Kipu ja endokannabinoidijärjestelmä

Transkriptio

1 Kandidaatintutkielma Kipu ja endokannabinoidijärjestelmä Riikka Huttunen Oulun yliopisto Biokemian ja molekyylilääketieteen tiedekunta

2 Sisällysluettelo Käytetyt lyhenteet Sisällys I KIRJALLISUUSTUTKIELMA Lyhenteet Kipu Kannabinoidijärjestelmä Toiminta Kannabinoidireseptorien rakenne Ligandien rakenne ja toiminta Signaalikaskaadi Lääkekäyttö Lähteet II liite: TIEDETTÄ POPULARISOIVA ESITYS Otsikko: Kipu ja endokannabinoidijärjestelmä Toteutus: Posteri 2

3 Lyhenteet AEA 2-AG N-arakinodyylietanoliamiini, Anandamidi 2-arakidonyyliglyseroli CB1 Kannabinoidireseptori 1 CB2 Kannabinoidireseptori 2 ATP FAAH MAGL THC GABA Adenosiinitrifosfaatti Rasvahappoamidihydrolaasi Monoasyyliglyserolilipaasi Δ 9 -tetrahydrokannabinoli Gamma-aminovoihappo 3

4 1. Kipu Kipu on subjektiivinen kokemus, joka mielletään epämiellyttävänä tunteeksi, mutta on hengissä säilymisen kannalta välttämätön aistimus. Kipusignaali muuttuu tuntemukseksi vasta aivoissa, mikä tarkoittaa, ettei kipuhermojen aktivoitumisesta välttämättä seuraa subjektiivista kiputuntemusta. Kipu muodostuu muistakin ulottuvuuksista kuin hermojen fysiologisesta stimuloinnista. Kipu voi olla luonteeltaan akuuttia, jolloin se toimii biologisena varoitussignaalina. Hermosolujen impulssia pystytään mittamaan, mutta tämä on huono mittari subjektiiviselle kipukokemukselle. Tyypillisesti kipua kartoittaessa yritetään arvioida kivun tiheyttä ja voimakkuutta sanallisesti tai numeerisella asteikolla. Yhdysvalloissa kartoitettiin lähes 9000 yksilöä tutkittaessa kiputilojen yleisyyttä ja voimakkuutta. Tutkimukseen osallistuneita pyydettiin arvioimaan viimeisen kolmen kuukauden aikana kokemiensa kiputilojen yleisyyttä ja intensiteettiä. Yli puolet, 55,7 %, raportoi tunteneensa jonkinlaista kipua viimeisen kolmen kuukauden aikana. Näistä suurin osa, 23,9 %, oli lievää kipua satunnaisina päivinä. Kroonisesta jokapäiväisestä kivusta kärsi 11,2 % vastaajista, joista 4,6 % luonnehti kipuaan todella intensiiviseksi. (Nahin 2015) Krooninen kipu heikentää elämänlaatua merkittävästi. Se on yhdistetty masennukseen, ahdistuneisuuteen sekä heikentyneisiin kognitiivisiin toimintoihin (Bushnell et al. 2015). Pitkäaikaisesta kivusta kärsivillä potilailla on myös vähemmän harmaata ainetta aivoissa verrattuna terveisiin yksilöihin. Nämä muutokset pystyttiin osoittamaan johtuvan nimenomaan kivusta, sillä aivojen muutokset korjaantuivat, mikäli kroonisen kivun määrä väheni. (Davis & Moayedi 2013) Kipua välittäviä hermoja kutsutaan nosiseptoreiksi. Nosiseptoreita löytyy laajalti ihosta, luista, lihaksista, useimmista sisäelimistä sekä verisuonista ja sydämestä. Ainoa poikkeus on aivot, joissa nosiseptoreita ei ole ollenkaan. (Bear et al. 2007) Kipua ja kosketusta välittävät eri hermot, jotka poikkeavat toisistaan niin rakenteellisesti läpimitaltaan, terminoitumispisteissään että hermostolliselta reitiltään. Kosketusta välittävissä hermoissa, pääasiassa Aβ-tyypin, hermopäätteissä on erikoistuneet rakenteet kun taas kipua välittävissä hermoissa hermopäätteet ovat vapaat. Aα ja Aβ-hermojen läpimitta on myös paksumpi verrattuna Aδ ja C-hermoihin. Aβ-hermot terminoituvat selkäytimen takajuureen, kun Aδ- ja C- hermot jatkavat Lissauerin alueen läpi päättyen substantia gelatinosaan. (Bear et al. 2007) Selkäytimen harmaa aine voidaan jaotella edelleen laminoihin I-X. Aδ-hermot terminoituvat kerroksiin I, II ja V, ja C-hermot pääasiassa I ja II-kerroksiin, mutta viskeraalisissa C-hermoissa terminoitumispaikka voi olla myös kerroksissa V ja X (Kandel et al. 2013). 4

5 Kipusignaali kulkee somatosensoriselle korteksille spinotalamista reittiä pitkin. Huomionarvoista on myös, että kosketussignaali kulkee kehossa ipsilateraalisesti, samanpuoleisesti, mutta kipusignaalit kontralateraalisesti. Kipuaistimus siirtyy selkäytimen kautta haaroittumatta välissä talamukselle ja siitä eteenpäin somatosensoriselle korteksille, jossa signaali tulkitaan kivuksi. (Bear et al. 2007) Nosiseptisen vasteen aikaansaaminen vaatii muutosta lämpötilassa, paineessa, hapenpuutteessa tai kemiallisessa ärsytyksessä. Vaikka useat nosiseptorit ovat polymodaalisia kipupäätteitä, jolloin ne voivat depolarisoitua mistä tahansa edellämainituista ärsykkeistä, osa hermoista on erikoistunut tietyntyyppisiin ärsykkeisiin selektiivisesti. (Bear et al. 2007) Selektiivisiin nosiseptoreihin kuuluu lämpö-, kemialliset ja mekaaniset nosiseptorit. Lämpönosiseptorit ovat erikoistuneet kylmän ja kuuman aistimiseen. Kemialliset nosiseptorit reagoivat erilaisiin kemiallisiin ärsykkeisiin kuten mastosolujen vapauttamaan histamiiniin ja mekaaniset nosiseptorit ovat erikoistuneet paineen muutoksiin. Erityisesti C-hermot ovat selektiivisiä histamiinille. (Bear et al. 2007) Fyysisen vaurion sattuessa rikkoutuneista hermosoluista vapautuu soluvälitilaan K + -ioneja, ATP:tä ja proteaaseja. Solun ulkopuolisen kaliumkonsentraation muutos saa aikaan depolarisaation ympäröivissä hermosoluissa. ATP edesauttaa aktiopotentiaalien syntyä kiinnittymällä ATPkytkettyihin ionikanaviin, joka muuttaa hermosolujen membraanipotentiaaleja. Soluista vapautuvat proteaasit hajottavat soluvälitilassa olevaa kininogeenia bradykiniiniksi, joka herkistää vaurioalueella olevia nosiseptoreita depolarisoitumaan herkemmin. Nosiseptorien herkkyyteen vaikuttavat myös solukalvon lipideistä entsymaattisesti hajotetut prostaglandiinit. Hermopäätteiden granuloihin on varastoitu substance P peptidiä, joka vapautuu soluvälitilaan mikäli hermosolu saa jatkuvaa aktiopotentiaalia. Substance P:tä vapautetaan myös nosiseptoreiden vapaista hermopäätteistä siinäkin tapauksessa että vaurio tapahtuu jossain muualla kuin kohdealueella. Substance P:n vapautuminen stimuloi verisuonten laajentumista sekä saa mastosolut vapauttamaan histamiinia soluvälitilaan, mikä aiheuttaa turvotuksen vaurioalueella. (Bear et al. 2007) Tässä tutkielmassa keskitytään nosiseptisen kivun mekanismeihin. 5

6 2. Kannabinoidijärjestelmä Endokannabinoidijärjestelmä on lipidiperusteinen välittäjäainejärjestelmä, jolla on moninaisia vaikutuksia kipuun (Fine & Rosenfeld 2013), syömiseen ja energia-aineenvaihduntaan (Di Marzo & Matias 2005), tunnetiloihin ja psykiatrisiin ongelmiin (Ashton & Moore 2011) sekä muistojen modulointiin (Morena & Campologno 2014) ja jopa uni-valverytmiin (Prospéro-García et al. 2016). Kannabinoidijärjestelmällä on myös yhteyksiä endorfiinijärjestelmään sekä välittäjäaine GABA:n (Gamma-aminovoihappo) ja glutamaatin sekä dopamiinin (Oleson & Cheer 2012) vapautumiseen hermosoluista. Kannabinoidijärjestelmään kuuluvat kannabinoidireseptorit CB1 ja CB2 ja niiden ligandit anandamidi ja 2-arakidonyyliglyseroli (2-AG) (Kuva 1), sekä ligandien metaboliasta vastaavat entsyymit. Kannabinoidiligandit voivat kuitenkin aktivoida myös muita reseptoreja lueteltujen CB1- ja CB2-reseptoreiden lisäksi. Näihin reseptoreihin kuuluvat TRPV1 ja GPR18 ja GPR55. Kuva 1. Anandamidin ja 2-AG:n rakennekaavat. Vasemmalla on anandamidi ja oikealla 2-AG. TRPV1-reseptori (Transient Receptor Potential Vanilloid-1) kuuluu TRP-ionikanavaperheeseen, ja sen pääligandi on chilien poltteen tuova kapsaisiini. Anandamidi pystyy kiinnittymään TRPV1- reseptoreihin ja inhiboimaan hermosolujen depolarisaatioherkkyyttä. TRPV1- ja CB1-reseptorin välillä on todettu myös proteiini-proteiini interaktioita hiiren sarveiskalvon epiteelisoluissa. (Yang et al. 2013) GPR55-reseptori luokiteltiin alunperin orvoksi G-proteiinikytketyksi reseptoriksi, kunnes Ryberg ryhmineen osoitti että GPR55 kykenee sitomaan anandamidia, Δ 9 -THC:ta, kannabinolia, kannabidiolia sekä synteettisiä kannabinodireseptorien agonisteja. Anandamidi ja synteettinen kannabininoidiagonisti O1602 saivat soluissa aikaan ekspressiosignaalin, mutta samaa vastetta ei 6

