Local Run Manager DNA GenerateFASTQ Dx Analysis Module

Transkriptio

1 Local Rn Manager DNA GenerateFASTQ Dx Analysis Modle MiSeqDx:n työnklkopas Yleiskatsas 3 Ajotietojen syöttäminen 3 Analyysimenetelmät 5 Ajon ja tlosten tarkasteleminen 5 Tlosraportti 6 Analyysin totostiedostot 6 Versiohistoria 10 Tekninen tki 11 Tokok 2022 OMISTUSOIKEUDEN OMISTAA ILLUMINA

2 Tämä asiakirja ja sen sisältö ovat Illmina, Inc:n ja sen tytäryhtiöiden ( Illmina ) omaistta, ja ne on tarkoitett ainoastaan Illminan asiakkaiden sopimskäyttöön tässä kvattjen totteiden käyttöön liittyen eikä mihinkään mhn tarkoitkseen. Tätä asiakirjaa ja sen sisältöä ei saa käyttää tai jakaa missään mssa tarkoitksessa ja/tai välittää, paljastaa tai jäljentää millään mlla tavoin ilman Illminalta ennakkoon saata kirjallista lpaa. Illmina ei tällä asiakirjalla lovta mitään käyttöoikeksia sen patentti-, tavaramerkki-, tekijänoikes- tai tapaoikeksien nojalla eikä vastaavien kolmansien osapolten oikeksien nojalla. Tässä kvattja totteita saa käyttää vain pätevä ja asianmkaisesti koltett henkilöknta nodattamalla täsmällisesti tässä asiakirjassa annettja ohjeita, jotta totteiden asianmkainen ja trvallinen käyttö voidaan taata. Asiakirjan sisältö on lettava ja ymmärrettävä kokonaisdessaan ennen näiden totteiden käyttöä. MIKÄLI TÄSSÄ ANNETTUJA OHJEITA EI LUETA JA TÄSMÄLLISESTI NOUDATETA, SEURAUKSENA VOI OLLA TUOTTEIDEN VAURIOITUMINEN, HENKILÖVAHINKOJA JOKO KÄYTTÄJILLE TAI MUILLE JA MUITA OMAISUUSVAHINKOJA, MINKÄ LISÄKSI TUOTTEITA MAHDOLLISESTI KOSKEVAT TAKUUT MITÄTÖITYVÄT. ILLUMINA EI OLE VASTUUSSA TÄSSÄ KUVATTUJEN TUOTTEIDEN VÄÄRINKÄYTÖSTÄ (MUKAAN LUKIEN TUOTTEEN OSAT JA OHJELMISTO) Illmina, Inc. Kaikki oikedet pidätetään. Kaikki tavaramerkit ovat Illmina, Inc:n tai niiden vastaavien omistajien omaistta. Tarkemmat tavaramerkkitiedot annetaan osoitteessa 2

