OLIGONUKLEOTIDIEN DERMAALINEN ANNOSTELU

Transkriptio

1 OLIGONUKLEOTIDIEN DERMAALINEN ANNOSTELU Seminaariesitelmä Pro gradun teoreettisesta osuudesta Ville-Matti Mäkinen Farmasian teknologian osasto, Farmasian tiedekunta, Helsingin yliopisto TIIVISTELMÄ Oligonukleotidit ovat nukleiinihapporakenteisia molekyylejä, joita voidaan käyttää terapeuttisesti proteiinisynteesin estämiseen mm. nk. antisense-tekniikassa. Modifioimalla ja derivatisoimalla oligonukleotideja kemiallisesti, voidaan niistä tehdä paremmin lääkeaineen vaatimukset täyttäviä molekyylejä. Oligonukleotideja on tullut jo jonkin verran kliiniseen käyttöön mm. eräiden harvinaisten sairauksien hoitoihin. Ne eivät ole kuitenkaan vielä mullistaneet lääkehoitoja. Oligonukleotidihoitoja kehitetään par aikaa usealla eri rintamalla. Myös ihosairauksien hoidossa on useita mahdollisia kohteita. Iho onkin antisense-tekniikan kannalta eräs tällä hetkellä helpoiten lähestyttävissä olevista elimistä. Ihon fyysinen suojamuuri stratum corneum estää kuitenkin oligonukleotidien kaltaisten suurien, hydrofiilisten ja varautuneiden molekyylien passiivisen annostelun. Erilaisia fysikaalisia ja kemiallisia apumenetelmiä kehittämällä muunneltuja oligonukleotideja onnistutaan annostelemaan kuitenkin yhä paremmin ihoon tai sen läpi. Oligonukleotidianalogin rakenne voi vaikuttaa siihen, soveltuuko se paremmin systeemiseen vai paikalliseen hoitoon. Myös eri annostelumenetelmillä voidaan mahdollisesti kohdentaa oligonukleotidi joko transdermaaliseen tai ihon paikalliseen terapiaan. Useasta eri annosteluun liittyvästä muuttujasta tarvitaan kuitenkin vielä paljon tietoa. SISÄLTÖ 1. ALKUSANAT 1 2. OLIGONUKLEOTIDIANALOGIT LÄÄKEAINEINA 1 3. OLIGONUKLEOTIDIEN DERMAALISEN IMEYTYMISEN EDISTÄMINEN 4 4. OLIGONUKLEOTIDIEN METABOLIA IHOSSA 7 5. IHON PAIKALLISTERAPIA VS. TRANSDERMAALINEN TERAPIA 9 6. OLIGONUKLEOTIDIT IHOSAIRAUKSIEN HOIDOSSA YHTEENVETO KIRJALLISUUSVIITTEET 11 0

2 1. ALKUSANAT Lääkehoidon piiriin on luvassa tulevaisuudessa uusia täsmällisesti vaikuttavia nukleiinihappolääkeainemolekyylejä. Tällaisia ovat esimerkiksi oligonukleotidit. Antisense-, antigeenitekniikka ja geeniterapia, joissa nukleiinihappomolekyylejä käytetään, ovat olleet lähes kolmen viime vuosikymmenen aikana vilkkaan tutkimuksen kohteena (Wraight ja White 2001). Mahdollisina kohteina ihon paikallisessa antisense-terapiassa ovat etenkin ihosyövät, ihon virustaudit, kuten HSV ja papillooma, sekä jotkin sieni- ja alkueläininfektiot (Regnier 1998, Wraight ja White 2001). Osa lupaavista antisense-molekyyleistä on edennyt jo kliiniseen käyttöön, vaikka tehokkaita täsmälääkkeitä joudutaan odottamaan vielä vuosia. Antisense-oligonukleotidien käyttöön in vivo liittyy kuitenkin lukuisia ratkaisemattomia ongelmia, kuten huono kulkeutuminen vaikutuspaikkaansa solun sisälle, sekä farmakokinetiikkaan ja toksisuuteen liittyvät ongelmat (Crooke 1997). Oligonukleotidit metaboloituvat nopeasti ruoansulatuskanavassa ja imeytyvät sieltä huonosti verenkiertoon. Laskimonsisäisesti (i.v.) annosteltuina oligonukleotidien on taas säilyttävä riittävän kauan stabiileina veressä, kunnes ne saavuttavat kohteensa ja voivat vaikuttaa (Wraight ja White 2001). Peroraaliselle ja laskimonsisäiselle annostelureitille vaihtoehtoisia kuljetusreittejä on haettu varsinkin ihosta, sillä korkean negatiivisen varauksensa ja suuren kokonsa puolesta oligonukleotidit eivät sovellu hyvin esim. pulmonaarisesti tai nasaalisesti annosteltuina (Oldenburg 1995). Oligonukleotidien transdermaalisista kuljetusmekanismeista ja niiden sovelluksista on kirjoitettu melko paljon, mutta vasta viime vuosina on kiinnitetty myös erityistä huomiota ihoon paikallisena oligonukleoditerapian kohteena. Iho on helposti lähestyttävä elin, ja ihoon annosteluun liittyy huomattavasti vähemmän systeemistä toksisuutta kuin i.v.-annosteluun (Wraight ja White 2001). Lisäksi eri annostelumenetelmät ihoon tarjoavat kivuttoman vaihtoehdon i.v.-annostelulle. Toisaalta ihoannosteluun liittyy myös omia haasteita, kuten ihon sarveiskerroksen (stratum corneum) läpäiseminen. 2. OLIGONUKLEOTIDIANALOGIT LÄÄKEAINEINA Oligonukleotideja käytetään terapeuttisesti mm. tunnetummassa antisense-strategiassa, jossa estetään spesifisesti translaatio ja vähemmän tutkitussa antigeeni-strategiassa, jossa estetään transkriptio. Antisense merkitsee vastakkaista sense :lle, joksi kutsutaan mrna:ssa esiintyvää emäskoodia (Walsh 2004, Wraight ja White 2001). Antisense-strategiassa saatetaan tunnetun spesifisen emäsjärjestyksen omaava farmakologisesti aktiivinen oligonukleotidi solun sisälle. Solulimaan päästyään oligonukleotidi kulkeutuu nopeasti tumaan, mikä on niiden tärkein vaikutusalue (Phillips ja Zhang 1999). Täällä se muodostaa kaksikierteisen riittävän pysyvän hybridin kohteena olevan Kuva 1. RNA/DNA-hybridin rakenne ja emäkset. vastakkaisen emäsjärjestyksen omaavan mrna:n kanssa (Walsh 2004, Phillips ja Zhang 1999). Yhdistymällä mrna:han oligonukleotidi estää sen sitoutumisen ribosomiin. Näin mrna:n translaatio estyy, eikä solu tuota enää tietyille sairauksille tyypillisiä proteiineja. Siten proteiinin synteesiä voidaan antisense-tekniikan avulla säädellä teoriassa hyvinkin valikoivasti. 1

