEIDEN RASKASMETALLIPITOISUUDET ELOSSASÄILYVYYS POIKASTEN KUNTO LUTEIINIANALYYSIT JA HÖYHENPUVUN VÄRITYS TULOSTEN TARKASTELU ELOSSASÄILYVYYS JA KUNTO LUTEIINIPITOISUUDET JA HÖYHENPUVUN VÄRITYS RASKASMETALLIALTISTUKSEN VAIKUTUS YHTEENVETO KIITOKSET KIRJALLISUUSLUETTELO... 38

3 1 1. Johdanto Viime vuosikymmeninä ympäristön tila on heikentynyt dramaattisesti ihmistoiminnan johdosta (Wahlström ym. 1992, Heywood 1995, WWF 2004). Useat eliöiden luontaiset elinympäristöt ovat pirstoutuneet ja maankäytön muutokset johtaneet tilanteisiin, jossa koko eliöyhteisö on ollut lähellä kadota (Delbaere 1998, EEA 2003, Fahrig 2003). Ympäristön pilaantuminen myrkkyjen ja saasteiden takia on vaikuttanut luonnonympäristön kunnon heikentymiseen ja aiheuttanut lisääntymismenestyksen muutoksia useissa eri eliöryhmissä (esim. Bengtsson ja Rundgren 1984, Eeva ja Lehikoinen 1995, 1996). Monet ympäristövaikutukset liittyvät päästöihin, joita ihmisen toiminta tuottaa. Päästön haittavaikutus riippuu sen määrästä, laadusta, ajankohdasta ja kestosta. Eri aineet vaikuttavat eri tavoin eri ympäristöissä ja tilanteissa. Usein olosuhteet ja esiintymismuoto ratkaisevat vaikutuksen luonteen ja voimakkuuden. Ympäristöön laskettu haitallinen aine voi vaikuttaa eliöihin sekä välillisesti elinympäristön pilaantumisen että suorien myrkkyvaikutusten kautta. Päästö voi levitä alueella useaa reittiä, ja sen vaikutukset voivat näkyä ympäristössä pitkään. Useimmiten ympäristömyrkkynä pidetään ainetta tai yhdistettä, joka on haitallinen elolliselle luonnolle ja kertyy helposti ravintoketjussa. Tietyt aineet ovat pieninä pitoisuuksina eliöille välttämättömiä, mutta saattavat suurina annoksina jopa tappaa (Beyer ym. 1985). Toisaalta monet aineet ja yhdisteet aiheuttavat haittoja hyvin pieninäkin pitoisuuksina. Myrkyn omien ominaisuuksien lisäksi myrkyllisyys on riippuvainen altistuvan eliön ominaisuuksista ja kunnosta, ja myrkyn sieto vaihtelee ikäryhmittäin ja kehitysvaiheittain (Wright ja Welbourn 2002a). Haitallisten aineiden

4 2 vaikutukset ilmenevät yleensä vasta pitkän altistuksen ja kertymisen jälkeen (Wright ja Welbourn 2002b). Myrkky voi vaikuttaa eliöön joko suoraan kemiallisesti tai välillisesti elintoimintoja haitaten. Välittömät biokemialliset haitat syntyvät, kun myrkky esimerkiksi kiinnittyy entsyymeihin tai hormoneihin ja estää tai muuttaa niiden toimintaa (Wright ja Welbourn 2002b). Ympäristömyrkkyjen vaikutukset eliöissä korostuvat ravintoketjujen yläpäässä (esim. Cooke ym. 1982). Suurimmat myrkkypitoisuudet mitataan yleensä ravintoketjun huipulla vaikuttavista saalistajista. Ravinnon laadulla ja määrällä on keskeinen vaikutus altistuksen voimakkuuteen. Hyvälaatuinen ravinto saattaa vaikuttaa siihen, kuinka hyvin yksilön elimistö kykenee ehkäisemään myrkkyjen ja saasteiden haitallisia vaikutuksia. Esimerkiksi laadukkaan ravinnon sisältämät korkeat karotenoidipitoisuudet voivat vaikuttaa myrkkyjen aiheuttaman oksidatiivisen stressin sietoon (Chew 1996, Edge ym. 1997, von Schantz ym. 1997, Møller ym. 2000). Samalla tällä saattaa olla vaikutusta yksilöiden menestykseen, mikä ilmenee kelpoisuuseroina populaatiossa Karotenoidit ja niiden tehtävät Karotenoidit ovat luonnossa yleisenä esiintyviä isopreenijohdannaisia hiilivetyketjuja, joita putkilokasvit, sienet, levät ja eräät bakteerit pystyvät tuottamaan (Fox 1976, 1979, Brush 1981, Goodwin 1984, Latscha 1990, Stradi 1998). Näitä pigmenttejä on löydetty luonnosta yli 600 (Goodwin 1984), ja niitä esiintyy runsaasti vihanneksissa, hedelmissä ja useissa muissa ravintoaineissa. Karotenoidit jaotellaan molekyylirakenteensa perusteella kahteen pääryhmään: karoteeneihin ja ksantofylleihin. Karoteenien pitkä molekyylirakenneketju koostuu hiili- ja vetyatomeista, jotka ovat konjugoituneet kaksoissidoksin. Ksantofyllit ovat karoteenien happijohdannaisia. Yleisimmät

5 3 karoteenit ovat β-karoteeni ja sen johdannaiset; ksantofylleistä merkittävimmät ovat luteiini, zeaksantiini ja kantaksantiini. Karotenoidit tuottavat useiden eliölajien kirkkaan värityksen. Eläimet eivät itse pysty syntetisoimaan karotenoideja, vaan niitä täytyy saada ravinnosta (Goodwin 1984, Schiedt 1989). Esimerkiksi useimmat lintulajit akkumuloivat karotenoideista pääasiallisesti luteiinia, zeaksantiinia, kantaksantiinia ja β-karoteenia (Brush 1981, Goodwin 1984, Stradi 1998, Royle ym. 1999). Ruoansulatuksen jälkeen karotenoidit kulkeutuvat vereen, ja niitä muokataan ja varastoidaan maksaan, rasvakudokseen tai elimistön muihin osiin (Brush 1978). Karotenoideja käytetään aineenvaihdunnan biokemiallisissa prosesseissa, ja lisäksi osa niistä siirretään höyhenten tai paljaiden osien väripigmenteiksi. Karotenoideilla on useita tärkeitä fysiologisia tehtäviä elimistössä. Ne toimivat yhteistyössä muiden molekyylien kanssa elimistön immuunipuolustusjärjestelmässä (Anderson ja Theron 1990, Sato ym. 1990, Jialal ja Grundy 1991, Olanow 1993, Palozza ja Krinsky 1992, Böhm ym. 1997). Karotenoidien on havaittu lisäävän immuunivasteessa toimivien lymfosyyttien, interleukiinien ja sytokiniinien määrää, kohottavan elimistön neutrofiilien ja makrofagien fagosytoosikapasiteettia ja parantavan elimistön vastustuskykyä kasvaimia vastaan (Bendich 1989, Chew 1993, Edge ym. 1997). Lisäksi karotenoidit toimivat useiden muiden tärkeiden molekyylien esiasteena (Vershinin 1999). Karotenoidit toimivat myös elimistön antioksidantteina ja pelkistävät haitallisia aineita. Elimistö tuottaa aineenvaihdunnan ja immuuni- ja myrkkypuolustuksen sivutuotteena