3 Yleiskatsas Local Rn Manager DNA GenerateFASTQ Dx -modli demltipleksoi ensin indeksoidt readit. Mikäli DNA GenerateFASTQ Dx on mkana, se lo välitloststiedostot FASTQ-tiedostomodossa ja poist sen jälkeen työnklsta. Kohdiststa tai lisäanalyysia ei soriteta. FASTQ-tiedostoja tarvitaan syötteeksi analyysiin, joka soritetaan kolmannen osapolen analyysityökalilla. Local Rn Manager DNA GenerateFASTQ Dx -modli voidaan ajaa Local Rn Manager v versiossa (tai sitä demmassa versiossa), ja se on yhteensopiva Windows 10:n kanssa. Analyysimodli tkee sekvensointia Illmina DNA Prep with Enrichment Dx -määritystä varten. Tietoa tästä oppaasta Tässä oppaassa annetaan ohjeet ajoparametrien määrittämiseksi sekvensointia ja DNA GenerateFASTQ Dx -analyysimodlin analysointia varten. Ohjelmiston käyttäminen edellyttää perstietoja Windowskäyttöjärjestelmän simmasta versiosta ja verkkoselainpohjaisesta käyttöliittymästä. Katso tietoa Local Rn Managerin koontinäyttö- ja järjestelmäasetksista asiakirjasta Local Rn Manager -ohjelmiston viiteopas MiSeqDx-järjestelmälle (asiakirjanro ). Ajotietojen syöttäminen Parametrien määrittäminen 1 Kirjad sisään Local Rn Manageriin. 2 Valitse Create Rn (Lo ajo) ja valitse sitten DNA GenerateFASTQ Dx. 3 Anna aintkertainen ajon nimi, jonka persteella ajo tnnistetaan sekvensoinnin ja analyysin aikana (enintään 40 merkkiä). Ajonimi voi sisältää aakkosnmeerisia merkkejä, välilyöntejä ja erityismerkkejä `.~!@#$%-_{}. Aiemman ajon nimeä ei voida käyttää. 4 [Valinnainen] Syötä ajon kvas ajon tnnistamisen helpottamiseksi (enintään 150 merkkiä). Ajon kvas voi sisältää aakkosnmeerisia merkkejä, välilyöntejä ja seraavia erityismerkkejä: `.~!@#$%-_{}. 5 Seraavien ajoasetsten määrittäminen Index Plate (Indeksilevy) valitse indeksilevyn asettel, jota käytetään kirjaston valmisteln aikana. Voit valita indeksijokosta A, indeksijokosta B ja indeksijokosta AB. Lisätietoja indeksilevysi asettelista on kohdassa Illmina DNA Prep With Enrichment Dx -pakkasseloste. Indeksijokot A ja B sisältävät 96 näytettä ja vastaavat aintkertaiset kaksoisalkkeet (UDP:t). Indeksijokko AB sisältää 192 näytettä ja vastaavat UDP:t. Read Type (Readin tyyppi) valitse yksittäinen read tai paired-end-read. Oletsarvoinen readin tyyppi on paired-end. Read Lengths (Readien pitdet) syötä readin pits. Readin oletsarvoinen pits on Määritä Modle-Specific Settings (Modlikohtaiset asetkset) -kohdassa Adapter Trimming (Adapterin leikkas) -vaihtoehto. Adapterin leikkas on oletsarvoisesti käytössä. 7 Valitse sekvensoitavien näytteiden määrä. Valittn näytteiden määrään sisältyvät atomaattisesti täytetyt UPD-sositkset. Jos et hala käyttää UDP-sositksia, valitse Cstom (Mkata). 3