7 saatu toisella yleisesti käytetyllä reseptoriagonistilla WIN55,212-2:lla. Vaikka kannabidiolilla on alhainen affiniteetti CB1- ja CB2-reseptoreihin, toimii se GPR55-reseptoreissa antagonistina. (Ryberg et al. 2007) GPR18-reseptori kuuluu lipidireseptoreihin, jotka sitovat ligandinaan ensisijaisesti N- arakidonyyliglysiiniä, mutta myös epätyypillistä kannabidiolia ja THC:tä. GPR18-reseptoreja on lokalisoitunut ainakin sarveiskalvon ja silmän sädekehän epiteelisoluissa hiirillä, ja reseptorien aktivointi laskee silmän intraokuraalista painetta. Koska N-arakidonyyliglysiini on anandamidin aineenvaihdunnan tuote ja CB1-reseptoreja on lokalisoitunut samoihin kudoksiin, GPR18-reseptorin ja kannabinoidijärjestelmän välillä voi olla yhteys. Caldwell kumppaneineen kuitenkin huomautti, että vaikka anandamidin määrä silmän etuosassa onkin huomattava, anandamidi voidaan metaboloida entsymaattisesti nopeammin kuin mitä se pystyisi sitoutumaan CB1-reseptoreihin. (Caldwell et al. 2013) Endokannabinoidijärjestelmä on pitkälti konservoitunut eläinkunnassa. Kirjallisuudessa on useita esimerkkejä in vivo -kokeista, joissa on käytetty mallieläiminä koiria, reesusapinoita sekä hiiriä. (Beardsley et al. 1987) Jopa yksinkertaisesta Hydrasta (Cnidaria) on tunnistettu kannabinoidireseptoreita sekä anandamidia ja anandimidin hajotukseen osallistuvia entsyymejä, joiden arvellaan vaikuttavan syöntivasteeseen. (De Petrocellis et al. 1999) CB1-reseptori karakterisoitiin alunperin rotan aivoista selektiivisellä agonistilla CP-55,940. Tällöin huomattiin myös kannabinoidireseptorin aktivoimisen inhiboivan adenylaattisyklaasia. (Devane et al. 1988) Reseptori kloonattiin ja ekspressoitiin onnistuneesti vuonna 1990 (Matsuda et al. 1990). Munro kumppaneineen raportoi vuonna 1993 kannabinoidireseptorista, jota ei ekspressoitu aivoissa vaan haiman makrofageissa. Tämä reseptori kykeni sitomaan anandamidin lisäksi kannabinolia, vaikka sen transmembraanialue poikkesi CB1-reseptorin vastaavasta 68:lla aminohapolla. Munro ryhmineen ehdotti tämän perusteella että aivojen kannabinoidireseptorista käytettäisiin nimeä CB1, jolloin uusi reseptori sai nimen CB2. (Munro et al. 1993) Ensimmäinen endokannabinoidi eristettiin sian aivoista. Eristetylle arakidonihapon etanoliamiinille annettiin nimeksi anandamidi sanskriitin ananda sanaa ( autuus ) mukaillen (Devane et al. 1992). 2-AG:ta ehdotettiin toiseksi endokannabinoidiksi, kun sen huomattiin aktivoivan samoja CB1- reseptoreja kuin anandamidi. Tutkimuksissa huomattiin myös, että 2-AG:ta tuotetaan ja vapautetaan hermosolujen synapseissa solunsisäisen kalsiumkonsentraation noustessa, mutta sen synteesireitti poikkeaa anandamidista ja sen affiniteetti CB1-reseptoriin on heikompi kuin anandamidilla. (Stella et al. 1997, Sugiura et al. 1995) 7

8 CB1-reseptorit ovat jakautuneet kehoon laajasti, joskin niiden pääasiallinen sijainti on keskushermostossa (Herkenham et al. 1991). CB1- reseptoreita esiintyy myös vähäisemmässä määrin sydämessä, keuhkoissa, luuytimessä, kateenkorvassa, nielurisoissa, lisämunuaisissa sekä naisilla kohdussa ja munasarjoissa sekä miehillä kiveksissä ja eturauhasessa (Galiegue et al. 1995). CB2- reseptoreita on pääasiassa immuunipuolustustuksesta vastaavissa kudoksissa haimassa, nielurisoissa ja kateenkorvassa. Rotilla kannabinoidireseptoreja on löytynyt myös aivokuorelta, käpyrauhasesta, tyvitumakkeesta, hippokampuksesta ja pikkuaivoista (Harkenheim et al. 1991). Kannabinoidireseptorien jakautuminen vaikuttaisi ohjaavan reseptoreiden välillä vallitsevaa hienoista erikoistumista. CB2-reseptoreja esiintyy suuremmissa määrin immuunipuolustuksesta vastaavissa soluissa. Näiden reseptorien aktivointi onkin yhteydessä tulehdusvasteiden säätelyssä toisin kuin CB1-reseptorien, jotka vaikuttavat aivoissa fysiologisiin vasteisiin. Endokannabinoidien eritystä on tutkittu aivojen makrofageilla, mikroglioilla. Mikrogliat ekspressoivat endokannabinoideja läheisten hermosolujen vaurioiden yhteydessä. Mikrogliat alkoivat myös jakaantua, mikäli 2-AG:n konsentraatiota nostettiin kasvatusmediassa. (Carrier et al. 2004) Kannabinoidien ekspressio hermosolujen vaurion yhteydessä viittaa niiden hermosoluja suojelevaan rooliin. Toisaalta mikrogliojen korkea määrä on tyypillistä Alzheimer- ja Parkinson-potilailla, joten näitä neurodegeneroivia sairauksia pystytään tulevaisuudessa ymmärtämään paremmin kannabinoidijärjestelmän tuntemuksen kautta. Ihmiset ovat käyttäneet Cannabis Sativa kasvin lehtiä ja kukintoja vuosituhansia kivunlievitykseen, ruokahalun parantamiseen, sekä myös päihtymiseen. Terapeuttisten ainesosien eristäminen ja lääkekehitys on olleet vauhdittamassa endokannabinoidijärjestelmän tutkimusta. Tällä hetkellä THC ja kannabidioli CBD ovat potentiaalisimmat ainesosat lääkekehitystä varten. Vuonna 2012 Saksassa oli lisensoitu yksi lääke MS-taudin hoitoon, joka sisälsi 1:1 suhteessa THC:tä ja CBD:tä tuotenimellä Nabiximols. (Grotenhermen et al. 2012) Yhdysvalloissa lääkekannabis on tällä hetkellä laillistettu 28:ssa osavaltiossa. 8

9 3. Toiminta Kannabinoidijärjestelmä säätelee elimistön fysiologisia toimintoja laajasti keskushermostossa ja immuunijärjestelmässä. Tämän kokonaisuuden muodostavat kannabinoidireseptorit, niiden ligandit ja näiden reseptorien stimuloinnin seurauksena aktivoituvat signalointireitit, jotka määrittävät solun käyttäytymistä. Endokannabinoidit stimuloivat CB1- ja CB2-reseptoreita. CB1-reseptorin kiderakenne selvitettiin vastikään. Vaikka kannabinoidireseptori kuuluukin G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin, sen rakenne on uniikki jopa valtavan proteiiniperheen keskellä. Rakenteen selvittäminen tarjoaa aivan uudenlaista tietoa endo- ja eksogeenisten kannabinoidien fyysisestä sitoutumismekanismeista. Endogeeniset kannabinoidiligandit anandamidi ja 2-AG syntetisoidaan solukalvojen fosfolipideistä entsyymaattisesti, ja lipofiilisinä molekyyleinä ne diffuntoituvat solukalvon läpi ekstrasellulaariseen tilaan. Reseptorin aktivoituaan anandamidi kuljetetaan takaisin sytosoliin hajotettavaksi. On vielä toistaiseksi epäselvää, onko 2-AG:lla samanlaista kuljetusmekanismia. Kannabinoidijärjestelmän medioima viestinvälitys tapahtuu retrogradisesti, jolloin vapautetut kannabinoidit kiinnittyvät presynaptisen hermon kannabinoidireseptoreihin ja vaimentavat näin hermosolujen toimintaa laskemalla neuraalista oskillaatiota ja vähentämällä siten vapautettujen välittäjäaineiden määriä. Tämä järjestelmä on on hyvin monimutkainen, sillä kannabinoidireseptoreja on sekä GABAergisissä että glutamaergisissä hermosoluissa, joten kannabinoidien nettovaikutus voi olla joko toimintaa kiihdyttävä tai vaimentava. Vaikka kannabinoidit vaimentaisivat hermosolujen toimintaa, ne pystyvät silti aktivoimaan useita solujen jakautumista ja kohtaloa sääteleviä signalointireittejä. Kannabinoidit kykenevät indusoimaan hermosoluihin myös pidempiaikaisia muutoksia. Hermosolut vapauttavat aktiopotentiaalin yhteydessä GABA:a ja glutamaattia, jotka ovat merkittäviä kehon inhiboivia ja kiihdyttäviä välittäjäaineita. Kun kannabinoidit muuttavat presynaptisen hermon aktiivisuutta, tämä ilmiö etenee dominomaisesti. Muut hermosolut mukautuvat myös muutoksiin ja puhutaankin hermosolujen plastisuudesta. Tämä on todettu esimerkiksi kannabinoidireseptoreja ekspressoivilla hippukampuksen hermosoluilla. (Abush & Akirav 2010) 9