6 4 erittäin reaktiivisia molekyylejä, joita kutsutaan vapaiksi radikaaleiksi. Nämä voivat vaurioittaa solukalvoja ja elimistölle tärkeitä molekyylejä, kuten DNA:ta, proteiineja ja rasvoja (Halliwell ja Gutteridge 1985, Gruner ym. 1986, Breimer 1990, Anderson ja Theron 1990, Shigenaga ja Ames 1994, Nebert ym. 1996, Parkinson 1996). Karotenoidit toimivat näiden radikaalien antioksidantteina pyydystäen ja muuttaen niitä elimistölle vaarattomampaan muotoon (Ames 1983, Burton 1989, Krinsky 1989 ja 1998, Edge ym. 1997). Vapaita radikaaleja käytetään myös osana elimistön luontaista immuunipuolustusjärjestelmää. Immuunipuolustukseen osallistuvat solut hapettavat, ja siten tuhoavat, vapaiden radikaalien avulla bakteereja ja muita elimistölle vieraita aineita (Chapple 1997). Mikäli vapaiden radikaalien määrä moninkertaistuu äkillisesti, elimistö joutuu tilaan, jota kutsutaan oksidatiiviseksi stressiksi (Burton ja Ingold 1984, Halliwell ja Gutteridge 1985, Gruner ym. 1986, Breimer 1990, Kappus 1993, Gregus ja Klaassen 1996, Parkinson 1996, Sies 1997, von Schantz ym. 1999). Esimerkiksi elimistön jatkuva vierasaineille tai patogeeneille altistuminen, nopean kasvun aika tai tiettyjen ravintoaineiden puutostilat voivat aiheuttaa oksidatiivista stressiä (Halliwell 1996). Immuunipuolustusjärjestelmän aktivoituessa antioksidanttien kulutus lisääntyy ja niiden määrä alkaa vähentyä, kun elimistö pyrkii tasapainottamaan vapaiden radikaalien tuottoa niiden neutralointinopeuden kanssa (Maguire ym. 1989, Frei ym. 1992, Lieber 1993). Linnuilla ja nisäkkäillä plasman karotenoidien ja C- ja E-vitamiinien pitoisuuksien on todettu vähenevän % niiden altistuttua infektiotaudeille (Ruff ym. 1974, Sykes 1979, Augustine ja Ruff 1983, Hennet ym. 1992). Tällöin plasman

7 5 karotenoidipitoisuus saattaa kertoa yksilön kokemasta oksidatiivisesta stressistä (Anderson ja Theron 1990, Sato ym. 1990, Jialal ja Grundy 1991). Suurin osa karotenoidien antioksidanttitutkimuksista koskee β-karoteenia, sillä se on ihmisravinnon yleisin karotenoidi (Burton 1989). Kuitenkin myös luteiinin ja zeaksantiinin antioksidanttitoimintaa on havaittu ainakin kissoilla (Kim ym. 2000b), koirilla (Kim ym. 2000a) ja hiirillä (Chew ym. 1996). Vaikka suurin osa karotenoiditutkimuksesta on tehty nisäkkäillä, myös muilla taksoneilla, kuten linnuilla, on karotenoidien havaittu olevan tärkeitä immuunipuolustuksessa (esim. Sklan ym. 1989, Tengerdy ym. 1990, Haq ym. 1996a, 1996b) Karotenoidien käytön allokaatioristiriita Karotenoidipigmentteihin perustuva väritys toimii lajien ja yksilöiden välisenä signaalina (Savalli 1995). Tällaista väritystä on havaittu nisäkkäillä, linnuilla, kaloilla ja matelijoilla, ja useimmiten se näkyy nokan, höyhenpuvun tai ihon värityksenä (Goodwin 1984, Brush 1990). Väritys on yleensä sukupuolidimorfista, ja sillä on merkitystä lajin- ja yksilöntunnistuksessa (Butcher ja Rohwer 1989, Whitfield 1987), ympäristöön naamioitumisessa (esim. Edmunds 1974, Endler 1978, Götmark ja Olsson 1997), varoitussignaalina (esim. Cott 1957, Edmunds 1974), ja se toimii signaalina puolisonvalinnassa (Hill 1990, 1991). Väritys voi ilmentää myös muita kelpoisuuteen vaikuttavia tekijöitä (esim. Hamilton ja Zuk 1982, Hudon ym. 1989). Useissa tutkimuksissa on havaittu, että ulkoasultaan värikkäät yksilöt ovat vastakkaista sukupuolta olevien yksilöiden suosiossa. Sukupuolivalinnassa kirkas väritys toimii piirteenä, jota selvästi suositaan (Endler 1983, Burley ja Coppersmith 1987, Hill 1990, 1991, 1994, Milinski ja Bakker 1990, Zuk ym.1990). Esimerkiksi Hill (1990, 1991)

8 6 havaitsi, että pihapunavarpusnaaraat (Carpodacus mexicanus) suosivat parinvalinnassaan kirkasvärisiä koiraita. On myös todettu, että värikkäät kolmipiikkikoiraat (Gasterosteus aculeatus) ovat naaraiden suosiossa (Bakker ja Sevenster 1983, Milinski ja Bakker 1990). Myös joidenkin lajien kirkkaan värisiä naaraita suositaan (Hill 1993a, Amundsen ja Forsgren 2001). Lisäksi eräissä tutkimuksissa on havaittu, että kirkasväriset poikaset ovat emojen huomion kohteena (Lyon ym. 1994, Kilner 1997). Sinitiaisen (Parus caeruleus) poikaset, joilla oli kirkkaampi kita kuin muilla poikasilla, saivat enemmän ruokaa vanhemmiltaan (Götmark ja Ahlström 1997). Toisaalta talitiaisen poikasilla tehdyissä ruokintakokeissa ei löydetty yhteyttä höyhenpuvun värityksen ja ravinnonsaannin välillä (Tschirren ym. 2005). Keskeinen kysymys on, mitä karotenoideihin perustuvilla signaaleilla, kuten höyhenpuvun värityksellä, pyritään viestittämään. Eräät tutkimukset osoittavat, että karotenoidien saatavuus rajoittaa karotenoideihin perustuvien ornamenttien ja signaalien ilmentymistä (laboratoriossa: Hill 1992, 1993b; luonnossa: Grether ym.1999, Saino ym. 2000). On myös havaittu, että signaalin voimakkuus (kuten värin intensiteetti) korreloi ympäristön laadun ja sen sisältämän ravinnon määrän kanssa (Slagsvold ja Lifjeld 1985, Eeva ym. 1998). Tällöin näyttävä ornamentti saattaisi ilmentää yksilön kykyä hankkia karotenoidipitoisia resursseja ja kertoisi yksilön ravinnonhankintakyvystä (Endler 1980, 1983, Kodric-Brown 1985, Hill 1992, Hill ym. 1994). On esitetty, että ornamentti voi ilmentää myös yksilön geneettistä laatua (Zahavi 1975, Hamilton ja Zuk 1982, Kodric-Brown ja Brown 1984, Andersson 1986). Tutkimukset osoittavat, että huomiota herättävä ornamentti korreloi yksilön terveydentilan ja