3 Kun oligonukleotidi on tarpeeksi pitkä, vähintään 17 nukleotidin pituinen, on sen emäsjärjestyksen sisältämän informaation laskettu stokastisesti olevan ainutlaatuinen koko ihmisen genomissa, jossa on nykytietämyksen mukaan yli 3 miljardia emäsparia. Molekyyliä pidetään näin ollen teoriassa äärimmäisen täsmällisenä vaikutukseltaan. Tavallisesti antisense-oligonukleotidit ovat nukleotidin pituisia. Lyhyemmät alkavat olla epäspesifisiä, pidemmät taas kulkeutuvat huonosti soluun ja voivat sitoutua proteiineihin (Phillips ja Zhang 1999). On todettu oleelliseksi tehokkaan translaation estämisen kannalta, että oligonukleotidi toimii RNaasi H -entsyymin substraattina ja katalysoi näin RNaasi H:n aikaansaaman mrna:n hajoamisen (Walsh 2004, Phillips ja Zhang 1999, Crooke 1997). RNaasi H:n substraattina voivat toimia vain luonnolliset oligonukleotidit, fosforotioaatti- ja boranofosfonaattioligonukleotidit sekä tietyt osittain modifioidut näiden analogit. Antisense-oligonukleotidien rakenteesta riippuen sen vaikutusmekanismi voi vaihdella. Jotkin oligonukleotidit, kuten metyylifosfonaattioligonukleotidit, tiettävästi estävät steerisesti ribosomissa tapahtuvaa translaatiota sitoutuessaan kohde-mrna:han. Oligonukleotidien melko universaalit mahdollisuudet terapeuttisessa käytössä perustuvat ensinnäkin laajaan tietämykseen siitä, että useaan sairauteen tai niiden oireisiin liittyy joko suoraan tai välillisesti jonkin proteiinin tuotantoa (Walsh 2004). Toiseksi on paljon in vitro ja in vivo näyttöä siitä, että sopivalla oligonukleotidimolekyylillä voidaan estää tai vähentää tällaisen proteiinin tuotantoa solussa, kun tunnetaan riittävästi proteiinia koodaavan geenin tai mrna:n rakenteesta. Sairauteen liittyvä proteiini voi olla esimerkiksi elimistön ulkopuolinen, kuten virusproteiini, tai elimistössä liiallisesti tuotettu, normaalisti tuottamaton tai jollain lailla sairauden tilaan vaikuttava proteiini (Wraight ja White 2001). Ero perinteisiin, pääasiassa pienimolekyylisiin lääkeaineisiin vaikutusmekanismin suhteen on siinä, että proteiiniin vaikutetaan tavallaan jo ennen, kuin se syntyy. Antisense-oligonukleotidin on lääkeaineena kuitenkin täytettävä monia ehtoja, ennen kuin se voi toimia terapeuttisesti. Sillä on oltava ainutlaatuinen sekvenssi ja kemiallinen rakenne, joka mahdollistaa spesifisen hybridisaation kohteena olevan mrna:n kanssa (Phillips ja Zhang 1999, Akhtar ym. 2000). Rakenteen on myös taattava molekyylille riittävä stabiilius fysiologisessa ympäristössä niin solujen sisä- kuin ulkopuolellakin. Oligonukleotidien pitää kulkeutua hyvin solun sisälle, ja niiden määrän on kasvettava solun sisällä enemmän, kuin niitä kulkeutuu solusta ulos. Oligonukleotidit eivät saa myöskään solun sisällä jäädä vesikkelien sisään, vaan niiden on jakaannuttava tasaisesti solulimaan, josta ne voivat lokalisoitua lopulta aktiivisiin vaikutuskohtiinsa kohteena olevaan mrna:han. Lopulta niiden tulee toimia sekvenssispesifisesti. Kohteen sekundaarirakenne ei saa myöskään häiritä sitoutumista mrna:n tiettyyn kohtaan. Edellisten lisäksi oligonukleotidit eivät saisi häiritä elimistön omia proteiineja sitoutumalla niihin (Phillips ja Zhang 1999). Sitoutumalla proteiineihin ne voivat aiheuttaa häiriöitä elimistön normaaleissa toiminnoissa tai esim. lääkeinteraktioita mm. kilpailemalla kuljetusproteiineista (Akhtar ym. 2000). Oligomukleotidien pitoisuuden on pysyttävä solussa riittävän suurena suhteessa estettävän proteiinin in vivo -aktiivisuuteen ja kinetiikkaan elimistössä. Kohdeproteiinin ja mrna:n on vähennyttävä terapian seurauksena, ja vaikutuksen tulee olla tasainen (Phillips ja Zhang 1999). Muunneltu oligonukleotidi ei saa olla toksinen, ja se ei saa laukaista immunologista vastetta (ellei se ole sen tarkoitus). Se ei saa olla myöskään mutageeninen (Crooke 1997). Mahdollisia genotoksisia mekanismeja joskin epätodennäköisiä tiedetään ainakin kaksi (EMEA 2005). Muuntelemattomat luonnonmukaiset oligonukleodit eivät täytä edellä 2

4 esitettyjä vaatimuksia, vaan systeemisesti annosteltuna mm. erittyvät nopeasti munuaisten kautta, kulkevat huonosti biologisten membraanien läpi ja pilkkoutuvat nopeasti nukleaasien vaikutuksesta (Agrawal ja Zhang 1998) Oligonukleotidien rakenteellisella muuntelulla on pyritty pidentämään etenkin oligonukleotidien biologista elinikää solussa, lisäämään niiden kulkeutumista solujen sisälle sekä parantamaan niiden hybridisaatiotehokkuutta mrnamolekyylin kanssa (Wallace ja Cossum 1998). Lisäksi muuntelulla on merkitystä oligonukleotidin kohdentamisessa ja biologisessa hyväksikäytettävyydessä sen annostelutavasta ja kohdekudoksesta riippuen. Luultavasti on mahdollista kehittää oligonukleotianalogeja, jotka ovat suhteellisen selektiivisiä tietyille kudoksille. Oligonukleotidien muuntelussa on kuitenkin tärkeää, ettei mikään molekyylin ominaisuuksien parantuminen tapahdu oligonukleotidin hybridisaatiotehokkuuden kustannuksella. Luonnonmukaisten oligonukleotidien muuntelu on tapahtunut substituoimalla