4 Jos sekvensoimiesi näytteiden määrä ei sisälly avattavaan valikkoon, valitse lähin näytemäärä. Varmista, että valitt määrä on pienempi kin sekvensoitava määrä ja että ylimääräisiä UDP-kohteita lisätään tarpeen mkaan. Voit esimerkiksi testata 18 näytettä valitsemalla 16 näytettä. Näytteiden määrittäminen ajoa varten Määritä näytteet ajoa varten käyttämällä jompaakmpaa seraavista vaihtoehdoista. Enter Samples Manally (Syötä näytteet manaalisesti) Käytä Create Rn (Lo ajo) -näytön tyhjää talkkoa. Import Samples (To näytteet) Siirry lkoiseen tiedostoon, jossa arvot on erotett toisistaan pilklla (*.csv). Create Rn (Lo ajo) -näytössä on saatavilla ladattava malli. Näytteiden syöttäminen manaalisesti 1 Syötä aintkertainen näytetnns Sample ID (Näytetnns) -välilehdelle. Käytä aakkosnmeerisia merkkejä ja/tai väliviivoja (enintään 40 merkkiä). Näytetnns ja vastaava näytekvas sekä UDP-asema korostetaan sinisellä merkiksi siitä, että näyte on syötetty. 2 [Valinnainen] Voit valita positiiviset ja negatiiviset kontrollinäytteet napsattamalla näytekoppia hiiren oikealla painikkeella. 3 [Valinnainen] Syötä näytekvas näytteen Description (Kvas) -välilehteen. Näytekvas voi sisältää aakkosnmeerisia merkkejä, pisteitä ja erityismerkkejä `~!@#$%-_{}. Välilyönnit eivät ole sallittja. Jos näytekvakseen yhdistettävää näytetnnsta käytetään delleen myöhemmässä ajossa, alkperäinen näytekvas korvataan. 4 Mokkaa sosittja UDP-asemia tarpeen mkaan. Ehdotett näytekoppa-asemat korostetaan keltaisella, violetilla, oranssilla ja vaaleanpnaisella. Jos käytetään ehdotettja näytekoppia, ohjelmisto täyttää atomaattisesti UDP-indeksisovittimet, jotka vastaavat diversiteetti-indeksin vaatimksia. Mikäli valitsemiesi näytteiden määrä ei ole testaamiesi näytteiden tarkka määrä, varmista, että valitaan UDP-indeksisovittimet ylimääräisille kopille. 5 [Valinnainen] Valitsemalla Export Samples (Näytteiden vienti) voit viedä näytetietotiedoston. 6 Valitse Save Rn (Tallenna ajo). Näytetiedostojen tonti Voit toda näytetiedot näytetietotiedostosta, joka on aiemmin viety DNA GenerateFASTQ Dx -modlista Export Samples (Näytteiden vienti) -ominaisden tai mallitiedoston avlla. Se voidaan loda valitsemalla Template (Malli) Create Rn (Lo ajo) -näytöltä. Katso kohdasta Näytteiden syöttäminen manaalisesti sivlla 4 ohjeet näytetietojen lontiin ja vientiin. Mallitiedostoon ei sisälly atomaattisesti täytettyjä UDP-sositksia. Mallitiedoston mokkaaminen: 1 Valitse Template (Malline) Create Rn (Lo ajo) -näytöltä, jotta voit loda den levyasetteln. Mallinetiedosto sisältää oikeat sarakeotsikot tontia varten. Mokkaa tiedostoa seraavasti. a b c Avaa näytetiedosto tekstieditorissa. Anna vaaditt näytetiedot. Tallenna tiedosto modossa, jossa arvot erotetaan pilklla (*.csv). Varmista, että näytetnnkset ovat aintkertaisia. 4

5 Voit toda näytetiedot seraavasti: 2 Valitse Import Samples (To näytteet) ja valitse sitten CSV-tiedosto. 3 [Valinnainen] Valitsemalla Export (Vie) voit viedä näytetiedot lkoiseen tiedostoon. 4 Valitse Save Rn (Tallenna ajo). Ajon mokkaaminen Katso ennen sekvensointia tapahtvaa ajon tietojen mokkasta koskevat ohjeet asiakirjasta Local Rn Manager -ohjelmiston viiteopas MiSeqDx-järjestelmälle (asiakirjanro ). Analyysimenetelmät DNA GenerateFASTQ Dx -analyysimodli sorittaa seraavat analyysivaiheet ja kirjoittaa sitten analyysin totostiedostot Alignment (Kohdists) -kansioon. Demltipleksoidaan indeksireadit Lodaan FASTQ-tiedostot Demltipleksointi Demltipleksoinnissa verrataan ktakin Index Read -sekvenssiä ajoa varten määritettyihin indeksisekvensseihin. Tässä vaiheessa ei oteta homioon laatarvoja. Indeksireadit tnnistetaan sorittamalla seraavat vaiheet: Näytteet nmeroidaan alkaen 1:stä sen järjestyksen persteella, jossa ne on letelt ajoa varten. Näytenmero 0 on varatt klstereille, joita ei ole määrätty näytteeseen. Klsterit määrätään näytteeseen, kn indeksisekvenssi on tarkka osma tai kn indeksireadia kohti on enintään yksi yhteensopimattoms. FASTQ-tiedoston lonti Demltipleksoinnin jälkeen ohjelmistossa lodaan välianalyysitiedostoja FASTQ-modossa. Se on tekstimoto, jota käytetään sekvenssien esittämiseen. FASTQ-tiedostot sisältävät readeja kstakin näytteestä ja niihin liittyvistä laatpisteytyksistä. Ajossa käytetyt kontrollit ja klsterit, jotka eivät läpäisseet sodattimia, jätetään pois. Jokainen FASTQ-tiedosto sisältää readeja vain yhdestä näytteestä, ja kyseisen näytteen nimi sisällytetään FASTQ-tiedoston nimeen. FASTQ-tiedostot ovat kohdistksen pääasiallisia syötetietoja. Ajon ja tlosten tarkasteleminen 1 Valitse Local Rn Manager -koontinäytöltä ajon nimi. 2 Tarkista sekvensointiajon mittarit Rn Overview (Ajon yleiskatsas) -välilehdestä. 3 Voit mttaa analyysitietotiedoston sijaintia valitn ajon tlevaa delleen jonoon asettamista varten valitsemalla Edit (Mokkaa) -kvaketta ja mokkaamalla tlostsajon kansiopolka. Tlostsajokansion nimeä ei voida mokata. 4 [Valinnainen] Valitsemalla Copy to Clipboard (Kopioi leikepöydälle) voit kopioida totosajon kansiopoln. 5 Valitsemalla Seqencing Information (Sekvensointitiedot) -välilehden voit tarkastella ajoparametreja ja tarviketietoja. 5