9 7 elossasäilymisen todennäköisyyden kanssa (Andersson 1994). Myös karotenoideihin perustuvan värityksen on ehdotettu olevan terveydentilasta riippuva ominaisuus (Andersson 1994, Møller ym. 2000), ja on todisteita siitä, että joissakin tapauksissa väritys ilmentää vastustuskykyä terveydentilaa alentavia loisia vastaan (Møller ym. 2000). Esimerkiksi Milinski ja Bakker (1990) havaitsivat, että kirkkaamman värisillä kolmipiikkikoirailla oli vähemmän sisäloisia kuin vähemmän värikkäillä lajitovereilla. Hill ja Brawner (1998) vuorostaan raportoivat, että värikkäillä pihapunavarpuskoirailla oli vähemmän loisia kuin vähemmän kirkkailla koirailla. Miten väritys ja terveydentila voivat olla yhteydessä toisiinsa? Lozano (1994) oli ensimmäinen, joka päätteli, että karotenoidien immuunipuolustus- ja antioksidanttitoiminnan ja värinmuodostuksen välillä saattaa olla positiivinen korrelaatio. Jos yksilö voi saavuttaa karotenoidiresursseja vain tietyn määrän, on resurssit jaettava immuunipuolustuksen (ja vierasaineiden pelkistämisen) ja värityksen muodostuksen välillä. Mikäli yksilöllä on mahdollisuus panostaa kirkkaan värin tuottamiseen, on sillä myös potentiaalia puolustautua vierasaineita vastaan. Tämän johdosta voidaan ennustaa, että silloin kun yksilö kykenee panostamaan kirkkaaseen ulkoasuun, sen täytyy myös olla fysiologisesti hyvässä kunnossa. Muussa tapauksessa suurin osa värityksen muodostamiseen tarvittavista karotenoideista kuluu immuunipuolustukseen ja vapaiden radikaalien neutralointiin, eikä karotenoideja yksinkertaisesti riitä ornamentin tuottamiseen. Aivan viime aikoina on kyetty kokeellisesti osoittamaan ornamentin ja immuunipuolustuksen välillä oleva yhteys. Faivre ym. (2003) osoittivat, että ainakin mustarastaalla (Turdus merula) karotenoideihin perustuvan ornamentin (kirkas nokka)

10 8 ja immuunipuolustuksen välillä vallitsee tilanne, jossa ornamentin väri ilmentää mahdollisuutta puolustautua vierasaineita vastaan. Lisäksi Blount ym. (2003) ja McGraw ja Ardia (2003) ovat osoittaneet, että karotenoidilisä vahvistaa seeprapeipon (Taeniopygia guttata) nokan väritystä, nostaen siten pariutumismenestystä, ja voimistaen samalla immuunivastetta. Myös poikasilla on havaittu immuunivasteen ja värityksen välinen positiivinen korrelaatio (Saino ym. 2000). Mikäli kirkkaan värisiä koiraita suositaan niiden ylivertaisen terveydentilan takia, miksi on havaittu, että myös naaraat ja poikaset voivat olla suosiossa värityksensä perusteella? Selitys saattaa jälleen olla siinä, että karotenoidit toimivat eliöiden immuunipuolustuksessa ja antioksidanttitoiminnassa. Kuoriutumisen on todettu aiheuttavan poikaselle oksidatiivista stressiä (Surai 1999) ja antioksidanttien tarve on tällöin suurimmillaan (Surai ym. 1996, 1998). Surai ja Speake (1998) ovat osoittaneet, että naaraan munaan sijoittamat karotenoidit saattavat vähentää kehittyvän sikiön ja poikasen kokemaa oksidatiivista stressiä ja estää nopean kehityksen aikana syntyvien vapaiden radikaalien haitallisia vaikutuksia. Lisäksi vanhempien tarjoaman ravinnon sisältämät karotenoidit saattavat ehkäistä mikrobien ja tautien leviämistä poikasen elimistössä. Näiden syiden johdosta kehittyvä poikanen voi olla paremmassa kunnossa ja tuottaa näyttävämmän ornamentin. Naaraan näyttävä väritys saattaisi tällöin kertoa sen kyvystä tuottaa hyvälaatuisia, paljon karotenoideja sisältäviä munia, ja mahdollisesti terveempiä ja hyväkuntoisempia poikasia (katso myös Blount ym. 2000) Raskasmetallien vaikutukset Ihmistoiminnasta johtuvat ympäristön epäpuhtaudet, kuten raskasmetallit, vaikuttavat eliöihin haitallisesti. Elimistöön kertyvien metallien on havaittu aiheuttavan kasvu-, käyttäytymis- ja lisääntymishäiriöitä, jotka johtavat lisääntyneeseen kuolleisuuteen ja

11 9 alentuneeseen pesimämenestykseen (esim. Scheuhammer 1987, Eeva ja Lehikoinen 1995, 1996). Raskasmetalliaineenvaihdunnan sivutuotteena syntyy vapaita radikaaleja, jotka vaurioittavat muun muassa kudoksia ja DNA:ta (Stohs ja Bagchi 1994, Ercal ym. 2001). Lisäksi metallit haittaavat immuunipuolustusta (Koller 1979), mikä saattaa altistaa elimistön muille stressitekijöille, kuten viruksille ja bakteereille. Nämä tekijät yhdessä lisäävät elimistön kokemaa oksidatiivista stressiä. Raskasmetallit vaikuttavat eliöihin myös epäsuorasti heikentämällä elinympäristön tilaa. Eräs keskeisin tekijä lisääntymismenestyksen muutoksiin on ravinnon määrän vähentyminen (esim. Quinney ym. 1986, Martin 1987), jota raskasmetallien on todettu aiheuttavan (esim. Eeva ja Lehikoinen 1996). Harjavallassa kuparisulaton läheisyydessä tehdyissä tutkimuksissa on havaittu, että ilmansaasteet vaikuttavat lintujen ravintona käyttämien hyönteistoukkien runsaussuhteisiin (Heliövaara ja Väisänen 1990, 1993, Koricheva ja Haukioja 1995, Ruohomäki ym. 1996, Eeva ym. 1997). Myrkyt voivat vaikuttaa toukkien määrään suoraan, mutta myös välillisesti muuttamalla ympäristön kasvillisuutta ja sitä kautta lämpö- ja kosteusolosuhteita (Morrison 1986). Toukkien määrän vähentyminen, yhdessä saasteiden suorien vaikutusten kanssa, on heikentänyt kolossa pesivien lintujen, kuten talitiaisen, pesimämenestystä Harjavallan saastuneella alueella (Eeva ja Lehikoinen 1996). Tutkimuksissa on havaittu, että raskasmetalleja tuottavan saastelähteen läheisyydessä ja urbaanissa ympäristössä talitiaiset, joiden väritys perustuu karotenoideihin, ovat vaaleampia kuin kauempana saastelähteestä ja maaseutuympäristössä pesivät talitiaiset (Eeva ym. 1998, Hõrak ym. 2000, 2001). Tämä voi johtua siitä, että ympäristön saastuminen vähentää karotenoidipitoisen ravinnon määrää, tai siitä, että myrkkyjen

12 10 aiheuttama oksidatiivinen stressi kuluttaa karotenoideja elimistöstä. Saattaa siis olla, että väritys ilmentää lintujen saastekuormaa ja niiden kokemaa oksidatiivista stressiä. Tällöin saasteet, suorien myrkkyvaikutusten lisäksi, saattavat vaikuttaa lajien ja yksilöiden välisiin signaaleihin ja heikentää yksilöiden kelpoisuutta Tutkimuksen tarkoitus On tärkeää tutkia, millä tavoin ympäristön saastuminen vaikuttaa eliöihin. Olennaista on selvittää, miten ja mitä kautta havaittu saastumisen seurausvaikutus syntyy. Raskasmetallien saastuttamassa ympäristössä vaikutus on kahtalainen: myrkyt muuttavat ympäristöä ja vaikuttavat eliöihin, kuten lintuihin, suoraan. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää, johtuuko raskasmetallien saastuttamassa ympäristössä havaittu talitiaisen höyhenpuvun vaaleneminen (Eeva ym. 1998) myrkkyjen suorista vaikutuksista. Pyrin kokeellisesti selvittämään, johtuuko värimuutos raskasmetallien aiheuttamasta oksidatiivisesta stressistä. Tutkimuksen keskeisin kysymys on, johtuuko talitiaisen höyhenpuvun värityksen vaaleneminen karotenoidipitoisen ravinnon vähyydestä vai karotenoidien kulutuksen lisääntymisestä. Lisäksi tutkimuksen tarkoituksena on selvittää, vaikuttavatko karotenoidit poikasten menestymiseen saastuneessa ympäristössä. Kokeen perusteella voidaan arvioida raskasmetallien suorien ja epäsuorien vaikutusten voimakkuutta höyhenpuvun värityksen muutoksiin ja poikasaikaiseen menestymiseen. 2. Aineisto ja menetelmät 2.1. Tutkittava laji Tutkimuslajina tässä tutkimuksessa käytettiin talitiaista (Parus major L.). Tavallisesti talitiainen pesii luonnonkoloissa mutta hyväksyy myös pöntöt pesimäpaikoikseen. Laji on yleinen, pitkäikäinen ja sen pesimäbiologia tunnetaan hyvin (Cramp ja Perrins 1993).