joitakin sen rungon osia, kuten fosfodiesterisidokset tai fosforikeskusatomi, muuntelemalla sokerirenkaita tai emästähteitä, liittämällä sopiva molekyyli oligomeerin 3 - tai 5 -päähän tai yhdistelemällä eri muuntelustrategioita (Kuva 2). Antisense-oligonukleotidien modifikointi on ollut koko viime vuosikymmenen vilkkaan tutkimuksen kohteena, ja uusia parempia oligonukleotidimuunnoksia pyritään kehittämään edelleen (Kuva 3). Esimerkiksi Seeberger ja Caruthers (1998) ovat esittäneet laajan katsauksen erilaisista antisense-oligonukleotidimodifikaatioista. Kuva 2. Oligonukleotidien muuntelustrategioita. Kuva 3. Erilaisia muunneltuja nukleotideja. (Seeberger ja Caruthers 1998). (Smith ym. 2000) Antisense-oligonukleotidien kohdentaminen tiettyihin soluihin ja niiden heikko kulkeutuminen solujen sisälle aina vaikutuspaikkaan asti ovat tuottaneet tutkijoille merkittävästi päänvaivaa, ja ne lienevät suurimpia ongelmia, joita liittyy antisense-oligonukleotidien terapeuttiseen käytettävyyteen (Dokka ja Rojanasakul 2000). Suuri koko (5 10 kda) ja negatiivinen varaus ehkäisevät soluunottoa (Stein ja Cheng 1993). Useiden tutkimusten perusteella tiedetään, että oligonukleotidien kulkeutuminen soluun ilman kantajaa on aktiivinen prosessi, joka vaatii energiaa (Dokka ja Rojanasakul 2000). Oligonukleotidien soluunottoa on yritetty parantaa erilaisilla kantajakomplekseilla, kuten liposomeilla ja kationisilla lipideillä, liittämällä niihin erilaisia kuljettajamolekyylejä tai adsorboimalla niitä polymeerinanopartikkeleihin, kuten polysyanoakrylaatin (Dokka ja Rojanasakul 2000, Tari 1999, Williams ym. 1999). Tällöin hyödynnetään endosytoosia kuljetuksessa solun sisälle. Myös reseptorivälitteisellä endosytoosilla on voitu parantaa erilaisten oligonukleotidien soluunottoa käyttämällä kantajana esim. transferriiniä tai foolihappoa (Dokka ja Rojanasakul 2000). En- 3

5 dosytoosiin liittyvät kohdentamisstrategiat ovat kuitenkin vielä siitä heikkoja, että päästyään soluun sisälle oligonukleotideilla on taipumus kumuloitua solun vesikkeleihin. Näistä suurimman osan solu ennen pitkää poistaa solun ulkopuolelle, tai ne metaboloituvat solun lysosomeissa (Kuva 4). Oligonukleotideja on kytketty lisäksi erilaisiin peptideihin, joiden avulla ne kulkeutuvat soluun aktiivisessa kuljetusprosessissa, ja joista ne vapautuvat solussa joko ajautumatta lainkaan endosomeihin tai vapautumalla niistä (Hong ym. 2004). Ihon ensimmäiset elävät solut, joihin oligonukleotidit (trans)dermaalisessa antotavassa kulkeutuvat, ovat kertatinosyyttejä. Keratinosyytit poikkeavat monista muista elimistön solutyypeistä antisense-tekniikan kannalta sikäli, että oligonukleotidit voivat kulkeutua keratinosyyttien sisälle endosytoosilla ilman kumuloitumista endosomien sisälle. Keratinosyyttejä pidetäänkin suhteellisen herkkänä kohteena oligonukleotideihin perustuvalle terapialle (Noonberg ym. 1993, Nestle ym. 1994). Kuva 4. Oligonukleotidien jakautuminen solun sisällä. Mikäli oligonukelotidit tulevat soluun aktiivisella kuljetuksella, on niiden vapauduttava endosomeista solulimaan ja kulkeuduttava edelleen tumaan (Dokka ja Rojanasakul 2000). 3. OLIGONUKLEOTIDIEN DERMAALISEN IMEYTYMISEN EDISTÄMINEN Iho on elimistön uloimpana oleva elin, joka erottaa elimistön ympäristöstä. Yksi ihon tärkeimpiä tehtäviä onkin toimia suojamuurina ulkomaailmaa vastaan, ehkäistä elimistölle vieraiden yhdisteiden pääsyä elimistöön (Täuber 1989). Ihon uloin kerros, stratum corneum toimii ihon merkittävänä fyysisenä esteenä hydrofiilisille, suurille ja sähköisesti varautuneille tai hyvin polaarisille yhdisteille (Täuber 1989). Stratum corneum on muodostunut kuolleista keratinosyyteistä, joita erottaa toisistaan levymäisesti kerrostuneet jatkuvat lipidikerrostumat. Nämä kerrostumat koostuvat pääasiassa keramideista, vapaista rasvahapoista ja kolesterolista ja muodostavat fysiologisissa lämpötiloissa hyvin tiukan ja joustavan rakenteen. Oligonukleotidit eivät läpäisseet Whiten ym. (2002) tutkimuksessa lähes lainkaan hiirelle siirretyn ihmisen ihoa 24 tunnin aikana, kun niitä annosteltiin vesiliuoksena iholle. Kun ihon sarveiskerros poistettiin, oligonukleotidit imeytyivät orvasketeen ja etenkin orvaskedessä esiintyvien keratinosyyttien tumiin asti. Oligonukleotidit imeytyvät helposti myös psoriasista sairastavan ihon läpi vesiliuoksena, koska psoriasiksessa sarveiskerros hilseilee pois (White ym. 2002). Nämä esimerkit havainnollistavat hyvin sarveiskerroksen oligonukleotidien annostelua estävän luonteen, kun imeytymiseen ei vaikuteta apumenetelmillä tai formulaatiolla. Ihon aukkojen osuus on vain 0,1 % kokonaispinta-alasta, joten niiden merkitys passiivisena kulkureittinä on vähäinen (Suhonen 1997). Oligonukleotidien kaltaisten molekyylien annostelussa niillä on kuitenkin merkitystä (Lieb ym. 1997, Alexeev ym. 1998, Alexeev ym. 2000, Wu ym. 2001, Dokka ym. 2005). Karvatuppien kautta on saatu eri menetelmillä imeytymään terapeuttisesti merkittäviä määriä oligonukleotideja. Alueilla, joilla on runsaasti karvatuppia, on imeytyminen ihoon tehokkaampaa, sillä suurimolekyyliset yhdisteet pääsevät tällöin stratum corneumin ohi imeytymällä huokosten kautta ihon soluihin. 4