6 6 Valitsemalla Samples and Reslts (Näytteet ja tlokset) -välilehden voit tarkastella analyysiraporttia. Mikäli analyysi asetettiin delleen jonoon, valitse asianmkainen analyysi avattavasta Select Analysis (Valitse analyysi) -lettelosta. Valitse vasemmasta navigointipalkista näytetnns, jotta voit tarkastella mn näytteen raporttia. 7 [Valinnainen] Kopioi analyysikansion tiedostopolk valitsemalla Copy to Clipboard (Kopioi leikepöydälle). Tlosraportti Reslts (Tlokset) tiivistetään Samples (Näytteet)- ja Reslts (Tlokset) -välilehdellä. Näytteet Talkko 1 Näytetalkko Sarakkeen otsikko Sample ID (Näytetnns) Plate (Levy) Index Well (Indeksikoppa) Description (Kvas) UDP Control (Kontrolli) Kvas Näytetnns, joka ilmoitettiin ajoa lotaessa. Indeksilevyn mkana ajon lonnin yhteydessä ilmoitettava levy. Sarake näytetään vain, jos valitaan indeksilevy AB. Näytekopan sijainnin mkana ajon lonnin yhteydessä ilmoitettava indeksikoppa. Näytekvas, joka ilmoitettiin ajoa lotaessa. Näytteen kanssa käytettävä UDP. Näytteen kanssa käytettävä positiivinen tai negatiivinen kontrolli. Indeksointi Talkko 2 Sarakkeen otsikko Index Nmber (Indeksinmero) Sample ID (Näytetnns) UDP Indeksointitalkko % Reads Identified (PF) (% tnnistettja readeja (PF)) Kvas Määritetty tnns, joka perst järjestykseen, jossa näytteet letellaan näytetalkossa. Näytetnns, joka ilmoitettiin ajoa lotaessa. Näytteen kanssa käytettävä UDP. Sodattimet läpäisseiden readien prosenttioss. Analyysin totostiedostot Seraavat analyysitloststiedostot lodaan DNA GenerateFASTQ Dx -analyysimodlille. Tiedostonimi Demltiplexing (*.demx) FASTQ (*.fastq.gz) Kvas Välitiedostot sisältävät demltiplexing-tloksia. Välitiedostot, jotka sisältävät laatpisteytykseen perstvia emästen tnnistksia. FASTQ-tiedostot ovat kohdistsvaiheen pääasiallisia syötetietoja. Demltipleksointi-tiedostomoto Demltipleksointiprosessissa letaan khnkin klsteriin liitetty hakemistosekvenssi klstereiden alkperänäytteen määrittämiseksi. Klstereiden ja näytenmeron välinen kartoits kirjoitetaan demltipleksointitiedostoon (*.demx) virtaskyvetin jokaisen rdn kohdalla. 6