13 11 Harjavallassa talitiaisen ekologiaa on tutkittu pitkään (esim. Eeva ym. 1997). Tavallisesti talitiaisnaarat aloittavat muninnan Harjavallassa toukokuun alussa, ja poikaset kuoriutuvat toukokuun loppupuolella (Bojarinova ym. 1999). Useat parit tekevät uusintapesyeen heinäkuun alkupuolella (Bojarinova ym.1999). Pesimäkauden aikana talitiaisen poikasten ravinto koostuu pääasiassa pesän läheisyydestä saalistetuista hyönteistoukista (Krebs 1971, Eeva ym. 1997, Ryömä 2004). Hyönteisravinnon sisältämät raskasmetallit kertyvät poikasten elimistöön, minkä johdosta talitiaisen pesäpoikasten on todettu olevan hyviä bioindikaattoreita saasteiden vaikutuksia tutkittaessa (Burger 1993, Cramp ja Perrins 1993, Furness ja Greenwood 1993, Janssens ym. 2002). Toukat sisältävät runsaasti karotenoideja (Partali ym. 1987), etenkin luteiinia ja zeaksantiinia, joilla on merkitystä talitiaisen höyhenpuvun värityksen määräytymisessä (Stradi 1998). Talitiainen onkin yksi niitä harvoja lajeja, joiden karotenoideihin perustuva höyhenpuvun väritys on havaittavissa jo pesäpoikasilla (Brush 1990). Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että karotenoidit varastoituvat höyhenpukuun ilmeisesti ilman biokonversiota (Partali ym. 1987). Luteiinilla ja zeaksantiinilla on kuitenkin havaittu olevan tärkeitä tehtäviä eliöiden antioksidanttitoiminnassa (Woodall ym. 1996, Surai ja Speake 1998), ja siten on mahdollista, että näillä karotenoideilla tai niiden aineenvaihduntatuotteilla on toiminnallinen rooli myös lintujen fysiologiassa. Näin ollen talitiainen soveltuu hyvin tutkimusorganismiksi tutkittaessa karotenoidien vaikutuksia lintujen pesimämenestykseen, terveydentilaan ja väritykseen saastuneessa ja puhtaassa ympäristössä.

14 Tutkimusalueet Tutkimus suoritettiin vuoden 2004 kesällä Harjavallassa ja sen lähikunnissa (61 20 N, E). Alueen teollisuusyhteisöön kuuluvat kupari- ja nikkelisulatto, rikkihappotehdas sekä lannoitetehdas. Kuparisulatto aloitti toimintansa Harjavallassa vuonna 1940 ja nikkelisulatto 20 vuotta myöhemmin. Metallien jalostuksessa ja käsittelyssä syntyy raskasmetalleja, joita on havaittu Harjavallan ja lähikuntien maaperässä huomattavia määriä (Jussila ja Jormalainen 1991). Kuparin (Cu) ja nikkelin (Ni) lisäksi tehtaat päästävät ilmaan arseenia (As), sinkkiä (Zn), lyijyä (Pb), kadmiumia (Cd), elohopeaa (Hg) ja rikkiä (S) (Kubin 1990, Jussila ja Jormalainen 1991). Alueen maaperässä on havaittu selvä raskasmetalligradientti tehtaalta poispäin mentäessä (Derome ja Lindroos 1998a, 1998b). Vielä 1990-luvun alussa Harjavalta ympäristöineen oli maamme pahimmin saastuneita alueita (Kubin ym. 2000), mutta 1990-luvun aikana päästöt alueella ovat huomattavasti vähentyneet tehtaiden teknisten parannusten ansiosta (Helmisaari 1998). Kohentunut tilanne on heijastunut muun muassa sammalten raskasmetallipitoisuuksiin (Kubin ym. 2000). Myös lintujen pesimämenestyksen on havaittu parantuneen päästöjen vähennyttyä (Eeva ja Lehikoinen 2000). Toisaalta vähentyneet päästöt eivät ole heijastuneet esimerkiksi havupuiden neulasten biomassaan tai puiden vuosikasvuun vuosien 1992 ja 1996 välillä (Mälkönen ym. 1999). Alue kuuluu eteläboreaaliseen havumetsävyöhykkeeseen. Valtapuuna on mänty (Pinus sylvestris L.), ja maasto on kuivaa ja suhteellisen heikkoravinteista (Mälkönen ym. 1999). Cajanderin (1949) luokittelun mukaan metsätyyppi vaihtelee alueella Vaccinumtyypistä Calluna-tyyppiin (Derome ja Lindroos 1998b). Pahiten saastuneilta alueilta aluskasvillisuus puuttuu lähes täysin. Vain eräät kasvit, kuten variksenmarja (Empetrum

15 13 nigrum L.) ja sianpuolukka (Arctostaphylos uva-ursi L.) pystyvät lisääntymään ja säilyttämään elinvoimaisia kasvustoja (Salemaa ja Vanha-Majamaa 1998). Tutkimuksessa oli käytössä 12 pönttöaluetta, jotka on perustettu vuosina Nakkilassa, Kiukaisissa ja Kokemäellä oli kussakin yksi tutkimusalue muiden sijaitessa Harjavallan kunnan alueella. Kullekin alueelle oli sijoitettu pönttöä. Alueita, jotka sijaitsevat alle neljän kilometrin päässä tehtaasta, kutsutaan tässä työssä saastealueeksi. Yli neljän kilometrin päässä olevat alueet kuuluvat tausta-alueeseen (Kuva 1.). Kuva 1. Harjavallan koealueet vuonna Maanmittauslaitos, lupa nro 829/MYY/04. Aineiston kopiointi ja muu laiton käyttö ilman Maanmittauslaitoksen lupaa on kielletty.

16 Ruokintakoe ja aineiston keruu Karotenoidiruokinta Pesimäkaudella pöntöt, joihin talitiaiset olivat tehneet pesän (n = 77 pesää, saastealue 35 + tausta-alue 42), tarkastettiin useaan kertaan viikossa. Munintavaiheessa pesillä käytiin kerran päivässä laskemassa munittujen munien määrä ja merkitsemässä uusin munittu muna yksilöllisellä koodilla. Jokaisesta pesästä kerättiin yksi muna talteen keltuaisen luteiinipitoisuuden määritystä varten. Koska muninnan edetessä keltuaisen karotenoidipitoisuus saattaa muuttua (Hõrak ym. 2002), munakeräys standardoitiin siten, että jokaisesta pesyeestä otettiin yhdeksäs muna talteen. Mikäli pesyekoko oli alle yhdeksän, viimeinen muna kerättiin talteen analysointia varten. Munankeltuaiset eroteltiin valkuaisista ja säilöttiin valolta suojattuna -22 C lämpötilassa. Kuoriutumisen jälkeen poikasilta mitattiin siiven pituus kuoriutumispäivän selvittämiseksi. Tarkka kuoriutumispäivä voitiin selvittää vertaamalla siiven pituutta iältään tunnettujen poikasten siipikasvukäyrään. Kolmen päivän iässä, juuri ennen lisäruokinnan aloittamista, poikaset jaettiin pesäkohtaisesti kahteen ryhmään siten, että kumpaankin ryhmään tuli samankokoisia yksilöitä. Tämän jälkeen suoritettiin arvonta: toisesta ryhmästä tuli käsittelyryhmä ja toisesta kontrolliryhmä. Käsittelyryhmälle syötettiin 0.1 ml karotenoidiliuosta päivässä (0.5 mg karotenoidia / 1 ml steriiliä vettä; F. Hoffmann-La Roche LTD, 5 % luteiinia ja 0.25 % zeaksantiinia). Kontrolliryhmä sai vastaavan määrän steriiliä vettä. Karotenoidiannos oli noin kolme-kahdeksankertainen verrattuna keskimääräiseen saantiin päivässä (Royama 1966, Partali ym. 1987, Fitze ym. 2003b). Pesyeitä kokeessa oli yhteensä 71 (saastealue 33 + tausta-alue 38). Ruokinta oli tärkeää aloittaa kuoriutumisajankohtaan nähden aikaisin, sillä talitiaisen höyhenpuvun väritys saattaa määräytyä hyvin varhaisessa vaiheessa (Fitze ym. 2003b).