10 3.1 Kannabinoidireseptorien rakenne Endokannabinoidijärjestelmään kuuluvat CB1- ja CB2-reseptori. CB1 ja CB2 ovat Gi/0- proteiinikytkentäisiä reseptoreja, jotka kuuluvat rodopsiinin tapaiseen luokan A/1 reseptoriperheeseen. Myös kolmannen kannabinoidireseptorien olemassaoloa epäillään, mutta tästä ei ole vielä tieteellistä konsensusta. CB1-reseptoria tuottaa CNR1-geeni, ja se koostuu 472:sta aminohaposta ja on molekyylimassaltaan 52,8 kda. CB2-reseptori on vastaavasti hieman pienempi aminohappoa ja molekyylimassaltaan 39,6 kda. Toistaiseksi vain CB1-reseptorin kiderakenne on selvitetty, mutta CB2-reseptorin rakenne olisi myös tieteellisen ymmärryksen vuoksi tärkeä selvittää. Pelkästään aminohapposekvenssin perusteella CB1- ja CB2-reseptorit jakavat vain 43 % samankaltaisuuden. (Shire et al. 1996). G-proteiinikytkentäiset reseptorit (GPCR) kuuluvat kehon yleisimpiin reseptorityyppeihin. Niillä kaikilla on yhteinen rakenne, jossa on seitsemän transmembraanista domeenia, johon ligandia sitova tasku muodostuu. G-proteiini koostuu 3 alayksiköstä: α, β ja γ. Reseptorin ollessa inaktiivinen α- alayksikköön on sitoutunut GDP. Ligandin kiinnityttyä reseptoriin α-alayksikkö dissosioituu G- proteiinikompleksista kun GTP sitoutuu alayksikön GDP:n tilalle. Jäljelle jääneet Gβ ja Gγ aktivoivat effektorientsyymejä, jotka säätelevät solunsisäisten toisiolähettien konsentraatioita. G-proteiini palautuu takaisin normaalitilaansa, kun α-alayksikön GTP hydrolysoidaan GDP:ksi, jolloin G- proteiinitrimeeri voi muodostua uudelleen. Reseptoriin kiinnittyvä ligandi määrää myös sen, mihin G-proteiiniin reseptori sitoutuu. Esimerkiksi kaikki adenylaattisyklaasin isomuodot on mahdollista aktivoida Gsα tyypin G-proteiinilla, mutta sen muiden spesifisten isomuotojen inhibointiin käy vain Gβγ tai Giα proteiinit. (Lodish et al. 2000) CB1-reseptorin kiderakenne saatiin selville kiteyttämällä se rakennetta stabiloivan antagonistin (AM6538) kanssa (Kuva 2). Kuten tyypilliset GPCR-perheeseen kuuluvat reseptorit, myös CB1- reseptorista löytyy seitsemän transmembraanista α-helikaalia, joita yhdistää kolme solun ulkopuolista ja solun sisäpuolista silmukkaa, sekä amfifaattinen alue. Reseptorissa on myös pitkä N-terminaalinen häntä, josta osa on asettunut ligandia sitovan taskun päälle toimien näin tulppana reseptorille. Tämä todennäköisesti auttaa välttämään epäspesifistä sitoutumista reseptorin ulkopuolelta. ECL2-domeeni projektoituu myös ligandia sitovaan taskuun neljän aminohapon verran. (Hua et al. 2016) CB1- reseptorissa on myös disulfidisidoksia N-terminaalisten Cys98- ja Cys107-aminohappojen välillä (Fay et al. 2013) sekä Cys257 ja Cys264 välillä. Cys257 ja Cys264 välinen disulfidisidos on CB1- reseptorin toiminnan kannalta olennainen. (Fay et al. 2005) 10

11 Kuva 2. Kannabinoidireseptori CB1:n kiderakenne. Vihreällä rakennetta stabiloiva antagonisti AM6538. (Hua et al. 2016) AM6538 on molekyyli jossa keskellä on pyratsolirengas, johon on kiinnittynyt kolme käsivartta, joissa on eri funktionaaliset ryhmät (Kuva 3). Käsivarret asettuvat kolmeen suuntaan ligandia sitovassa taskussa, joita ovat pitkä kanava (Long channel), sivutasku (Side pocket) ja rako (Gap). Pyratsolirengas keskellä on II ja VII helikaalin välissä ja vuorovaikuttaa Phe170, Phe379 ja Ser383 aminohappojen sekä N-terminaalin kanssa. Ensimmäinen käsi, jossa on diklorofenyylirengas on asettunut sivutaskuun jonka muodostavat helikaalit II, III, VI ja VII. Se muodostaa π-π-sidoksia sekä hydrofobisia sidoksia sivutaskun aminohappojen ja N-terminaalin kanssa. Toisessa kädessä on 4- alifaattinen ketju substituoituna fenyylirenkaaseen. Se asettuu pitkään kanavaan, jonka muodostavat helikaalit III, V, VI ja ECL2, jossa se muodostaa hydrofobisia ja π-π-sidoksia kanavan aminohappojen kanssa. Kolmannessa kädessä oleva piperiini-1-ylkarbamoyyli on asettunut helikaalien I, II ja VII muodostamaan rakoon. Poikkeuksena muihin käsivarsiin verrattuna kolmannessa kädessä sidokset ovat nonspesifisiä. (Hua et al. 2016) 11

12 Kuva 3. AM6538:n rakennekaava. Kolmelle kannabinoidiantagonistille tehtiin docking-malli reseptorin rakenteen perusteella. Malleiksi valittiin Rimonabant, Otenabant ja Taranabant. Antagonistien ennustettu sitoutuminen noudattaa samaa kaavaa, sillä ne muistuttavat AM6538:aa rakenteellisesti. Näistä kolmesta Taranabantilla oli voimakkain affiniteetti reseptoriin. Kolmannessa kädessä olevassa funktionaalisessa ryhmässä oli antagonisten välillä suurin vaihtelu, mutta sitoutuminen lienee mahdollinen kunhan hydrofobisia sidoksia muodostuu. (Hua et al. 2016) Lysiiniä kohdassa 192 on epäilty olevan aktiivinen ligandin sitomisessa ja reseptorin rakenteen stabiloinnissa. (Chin et al. 1998) Uusimmissa rakennekuvissa yhteyttä AM6538:n ja lysiinin välillä ei kuitenkaan ole havaittavissa. Sen sijaan se vaikuttaa muodostavan suolasiltoja Asp176 ja Asp184 kanssa. Phe102 ja Asp184 vakauttavat N-terminaalin rakennetta muodostamalla vetysidoksia toistensa kanssa. (Hua et al. 2016) Endogeenisille agonisteille tehtiin myös vastaavat docking-mallit ja ennustetut sitoutumispaikat. Malleina olivat klassiset kannabinoidit THC ja CP55,940, endogeeniset agonistit anandamidi ja 2- AG, sekä indolijohdannaiset JWH-018 ja WIN 55, Mallien perusteella agonistit interaktoivat ECL2-domeenin, N-terminaalisen silmukan sekä III, VI ja VII-helikaalien kanssa, mutta eivät helikaalien I ja II kanssa. Endokannabinoidien ennustetaan asettuvan N-terminaalisen loopin ja ECL2-domeenin väliin, jolloin alifaattiset alueet jatkuvat kohti pitkää kanavaa. (Kuva 4) Kaikki agonistit interaktoivat myös Phe268:n ja Phe379:n kanssa. Synteettisillä ja eksogeenisillä kannabinoidiagonisteilla oli luonnollisesti enemmän π-π-sidoksia niiden rakenteesta johtuen. (Hua et al. 2016) 12

13 JWH-018 ja WIN55,212-2 sitoutuivat kuitenkin matalalle reseptorin pohjaan verrattuna muihin agonisteihin. Tämä on kiinnostava havainto, sillä JWH-018 synteettisenä kannabinoidiagonistina on väärinkäytettynä aiheuttanut voimakkaita psyykkisiä ja fyysisiä oireita (Hermann-Clausen et al. 2013). Toistaiseksi yhtään THC:n aiheuttamaa yliannostusta ei tunneta, joten erojen on löydyttävä siitä kuinka agonistit sitoutuvat reseptoriin ja millaisella affiniteetilla. Kuva 4. Endokannabinoidien anandamidin ja 2-AG:n kiinnittyminen CB1-reseptoriin. (Hua et al. 2016) Kuten monet muut G-proteiinikytkentäiset reseptorit, myös kannabinoidireseptorit pystyvät muodostamaan sekä homodimeerejä (Wager-Miller et al. 2002) että heterodimeerejä (Hojo et al. 2008). Dimeerien muodostumiseen liittyy kuitenkin vielä useita kysymyksiä, kuten miten dimerisaatio vaikuttaa solusignalointiin ja kuinka ligandien sitoutuminen toimii dimeereissä (Mackie 2005). Heterodimeerien muodostuminen µ-opioidireseptorien on todistettu käyttäen FRET-kuvantamista sekä ko-ekspressiokokeita (Wager-Miller et al. 2002). CB1-reseptoreita on lokalisoitunut myös samoille alueille aivoissa dopamiinireseptoreiden kanssa ja nämä muodostavat heterodimeerejä (Kearn et al. 2005). Samoin myös TRPV1- ja CB1-reseptoreita on kolokalisoitunut hiiren ja ihmisen sarveiskalvon epiteelisoluissa, ja immunovärjäys on osoittanut reseptorien interaktoivan keskenään. CB1-reseptorit näyttävät tässä tapauksessa hillitsevän TRPV1:n eteenpäin medioimia nosiseptisiä signaaleja (Yang et al. 2013). Tuore tutkimus osoittaa CB1-reseptorien muodostavan heterodimeerejä myös 5-HT2A reseptorien kanssa, mikä voisi osaltaan selittää kannabinoidien psykotrooppiset vaikutukset. (Viñals et al. 2015) 13