7 Demltipleksointitiedoston nimeämismoto on s_1_x.demx, jossa X on rdn nmero. Demltipleksointitiedostojen alssa on otsikko: Versio (4-tavinen kokonaislk), tällä hetkellä 1 Klsterimäärä (4-tavinen kokonaislk) Tiedoston m osa koost rdn knkin klsterin näytenmeroista. Kn demltipleksointivaihe on valmis, ohjelmisto lo demltipleksointitiedoston nimeltä DemltiplexSmmaryF1L1.txt. Tiedostonimessä F1 edstaa virtaskyvetin nmeroa. Tiedostonimessä L1 edstaa kaistan nmeroa. Demltipleksoinnin tloksena syntyy talkko, jossa on yksi rivi rta kohti ja yksi sarake näytettä kohti, näyte 0 mkaan lettna. Indeksireadien yleisimmin ilmenevät sekvenssit. FASTQ-tiedostomoto FASTQ on tekstipohjainen tiedostomoto, joka sisältää emästen tnnistksia ja laatarvoja readia kohti. Jokaisessa tieteessa on 4 riviä: Tnniste Sekvenssi Pls-merkki (+) Phred-laatpisteytykset ASCII koodatssa modossa Tnniste motoillaan Readnmero:Sodatinlipp:0:Näytenmero 1:N:0:2 TCGCACTCAACGCCCTGCATATGACAAGACAGAATC + <>;##=><9=AAAAAAAAAA9#:<#<;<<<????#= Täydentävät totostiedostot Seraavissa totostiedostoissa annetaan täydentäviä tietoja tai tiivistetään ajotlokset ja analyysivirheet. Vaikka näitä tiedostoja ei tarvita analyysitlosten arviointiin, niitä voidaan käyttää vianmääritystarkoitksiin. Kaikki tiedostot sijaitsevat Alignment (Kohdists) -kansiossa, ellei mta ole ilmoitett. Tiedostonimi AdapterTrimming.txt AnalysisLog.txt Kvas Lettelo leikatista emäksistä ja emästen prosenttiosksista knkin rdn kohdalla. Tämä tiedosto on mkana vain, jos adapterin leikkas määritettiin ajoa varten. Prosessointiloki, jossa kvataan kaikki klloisenkin ajokansion analyysin aikana soritett vaiheet. Tämä tiedosto ei sisällä virheilmoitksia. Sijaitsee ajokansion päätasolla. 7

8 Tiedostonimi AnalysisError.txt CompletedJobInfo.xml Checksm.csv DemltiplexSmmaryF1L1.txt GenerateFASTQRnStatistics.xml Kvas Prosessointiloki, jossa letellaan analyysin aikana ilmenneet mahdolliset virheet. Tämä tiedosto on tyhjä, ellei virheitä ilmennyt. Sijaitsee ajokansion päätasolla. Kirjoitett analyysin valmistmisen jälkeen, sisältää tietoa ajosta, kten päivämäärän, virtaskyvetin tnnksen, ohjelmistoversion ja mita parametreja. Sijaitsee ajokansion päätasolla. Sisältää tiedostonimet ja aintkertaiset tarkistssmma-arvot määritettyjen ja määrittämättömien FASTQ-tiedostojen, BCL-tiedostojen sekä SampleSheetUsed.csv-tiedoston kohdalla. Demltipleksoinnin tlokset ilmoitetaan talkossa, jossa on 1 rivi rta kohti ja 1 sarake näytettä kohti. Sisältää ajokohtaiset tiivistetyt tilastot. Sijaitsee ajokansion päätasolla. Analyysikansio Analyysikansiossa on Local Rn Manager -ohjelmistossa lodt tiedostot. Totos- ja analyysikansion välinen shde tiivistetään seraavasti: Sekvensoinnin aikana reaaliaikainen analyysi (RTA, Real-Time Analysis) täyttää totoskansion kvaanalyysin, emästen tnnistamisen ja laadn pisteytyksen aikana lodilla tiedostoilla. RTA kopioi tiedostot analyysikansioon reaaliajassa. Kn RTA määrää laatpisteet knkin jakson kllekin emäkselle, ohjelmisto kirjoittaa tiedoston RTAComplete.xml molempiin kansioihin. Kn tiedosto RTAComplete.xml on mkana, analyysi alkaa. Analyysin jatkessa Local Rn Manager kirjoittaa totostiedostot analyysikansioon ja kopioi sitten tiedostot takaisin totoskansioon. Alignment (Kohdists) -kansiot Kn analyysi asetetaan delleen jonoon, Local Rn Managerissa lodaan kohdistskansio nimeltä Alignment_N, jossa N on peräkkäinen nmero. Kansion rakenne Tiedot Kohdists_## tai Kohdists_tot_## [Ajon aikaleima] Tietokäyttötiedostot Fastq FastqSmmaryF1L1.txt Sample1_S1_L001_R1_001.fastq.gz Sample2_S2_L001_R2_001.fastq.gz Undetermined_S0_L001_R1_001.fastq.gz Undetermined_S0_L001_R2_001.fastq.gz Kirjatminen BildFastq0.stdot.txt 8