17 15 Ruokinta suoritettiin ruiskuttamalla vakioannos nestettä poikasen suuhun laboratorioruiskulla. Samalla poikaset punnittiin. Ruokinnan aloittamisesta lähtien poikaset saivat kahdeksaan ikävuorokauteen asti 0.1 ml lisäruokaa päivässä. Tämän jälkeen annos kaksinkertaistettiin, mutta samalla ruokintatiheyttä laskettiin (0.2 ml lisäruokaa joka toinen päivä). Kuuden päivän iässä poikaset rengastettiin laittamalla rengas eri koeryhmissä eri jalkaan. Seitsemän vuorokauden iässä poikasilta otettiin ulostusnäytteet (pesäkohtaisesti) raskasmetallipitoisuuksien analysointia varten. Ulosteiden on todettu olevan hyvä indikaattori raskasmetallien määrästä ravinnossa (Leonzio ja Massi 1989). Näytteet analysoitiin myöhemmin laboratoriossa Turussa (menetelmäkuvaus esitetty artikkelissa Eeva ym. 2004). Kun poikaset olivat yhdeksän vuorokauden ikäisiä, jokaisesta koepesästä valittiin satunnaisesti yksi poikanen kummastakin koeryhmästä verinäytteen ottoa varten (n = 60 pesyettä, saastealue 26 + tausta-alue 34). Siipisuonesta otettu näyte kerättiin heparinisoituihin kapillaariputkiin, ja niitä sentrifugoitiin viisi minuuttia (4000 rpm) plasman ja verisolujen erottamiseksi. Verisolujen ja plasman määrä mitattiin viivaimella kapillaariputkesta hematokriitin (verisolujen prosenttiosuus koko verestä) laskemista varten (Merilä ja Svensson 1995), ja plasma säilöttiin kylmälaukkuun laboratorioanalyyseja varten. Lisäruokintaa jatkettiin, kunnes poikaset olivat 14 vuorokauden ikäisiä. Höyhenpuvun valokuvauksen yhteydessä, 16 vuorokauden iässä, poikasilta otettiin rinnan keltaisesta höyhenyksestä näytteet luteiinianalyyseja varten Värityksen mittaaminen ja digitaalinen analysointi Talitiaisen poikasten höyhenpuku kehittyy valmiiksi juuri ennen pesästä lähtöä. Tavallisesti poikaset lähtevät pesästä noin päivän ikäisenä (Gosler 1993). Koska eliöiden väritystä ei voida objektiivisesti mitata ihmissilmällä (Endler 1990), poikasten

18 16 höyhenpuku valokuvattiin värityksen digitaalista mittausta varten. Poikaset olivat tällöin 16 vuorokauden ikäisiä. Molemmista koeryhmistä arvottiin yksi poikanen kuvaan. Välineistöön kuuluivat harmaa taustalevy ja värikarttasarja (Tikkurila Oy 2004), joka oli asetettu kuvattavien poikasten viereen taustalevylle. Poikaset asetettiin makaamaan vatsapuoli ylöspäin taustalevyn päälle, ja kuva pyrittiin ottamaan yhdenmukaisissa valaistusolosuhteissa standardikorkeudelta (Kuva 2.). Kuvaus suoritettiin Nikon Coolpix digitaalikameralla (Nikon Corporation 2003). Kuva 2. Poikasten höyhenpuku valokuvattiin keltaisuuden mittausta varten. Lauri Nikkinen Digitaalikuvat analysoitiin käyttämällä Corel Photo-Paint 12 -kuvankäsittelyohjelmaa (Corel Corporation 2003). Poikasen kupeiden molemmilta puolilta rajattiin mahdollisimman suuri ala keltaista höyhenystä käyttämällä ohjelmatyökalua (Eyedropper tool), joka laskee värityksen keskiarvot (CMYK-väriavaruudessa) rajatulta

19 17 alalta. Molemmilta kupeilta saatu keltaisuusarvo (Y) tallennettiin muistiin. Tämä tehtiin sekä käsittely- että kontrolliryhmän poikasille. Myös värilaatan (K302, Tikkurila Oy 2004) keltaisuus (Y s ) mitattiin samalla menetelmällä. Koska kuvanottohetken valaistusolosuhteet ovat voineet vaikuttaa kuvan väreihin, kaikille kuville laskettiin korjattu keltaisen värin arvo (Y c ). Kaikki kuvat standardoitiin käyttämällä kuvista laskettujen värilaattojen keltaisen (Y s ) värin keskiarvoa. Mikäli kuvasta saatu kontrollilaatan keltaisuus oli pienempi kuin kaikkien kontrollilaattojen keskiarvo, höyhenpuvun keltaisuusarvoa nostettiin vastaavassa suhteessa (Y c = Y + (((Y s - Y s ) / Y s )) HY)). Mikäli kontrollilaatan arvo oli suurempi, keltaisuusarvoa pienennettiin vastaavassa suhteessa Aineiston tilastolliset käsittelyt Aineistojen tilastollinen käsittely suoritettiin SAS-tilasto-ohjelmalla (versio 8.2, SAS Institute Inc. 2001). Koeasetelmasta ja tutkimuskysymyksestä johtuen malleissa oli yleensä mukana kaksi päävaikutusta: koeryhmä ja alue, jotka molemmat sisälsivät kaksi tasoa (käsittely vs. kontrolli; saaste vs. tausta). Lisäksi malleissa oli mukana pesäpaikka (pönttö) satunnaistekijänä, koska voidaan ajatella, että linnut olivat valinneet pesäpaikkansa suuresta joukosta mahdollisia pesäpaikkoja, eikä tekijä näin ollen ollut tutkijan kontrolloitavissa. Edellä mainittujen tekijöiden johdosta mallit analysoitiin SAS:n MIXED-proseduurilla (ANOVA-malli) lukuun ottamatta elossasäilyvyysmalleja, jotka analysoitiin vastemuuttujan jakaumatyypistä johtuen GENMOD-proseduurilla (yleistetty lineaarinen malli). Merkitsevyystaso oli kaikissa testeissä Koska sekamallien (MIXED-proseduuri) ehdoton edellytys on mallin jäännösvaihtelun normaalijakautuneisuus (Littell ym. 1996), jouduttiin joissakin tapauksissa käyttämään