6 Eri menetelmät, joilla tehostetaan lääkeaineiden perkutaanista annostelua perustuvat kahteen strategiaan: ihon läpäisevyyden lisäämiseen ja/tai ulkoisen kuljetusta lisäävän voiman hyväksikäyttöön. Näissä strategioissa (trans)dermaalista kuljetusta voidaan tehostaa erilaisilla mekanismeilla: (1) lisäämällä lääkeaineen lipidiliukoisuutta lääkevalmisteen formulaatiossa tai lisäämällä sen jakautumista stratum corneumin läpi (esim. kemiallisten enhanserit); (2) lisäämällä sähköisesti varautuneiden ionien siirtymistä elektronisen sähkökentän gradientin avulla (iontoforeesi ja elektroporaatio); (3) vaikuttamalla kulkeutumiseen hiukkasten johtuvuuden aiheuttaman virtauksen avulla (esim. elektro-osmoosi iontoforeesissa tai pakotettu kuljetus ultra-äänen aiheuttaman paineen avulla); (4) lisäämällä ihon sisäisiä diffuusiotekijöitä ihon rakenteellisen muuntelun avulla (kemialliset enhanserit, iontoforeesi, elektroporaatio ja sonoforeesi); (5) käyttämällä mikroneuloja mekaanisena kulkureittinä suoraan annosteltavaan paikkaan ihon läpi; (6) vaikuttamalla usealla mekanismilla yhtäaikaisesti (esim. käyttämällä iontoforeesin lisäksi samanaikaisesti mikroneuloja tai elektroporaatiota) Kemialliset enhanserit muuntavat stratum corneumin rakennetta ja parantavat lääkkeiden läpäisevyyttä ihon läpi. Ne lisäävät sekä hydrofiilisten että lipofiilisten molekyylien kulkeutumista ihon läpi, mutta eivät merkittävästi suurten molekyylien. Niiden toimintamekanismeja ovat lipidirakenteen hajottaminen, molekyylin liukoisuuden lisääminen formulaatiossa, parantunut jakautuminen stratum corneumiin tai vuorovaikutus startum corneumin hydrofiilisen osan kanssa (Hadgraft ja Guy 1989). Enhansereiden käyttö ei kuitenkaan lisää oligonukleotidien soluunottoa syvemmällä ihossa oleviin soluihin (Wingens ym. 1999). Transdermaalisessa annostelussa on myös ratkaisevaa kulkeutuminen ihon eläviin soluihin, etenkin kun keratinosyytit ottavat helposti oligonukleotideja sisälleen (Brand ym II ). Enhansereina voidaan käyttää esim. esim. etanolia, heksanolia, oktanolia ja öljyhappoa (Potts ym. 1991). Kapseloimalla lääkeaineita esim. liposomi-, niosomi- ja transferosomi-vesikkeleihin voidaan parantaa joidenkin molekyylin kulkeutumista ihon läpi. Nämä vesikkelit jakautuvat tehokkaammin stratum corneumiin kuin lääkeaineet yksinään. Kationisia lipidejä on käytetty kuljettamaan negatiivisesti varautuneita oligonukleotideja stratum corneumin läpi, ja ne toimivat samalla lääkevarastoina sekä lisäävät ihon läpäisevyyttä. Joitakin liposomeja on erityisesti kohdennettu karvatuppeihin (Hoffman 1997, Weiner 1998). Dokkan ym. (2005) mukaan oligonukleotideja voidaan annostella transdermaalisesti karvatuppien kautta, mutta vain lipidiformulaationa. Muuten oligonukleotidit kumuloituvat karvatuppeihin. Kuitenkin karvatuppien sisällä jakautuessaan yhdisteen polaarisuus on eduksi, joten formulaation lipo-/hydrofiilisyystasapaino on tärkeää imeytymisen kannalta (Dokka ym. 2005). Enhansereiden käytön hyöty riippuu ihon läpi kuljetettavan lääkkeen ominaisuuksista. Sähköisesti neutraaleja morfolino-oligonukleotideja on annosteltu passiivisesti yhdessä polyetyleeniglykolin ja linolihapon kanssa. Niitä on saatu näin annosteltua rotille 20 kertaa suurempi pitoisuus kuin annostelemalla sähkövirran avulla vastaavia fosforotioaattimolekyylejä (Brand 2000). Niillä saatiin aikaan systeeminen vaste CYP 3A2 -entsyymin estossa (Arora ym. 2004). Brandin ym. (2000) mukaan oligonukleotidien annostelu transdermaalisesti tullee tapahtumaan todennäköisimmin passiivisesti kemiallisten enhasereiden avulla, koska tämä on monessa suhteessa yksinkertaisempaa kuin fysikaalisten menetelmien käyttö. Iontoforeesissa käytetään ihon läpäisemiseksi apuna alhaista sähkövirtaa (< 0.5 ma/cm 2 ) ja pientä jännitettä (Delgada-Charro ja Guy 1998). Virta voi olla tasaista tai pulssittaista. Annostelu kestää joistakin minuuteista muutamiin tunteihin. Iontoforeesi perustuu kolmeen mekanismiin: elektorepulsioon, eletkro-osmoosiin ja ihon permeabiliteetin lisääntymiseen (pienten huokosten syntymiseen). Näistä kaksi ensin mainittua ovat tärkeimmät (Green 1996). Elektro- 5

7 repulsio johtuu molekyylien ja sähkökentän välisestä vuorovaikutuksesta, elektro-osmoosi taas johtuu veden virtauksesta anodin ja katodin välillä. Tärkeimmät kuljetusreitit stratum corneumin läpi iontoforeesissa ovat ihon huokoset ja rasvamatriksi sarveistuneiden solujen välillä. Iontoforeesin haittana on ihoärsytys, mutta sitä pidetään alhaisella sähkövirralla turvallisena ja siedettävänä menetelmänä. Se soveltuu erityisesti hydrofiilisten ja alle 10 kda kokoisten molekyylien annosteluun ihon läpi (Guy ym. 1992, Green 1996, Turner ym. 1997). Iontoforeesia oligonukleotidien (trans)dermaalisessa annostelussa ovat tutkineet mm. Vlassov ym. (1994), Oldenburg ym. (1995), Brand ja Iversen (1996), Brand ym. (1998 I-II ), Brand ym. (2001), Aramaki ym. (2003) ja Sakamoto ym. (2004). Makromolekyylien annostelussa iontoforeesin tehon kannalta on oleellista molekyylin