14 3.2 Ligandien rakenne ja toiminta Endokannabinoidireseptorien tärkeimmät ligandit ovat N-arakidonyylietanoliamiini, toiselta nimeltään anandamidi (AEA) ja 2-arakidonyyliglyseroli (2-AG). Anandamidi ja 2-AG toimivat välittäjäaineina ja syntetisoidaan tarvittaessa solukalvojen fosfatidyyli-inositoleista. Anandamidi ja 2-AG vapautetaan välittömästi syntetisoinnin jälkeen synapsirakoon, jossa ne kiinnittyvät presynaptisiin kannabinoidireseptoreihin. (Huang et al. 2016) Molempien ligandien vapauttaminen on solunsisäisestä kalsiumkonsentraatiosta riippuvainen tapahtuma. Anandamidin synteesi tapahtuu kahdessa vaiheessa: N-asetyylitransferaasi (NAT) liittää solukalvon fosfatidyylietanoliamiiniin N-arakidonyylin, jolloin muodostuu N- arakidonyylifosfatidyylietanoliamiini (NAPE). NAPE-selektiivinen fosfolipaasi D hydrolysoi muodostuneen NAPE:n anandamidiksi. (Di Marzo et al. 1994) 2-AG voidaan syntetisoida kehossa kolmea eri kautta: Arakidonihappoa pystytään tekemään diasyyliglyserolista (DAG), joka on kehon yleisimpiä toisiolähettejä. Diasyyliglyserolilipaasi (DAGL) hydrolysoi 1,2-diasyyliglyserolin (DAG) 2-monoasyyliglyseroliksi (MAG). Monoasyyliglyserolilipaasi (MAGL) hydrolysoi MAG:in, jolloin saadaan arakidonihappo. (Farooqui et al. 1989) Toinen reitti kulkee fosfatidyyli-inositolin (PI) kautta. Fosfolipaasi C katkaisee solukalvosta irrotetun fosfatidyyli-inositolin fosfaattiosan, jolloin muodostuu diasyyliglyseroli. Diasyyliglyserolilipaasi (DAGL) poistaa hydrolysoimalla molekyylistä rasvahapon, jolloin muodostuu 2-AG. (Kuva 5) (Kano et al. 2009; Stella et al. 1997) Fosfatidyyli-inositolista voidaan saada 2-AG:tä myös vaihtoehtoisesti hydrolysoimalla PI lysofosfatidyyli-inositoliksi (LysoPI) spesifisellä fosfolupaasi A1 entsyymillä (PLA). LysoPI voidaan edelleen hydrolysoida 2-AG:ksi LysoIP-spesifisellä fosfolipaasi C:llä. (Kuva 5) (Sugiura et al. 1995) Kuva 5. 2-AG:n kaksi vaihtoehtoista synteesitapaa. 14

15 Kun kannabinoidit irtoavat reseptoreistaan, ne kuljetetaan takaisin solun sisälle hajotettavaksi. Anandamidin kataboliasta vastaa rasvahappoamidihydrolaasi (FAAH). Se on integraalinen kalvoproteiini, joka on lokalisoitunut endoplasmiseen retikulumiin. FAAH:in toinen substraatti on rasvahappoamidi oleamidi, joka on endokannabinoidien sukulaismolekyyli, jolla arvellaan olevan yhteys uni-valverytmiin (Prospéro-García et al. 2016). Endokannabinoidit ovat lipofiilisiä, ja ne diffuntoituvat solukalvon läpi synteesin jälkeen. Kuinka kannabinoidit pääsevät takaisin sytosolin puolelle hajotettavaksi on ollut mysteeri. Anandamidin tapauksessa ehdotettiin endosytoosia, mutta myöhempi tutkimus osoittaa että kuljetusmekanismi on olemassa. Rasvahappoja sitovan proteiinin (FABP) on osoitettu kuljettavan anandamidia takaisin solun sisälle, jolloin FAAH pystyy hydrolysoimaan sen arakidonihapoksi ja etanolamiiniksi. (Kuva 6) Tämä on osoitettu COS7- ja N18TG2-soluissa käyttämällä FABP-inhiittoria ja oleamidihappoa, joka on FABP:n luonnollinen ligandi. AEA:n lokalisoituminen solun sisään hidastui puolella inhibiittoria ja agonistia käytettäessä. (Kaczocha et al. 2009) Kuva 6. Endokannabinoidien metaboliaa. 2-arakidonyyliglyseroli hajoaa arakidonihapoksi ja glyseroliksi, kun vastaavasti anandamidi hajoaa arakidonihapoksi ja etanolamiinikisi. 2-AG myös lipofiilisenä molekyylinä kohtaa yhtälaisen kuljetushaasteen päästäkseen monoasyyliglyserolilipaasin (MAGL) hajotettavaksi sytosoliin. Vaikka anandamidin transportaatiosta on tehty useita tutkimuksia, 2-AG:n kuljetusmekanismit ovat edelleen harmaata aluetta. Tutkimuksia aiheesta on vähän, ja tulokset ovat tulkinnanvaraisia. On mahdollista että 2- AG:lle on oma kuljetusproteiininsa ja anandamidille omansa, tai AEA:ta ja 2-AG:tä kuljettaa yksi kotransportteri. (Hermann et al. 2006) 2-AG:n hajotukseen kuitenkin tiedetään pystyvän kaikkiaan 7 entsyymiä, joista MAGL, ABHD12 ja ABHD6 medioivat suurimman osan. MAGL on seriinihydrolaasi-proteiiniperheeseen kuuluva kalvoproteiini, joka on lokalisoitunut sytosoliin ja 15

16 tumaan. Se hydrolysoi 2-AG:n arakidonihapoksi ja glyseroliksi (Kuva 6). MAGL:in osuus 2-AG:n hajotuksesta on merkittävä noin 85 % osuudellaan aivoissa. ABHD12 ja ABHD6 osallistuvat myös 2-AG:n hajotukseen 9 % ja 4 % osuuksillaan. Nämä proteiinit ovat kuitenkin lokalisoituneet solukalvolle ja ekstrasellulaariseen tilaan ja onkin kiinnostavaa, miksi useita 2-AG:n hajotukseen osallistuvia entsyymejä on lokalisoitunut eri paikkoihin. (Blankman et al. 2007) 2-AG:n sitoutuu CB1-reseptoriin samoin kuin anandamidi, mutta matalammalla affiniteetilla. Myös ligandien konsentraatioissa on eroja: 2-AG:ta esiintyy rotalla aivojen lipidiekstraktissa kertainen määrä verrattuna anandamidiin. (Buczynski & Parsons 2010) Sillä on kuitenkin matalampi affiniteetti kuin AEA:lla, jonka lisäksi se toimii täysagonistina toisin kuin anandamidi, joka toimii osittaisagonistina. (Hillard 2000, Sugiura et al. 1996). Ligandin kiinnittyminen näyttäisi kuitenkin olevan solujen erikoistumisesta riippuvainen. CB2-reseptoria ekspressoivilla HL-60 soluilla saatiin aikaan kalsiumvirtaus kun soluja stimuloitiin 2-AG:llä. Tämä vaikutus pystyttiin estämään CB2- antagonisteilla. Sama ei kuitenkaan onnistunut CB1-antagonistilla. Sugiura et al (1996) ovat kuitenkin osoittaneet että 2-AG kiinnittyy CB1-reseptoreihin NG neuroblastooma x glioomahybridisoluissa. McPartland kumppaneineen kokosivat 211 tutkimuksesta meta-analyysin, jossa koitettiin selvittää kannabinoidiligandien affiniteettiä CB1- ja CB2-reseptoreihin. Anandamidin Ki-arvo ihmisen CB1- reseptorille on 239,2 +/- 61,77 nm ja CB2-reseptorille 439,5 +/- 95,89 nm. 2-AG:n vastaavat arvot ovat CB1-reseptorille 3423,6 +/- 3288,24 nm ja CB2-reseptorille 1193,8 +/- 327,71 nm. On huomattavaa, että THC:n vastaavat arvot olivat CB1-reseptoriin 25,1 +/- 5,54 ja CB2-reseptoriin 35,2 +/ nm. Endogeenisistä ligandeista anandamidi sitoutuu helpommin ja sillä on yhtä suuri preferenssi molempiin reseptoreihin. 2-AG:n affiniteetit olivat anandamidin vastaavia huomattavasti suuremmat, mutta 2-AG:llä vaikuttaisi myös olevan selvä preferenssi CB2-reseptoriin. THC:llä sen sijaan ei ole preferenssiä reseptoreiden välillä lainkaan, mutta sen Ki arvo on todella pieni suhteessa anandamidiin. Meta-analyysissä havaittiin myös lajikohtaisia eroja rotan ja ihmisen kannabinoidireseptorien välillä. Anandamidin Ki arvo rotalla oli 87,8 +/- 11,32 nm CB1- reseptoreissa, kun ihmisen vastaava oli 239,2 +/- 61,77 nm. (McPartland et al. 2007) Kannabinoidireseptoreille on kehitetty lukuisia selektiivisiä agonisteja ja antagonisteja sekä tutkimus- että lääkekäyttöön. CB1-selektiivisistä agonisteista mainittakoon R-(+)-metanandamidi, arakidonyyli-2 -kloroetyyliamidi (ACEA), arakidonyyli-syklopropyyliamidi (ACPA) ja O (Pertwee R.G 2006) CB1-reseptorille selektiivisiä antagonisteja ovat SR141716A, AM251, AM281 ja LY (Pertwee R.G 2005) 16