20 18 vastemuuttujana vasteen muunnettuja arvoja. Kaikissa tapauksissa joko logaritmimuunnos tai potenssimuunnos normalisoi residuaalien jakauman. Mallinvalinnassa edettiin monimutkaisesta yksinkertaiseen, testaten ensin päävaikutusten yhdysvaikutukset ja jättäen ei-merkitseviä yhdysvaikutuksia malleista pois. Useissa malleissa oli mukana myös kovariaatteja, joista osa jätettiin lopullisista malleista pois. Mallin laatua mitattiin Akaiken luvun perusteella (AICc). Poikasten elossasäilyvyyttä tarkasteltaessa vastemuuttujana oli lentoonlähtötodennäköisyys. Tällä tarkoitetaan todennäköisyyttä, jolla kuoriutunut poikanen selviää lentopoikaseksi. Koska poikaset voitiin jakaa koeryhmiin vasta kolmen vuorokauden ikäisinä, koostui lentoonlähtötodennäköisyys lentopoikasmäärän ja kolmen vuorokauden ikäisten poikasten määrän suhteesta. Analyysia varten aineistosta poistettiin pesät (n = 19), jotka olivat tuhoutuneet ihmisen vaikutuksesta, pöntön rikkoutumisen takia tai yllättävän kylmän säätilan vuoksi. Koska ulostenäytteet jouduttiin yhdistämän pesäkohtaisesti, jotta näyte olisi riittävän suuri, tarkasteltiin raskasmetallipitoisuuksien vaikutusta elossasäilyvyyteen pesäkohtaisesti. Pitoisuudet muunnettiin tilastollisia testejä varten logaritmisiksi, jonka jälkeen tärkeimmille raskasmetalleille (As, Cd, Cu, Ni, Pb, Zn) suoritettiin pääkomponenttianalyysi. Tässä mallissa ensimmäisellä pääkomponentilla (PC1) selitettiin lentoonlähtötodennäköisyydessä esiintyvää vaihtelua. Pääkomponentti (PC1) kuvaa hyvin raskasmetallipitoisuuksien yhteisvaihtelua ja sitä käytettiin yleisesti eri malleissa kovariaattina. Useimmiten se jätettiin lopullisista malleista kuitenkin pois, sillä se ei selittänyt vastemuuttujissa esiintyviä vaihteluja.

21 19 Poikasten kuntoeroa mitattiin painon ja verinäytteistä mitatun hematokriitin avulla. Linnuilla painoa on yleisesti käytetty kuntomittarina (van Noordwijk ym. 1988, Alatalo ym. 1990, Haywood ja Perrins 1992, Potti ym. 1999) ja on havaittu, että poikasten lentoonlähtöpainolla on vaikutusta elossasäilymiseen (Tinbergen ja Boerlijst 1990, Gebhardt-Henrich ja Richner 1998) ja hedelmällisyyteen tulevaisuudessa (Haywood ja Perrins 1992). Koska paino mitattiin poikasaikana toistuvasti samoista yksilöistä, analysoitiin painon koeryhmä- ja aluekohtaisia eroja toistettujen mittausten varianssianalyysillä (Ranta ym. 1994). Mallinnettava kovarianssirakenne valittiin pienimmän Akaiken luvun perusteella, ja tässä mallissa käytettiin kovarianssirakenteen oletusarvoa. Hematokriittia on useissa tutkimuksissa käytetty lintujen ravitsemus- ja terveydentilan mittarina (esim. Jones 1983, Svensson ja Merilä 1996, Potti ym. 1999, Piersma ym. 2000). Lyhyellä aikavälillä hematokriitti saattaa kertoa kyvystä kestää rasitusta, mikä heijastuu veren parantuneeseen hapenkuljetuskapasiteettiin (Hõrak ym. 1998). Hematokriittianalyysi suoritettiin kovarianssianalyysinä MIXED-proseduurilla. Aineistosta jouduttiin poistamaan yksi hematokriittiarvo, sillä yksi mitattu poikanen oli huomattavasti muita poikasia kevyempi (lähes kuolemaisillaan), ja tämä saattoi vääristää analyysin tulosta. Mallissa oli mukana päävaikutusten lisäksi verinäytteenoton kellonaika ja kovariaattina linnun paino päivää aikaisemmin. Tässä mallissa vastemuuttujan muunnoksilta vältyttiin. Plasman ja höyhenpuvun luteiinimääriä ja digitaalikuvista saatuja keltaisuusarvoja tarkasteltiin myös ANOVA-malleina. Munien luteiinipitoisuus oli aluksi malleissa mukana kovariaattina, mutta se jätettiin lopullisista malleista pois. Lisäksi

22 20 värianalyysissä mukana oli aluksi poikasten määrä pesässä mutta lopullisesta mallista se jätettiin pois. Plasman luteiinia tarkastelevassa mallissa oli mukana myös näytteenoton kellonaika. Lisäksi analysoitiin luteiinipitoisuuksien ja höyhenpuvun keltaisuuden väliset korrelaatiot ja poikasten painon vaikutus väriin. 3. Tulokset 3.1. Ulosteiden raskasmetallipitoisuudet Harjavallan alueen talitiaisten ulosteiden raskasmetallipitoisuudet olivat tässä tutkimuksessa samankaltaisia kuin alueella edeltävinä vuosina suoritetuissa tutkimuksissa on havaittu (esim. Eeva ja Lehikoinen 1996). Saastealueen pitoisuudet olivat useimpien mitattujen raskasmetallien osalta merkitsevästi korkeammat kuin tausta-alueen pitoisuudet (Taulukko 1.). Arseenin, lyijyn, kuparin ja nikkelin pitoisuudet saastealueella olivat huomattavan korkeat verrattuna tausta-alueen pitoisuuksiin. Alumiinin, elohopean ja sinkin pitoisuuksissa ei ollut alueiden välistä eroa.

23 21 Taulukko 1. Talitiaisen poikasista pesäkohtaisesti mitattujen ulosteiden raskasmetallipitoisuuksien keskiarvot keskivirheineen (ppm=mg/kg) ja ANOVA-testin tulokset. Metalli Alue n ka SE df F P Al saaste , tausta As saaste , <.0001 tausta Cd saaste , tausta Cu saaste , <.0001 tausta Hg saaste , tausta Ni saaste , <.0001 tausta Pb saaste , tausta Zn saaste , tausta Merkkien selitykset: n = näytteiden määrä, ka = keskiarvo, SE = keskiarvon keskivirhe, df = vapausasteet, F = testisuure, P = testin tulos Elossasäilyvyys Tausta-alueella kasvaneiden poikasten todennäköisyys säilyä elossa pesäpoikasesta lentopoikaseksi oli suurempi kuin saastealueen poikasilla (Taulukko 2.; ANOVA, n = 112, χ 2 1,108 = 6.12, P = ). Karotenoidien lisäruokinnalla ei ollut vaikutusta pesäpoikasaikaiseen selviytymiseen, vaikkakin käsittelyryhmän todennäköisyys selvitä lentopoikaseksi oli hieman suurempi kuin kontrolliryhmän (ANOVA, n = 112, χ 2 1,108 = 1.06, P = ). Käsittelyn vaikutus oli sekä saaste- että tausta-alueella samanlainen (yhdysvaikutus ei-merkitsevä; ANOVA, n = 112, χ 2 1,108 = 0.19, P = ). Raskasmetalleilla (PC1) ei ollut vaikutusta poikasten lentoonlähtötodennäköisyyteen (ANOVA, n = 54, χ 2 1,52 = 2.18, P = ).