varaus sen kokoon nähden. Iontoforeesin käytettävyyttä voi kuitenkin myös estää oligonukleotidin suuri anioninen sähkövaraus, koska se estää molekyylien imeytymisen soluihin (Stein ja Cheng 1993). Yleensä samankokoisen anioinin kuljettaminen stratum corneumin läpi on vähäisempää kuin vastaavan kationin, koska kationit kulkevat myös elektro-osmoosin avulla virtauksen suuntaisesti (Delgada-Charro ja Guy 1998). Aiemmin on esitetty, että todennäköisesti iontoforeesia voidaan käyttää vain oligonukleotidien paikalliseen annosteluun. Mm. Li ym. esittivät (2001) että, transdermaalisella iontoforeesilla ei todennäköisesti voida saavuttaa ihmiselle terapeuttisesti tyydyttäviä pitoisuuksia systeemiseen terapiaan. He perustelivat laskelmiaan sovelletulla Nernst-Planckin diffuusiomallilla käyttäen kokeessaan kuutta eripituista oligonukleotidia ja ihmisen ihoa in vitro. Tässä mielessä iontoforeesi olisi käyttökelvollinen nimeen omaan ihon paikalliseen terapiaan. Yhä potentimpien oligonukleotidianalogien tullessa tutkimuksiin saattaa tilanne kuitenkin muuttua. Brandin mukaan transdermaalinen annostelu iontoforeettisesti rotalle ja systeemisen vasteen aikaan saaminen C-5-propyynianalogilla on mahdollista (Brand ym. 2001). Pulssittaisella PDP-iontoforeesilla on saatu kuitenkin ihon soluihin annosteltua terapeuttisesti merkittäviä määriä oligonukleotideja vähäisellä ihoärsytyksellä (Aramaki ym. 2003, Sakamoto ym. 2004). Toisin kuin iontoforeesissa, elektroporaatiossa hyödynnetään annostelussa korkeaa jännitettä (100 V) lyhytkestoisella virralla. (Trans)dermaalista annostelua elektroporaatiossa voidaan kontrolloida sekä pulssin sähköisillä parametreilla (pulssien jännitteellä, ajalla ja lukumäärällä) että lääkeaineen ominaisuuksilla (Regnier ja Preat 1998). Elektroporaatiossa korkeajännitteiet pulssit luovat hetkellisiä reittejä lipidikerroksen läpi (Weawer ja Chizmadzhev 1996). Molekekyylibiologiassa menetelmää on käytetty rutiininomaisesti geenien siirtämiseen in vitro. Elektroporaatio soveltuu hyvin makromolekyylien annosteluun ihoon (Banga ja Prausnitz 1998, Lombry ym. 2000). Se myös parantaa kulkeutumista muiden kudosten läpi, kunhan ne ovat sähkökentässä. Päämekanismina elektroporaatiossa on elektroforeesi. Esim. Regnier ym. (1997, 1998, 2000) ovat tutkineet elektroporaatiota erilaisten oligonukleotidien annostelussa. Sonoforeesissa hyödynnetään ultraääntä molekyylien kuljetukseen. Se lisää useiden molekyylien ihon läpäisevyyttä (Mitragotri ym. 1995). Ultraäänen taajuus on yli 20 khz, terapiassa käytetään taajutta 0,7 3 MHz (Kost 1998). Ulraäänen aaltoliike on pitkittäistä. Pitkittäiset ääniaallot aiheuttavat väliaineessa painevaihtelua, mikä johtuu väliaineen pakkautumisesta ja laajenemisesta aaltoliikkeen mukaisesti. Ultraäänen ihon läpäisevyyttä parantavia mekanismeja ei tarkkaan tunneta. Eräänä mahdollisena mekanismina pidetään sen vuorovaikutusta rakennelipideihin, joita on solujen välillä stratum corneumissa. Tämä vaikutus muistuttaa hieman kemiallisten enhansereiden rakennelipidien järjestystä muuttavaa vaikutusta. Ultraäänen kudoksiin tuoma energia saattaa helpottaa diffuusiota lipidirakenteiden poikki. Vaihtoehtoisia kuljetusreittejä löytyy myös stratum corneumin proteiineista. On ajateltu toisen näistä kuljetusreiteistä kulkevan transsellulaarisesti (korneosyyttien) läpi ja toisen parasellulaarisesti solujenvälisissä lipidikerroksissa. Sonoforeesilla on mahdollista annostella sekä varautuneita, että varauksettomia molekyylejä. Mm. Tezel ym. (2004) ovat an- 6

8 nostelleet oligonukleotideja stratum corneumin läpi in vitro. Sonoforeesia on myös mahdollista käyttää yhdessä synergisesti enhansereiden (surfaktanttien) kanssa (Tezel ym. 2002). Mikroneulojen avulla voidaan annostella oligonukleotideja stratum corneumin läpi suoraan verinahkaan asti. Neulalaastarilla, jossa oli 430 µm pituisia ja 30 µm levyisiä neuloja (240/cm 2 ) on annosteltu oligonukleotideja sekä passiivisesti että iontoforeesia hyödyntäen (Lin ym. 2001). Menetelmässä voitiin säädellä annostelua sen kestolla, vehikkelin konsentraatiolla, virran voimakkuudella ja laastarin koolla. Paitsi eri menetelmillä myös modifikaatioilla voidaan vaikuttaa oligonukleotidien kulkeutumiseen ihoon tai sen läpi. Substituoimalla fosfodiesterin toinen tai molemmat sidokset jollakin lipofiilisellä molekyylillä voidaan parantaa molekyylin membraaniläpäisevyyttä (Crooke 1997). Toisaalta fosfodiesterimuunnoksilla voidaan vaikuttaa myös molekyylin varaukseen, jolla voi olla merkitystä sopivan annostelumenetelmän valintaan (Oldenburg ym. 1995). 