Elatusaineiden toimivuuden varmistamiseen käytettävien mikrobisuspensioiden (SkimMilk) valmistus

Transkriptio

1 Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 1 / 5 Elatusaineiden timivuuden varmistamiseen käytettävien mikrbisuspensiiden (SkimMilk) 1. Periaate Työhjeen tarkittamat mikrbi (bakteeri)suspensit vat rasvattman (kuritun) maidn ja bakteeriviljelmän seksia, jissa bakteerien lukumäärä n määritetty. Niitä vidaan hyödyntää mm. elatusaineiden kvantitatiivisessa laadunvarmistuksessa tai validintikkeissa (tarkasti määritetty bakteerilisäys). Valmistettaessa suspensiita, bakteerikanta viljellään ensin tureeksi pakastusputkestaan (vertailukannan stkkiputki ) ja siirrstetaan ei-selektiiviseen rikastusliemeen. Viljellyn rikasteen mikrbipitisuus määritetään laimennssarjan ja maljaviljelyn avulla rikasteen dttaessa jääkaappilämpötilassa. Kun selvillä n suspensin teka varten spiva laimennstas ja maitn siirrstettava tilavuus, tehdään jääkaapissa säilytetystä rikasteesta uusi laimennssarja. Laimennssarjan viimeinen laimenns (haluttu pitisuus maitputkissa) tehdään rasvattmaan maitn. Maitsuspensi pipetidaan pakastusputkiin ja säilytetään -80 C:ssa. Näin valmistetut maitampullit säilyvät stabiileina bakteerilajista riippuen yleensä vuden (Schijven ym. 1994). Kuvattu menettely ei sellaisenaan svi tiettyjen pakastamisen kannalta herkkien bakteerilajien kuten Campylbacter ja Clstridium säilyttämiseen. Kampylbakteerisuspensiiden ja pakastus n hjeistettu tässä hjeessa erikseen. 2. Työturvallisuus Mikrbilgisessa labratrissa työskenneltäessä nudatetaan timintahjetta LAB 223. Valmistettaessa suspensiita STEC-kannista nudatetaan lisäksi timintahjetta LAB 741.

2 Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 2 / 5 3. Laitteet ja välineet 1) Mikrbilginen perusvälineistö 2) Pakastin -80 C 3) 4 ± 2 C jääkaappi 4) Lämpökaapit 25 C±1 C, 30 C±1 C, 37 C±1 C, 44 C±1 C riippuen bakteerin kasvuvaatimuksista 5) DiluShaker 4. Elatusaineet ja reagenssit 1) Veriagar tai TSA-agar 2) TSB-, BHI- tai BPW-liemi (bakteerin kasvuvaatimuksista riippuen vidaan krvata myös jllain muulla ei-selektiivisellä rikastusliemellä, esim. kampylbakteereille BRULIE) 3) 9 ml peptni-sulalius (PEPSU) tai 9 ml Dilucup 4) rasvatn (kurittu) mait (skim milk) 20 %, (Skim milk lius, 20 %) 50/100 ml 5) 2,0 ml pakastusputket 5. Suritus Alla leva hje sveltuu suurimmalle salle mikrbikantja. Kampylbakteerisuspensiiden n kuvattu tämän työhjeen khdassa 6. Päivä 0 1. Tee pakkasstkista puhdasviljelmä verimaljalle tai TSA:lle ja inkubi kannalle spivassa, menetelmähjeen mukaisessa lämpötilassa h. Viljeltyjä maljja saa käyttää vain mikrbisuspensiiden valmistukseen. Päivä 1 2. Siirrsta bakteeripesäke 1 µl silmukalla 10 ml:aan ei-selektiivistä rikastuslientä (TSB, BHI tai BPW) ja inkubi kuten edellä. Bakteerin kasvuvaatimuksista riippuen vidaan krvata myös jllain muulla valikimattmalla rikastusliemellä, esim. kampylbakteereille BRULIE (khta 6). Päivä 2 3. Tee liemestä laimennssarja -8 asti (tai bakteerin tunnetun kasvun mukaan) ja viljele klmesta suurimmasta peräkkäisestä laimennksesta 0,1 ml, jllin määrä maljilla vastaa laimennksia -7, -8 ja -9. Viljele laimennkset kahdelle rinnakkaiselle maljalle (TSA/veriagar). Säilytä liemiviljelmä 4 ± 2 C:ssa siihen asti, kunnes viljelyn tuls n selvillä. Inkubi kannalle spivassa, menetelmähjeen mukaisessa, lämpötilassa bakteerista riippuen 24 tai 48 h.