9 BildFastq1.stdot.txt Kviot commands.txt AdapterConts.txt AdapterTrimming.txt AnalysisError.txt AnalysisLog.txt Checkpoint.txt Checksm.csv CompletedJobInfo.xml DemltiplexSmmaryF1L1.txt GenerateFASTQRnStatistics.xml SampleSheetUsed.csv Emästen tnnistaminen ja indeksin monimotoiss Kn näytteet sekvensoidaan MiSeqDx-laitteessa, emästen tnnistksella määritetään emäs (A, C, G tai T) tietyn rdn tai virtaskyvetin kvantamisaleen jokaista klsteria kohti tietyssä jaksossa. MiSeqDxlaitteessa käytetään nelikanavasekvensointia, joka edellyttää neljää kvaa neljän DNA-emäksen koodakseen, kahta pnaisesta ja kahta vihreästä kanavasta. Emäksen tnnistamisen indeksin readien prosessi eroaa emäksen tnnistamisesta miden readien aikana. Kn ajon lonnin aikana valitaan indeksejä, näkyviin tlee alhaisen diversiteetin varoits, jos indeksit eivät vastaa diversiteettivaatimksia. Valitse alhaisen diversiteetin varoitksen välttämiseksi indeksisekvenssejä, joilla saadaan signaali molemmista kanavista knkin jakson kohdalla. Pnainen kanava A tai C Vihreä kanava G tai T Tällä emästen tnnistsprosessilla varmistetaan tarkks kompleksiltaan matalia näytteitä analysoitaessa. Lisätietoja indeksiesi sekvensseistä on kohdassa Illmina DNA Prep With Enrichment Dx -pakkasseloste. Lotaessa ajoa Local Rn Managerissa valitset testattavien näytteiden määrän. Ehdotett indeksiyhdistelmät, jotka vastaavat indeksin diversiteettivaatimksia, täytetään atomaattisesti ohjelmistossa. Vaikka sinn ei tarvitse käyttää ehdotettja UDP-indeksiyhdistelmiä, se on sositeltavaa. 9

10 Versiohistoria Asiakirja Päivämäärä Mtoksen kvas Asiakirjanro v01 Tokok 2022 Lisätty astralialaisen rahoittajan osoite. Selvennetty näytekvaksen rajallistta. Asiakirjanro v00 Helmik 2022 Alstava jlkais 10

11 Tekninen tki Teknisissä kysymyksissä voit ottaa yhteyttä Illminan tekniseen tkeen. Verkkosivsto: Sähköposti: Illminan asiakasten phelinnmerot Ale Ilmainen Aleellinen Pohjois-Amerikka Alankomaat Astralia Belgia Espanja Etelä-Korea Hongkong, Kiina Irlanti Italia Itävalta Japani Kiina Norja Ranska Rotsi Saksa Singapore Somi Sveitsi Taiwan, Kiina Tanska Usi-Seelanti Yhdistynyt kningasknta Mt maat Käyttötrvallisstiedotteet (KTT) saatavilla Illminan verkkosivstolta osoitteesta spport.illmina.com/sds.html. Totedokmentaatio ladattavissa osoitteesta spport.illmina.com. 11

12 Illmina 5200 Illmina Way San Diego, California U.S.A ILMN (4566) (Pohjois-Amerikan lkopolella) Illmina Netherlands B. V. Steenoven DK Eindhoven Alankomaat Rahoittaja Astraliassa Illmina Astralia Pty Ltd Nrsing Association Bilding Level 3, 535 Elizabeth Street Melborne, VIC 3000 Astralia 2022 Illmina, Inc. Kaikki oikedet pidätetään.