3 -päästä muunnellut oligonukleotidit voivat olla hyviä vaihtoehtoja eniten tutkituille 1. polven fosforotioaattioligonukleotideille. Sen lisäksi, että fosforotioaattioligonukleotidit ovat toksisia, niillä on voimakkaampi affiniteetti stratum corneumiin kuin sopivasti 3 -päästä muunnelluilla oligonukleotideilla (Regnier ja Preat 1998, Regnier ym. 2000). On myös näyttöä siitä, että kimeeriset oligonukleotidit ovat ihon soluissa vähemmän toksisia kuin fosforotioaattioligonukleotidit (Wingens ym. 1999). Myös 2. polven oligonukleotidi, jossa on 2 -O-MOE -sokerimuunnos fosfodiesterioligonukleotidissa, ei ole niin toksinen kuin vastaava fosforotioaattioligonukleotidi, joka saa aikaan sytokiinien vapautumista ihosoluissa. Se ei myöskään sitoudu yhtä paljon stratum corneumiin (Geary ym 2001, Dokka ym. 2005). Molekyylin tehokkuus on tärkeä tekijä, koska ihon kautta lääkeainetta voidaan annostella vain rajallinen määrä tietyssä ajassa. Esim. 2 -Ometyyli-modifikaatiolla voidaan lisätä jonkin verran iontoforeettista kuljetusta transdermaalisesti (Brand ja Iversen 2000). Samalla kyseinen modifiointi on myös merkityksellinen sen hybridisaatiota tehostavien ominaisuuksien vuoksi. Myös emästen muuntelu voi parantaa paljon oligonukleotidien tehokkuutta ja samalla niiden topikaalista käytettävyyttä (Brand ja Iversen 2000). Esimerkiksi fosforotioaattioligonukleotideilla, joilla on sytidiinin ja uridiinin sijasta C5- propyynianalogit kyseisten emästen paikalla, on suuri affiniteetti mrna:han, mikä lisää niiden tehokkuutta (Wagner ym. 1993). Vielä suuremmat muutokset koko oligonukleotidissa voivat vaikuttaa enemmän sen ominaisuuksiin. Fosforoamidaattimorfolino-oligonukleotideilla, joiden sekä runkoa että sokeria on muokattu, on havaittu jopa 30- kertaista tehokkuutta in vivo verrattuna fosforotioaattioligonukleotideihin (Hudziak ym. 1996, Summerton ja Weller 1997). Suuren tehokkuutensa vuoksi ja sähköisesti neutraaleina oligonukleotideina ne voivat olla potentiaalisia kohteita transdermaaliselle kuljetustavalle (Brand ja Iversen 2000). Yleisesti ottaen oligonukleotidien koolla on kääntäen verrannollinen karkea yhteys niiden kulkeutumiseen ihon läpi (Oldenburg ym. 1995). Tiedetään myös, että emäskoostumuksen ja muiden rakenteellisten tekijöiden, kuten sekundaarirakenteiden merkitys oligomeerien kulkeutumiseen ihoon tai sen läpi on suuri (Oldenburg ym. 1995, Brand ym I-II ). Kokonaiskuva oligonukleotidien ihon läpi kulkeutumisesta ja soluun otosta on kuitenkin edelleen mysteeri. 4. OLIGONUKLEOTIDIEN METABOLIA IHOSSA Fosforotioaattioligonukleotidien on havaittu säilyvän metaboloitumattomina keratinosyyteissä vielä 48 tuntia annostelun jälkeen (Wraight ja White 2001). Muiden modifioitujen oligonukleotidien stabiiliutta ihossa ei ole vielä paljon kuvailtu. C5-propyyni-modifioitujen oligonukleotidien on havaittu säilyvän muuttumattomina ihossa yli 24 tuntia 7

9 (White ym. 2002). Oligonukleotidien ihometaboliaa pidetäänkin hämmästyttävän vähäisenä. Ihossa on yleisesti ottaen paljon entsyymiaktiivisuutta, mikä voi vaikuttaa merkittävästi eri lääkeaineiden kulkeutumiseen ihon läpi (Martin 1987, Täuber 1989). Oligonukleotidien metaboliasta tarvitaan vielä paljon tietoa, koska niiden metaboliassa on eroa erilaisilla analogeilla ja eri kudoksissa. Ihosolujen lisäksi oligonukleotidien on havaittu säilyvän merkittävästi myös maksan soluissa vielä 24 tuntia oligonukleotidien annostelun jälkeen (Wraight ja White 2001). Oligonukleotidit metaboloituvat kaikkialla elimistössä pääasiassa nukleaasien vaikutuksesta. Nukleaasit ovat entsyymejä, joita solu käyttää normaalissa aineenvaihdunnassaan DNA- ja RNA-molekyylien hajottamiseen (Lehninger ym. 1993, Summerton ja Weller 1997). Ne ovat yleensä joko DNA-molekyylejä hajottavia DNaaseja tai RNA-molekyylejä hajottavia RNaaseja. Eräät nukleaasit hajoittavat molempia. Yleensä nukleaasit hajoittavat vain yksijuosteista DNAtai RNA-ketjua. On myös kaksijuosteista nukleaanihappoketjua hajottavia nukleaaseja. Eksonukleaasit voivat hajottaa DNA/RNA-molekyylin ketjuja vain molekyylin jommasta kummasta päästä, 3 -eksonukleaasi 3 -päästä ja 5 - eksonukleaasi 5 -päästä. Endonukleaasit voivat hajottaa DNA/RNA-ketjuja molekyylin keskeltä. Tunnetaan eräitä endo- ja eksonukleaaseja, jotka hajottavat ketjuja vain tietyn nukleotidin kohdalta. Nukleaasien oligonukleotideja hajottavista vaikutuksista on saatu havaintoja useista eri kokeista, joissa on käytetty luonnollisia fosfodiesterioligonukleotideja ja niiden erilaisia analogeja, joita on suojattu erilaisilla funktionaalisilla ryhmillä tai fosforotioaattisidoksilla 3 -päästä tai 5 -päästä, molemmista päistä, eri osista runkoa tai täydellisesti. Lisäksi on käytetty mm. rengasmaisia oligonukleotideja, joissa 3 - ja 5 -päät ovat kiinni toisissaan (Shaw ym. 1991, Gamber ym. 1992, Fisher ym. 1993, Sands ym. 1994, Sands ym. 1995, Geary ym. 2001). Tulosten mukaan oligonukleotidit hajoavat in vivo ensisijaisesti 3 -eksonukleaasien vaikutuksesta (Agrawal 1998). 