17 3.3 Signaalikaskaadi Yksi endokannabinoidien mielenkiintoisimpia signalointireittejä on anandamidin ja 2-AG:n retrogradinen signalointi. Tyypillisessä hermosolujen signaloinnissa viesti siirtyy yksisuuntaisesti presynaptiselta hermolta postsynaptiselle. Retrogradisessa signaloinnissa tämä asetelma kääntyy ympäri. Anandamidi syntetisoidaan hermosolun postsynaptisessa terminaalissa solukalvon fosfolipideistä, jonka jälkeen se siirtyy synapsirakoon ja kiinnittyy presynaptisen hermosolun kannabinoidireseptoreihin vaimentaen solun välittäjäaineiden vapautumista ja depolarisaatioherkkyyttä. Endokannabinoidit ovatkin tunnetuin välittäjäaineryhmä, jonka pääasiallinen signalointi tapahtuu tällä erikoisella tavalla. Retrogradisen signaloinnin ilmiö huomattiin 90-luvulla tutkittaessa Purkinjen solujen GABAherkkyyttä. GABA (Gamma-aminovoihappo) on aivojen merkittävin hermosoluja inhiboiva välittäjäaine. Presynaptinen inhibitio toteutui, kun postsynaptisen hermosolun kalsiumkonsentraatio nousi. Tutkimuksessa spekuloitiin myös mahdollista kalsiumriippuvaisen lähetin olemassaoloa. (Llano et al. 1991) Todisteita endokannabinoidien roolista kalsiumriippuvaisina lähetteinä saatiin vuosia myöhemmin. Endokannabinoidit sopivat lähetin viitekehykseen niiden nopean synteesin ja lipofiilisen luonteen vuoksi, joka mahdollistaisi nopean diffuusion sytosolista synapsirakoon. CB1- reseptoreita on lokalisoitunut hippokampuksen GABAergisiin neuroneihin. (Tsou et al. 1999) Kun reseptoreita stimuloitiin synteettisellä CB1-agonistilla, GABA:n vapauttaminen presynaptisesta hermosolusta laskee samoin kuin niiden neuraalinen oskillaatio. (Wilson & Nicoll 2001) Hermoimpulssin vaimentaminen toimii GABAergisissä hermosoluissa, mutta kannabinoidit pystyvät säätelemään myös eksitatoristen hermosolujen aktiopotentiaaleja. Tämä on todettu Purkinjen soluilla, joita stimuloimalla saatiin presynaptisissa neuroneissa aikaan kymmeniä sekunteja kestävä inhibitio ja välittäjäaineiden supressio. (Kreitzer & Reger 2001) Endokannabinoidit pystyvät moduloimaan hermosolujen depolarisaatiota näinollen sekä inhibitorisissa että eksitatorisissa hermosoluissa. Tämä yhdistettynä käänteiseen signalointiin tekee endokannabinoideista erikoisimpia välittäjäaineita mitä eläinkunnasta löytyy. CB1-reseptorin aktivointi inhiboi adenylaattisyklaasia, joka syntetisoi syklistä adenosiinimonofosfaattia (camp) ATP:stä. G-proteiinit irtoavat alayksiköikseen aktivoinnin seurauksena, jolloin alatyyppi Gi inhiboi adenylaattisyklaasia, mikä johtaa solunsisäisen campkonsentraation laskuun. Tämä sulkee solun kalsiumkanavat, joka vaikuttaa välittäjäaineiden vapautumiseen presynaptisesta hermopäätteestä synapsirakoon. Kannabinoidit säätelevät lisäksi presynaptisen hermon generoimia aktiopotentiaaleja sulkemalla jänniteherkkiä kalium- ja natriumkanavia. 17

18 Endokannabinoidit sekä kannabinoidiagonistit pystyvät hillitsemään presenaptisen hermon vapauttamia välittäjäaineita kalsiumkanavien avulla. Kun CB1-reseptoreita stimuloidaan agonistilla, presynaptisen hermon kalsiumkanavat sulkeutuvat jolloin hermosolun sisäinen kalsiumkonsentraatio laskee inhiboiden hermosolun depolarisaatioherkkyyttä ja täten välittäjäaineiden vapautumista. Tämä on havaittu GABAergisillä kolekystokiinia ja CB1-reseptoreita ekspressoivilla pyramidaalisoluilla, joita stimuloitiin kalsiumkanavan salpaajilla samalla mitaten postsynaptisia amplitudin muutoksia. Kalsiumin virtaus vaikuttaa tapahtuvan N-tyypin jänniteherkkien kalsiumkanavien kautta, joita CB1- reseptorit salpaavat. Solunsisäinen kalsiumkonsentraatio on myös suoraan verrannollinen vapautettuun GABA:n määrään. (Szabó et al. 2014) Hermosolussa on lepotilassa negatiivinen jännite suhteessa solun ulkopuoliseen tilaan, jossa on positiivinen jännite. Tällöin solun sisäpuolella on runsaasti kaliumioneita, mutta vähän natriumioneja. Solun ulkopuolisessa tilassa asetelma on päinvastoin: natriumia on ylimäärin, mutta kaliumia ei. Tämä synnyttää potentiaalieron solun sisä- ja ulkopintojen välille. Aktiopotentiaali syntyy, kun solun pinnassa olevat jänniteherkät natrium-kanavat aukeavat, jolloin solun ulkopuolinen natrium virtaa solun sisälle, nostaen sen jännitteen positiiviseksi. Jänniteherkät kalium-kanavat aukeavat seuraavaksi, jolloin solunsisäinen kalium virtaa solusta ulos tämä laskee jännitettä ja palauttaa solun lopulta lepotilan negatiiviseen jännitteeseen. (Lodish et al. 2000) Kannabinoidien kaliumkanavien säätelyä on testattu dendriittisoluilla, jotka ekspressoivat CB1- reseptoria. Stimulointi anandamidilla sekä anandamidianalogilla johti ulospäin virtaavaan kaliumin määrän laskemiseen, joka vaikuttaa suoraan aktiopotentiaalin syntyyn. Kaliumin virtauksessa syntyneet muutokset pystyttiin estämään käyttämällä CB1-reseptorin antagonisteja. (Wacnik et al. 2008) Kaliumkanavien hallinnoin lisäksi endokannabinoidit inhiboivat myös solun natriumkanavia. Eristetyissä synaptosomeissa ja synaptoneurosomeilla tehdyt kokeet osoittavat anandamidin ja synteettisten anandamidianalogien vähentävän hermosolujen depolarisaatiota sekä nostavan jatkuvasti signaaleja generoivien hermosolujen latenssia mikromolaarimäärillä. (Nicholson et al. 2003) Vaikka kannabinoidien toiminta vaikuttaisi olevan yksinomaan hermosolujen toiminnan vaimentamista, tämä ei pidä täysin paikkansa. CB1-reseptoreiden stimulointi aktivoi samalla MAPK/ERK-signalointireittiä, joka on merkittävä solun jakautumisen, apoptoosin ja erikoistumisen kannalta. (Turu & Hunyady 2010) Tämä on osoitettu astrosytoomasoluilla, joissa CB1-reseptorin stimulointi HU-210 agonistilla sai ERK-vasteen aikaan, sekä että vaste oli nimenomaan CB1- reseptorista johtuva koska se oli estettävissä CB1-antagonistilla. Reseptorien aktivointi auttoi myös estämään keramidilla indusoidun apoptoosin. Reseptoreiden signalointi on linkittynyt myös 18

19 PI3K/PKB-reittiin, joka osallistuu solun kohtalon säätelyyn yhdessä ERK-reitin kanssa. (Galve- Roperh et al. 2002) Kannabinoidijärjestelmän signalointi ei rajoitu pelkästään MAPK/ERK-reittiin. Yhteyksiä β- arrestiiniin (Nguyen et al. 2012) sekä Wnt-signalointiin (Laezza et al. 2012) on myös löydetty. β-arrestiini on proteiini, joka estää G-proteiinikytkentäisten reseptorien yhdistämisen G- proteiineihin. β-arrestiini2 nimenomaisesti pystyy säätelemään CB1-reseptoreiden turtumista eksogeenisten kannabinoidien jatkuvan annostelun seurauksena. Nguyen ryhmineen testasi β- arrestiinin osuutta THC:llä βarr2-ko hiirillä. THC:n annostelun jälkeen βarr2-ko hiirillä oli selvästi kohonnut G-proteiiniaktivaatio, antinosiseptio ja hypotermia verrattuna villityypin hiiriin. Molemmilla hiirillä kehittyi toleranssia kivunlievitykseen THC:n jatkuvan annostelun seurauksena, mutta βarr2-ko hiirillä tämä muutos oli hitaampi. Sama ilmiö toistui annosteltaessa hiirille opiaatteja vahvistaen β-arrestiinin roolia reseptoriherkkyyden säätelyssä. Kokeissa havaittiin myös että THC:n aiheuttama lihasjäykkyys oli heikentynyt βarr2-ko hiirillä. (Nguyen et al. 2012) β- arrestiinin osuus solusignaloinnissa pystytään suoraan kytkemään endokannabinoidijärjestelmään ja soveltamaan lääkesuunnittelussa. Wnt-signalointi ohjaa monia solun toimintoja liittyen proliferaatioon, liikkumiseen, polaarisuuteen sekä organogeneesiin. Syöpäsoluissa signalointi on tyypillisesti häiriintynyttä johtaen aggressiiviseen jakautumiseen. MDA MB 231 rintasyöpäsolujen kasvua pystyttiin hidastamaan käyttämällä synteettistä anandamidin analogia 2-metyyli-2 -F-anandamidia (Met-F-AEA). Syöpäsoluissa β- kateniini translokatoituu tumaan, jossa se aktivoi solun jakautumista edistäviä transkriptiotekijöitä. Analogilla käsitellyissä soluissa β-kateniinia ei ollut lokalisoitunut sytosoliin tai tumaan, viitaten että se on hajotettu preteosomeissa. Sen lisäksi reseptorin aktivointi rajoitti syöpäsolujen kykyä tehdä etäpesäkkeitä inhiboimalla epiteeli-mesenkymaalitransitiota sekä vaimentamalla mesenkymaalimarkkereita. MCF7-soluissa adriamysiini-indusoitu epiteeli-mesenkymaalitransitio pystyttiin estämään kokonaan käsittelemällä solut Met-F-AEA:lla. (Komiya & Habas 2008) Parasetamolia käytetään yleisesti kipu- ja kuumelääkkeenä. Parasetamolin ja endokannabinoidien kipua lievittävät ominaisuudet ovat linkittyneet toisiinsa yhteisten metaboliareittien kautta. Tätä yhteyttä on tutkittu mittaamalla rottien kivunsietokykyä lämpölaattakokeella. Kokeissa käytettiin CB1-reseptorille selektiivistä agonistia HU 210, parasetamolia sekä kahta CB1-reseptorille selektiivistä antagonistia (SR ja AM281). Tutkimusryhmä huomasi että antagonistit hävittivät täysin sekä parasetamolin että HU 210:n aikaansamaan kivunlievityksen rotilla. Tällöin parasetamolin kivunlievityksellä ja kannabinoidireseptoreilla on oltava yhteys. (Ottani et al. 2006) 19

20 Aiemmin on tiedetty N-(4-hydroksifenyyli)arakidonyyliamidin (AM404) lisäävän anandamidin konsentraatiota rottien aivoissa, sillä se inhiboi anadamidille selektiivisiä kuljettajaentsyymejä (Beltramo et al. 1997). AM404 on parasetamolin pääasiallinen metaboliitti, jolloin parasetamolin kivunlievitys perustuu osittain myös endokannabinoidijärjestelmän hyödyntämiseen. Endokannabinoidien kivunlievitys perustuu presynaptisen hermosolun vaimentamiseen säätelemällä ionikanavia sekä G-proteiineja ja täten solun depolarisaatioherkkyyttä ja välittäjäaineiden vapautumista. Järjestelmällä on yhteyksiä myös signalointireitteihin, jotka vaikuttavat solun jakaantumiseen ja elossapysymiseen. CB1-reseptorit ovat tässä avainasemassa, sillä ne ovat lokalisoituneet keskushermostoon ja aivoihin. 20