24 22 Taulukko 2. Alueen ja koeryhmän vaikutus poikasten lentoonlähtötodennäköisyyteen ja ANOVA-mallin antamat testin tulokset. luottamusvälit Lentoonlähtötodennäköisyys Ryhmä n td. 95 % saaste tausta käsittely kontrolli saaste+käsittely saaste+kontrolli tausta+käsittely tausta+kontrolli Selittäjät df χ 2 alue 1, koeryhmä 1, alue*koeryhmä 1, P Poikasten kunto Toistomittausanalyysin perusteella poikasten painot eivät eronneet koeryhmien välillä (ANOVA, F 1,355 = 0.29, P = ). Sen sijaan saaste- ja tausta-alueen välillä painoero oli tilastollisesti merkitsevä molemmissa mitatuissa poikasajan vaiheissa (Kuva 3., ANOVA, F 1,355 = 26.56, P < ). Tausta-alueen poikaset olivat kahdeksan vuorokauden iässä 13.8 % painavampia kuin saastealueen poikaset. 16 vuorokauden iässä tausta-alueen poikaset painoivat 7.6 % enemmän kuin saastealueen poikaset.

25 Saaste Tausta Paino (g) Ikä (vrk) Kuva 3. Toistomittausanalyysin tuottamat poikasten painokeskiarvot ja näiden 95 % luottamusvälit saaste- ja tausta-alueen välillä kahdessa eri poikasvaiheessa. Kuvan arvot ovat takaisintransformoituja. Poikasten keskimääräinen hematokriittiarvo oli ± SE 0.46 (alueet ja ryhmät yhdistetty). Koeryhmäkohtaisessa tarkastelussa ei koeryhmien hematokriittitasoissa ollut eroa (ANCOVA, F 1,54.9 = 2.26, P = ). Myöskään aluekohtaisessa tarkastelussa poikasten hematokriittiarvot eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi (ANCOVA, F 1,56.9 = 0.03, P = ), ja lisäksi mittausajankohdalla (kellonaika) ei ollut vaikutusta veren hematokriittiarvoon (ANCOVA, F 1,52.8 = 1.51, P = ). Ainoa tekijä, joka mallin mukaan vaikutti hematokriittiin, oli poikasten paino (Kuva 4., ANCOVA, F 1,92.4 = 11.37, P = ).

26 Käsittely Kontrolli 45 Hematokriitti (%) Paino (g) Kuva 4. Poikasten painon vaikutus veren hematokriittitasoon. Kuvaan on piirretty hematokriitin kehitystä painon suhteen kuvaavat suuntaviivat Luteiinianalyysit ja höyhenpuvun väritys Pesiltä kerättyjen munien luteiinipitoisuuksissa ei ollut alueiden välistä eroa (F 1,66 = 0.18, P = ). Plasman ja höyhenpuvun luteiinipitoisuuksissa lisäruokinnan vaikutus näkyi selvästi (Kuva 5.). Molemmissa analyyseissa koeryhmien välinen ero oli huomattava ja tilastollisesti merkitsevä (Taulukko 3.). Plasman luteiinipitoisuudet olivat merkitsevästi korkeammat saastealueen poikasilla (F 1,55.9 = 6.77, P = ), ja pitoisuuksiin vaikutti myös näytteenoton kellonaika (Taulukko 3.); myöhemmin päivällä mitatuilla linnuilla oli enemmän luteiinia veressään kuin aikaisin aamulla mitatuilla linnuilla (F 1,56 = 14.19, P = ). Käsittelyryhmien keskiarvot erosivat alueiden välillä merkitsevästi (F 1,56 = 4.44, P = ), mutta kontrolliryhmien välinen ero ei ollut merkitsevä (F 1,55 = 3.13, P = ). Koeryhmän ja alueen yhdysvaikutus ei ollut merkitsevä, mikä tarkoittaa, että vaste ruokintakäsittelyyn oli samanlainen molemmilla alueilla (F 1,56.4 = 0.01, P = ).

27 Plasman luteiinipitoisuus Luteiini (µg/ml) Saaste Tausta 60 Höyhenten luteiinipitoisuus Luteiini (µg/g) Saaste Tausta 90 Höyhenpuvun keltaisuus Keltaisuus (Y c %) Saaste Tausta Kuva 5. ANOVA-mallien antamat talitiaisten poikasten plasman ja höyhenpuvun luteiinipitoisuuden keskiarvot sekä höyhenpuvun keltaisuuden keskiarvot 95 % luottamusväleillä. Käsittely Kontrolli

28 26 Höyhennäytteiden luteiinipitoisuudet olivat käsittelyryhmässä suuremmat taustaalueella, kun sitä vastoin kontrolliryhmän poikasilla pitoisuudet olivat korkeammat saastealueella (Taulukko 3.). Alueiden välinen ero ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä (F 1,55.9 = 0.09, P = ). Tämän lisäksi koeryhmän ja alueen yhdysvaikutus ei ollut merkitsevä (F 1,53.9 = 3.22, P = ), mikä osoittaa, että vaste käsittelyyn oli samanlainen molemmilla alueilla. Plasman luteiinipitoisuudet korreloivat höyhenten luteiinpitoisuuksien kanssa kontrolliryhmän osalta (n = 55, r = 0.47, P = ), mutta käsittelyryhmässä korrelaatiota ei ollut (n = 55, r = -0.12, P = ). Taulukko 3. Talitiaisen poikasten luteiini- ja keltaisuusmallien (ANCOVA, ANOVA) tulokset. Plasman luteiini Selittäjät df F alue 1, koeryhmä 1, alue*koeryhmä 1, klo 1, Höyhenten luteiini Selittäjät df F alue 1, koeryhmä 1, alue*koeryhmä 1, Höyhenpuvun keltaisuus (Y c ) Selittäjät df F alue 1, koeryhmä 1, alue*koeryhmä 1, P < P < P < Digitaalikuvista määritettyjen väriarvojen analyysin perusteella käsittelypoikaset olivat merkittävästi keltaisempia kuin kontrolliryhmän poikaset (Taulukko 3., Kuva 5.). Lisäksi tausta-alueen poikaset olivat hieman keltaisempia kuin saastealueen poikaset, mutta ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (F 1,55.3 = 2.79, P = ). Alueittain vertailtuna ryhmät eivät eronneet toisistaan (saaste+käsittely vs. tausta+käsittely: F 1,55 = 1.53, P = ; saaste+kontrolli vs. tausta+kontrolli: F 1,54 = 2.79, P = ). Poikasten paino ei vaikuttanut höyhenpuvun keltaisuuteen (F 1,105 = 0.84, P = ).

29 27 Plasman ja höyhenten luteiinipitoisuudet korreloivat positiivisesti värityksen kanssa (plasma: n = 113, r = 0.33, P = ; höyhen: n = 113, r = 0.52, P = ). Raskasmetallipitoisuuksien (PC1) ja värityksen välillä ei ollut korrelaatiota (käsittely: n = 54, r = -0.05, P = ; kontrolli: n = 53, r = -0.19, P = ). Yksittäin tarkasteltuna ainoastaan lyijy korreloi negatiivisesti värityksen kanssa kontrollipoikasilla (n = 55, r = -0.37, P = ); lyijypitoisuuden kasvaessa poikasen väritys vaaleni. 4. Tulosten tarkastelu Tutkimuksen tarkoituksena oli pyrkiä selvittämään, johtuuko alueella aikaisemmin tehdyssä tutkimuksessa (Eeva ym. 1998) havaittu talitiaisen poikasten värityksen vaaleneminen saastegradientilla raskasmetallien aiheuttamasta oksidatiivisesta stressistä. Samalla oli tarkoituksena tutkia, mitä vaikutuksia talitiaisten värityksen määräytymisessä merkittävien karotenoidien lisäruokinnalla on talitiaisen poikasten elossasäilyvyyteen, kuntoon, terveydentilaan ja väritykseen Elossasäilyvyys ja kunto Kokeessa suoritetulla karotenoidien lisäruokintakäsittelyllä ei ollut vaikutusta talitiaisten poikasten elossasäilyvyyteen pesäpoikasaikana: poikasten todennäköisyys selvitä lentopoikaseksi (lentoonlähtötodennäköisyys) oli käsittely- ja kontrolliryhmässä yhtä suuri. Käsittelyllä ei myöskään ollut vaikutusta poikasten kuntoon, sillä poikasten painoissa ja hematokriittitasoissa ei havaittu käsittelystä johtuvia eroja. Aluetekijän vaikutus poikasten tilaan oli huomattava: tausta-alueen poikasten lentoonlähtötodennäköisyys ja paino olivat suuremmat kuin saastealueen poikasten.