5 -eksonukleaasien vaikutus on vähäisempi. Oligonukleotidit voivat hajota myös molempien entsyymien vaikutuksesta. Lisäksi endonukleaasit voivat hajottaa oligonukleotideja molekyylin keskeltä. On havaittu, että oligonukleotidien hajoaminen päistä eksonukleaasien vaikutuksesta tapahtuu suhteellisen nopeasti ja keskeltä endonukleaasien vaikutuksesta hitaammin (Glover ym. 1997, Agrawal 1998). Endonukleaasien keskeltä pilkkomat oligonukleotidimetaboliitit kuitenkin hajoavat hyvin nopeasti edelleen 3 - ja 5 -eksonukleaasien vaikutuksesta. Oligonukleotidien metabolia on todennäköisesti solun ulkopuolella nukleaasien, ensisijaisesti 3 -eksonukleaasien, vaikutuksesta nopeampaa kuin solun sisäpuolella. Oligonukleotidien pilkkoutuminen hidastuu niiden päästyä solun sisäpuolelle. Solujen syntetisoimat nukleaasit kulkeutuvat solujen ulkopuolelle, ekstrasellulaaritilaan solujen erittäminä (Gamber ym. 1992). Maksan nukleaaseille altistettujen modifioimattomien ja modifioitujen oligonukleotidien hajoamisprofiilien perusteella on havaittu ainakin seuraavien oligonukleotidien ominaisuuksien vaikuttavan niiden metaboliaan: sidos nukleotidien välillä, nukleaasien inhibitio (esim. fosforotioaattioligonukleotidit), diastereoisomeria (nukleaasien selektiivisyys eri diastereoisomeereille), oligonukleotidin sekvenssi, sen emäskoostumus sekä erilaiset kemialliset modifioinnit emäs- ja sokerirakenteissa. Useat näistä tekijöistä voivat vaikuttaa metaboliaan yksittäisinä tekijöinä, monet voivat vaikuttaa myös yhdessä (Crooke ym. 2000). Esim. oligonukleotidin stabiiliuteen vaikuttaa merkittävästi myös sen sekundaarirakenne, johon puolestaan vaikuttaa oligonukleotidin sekvenssi. Merkittävästi parempi stabiilisuus nukleaaseja vastaan nauhamaisiin oligonukleotideihin verrattuna on havaittu jopa modifioimattomilla fosfodiesterioligonukleotideilla, joissa on G4-rakenne (neljän guanosiinin muodostama 4-juosteinen hyperrakenne) (Agrawal 1998, Dapic ym. 2002), tai hiusneularakenne, jossa oligonukleotidin toinen pää on kaksijuosteinen (Agrawal 1998, Tang ym. 1992, Rebowski ym. 2001). Sekvenssin päissä olevat modifikaatiot suojaavat oligonukleotidia eksonukleaaseja vastaan ja keskellä ole- 8

10 vat modifikaatiot endonukleaaseja vastaan. Esim. 2 -O-propyylimodifikaatiolla saavutetaan merkittävää stabiiliutta nukleaaseja vastaan (Crooke ym. 2000). Oligonukleotidien metabolia johtaa ennen pitkää mononukleotideihin, jotka noudattavat normaalia metaboliareittiä in vivo (Agrawal 1998). Oligonukleotidit metaboloituvat kaikissa kudoksissa, pääasialliset hajoamispaikat ovat maksa ja munuaiset. Ne voivat eliminoitua virtsan mukana elimistöstä pääasiassa lyhyinä nukleotidiketjuina ja mononukleotideina. Oligonukleotidin (n-1)-metaboliitti syntyy, kun alkuperäisestä oligonukleotidista lohkeaa yksi nukleotidi pois, (n-2)-metaboliitti kahden nukleotidin lohjettua jne. On huomionarvoista, että farmakologisesti vaikuttavan ehjän oligonukleotidin (n-1)- ja (n-2)-metaboliititkin saattavat edelleen aikaansaada suurella todennäköisyydellä sekvenssispesifisesti saman farmakologisen vasteen kuin alkuperäinen oligonukleotidi, koska ne ovat menettäneet vain yhden tai kaksi nukleotidia (Crooke ym. 1995). 5. IHON PAIKALLISTERAPIA VS. TRANSDERMAALINEN TERAPIA Useilla onnistuneilla yksittäisillä kokeilla on saatu oligonukleotidien dermaalisella annostelulla aikaan haluttu vaste in vivo. Ihon läpi annosteltaessa on eroteltava toisistaan kaksi erillistä strategiaa, systeeminen ja paikallinen terapia. Oligonukleotidien rakenne voi vaikuttaa siihen, soveltuvatko ne paremmin systeemiseen vai paikalliseen hoitoon, mutta myös eri annostelumenetelmillä voidaan vaikuttaa oligonukleotidien kohdentamiseen (Brand ja Iversen 2000). Oligonukleotidien imeytyminen ihon eläviin soluihin korreloi käänteisesti molekyylin transdermaalisen kuljetuksen kanssa. Eli mitä enemmän oligonukleotideja jää (erityisesti) keratinosyytteihin, sitä vähemmän oligonukleotidilla on merkitystä transdermaalisesti ja päinvastoin. Jos oligonukleotidit kumuloituvat keratinosyytteihin, soveltuvat ne niiden paikalliseen terapiaan. Kohdentaminen ihon syvempiin osiin, kuten erilaistumattomiin ihon kantasoluihin, on ongelmallisempaa kuin keratinosyyttien tapauksessa (Alexeev ym. 2000). Tehokkaassa ihosairauksien geenikorjauksessa tulisi yltää tänne asti. Epidermaalisen geeniekspression estämisestä ilman penetraation parantajia on näyttöä in vitro vain epidermiksen suprabasaalisiin keratinosyytteihin asti (Wingens ym. 1999). Terapeuttisesti tällä alueella voidaan estää mm. psoriasiksen syntyä antisense-tekniikalla. Jotta antisense-oligomeerit saataisiin imeytymään syvempiin solukerroksiin asti, lisääntyviin basaalisoluihin tai vielä pidemmälle, aina dermiksen soluihin saakka, tarvitaan jotain sopivaa dermaalisen permeabiliteetin manipulaatiota. Jos taas oligonukleotidit kulkevat hyvin ihon elävien kerrosten läpi, tulisi niitä hyödyntää systeemisessä antotavassa. Mahdollisesti oligonukleotidien rakennetta ja formulointistrategiaa voidaan hyödyntää sekä molekyylien paikallisessa että systeemisessä kuljetuksessa (Brand ja Iversen 2000). Siksi on tärkeää ymmärtää, miten oligonukleotidit kulkeutuvat keratinosyyttien sisälle. Toisaalta oligonukleotidit, jotka kulkeutuvat helposti keratinosyytteihin, eivät välttämättä penetroidu hyvin niihin silloin, kun käytetään kuljetuksessa apuna sähkövirtaa. Tätä voidaan käyttää mahdollisesti hyväksi hoidettaessa ihosairauksia vähäisillä systeemisillä vaikutuksilla tai annosteltaessa oligonukleotideja systeemisesti mahdollisimman vähäisillä haittavaikutuksilla ihoon (Brand ja Iversen 2000). On osoitettu, että fosforotioaattioligonukleotidien kulkeutuminen stratum corneumin läpi on pääasiassa transsellulaarista elektoroporaatiossa ja parasellulaarista iontoforeesissa (Regnier ja Preat 1998) (Kuva 6). Myös näitä eri menetelmiä voidaan käyttää teoriassa hyväksi eroteltaessa paikallinen ja systeeminen terapia (Brand ja Iversen 2000). Molemmilta tekniikoilta voidaan odottaa kumuloitumista solujen sisäosiin, ainakin jos käytetään pulssittaista PDP-iontoforeesia 9