21 4. Lääkekäyttö Kannabinoidijärjestelmän toimintaa voidaan muokata joko annostelemalla eksogeenisiä kannabinoideja, jotka ovat tyypillisesti reseptoreidensa agonisteja, tai nostamalla endokannabinoidien konsentraatiota keskushermostossa inhiboimalla niiden aineenvaihduntaan vaikuttavia entsyymejä. Tutkimus on vasta alussa, vaikka monia lupaavia terapeuttisia sovelluksia on jo olemassa. Arakidonihapon yhteydet prostaglandiinien synteesiin ja sitä kautta suoraan immuunijärjestelmän toimintaan tarjoaa myös maaperän uusille lääkkeille, joilla voisi säädellä kehon immuunivasteita. Kannabinoideja on käytetty muun muassa krooniseen neuropaattiseen kipuun (Cohen 2008), migreeniin, päänsärkyyn ja klusteripäänsärkyihin (Russo 1998), syöpään liittyviin kiputiloihin (Farguhar-Smith 2009), epilepsiaan (Rosenberg et al. 2015), multippeliskleroosin kivunhoitoon ja spastisuuteen (Zajicek & Apostu 2011), ahdistukseen (Tambaro & Bortolato 2012) ja posttraumaattiseen stressioireyhtymään (Mizrachi Zer-Aviv et al. 2016), ruokahalun parantamiseen (Mattes et al. 1994) ja Alzheimerin (Aso & Ferrer 2014) sekä autoimmuunisairauksien hoitoon (Katchan et al. 2016). Endokannabinoidien AEA:n ja 2-AG:n käyttäminen lääkkeenä on ongelmallista niiden synteesireitin ja epävakauden vuoksi. Kannabinoidien konsentraatiota aivoissa on kuitenkin pystytty nostamaan epäsuorasti inhiboimalla anandamidin ja 2-AG:n hajotukseen osallistuvia FAAH- ja MAGLentsyymejä. Myös suoria CB1-reseptorin antagonisteja on kokeiltu ruokahalun hillitsemiseen ja liikalihavuuden hoitoon. Näistä ensimmäinen oli Rimonabant, joka tuli myyntiin Euroopassa 2006 mutta sen valmistus ja myynti lopetettiin kahta vuotta myöhemmin vakavien psykiatristen sivuvaikutusten vuoksi (Moreira & Crippa 2009). Rimonabant toimi CB1-reseptortin käänteisenä antagonistina, ja on hyvin todennäköistä että ainakin osa sivuvaikutuksista johtui tästä. Neutraaleista antagonisteista mainittakoon Surinabant, jota on kokeiltu tupakoinnin lopettamisen apuna. Surinabant ei auttanut plaseboa paremmin tupakoinnin lopettamiseen, mutta se vähensi hieman tupakoinnin lopettamisen jälkeistä painonnousua kontrolliryhmään verrattuna. (Tonstad & Aubin 2012) Useita potentiaalisia FAAH-inhibiittoreita on testattu kliinisissä ensimmäisen ja toisen vaiheen kokeissa. Aiemmissa kokeissa testatut lääkeaineet oli todettu ihmiselle turvalliseksi, mutta odottamattomat haittavaikutukset saattavat silti yllättää tutkijat. Neuropaattisen kivun hoitoon ensisijaisesti kehitetty FAAH-inhibiittori BIA sai negatiivista julkisuutta vuoden 2016 alkupuolella, kun kuudentena testipäivänä yksi koehenkilöistä kuoli ja viidellä muulla koehenkilöllä ilmeni magneettikuvauksissa pysyviä aivovaurioita. Ensimmäisen vaiheen lääketutkimukset 21

22 keskeytettiin välittömästi tapahtuman jälkeen. On toistaiseksi selvityksen alla miksi koe päättyi näin traagisesti, mutta syitä voi olla lääkeaineen epäspesifinen sitoutuminen muihin entsyymeihin, liian suuret annoskoot tai lääkeaineen metaboliittien kasautuminen. Osalle koehenkilöistä annosteltiin inhibiittoria päivittäin ja tämä on voinut osaltaa vaikuttaa odottamattomiin tuloksiin. Toistaiseksi markkinoilla ei ole yhtään kaupallistettua FAAH-inhibiittoria, mutta tutkimukset jatkuvat. (Kaur et al. 2016) 2-AG:n hajotukseen osallistuvan monoasyyliglyserolilipaasin (MAGL) inhibointi on ollut myös suosittu tutkimuskohde. Ignatowska-Jankowska ryhmineen raportoivat testanneensa KML29-nimistä MAGL-inhibiittoria kivunlievitykseen hiirillä. Kipumalleina käytettiin karrageenilla indusoitua takakäpälän turvotusta, lonkkahermon liimauksesta seurannutta allodynesiaa sekä tulehduskipulääke Diklofenaakilla indusoitu mahalaukun verenvuotoa. Inhibiittorin annostelemisen jälkeen 2-AG:n määrä hiirten aivoissa nousi 2-4 tunnin aikana, jolloin eläimillä havainnoitiin myös suurin kivunlievitys. Kokeiden perusteella karrageenin aiheuttamaan kipuun tarvitaan sekä CB1 että CB2- reseptoreiden aktivointi, kun lonkkahermon allodyniaa saatiin lievitettyä aktivoimalla pelkästään CB1-reseptoria 2-AG:llä. Inhibiittori ehkäisi myös diklofenaakin indusoiman mahanlaukun verenvuodon. Inhibiittori ei vaikuttanut anandamidin konsentraatioon aivoissa millään tavalla. Tutkijat pitivät myös erityisen innostavana, ettei hiirillä ilmennyt kannabinoideille olennaista päihtymystä lääkeannoksen antamisen jälkeen siitä huolimatta, että 2-AG aktivoi CB1-reseptoria. (Ignatowska-Jankowska et al. 2014) Pasquarellin ryhmä on myös saanut samakaltaisia tuloksia omista KML29-kokeistaan. He lähestyivät tutkimusongelmaa prostaglandiinien synteesin kautta, ja kuinka endokannabinoidijärjestelmä voisi kytkeytyä tähän. Prostaglandiineja voidaan syntetisoida solunsisäisestä diasyyliglyserolista tai solukalvojen fosfolipideistä. Nomura kumppaneineen olivat aiemmin osoittaneet, että 2-AG:n hydrolyysissä syntyvä arakidonihappo toimii prostaglandiinien prekursorina ja näin ollen tarjoaa vaihtoehtoisen synteesireitin (Nomura et al. 2011). Pasquarellin ryhmä varmisti nämä tulokset, ja osoitti syntetisoidun prostaglandiinin määrän alentuneen aivoissa, lihaksissa, maksassa ja haimassa inhibiittorin annostelun jälkeen. (Pasquarelli et al. 2015) Eksogeenisillä kannabinoideilla vaikuttaisi olevan myös rooli antioksidantteina sekä hermosolujen suojelemisessa. Kun aivokuoren kortikaalisia hermosoluja altistettiin glutamaatille tai tertbutyylihydroperoksidille, sekä THC että CBD pystyivät suojelemaan hermosoluja glutamaatin ja hydroperoksidin aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta. Tämä vaikutus säilyi käytettäessä kannabinoidireseptorien antagonistia SR A, osoittaen ettei efekti ole kannabinoidireseptorista riippuvainen. Mielenkiintoisena havaintona endogeeninen kannabinoidi anandamidi ei hapettunut 22

23 eikä siten pysty medioimaan suojaavaa vaikutusta eksogeenisten kannabinoidien tapaan. (Hampson et al. 1998) Lynch ja Campbell kokosivat yhteen satunnaistettua 18 kliinistä koetta vuosilta , joissa oli tutkittu kannabinoidien vaikutusta krooniseen, ei-syöpäperäiseen kipuun 776:lla potilaalla. Kokeissa testattiin poltettua kannabista, suun kautta annosteltavaa suihketta, sekä synteettistä kannabinoideja Nabilonea, Drobinolia sekä ajuleemihappoa (THC-11-oic acid). Kaikkiaan 15 kokeessa havainnoitiin merkittävä kivunlievennys, ja joissain tapauksissa myös parantunut unenlaatu. Yleisimmiksi haittavaikutuksiksi raportoitiin suun kuivuminen, huimaus, rauhoittuminen, pahoinvointi ja keskittymisen häiriöt. Vakavammat sivuvaikutukset käsittivät päänsärkyä, paranoiaa, koordinaation heikkenemistä, kiihtymystä ja dissosiaatiota. Haittavaikutukset olivat kuitenkin kuvailtu lieviksi ja hyvin siedetyiksi. Kivunlievityksen kannalta kannabinoidit vaikuttavat toimivan kohtalaisesti, mutta toisaalta kahdessa kokeessa (Abrams et al. 2007; Ellis et al. 2009) havaittiin poltetun kannabiksen lievittävän HIV:iin liittyviä vaikeita neuropaattisia kiputiloja. Kokeiden keskimääräinen kesto oli 2,8 viikkoa, mikä on tarkasteluajanjaksona melko lyhyt. Pidemmät seurantajaksot sekä laajempi kartoitus toimintakyvyn palautumisesta olisivat tarpeen selvitettäessä kannabinoidien lääkekäytön pitkäaikaisvaikutuksia. Kannabinoidit vaikuttaisivat turvalliselta vaihtoehdoilta kroonisiin kipuun, mutta niiden kivunlievitys ei välttämättä ole yksinään riittävä erittäin vaikeisiin kiputiloihin. (Lynch & Campbell 2011) Kiehtova tuore tutkimus valottaa taustoja tetrahydrokannabinolin, päihtymyksen ja kivunlievityksen välille. Viñals kumppaneineen osoittivat että CB1-reseptorit pystyvät muodostamaan heteromeerejä 5-HT2A reseptoreiden kanssa, jotka kuuluvat G-proteiinikytkentäisiin serotoniinreseptoriperheeseen. 5-HT2A on myös LSD:n, psilosybiinisienten ja meskaliini-kaktusten psykoaktiivisten agonistien vastinreseptori. Eläinkokeissa villityypin hiirillä havaittiin muistihäiriöitä, sedaatiota ja kohonnutta sosiaalisuutta THC:n annostelun jälkeen, mutta 5-HT2A KO-hiirillä nämä käyttäytymismallit joko lievenivät tai hävisivät kokonaan. Erittäin mielenkiintoisena havaintona THC:n tuoma kivunlievitys säilyi ennallaan molemmilla hiirillä lämpölaatta- ja hännäheilautuskokeissa. CB1-5-HT2A dimeeri pystyttiin erottamaan toisistaan käyttämällä solukalvon läpäiseviä peptidejä, jolloin villityypin hiirten muistihäiriöt hävisivät, mutta kivunlievitys säilyi ennallaan THC:n annostelun jälkeen. Tämän yhteyden löytyminen auttaa ymmärtämään ja suunnittelemaan tulevaisuudessa uudenlaisia lääkkeitä, jotka pystyvät medioimaan eksogeenisten kannabinoidien hyödyt ja minimoimaan haitat. Endokannabinoidijärjestelmän yhteydet muihin kehon välittäjäainejärjestelmiin, kuten endorfiini- ja dopamiinijärjestelmään tulisi näinollen ottaa huomioon lääkesuunnittelussa. (Viñals et al. 2015) 23