3 Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 3 / 5 Päivä 3 1. Määritä rikastusliemen pitisuus laimennssarjasta tehtyjen maljjen perusteella. 2. Saadun tulksen perusteella määritetään spiva laimenns, jlla rikastusliemestä vidaan valmistaa halutun vahvuinen maitsuspensi. - Elatusaineiden tuttavuustestauksen testikannat: pmy/0,1 ml - Elatusaineiden kvalitatiivinen, selektiivisyys- ja spesifisyystestaus: 10 4 pmy/0,1 ml Lisättävän rikasteen suus saa lla maksimissaan 10 % maitsuspensin kknaistilavuudesta. Laimennsten laskemiseen ja suspensiiden valmistamisen dkumentintiin käytetään lmaketta LAB Täytä lmake ja tulsta se työkirjaksi ja dkumentiksi. 4. Valmista maitsuspensi: Tee rikastusliemestä uusi laimennssarja ja lisää edellä määritettyä laimennsta spiva tilavuus. Pipetitavan tilavuuden vi pyöristää lähimpään 10 µl:aan. Js kannan tiedetään rikastuvan kylmäsäilytyksen aikana (esimerkiksi Listeria mncytgenes, Yersinia pseudtuberculsis), tilavuuden vi pyöristää alaspäin lähimpään 100 µl:aan. Merkitse tekemäsi muutkset lmakkeelle LAB Sekita hyvin, ja jaa pakastettava maitsuspensierä pakastusputkiin 1,5 ml:n eriin. Sekita suspensiita pipetinnin aikana sillin tällöin. 6. Suspensin pitisuuden määrittämiseksi pipeti TSA:lle/veriagarille - Tuttavuustestaus ( pmy/0,1 ml): viljele 0,1 ml suspensita neljälle rinnakkaiselle maljalle. - Vahvat suspensit (10 4 pmy/0,1 ml): valmista suspensista laimennssarja 10 4 asti. Viljele laimennksista -2, -3 ja µl kahdelle rinnakkaiselle maljalle (maljalla -3, -4, -5). Inkubi kuten edellä (päivä 2). 7. Pakasta välittömästi -80 C:een. Suspensi n pakastettava viimeistään 2 h kuluessa sen ten alittamisesta, ja sitä n säilytettävä jääkaappilämpötilassa js työ keskeytyy.

4 Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 4 / 5 Päivä 4 1. Laske valmistetusta mikrbisuspensista viljellyt maljat. Tulsten laskeminen - - Tuttavuustestaus ( pmy/0,1 ml): neljän maljan keskiarv - - Vahvat suspensit (10 4 pmy/0,1 ml): laske suspensin pitisuus timintahjeen LAB 703 mukaisesti. Humaa, että laskemasi tulksen yksikkö n pmy/1 ml. Muuta tuls pitisuuteen pmy/100 µl jakamalla saamasi tuls 10:llä. 2. Merkitse maitsuspensin tteutunut pitisuus työpapereihin ja serverillä ylläpidettävään elatusainetestauksen mikrbisuspensilistaan. Kun tarvitset mikrbisuspensita, sulata sitä huneenlämmössä krkeintaan 30 minuuttia. Vaihtehtisesti sulata suspensita yön yli jääkaapissa tai esim. +37 C lämpökaapissa krkeintaan 30 minuuttia. 6. Kampylbakteerisuspensiiden Päivä 1 Siirrsta bakteeripesäke 10 ml:aan brusella-lientä (BRULIE). Inkubi 24 tuntia 37 C:ssa mikraerbisissa lsuhteissa. Päivä 2 Pipeti 0,1 ml liemiviljelmää 30 ml:aan BHI-lientä. Lisää sekseen 3 ml steriiliä glyserlia (pitisuuteen 10 %). Pakasta ses 1,5 ml:n erissä -80 C:een. Kampylbakteerien määrä seksessa vähenee pakastuksen yhteydessä humattavasti. Tämän takia seksen knsentraati määritetään vasta pakastetusta suspensista. Päivä 3 Sulata kaksi putkea. Tee mlemmista putkista laimennussarja 10-4 :een ja viljele kaikki laimennkset kahdelle rinnakkaiselle verimaljalle viljelmän pitisuuden määrittämiseksi. Odtettu pitisuus n nin pmy/100 µl Tulsten perusteella valitaan laimennustas, jhn sulatettu suspensi laimennetaan siten, että saadaan pitisuudeksi pmy /100 µl. Merkitse laimennshje niihin työkirjihin, jissa kampylbakteerisuspensiita tarvitaan. Pakastetun seksen knsentraati pysyy muuttumattmana ainakin kuusi kuukautta.

5 Vastuuhenkilö Kirsi-Maria Eklund Sivu/sivut 5 / 5 7. Viitteet Schijven, J.F., Havelaar, A.H. ja Bahar, M A simpele and widely applicable methd fr preparing hmgenus and stable quality cntrl samples in water micrbilgy. Applied and envirnmental micrbilgy: Nv. s SFS-EN ISO 11133:2014. Elintarvike-, rehu- ja vesimikrbilgia. Kasvualustjen, tutant, säilytys ja timivuuden testaus Niemelä, S. HAMBI 220: Sisäisen vertailunäytteen. Pakastusmenetelmä Muutkset edelliseen versin Pistettu maininta suspensiiden ELMO-kirjauksesta Tarkennettu suspensiiden käyttökhteet ja muutettu Elatusaineiden kvalitatiivinen, selektiivisyys- ja spesifisyystestauksen knsentraati 10 5 pmy/0,1 ml:sta 10 4 pmy/0,1 ml Lisätty kampylbakteerisuspesiiden hje Tarkennettu suspensiiden hjetta Tarkennettu hjeen nimeä Tarkennettu pitisuuksien laskemisen hjeistusta Tarkennettu kampylbakteerisuspensiiden hjetta Pieniä krjauksia kieliasuun Ylätunniste päivitetty rganisaatimuutksen ( ) mukaisesti. Tekninen päivitys.