30 28 Tulokset eivät anna tukea ajatukselle, että karotenoideilla olisi merkittävä vaikutus poikasten menestymiseen pesäpoikasaikana karotenoidien antioksidanttivaikutusten takia. Tutkimuspopulaatiossa karotenoidien puute ei suoraan selitä poikasten menestymistä pesäpoikasaikana. Poikasten kasvu on erittäin nopeaa ja Harjavallassa ne altistuvat ravinnon kautta raskasmetalleille. Nopean kasvun, aliravitsemuksen ja raskasmetallialtistuksen on useilla eliölajeilla todettu lisäävään elimistön oksidatiivista stressiä (Halliwell 1996, Ercal ym. 2001). Karotenoidien on todettu useissa tutkimuksissa toimivan elimistön solujen antioksidanttijärjestelmässä pyydystäen, neutraloiden ja muuttaen vapaita radikaaleja vaarattomampaan muotoon ja täten vähentäen elimistön kokemaa oksidatiivista stressiä (Ames 1983, Burton 1989, Krinsky 1989 ja 1998, Edge ym. 1997, Møller ym. 2000). On selvää, että nopea kasvu ja raskasmetallien kertyminen ravinnon kautta poikasten elimistöön voivat aiheuttaa fysiologisia muutoksia ja oksidatiivista stressiä, mikä saattaa heikentää poikasten tilaa ja vähentää mahdollisuuksia selvitä pesäpoikasajasta hengissä. Kokeessa ei kuitenkaan kyetty osoittamaan, että karotenoidin lisäruokinnalla olisi vaikutusta poikasten todennäköisyyteen säilyä elossa pesäpoikasaikana ja että tämä vaikuttaisi poikasten kuntoon. Tähän saattaa olla syynä se, että poikaset saavat ravinnon kautta riittävästi karotenoideja nopean kasvun ja raskasmetallialtistuksen aiheuttaman oksidatiivisen stressin hallintaan. Tällöin vapaiden radikaalien syntyminen aineenvaihdunnan kautta ei riitä siihen, että oksidatiivinen stressi vaarantaisi poikasten terveyttä. Tämä tarkoittaa sitä, että myös saastealueella ravinnosta saatavien karotenoidien määrä riittää ylläpitämään antioksidanttikoneistoa, mutta karotenoideja ei välttämättä enää riitä höyhenpuvun värityksen muodostamiseen (Eeva ym. 1998). Mikäli karotenoidien määrä ravinnossa on riittävä ylläpitämään perustoimintoja, päädymme tulokseen, jossa

31 29 karotenoidien määrän nostaminen ravinnossa (lisäruokinta) ei paranna poikasten elossasäilyvyyttä tai vaikuta niiden kuntoon. Karotenoidien vaikutuksia pesäpoikasten menestymiseen on tutkittu huomattavan vähän. Aivan viime aikoina Fitze ym. (2003a, 2003b) ovat raportoineet vastaavan kaltaisista tuloksista talitiaisen poikasille tehdyistä lisäruokintakokeista. Tutkijat havaitsivat, että lisäruokinnalla ei ollut vaikutusta poikasten kasvuun, kuntoon tai elossasäilyvyyteen. He päättelivät, että karotenoideilla voi olla hyödyllisiä vaikutuksia poikasten tilaan, mutta ruokinnan vaikutus peittyy ympäristössä esiintyvän varianssin alle. Lisäksi heidän mukaansa karotenoidit saattavat stimuloida ainoastaan immuunijärjestelmää, eivätkä niinkään vaikuta kasvuun tai terveydentilaan. Hematokriittiä on käytetty useissa tutkimuksissa terveydentilan ja kunnon mittarina (esim. Jones 1983, Svensson ja Merilä 1996, Potti ym. 1999, Piersma ym. 2000). Alhaiset hematokriittitasot (anemia) on yhdistetty muun muassa huonoon ravitsemustilaan (Jones 1983). Tutkimuksessa suoritetulla ruokintakäsittelyllä ei ollut vaikutusta poikasten hematokriittiarvoihin: ainoastaan paino selitti hematokriittiarvojen vaihtelua. Painavammilla poikasilla veren hematokriittitaso oli korkeampi. Tulos antaa viitteitä siitä, että hyvä ravitsemustila vaikuttaa poikasten hematokriittitasoihin. On myös mahdollista, että hematokriitti yksinkertaisesti muuttuu poikasen kehityksen mukaan. Ruokintakokeessa havaittiin, että poikasten pesimäympäristöllä oli suurempi vaikutus poikasten tilaan kuin karotenoidien lisäruokinnalla. Aikaisemmissa tutkimuksissa on havaittu, että Harjavallan ympäristössä esiintyvät korkeat raskasmetallipitoisuudet

32 30 aiheuttavat talitiaisen pesimämenestyksen alentumista (esim. Eeva ja Lehikoinen 1996). Letaalien, patogeenisten ja oksidatiivista stressiä lisäävien vaikutusten lisäksi raskasmetalleilla onkin yleisesti havaittu olevan epäsuoria vaikutuksia lintujen pesintään. Esimerkiksi raskasmetallien aiheuttama loisten määrän lisääntymisen (Eeva ym. 1994) ja ravinnon vähenemisen (Graveland 1990, Hörnfeld ja Nyholm 1996) on todettu aiheuttavan poikasten kasvun hidastumista ja pesimämenestyksen alentumista (Eeva ja Lehikoinen 1996). Ravinnon määrä onkin eräs tärkeimpiä ympäristömuuttujia, mikä vaikuttaa keskeisesti poikasten menestymiseen pesäpoikasaikana (esim. Quinney ym. 1986, Martin 1987). Tässä tutkimuksessa havaittu talitiaisen poikasten kunto- ja elossasäilyvyysero saastegradientilla (alueiden välillä) on yhtenevä alueella aikaisemmin suoritettujen tutkimusten kanssa (esim. Eeva ja Lehikoinen 1996). Syynä poikasten heikompaan kuntoon ja menestykseen saastealueella on ehdotettu olevan raskasmetallien aiheuttamat muutokset poikasten ravinnossa (Eeva ja Lehikoinen 1996). Kokeen tulosten perusteella voidaan olettaa, että ravinnon määrä on merkittävämpi poikasten kasvuun vaikuttava tekijä kuin raskasmetallien aiheuttama oksidatiivinen stressi. Stressi voi mahdollisesti lisätä kuolleisuutta, mutta kuten koe osoittaa, karotenoidien lisäruokinta ei kompensoi ravinnon vähyydestä johtuvaa poikasten menestymiseroa alueiden välillä. Nopean kasvun aikana ravinnon merkitys korostuu, sillä aineenvaihdunta on kiivasta ja perustoimintojen ylläpitämiseen ja kehittämiseen tarvitaan runsaasti energiaa. Toisaalta tutkimusaineiston pienuus saattaa osaltaan vaikuttaa siihen, että kokeessa ei kyetty osoittamaan karotenoidien positiivista vaikutusta poikasten menestymiseen. Lisäksi saattaa olla, että talitiaisten paikkauskollisuuden vuoksi saastealueen linnut ovat sopeutuneita sietämään saasteiden aiheuttamaa stressiä. Tämä stressinsietokyky periytyy myös näiden lintujen poikasille ja tällöin antioksidanttien puutostila ei välttämättä vaikuta poikasten menestymiseen.