24 Kannabinoidien lääkekäytön yhteydessä on otettava huomioon sivuvaikutukset. Vaikka kannabinoidireseptoreja on keskushermostossa, ne eivät ole lokalisoituneet aivorungossa sydämen ja keuhkojen toimintaa sääteleville alueille kuten opioidireseptorit. Tästä johtuen opiaattien yliannostuksessa ilmenevä hermostolama on mahdoton saavuttaa pelkästään kannabinoideilla. (Abrams et al. 2011) Vaikka eksogeenisiä kannabinoideja on käytetty lääkkeeksi, tutkimus pysähtyi vuosikymmeniksi kun kannabis luokiteltiin vuonna 1970 Yhdysvalloissa Luokan I huumausaineeksi, jossa se nykyäänkin on. Luokka I sisältää vaatimuksen siitä, että aineella on korkea riippuvuutta aiheuttava potentiaali, ei hyväksyttyä lääketieteellistä käyttöä sekä ettei aine ole turvallinen käyttää edes lääkärin valvonnassa. Useita esityksiä luokittelun muuttamiseksi on tehty tieteellisen ymmärryksen lisääntyessä kannabinoidijärjestelmästä sekä kannabinoidien farmakologisesta potentiaalista, mutta toistaiseksi kannabis säilyy laittomana. (Baron 2015) Kannabinoidien täyden lääketieteellisen potentiaalin kartoittaminen on arvokasta työtä. CB1- reseptorin rakenteen selvittämisen ja heterodimerisaation löytyminen auttavat suunnittelemaan yhä spesifisempiä lääkkeitä. Tällä hetkellä markkinoilla olevat lääkkeet tarjoavat ensimmäisen polven ratkaisuja tehokkaampaan ja turvallisempaan kivunlievitykseen. Kannabinoideja käytetään tällä hetkellä MS-taudin, syövän sekä akuutin ja krooniseen kivun hoitoon. Nykytietämyksen valossa kannabinoideilla on mahdollista saavuttaa kohtalainen kivunlievennys melko miedoilla sivuvaikutuksilla. 24

25 Lähteet Abrams, D. I., Jay, C. A., Shade, S. B., Vizoso, H., Reda, H. et al. Petersen, K. L. (2007). Cannabis in painful HIV-associated sensory neuropathy: A randomized placebo-controlled trial. Neurology, 68(7), Abush, H. & Akirav, I. (2010). Cannabinoids modulate hippocampal memory and plasticity. Hippocampus, 20(10), Ashton, C. H. & Moore, P. B. (2011). Endocannabinoid system dysfunction in mood and related disorders. Acta Psychiatrica Scandinavica, 124(4), Aso, E. & Ferrer, I. (2014). Cannabinoids for treatment of Alzheimerâ s disease: Moving toward the clinic. Frontiers in Pharmacology, 5, /fphar Baron, E. P. (2015). Comprehensive review of medicinal marijuana, cannabinoids, and therapeutic implications in medicine and headache: What a long strange trip it's been... Headache, 55(6), Bear, M. F., Connors, B. W., & Paradiso, M. A. (2007). Neuroscience: Exploring the brain. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins Beardsley, P. M., Scimeca, J. A. & Martin, B. R. (1987). Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9- tetrahydrocannabinol. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 241(2), Beltramo, M., Stella, N., Calignano, A., Lin, S. Y., Makriyannis, A. & Piomelli, D. (1997). Functional role of high-affinity anandamide transport, as revealed by selective inhibition. Science (New York, N.Y.), 277(5329), Blankman, J. L., Simon, G. M. & Cravatt, B. F. (2007). A comprehensive profile of brain enzymes that hydrolyze the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Chemistry & Biology, 14(12), Buczynski, M. W. & Parsons, L. H. (2010). Quantification of brain endocannabinoid levels: Methods, interpretations and pitfalls. British Journal of Pharmacology, 160(3), Bushnell, M., Case, L., Ceko, M., Cotton, V., Gracely, J. et al. Villemure, C. (2015). Effect of environment on the long-term consequences of chronic pain. Pain, 156(0 1), S

26 Caldwell, M. D., Hu, S. S., Viswanathan, S., Bradshaw, H., Kelly, M. E. & Straiker, A. (2013). A GPR18-based signalling system regulates IOP in murine eye. British Journal of Pharmacology, 169(4), Carrier, E. J., Kearn, C. S., Barkmeier, A. J., Breese, N. M., Yang, W. et al. Hillard, C. J. (2004). Cultured rat microglial cells synthesize the endocannabinoid 2-arachidonylglycerol, which increases proliferation via a CB2 receptor-dependent mechanism. Molecular Pharmacology, 65(4), Chin, C. N., Lucas-Lenard, J., Abadji, V. & Kendall, D. A. (1998). Ligand binding and modulation of cyclic AMP levels depend on the chemical nature of residue 192 of the human cannabinoid receptor 1. Journal of Neurochemistry, 70(1), Davis, K. D. & Moayedi, M. (2013). Central mechanisms of pain revealed through functional and structural MRI. Journal of Neuroimmune Pharmacology : The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology, 8(3), De Petrocellis, L., Melck, D., Bisogno, T., Milone, A. & Di Marzo, V. (1999). Finding of the endocannabinoid signalling system in hydra, a very primitive organism: Possible role in the feeding response. Neuroscience, 92(1), Devane, W. A., Dysarz, F. A., Johnson, M. R., Melvin, L. S. & Howlett, A. C. (1988). Determination and characterization of a cannabinoid receptor in rat brain. Mol Pharmacol, 34(5), 605. Devane, W. A., Hanus, L., Breuer, A., Pertwee, R. G., Stevenson, L. A. et al. Mechoulam, R. (1992). Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science (New York, N.Y.), 258(5090), Di Marzo, V. & Matias, I. (2005). Endocannabinoid control of food intake and energy balance. Nature Neuroscience, 8(5), Ellis, R. J., Toperoff, W., Vaida, F., van den Brande, G., Gonzales, J. et al. Atkinson, J. H. (2009). Smoked medicinal cannabis for neuropathic pain in HIV: A randomized, crossover clinical trial. Neuropsychopharmacology : Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology, 34(3), Farooqui, A. A., Rammohan, K. W. & Horrocks, L. A. (1989). Isolation, characterization, and regulation of diacylglycerol lipases from the bovine brain. Annals of the New York Academy of Sciences, 559,

27 Fay, J. F., Dunham, T. D. & Farrens, D. L. (2005). Cysteine residues in the human cannabinoid receptor: Only C257 and C264 are required for a functional receptor, and steric bulk at C386 impairs antagonist SR141716A binding. Biochemistry, 44(24), Fay, J. F. & Farrens, D. L. (2013). The membrane proximal region of the cannabinoid receptor CB(1) N-terminus can allosterically modulate ligand affinity. Biochemistry, 52(46), Fine, P. G. & Rosenfeld, M. J. (2013). The endocannabinoid system, cannabinoids, and pain. Rambam Maimonides Medical Journal, 4(4), e0022. doi: /rmmj Galiegue, S., Mary, S., Marchand, J., Dussossoy, D., Carriere, D. et al. Casellas, P. (1995). Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations. European Journal of Biochemistry / FEBS, 232(1), Galve-Roperh, I., Rueda, D., Gomez del Pulgar, T., Velasco, G. & Guzman, M. (2002). Mechanism of extracellular signal-regulated kinase activation by the CB(1) cannabinoid receptor. Molecular Pharmacology, 62(6), Herkenham, M., Lynn, A. B., Johnson, M. R., Melvin, L. S., de Costa, B. R. & Rice, K. C. (1991). Characterization and localization of cannabinoid receptors in rat brain: A quantitative in vitro autoradiographic study. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience, 11(2), Hermann, A., Kaczocha, M. & Deutsch, D. G. (2006). 2-arachidonoylglycerol (2-AG) membrane transport: History and outlook. The AAPS Journal, 8(2), E Hermanns-Clausen, M., Kneisel, S., Szabo, B. & Auwarter, V. (2013). Acute toxicity due to the confirmed consumption of synthetic cannabinoids: Clinical and laboratory findings. Addiction (Abingdon, England), 108(3), Hillard, C. J. (2000). Biochemistry and pharmacology of the endocannabinoids arachidonylethanolamide and 2-arachidonylglycerol. Prostaglandins & Other Lipid Mediators, 61(1-2), Hojo, M., Sudo, Y., Ando, Y., Minami, K., Takada, M. et al. Uezono, Y. (2008). Mu-opioid receptor forms a functional heterodimer with cannabinoid CB1 receptor: Electrophysiological and FRET assay analysis. Journal of Pharmacological Sciences, 108(3), Hua, T., Vemuri, K., Pu, M., Qu, L., Han, G. et al. Liu, Z.Crystal structure of the human cannabinoid receptor CB1. Cell, 167(3), e14. 27

28 Huang, W. J., Chen, W. W. & Zhang, X. (2016). Endocannabinoid system: Role in depression, reward and pain control (review). Molecular Medicine Reports, 14(4), Ignatowska-Jankowska, B. M., Ghosh, S., Crowe, M. S., Kinsey, S. G., Niphakis, M. J. et al. Lichtman, A. H. (2014). In vivo characterization of the highly selective monoacylglycerol lipase inhibitor KML29: Antinociceptive activity without cannabimimetic side effects. British Journal of Pharmacology, 171(6), Kaczocha, M., Glaser, S. T. & Deutsch, D. G. (2009). Identification of intracellular carriers for the endocannabinoid anandamide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(15), Kandel Eric R., Schwartz James H., Jessell Thomas M., Siegelbaum Steven A., Hudspeth A.J (2013) Principles of Neural Science, McGraw-Hill, ISBN: Kano, M., Ohno-Shosaku, T., Hashimotodani, Y., Uchigashima, M. & Watanabe, M. (2009). Endocannabinoid-mediated control of synaptic transmission. Physiological Reviews, 89(1), Katchan, V., David, P. & Shoenfeld, Y. (2016). Cannabinoids and autoimmune diseases: A systematic review. Autoimmunity Reviews, 15(6), doi: /j.autrev [doi] Kaur, R., Sidhu, P. & Singh, S. (2016). What failed BIA 10â 2474 phase I clinical trial? global speculations and recommendations for future phase I trials. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics, 7(3), Kearn, C. S., Blake-Palmer, K., Daniel, E., Mackie, K. & Glass, M. (2005). Concurrent stimulation of cannabinoid CB1 and dopamine D2 receptors enhances heterodimer formation: A mechanism for receptor cross-talk? Molecular Pharmacology, 67(5), Komiya, Y. & Habas, R. (2008). Wnt signal transduction pathways. Organogenesis, 4(2), Kreitler, S. & Beltrutti, D. (2007). The handbook of chronic pain Nova Biomedical Books. Kreitzer, A. C. & Regehr, W. G. (2001). Retrograde inhibition of presynaptic calcium influx by endogenous cannabinoids at excitatory synapses onto purkinje cells. Neuron, 29(3), Laezza, C., D'Alessandro, A., Paladino, S., Maria Malfitano, A., Chiara Proto, M. et al. Endocannabinoid Research Group (2012). Anandamide inhibits the Wnt/beta-catenin signalling pathway in human breast cancer MDA MB 231 cells. European Journal of Cancer (Oxford, England : 1990), 48(16),

29 Llano, I., Leresche, N. & Marty, A. (1991). Calcium entry increases the sensitivity of cerebellar purkinje cells to applied GABA and decreases inhibitory synaptic currents. Neuron, 6(4), Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman; Section 20.3, G Protein Coupled Receptors and Their Effectors. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman; Section 21.2, The Action Potential and Conduction of Electric Impulses. Mackie, K. (2005). Cannabinoid receptor homo- and heterodimerization. Life Sciences, 77(14), Matsuda, L. A., Lolait, S. J., Brownstein, M. J., Young, A. C. & Bonner, T. I. (1990). Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cdna. Nature, 346(6284), Mattes, R. D., Engelman, K., Shaw, L. M. & Elsohly, M. A. (1994). Cannabinoids and appetite stimulation. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior, 49(1), McPartland, J. M., Glass, M. & Pertwee, R. G. (2007). Meta-analysis of cannabinoid ligand binding affinity and receptor distribution: Interspecies differences. British Journal of Pharmacology, 152(5), Mizrachi Zer-Aviv, T., Segev, A. & Akirav, I. (2016). Cannabinoids and post-traumatic stress disorder: Clinical and preclinical evidence for treatment and prevention. Behavioural Pharmacology, 27(7), Moreira, F. A. & Crippa, J. A. (2009). The psychiatric side-effects of rimonabant. Revista Brasileira De Psiquiatria (Sao Paulo, Brazil : 1999), 31(2), Morena, M. & Campolongo, P. (2014). The endocannabinoid system: An emotional buffer in the modulation of memory function. Neurobiology of Learning and Memory, 112, Nahin, R. L. (2015). Estimates of pain prevalence and severity in adults: United states, The Journal of Pain : Official Journal of the American Pain Society, 16(8), Nguyen, P. T., Schmid, C. L., Raehal, K. M., Selley, D. E., Bohn, L. M. & Sim-Selley, L. J. (2012). Beta-arrestin-2 regulates cannabinoid CB(1) receptor signaling and adaptation in a CNS regiondependent manner. Biological Psychiatry, 71(8), Nicholson, R. A., Liao, C., Zheng, J., David, L. S., Coyne, L. et al. Lees, G. (2003). Sodium channel inhibition by anandamide and synthetic cannabimimetics in brain. Brain Research, 978(1-2),

30 Nomura, D. K., Morrison, B. E., Blankman, J. L., Long, J. Z., Kinsey, S. G. et al. Cravatt, B. F. (2011). Endocannabinoid hydrolysis generates brain prostaglandins that promote neuroinflammation. Science (New York, N.Y.), 334(6057), Oleson, E. B. & Cheer, J. F. (2012). A brain on cannabinoids: The role of dopamine release in reward seeking. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2(8), /cshperspect.a Ottani, A., Leone, S., Sandrini, M., Ferrari, A. & Bertolini, A. (2006). The analgesic activity of paracetamol is prevented by the blockade of cannabinoid CB1 receptors. European Journal of Pharmacology, 531(1-3), Pertwee, R. G. (2006). The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands: An overview. International Journal of Obesity, 30, S13-S18. Pertwee, R. G. (2005). Inverse agonism and neutral antagonism at cannabinoid CB1 receptors. Life Sciences, 76(12), Prospero-Garcia, O., Amancio-Belmont, O., Becerril Melendez, A. L., Ruiz-Contreras, A. E. & Mendez-Diaz, M. (2016). Endocannabinoids and sleep. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 71, Rosenberg, E. C., Tsien, R. W., Whalley, B. J. & Devinsky, O. (2015). Cannabinoids and epilepsy. Neurotherapeutics : The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 12(4), Russo, E. (1998). Cannabis for migraine treatment: The once and future prescription? an historical and scientific review. Pain, 76(1-2), 3-8. Ryberg, E., Larsson, N., Sjogren, S., Hjorth, S., Hermansson, N. O. et al. Greasley, P. J. (2007). The orphan receptor GPR55 is a novel cannabinoid receptor. British Journal of Pharmacology, 152(7), Shire, D., Calandra, B., Delpech, M., Dumont, X., Kaghad, M. et al. Ferrara, P. (1996). Structural features of the central cannabinoid CB1 receptor involved in the binding of the specific CB1 antagonist SR A. The Journal of Biological Chemistry, 271(12), Stella, N., Schweitzer, P. & Piomelli, D. (1997). A second endogenous cannabinoid that modulates long-term potentiation. Nature, 388(6644), Sugiura, T., Kodaka, T., Kondo, S., Tonegawa, T., Nakane, S. et al. Waku, K. (1996). 2- arachidonoylglycerol, a putative endogenous cannabinoid receptor ligand, induces rapid, transient 30

31 elevation of intracellular free Ca2+ in neuroblastoma x glioma hybrid NG cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 229(1), Sugiura, T., Kondo, S., Sukagawa, A., Nakane, S., Shinoda, A. et al. Waku, K. (1995). 2- arachidonoylglycerol: A possible endogenous cannabinoid receptor ligand in brain. Biochemical and Biophysical Research Communications, 215(1), Szabó, G. G., Lenkey, N., Holderith, N., Andrà si, T., Nusser, Z. & Hà jos, N. (2014). Presynaptic calcium channel inhibition underlies CB1 cannabinoid receptor-mediated suppression of GABA release. The Journal of Neuroscience, 34(23), Tambaro, S. & Bortolato, M. (2012). Cannabinoid-related agents in the treatment of anxiety disorders: Current knowledge and future perspectives. Recent Patents on CNS Drug Discovery, 7(1), Tonstad, S. & Aubin, H. J. (2012). Efficacy of a dose range of surinabant, a cannabinoid receptor blocker, for smoking cessation: A randomized controlled clinical trial. Journal of Psychopharmacology (Oxford, England), 26(7), Tsou, K., Mackie, K., Sanudo-Pena, M. C. & Walker, J. M. (1999). Cannabinoid CB1 receptors are localized primarily on cholecystokinin-containing GABAergic interneurons in the rat hippocampal formation. Neuroscience, 93(3), Turu, G. & Hunyady, L. (2010). Signal transduction of the CB1 cannabinoid receptor. Journal of Molecular Endocrinology, 44(2), Viñals, X., Moreno, E., Lanfumey, L., CordomÃ, A., Pastor, A. et al. Robledo, P. (2015). Cognitive impairment induced by Delta9-tetrahydrocannabinol occurs through heteromers between cannabinoid CB(1) and serotonin 5-HT(2A) receptors. PLoS Biology, 13(7), e doi: /journal.pbio Wacnik, P. W., Luhr, K. M., Hill, R. H., Ljunggren, H. G., Kristensson, K. & Svensson, M. (2008). Cannabinoids affect dendritic cell (DC) potassium channel function and modulate DC T cell stimulatory capacity. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), 181(5), Wager-Miller, J., Westenbroek, R. & Mackie, K. (2002). Dimerization of G protein-coupled receptors: CB1 cannabinoid receptors as an example. Chemistry and Physics of Lipids, 121(1-2), Wilson, R. I. & Nicoll, R. A. (2001). Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at hippocampal synapses. Nature, 410(6828),

32 Yang, Y., Yang, H., Wang, Z., Varadaraj, K., Kumari, S. S. et al. Reinach, P. S. (2013). Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cellular Signalling, 25(2), Zajicek, J. P. & Apostu, V. I. (2011). Role of cannabinoids in multiple sclerosis. CNS Drugs, 25(3),

33 33