11 (Aramaki ym. 2003, Sakamoto ym. 2004). Sekä karvatuppien että stratum corneumin kautta tapahtuvaan kulkeutumiseen vaikuttavat paitsi oligonukleotidin rakenne myös vehikkelin oikea hydro-/lipofiilisyystasapaino (Dokka ym. 2005, White ym. 2002, Arora ym. 2002, Pannier ym. 2004). Oligonukleotideja on tullut jo kliiniseen käyttöön. Ne eivät ole kuitenkaan vielä mullistaneet lääkehoitoja. Oligonukleotidihoitoja kehitetään usealla eri rintamalla, ja myös ihosairauksien hoidossa on useita mahdollisia kohteita. Kliinisen tutkimuksen vaiheissa II ja III olevien molekyylien kasvaneesta määrästä voidaan arvioida antisense-teknologian kehityksen suuntaa. Julkisesti rahoitetun Antisense Research Ltd:n mukaan antisense-molekyylejä on näissä faaseissa ainakin 15. EU:ssa ensimmäiselle oligonukleotidille (fomivirseeni) myönnettiin myyntilupa vuonna Sittemmin valmiste on vedetty markkinoilta kaupallisista syistä. Tutkimuslääkkeitä, joita käytetään harvinaisten sairauksien hoitoon EU-alueella, on jo useita (European Commission 2006) (Liite 1, Taulukko 2). Ensimmäinen systeemiseen käyt- Oligonukleotidien soveltuvuutta joko paikalliseen tai systeemiseen terapiaan voidaan havainnollistaa mallilla, jossa tarkastellaan nopeusvakioita (Kuva 7). Jos nopeusvakioille k 1 (transdermaalinen kulkeutuminen), k 2 (soluunotto epidermikseen) ja k 3 (solusta poistuminen) pätee, että k 2>k 1 k 3, oligonukleotidit soveltuvat hyvin ihon terapiaan, koska ne pysyvät keratinosyyttien sisällä. Tällöin niitä voitaisiin käyttää mahdollisesti mm. HSV:n, psoriasiksen tai karsinooman hoitoon. Jos taas k 3>k 2 tai k 1>k 2, voidaan molekyylejä, jotka kulkevat hyvin iontoforeettisesti, käyttää systeemiseen terapiaan: tällaiset oligonukleotidit eivät sovellu hyvin keratinosyytteihin kohdistuvaan terapiaan. Jos taas k 1=k 2 ja k 3 on arvoltaan pieni, voidaan oligonukleotideja käyttää sekä ihon paikalliseen terapiaan että systeemiseen terapiaan. Näihin nopeusvakiohin vaikuttavat paljon myös oligomeerin emäsjärjestys, joten jokin terapeuttisessa mielessä relevantti oligonukleotidi voi olla emäsjärjestyksensä vuoksi ihanteellinen molekyyli joko systeemiselle tai paikalliselle terapialle ihon kautta annosteltuna, ja pienikin muutos emäsjärjestyksessä saattaa vaikuttaa ratkaisevasti molekyylin käyttäytymiseen ihon solukossa (Brand ym I-II, Pannier ym. 2004). Pannierin ym. (2004) mukaan sekä emäskoostumus että vehikkelin koostumus vaikuttavat siihen, Oligonukleotidi soveltuuko oligonukleotidi paremmin Stratum corneum käytettäväksi ihon kautta lokaalisesti keratinosyytti k vai systeemisesti. Iontoforeesilla 2 k Epidermiksen ja 1 verinahan solut tehdyissä kokeissa on havaittu, että k 3 emäskoostumuksella, varsinkin 3 päässä, saattaa olla merkitystä kulkeutumiseen ihon läpi (Oldenburg ym. verenkierto 1995, Brand ym I, Brand ym. Kuva 7. Malli oligonukleotidien kulkeutumisesta ihon läpi (Brand ym II ) 1998 II ). Riippuen annostelumenetelmästä ja oligonukleotidin rakenteesta, oligonukleotidi kulkeutuu ihossa eri tavoin. Edellä esitettyjen havaintojen perusteella menetelmän ja oligonukleotidin rakenteen avulla voi olla mahdollista optimoida oligonukleotidin kulkeutumista haluttuun kohteeseen (Liite 1, Kuva 8). 6. OLIGONUKLEOTIDIT IHOSAIRAUKSIEN HOIDOSSA 10

12 töön hyväksytty antisense-lääke on injektiona annosteltava oblimerseeni, jota käytetään mm. melanooman yhdistelmähoidossa. Melanooman lisäksi useihin muihin ihosyöpätyyppeihin ja ihon hyvänlaatuisiin kasvaimiin liittyvien proteiinien estämiseen on saatua kokeellisesti apua antisense-terapiasta. Wraight ja White ovat luetelleet katsauksessaan (2001) esimerkkejä. Lisäksi oligonukleotideilla saattaa olla merkitystä tulevaisuudessa UV-säteilyyn liittyvien syöpien ennaltaehkäisyssä (Huang ym. 2000). Solun apoptoosilla on merkitystä usean ihosairauden patologiassa, mutta myös terveen ihon toiminnassa kuten keratinosyyttein erilaistumisessa. Apoptoosiin liittyviä proteiineja, jotka ovat mahdollisia antisense-terapian kohteita (kuten BCL2 oblimerseenin tapauksessa), tunnetaan useita (Citro ym. 1998, Leonetti ym. 1999, Teraki ja Shiohara 1999, Jansen ym. 2000). Muita antisense-terapian alueita ovat esimerkiksi inhon infektiotaudit, kuten HSV ja papillooma, haavan paranemin, allergian ja atooppisen ihon hoito sekä rokottaminen (Gao ym. 1989, Gao ym. 1990, Shillitoe ym. 1994, Lin ym. 1995, Crooke ym. 1996, Baker ja Tyring 1997, Choi ym. 1996, Kim. ym. 1998, Mehta ym. 2000, White ym. 2002, Sakamoto ym. 2004, Grajkowski ym. 2005). 7. YHTEENVETO Antisense-oligonukleotideilla voidaan teoriassa ja käytännössä hoitaa monia ihosairauksia. Tällä hetkellä geenilääkkeitä voidaan käyttää sekä lokaalisessa että systeemisessä hoidossa, lähinnä injektioina. Iho geenilääkkeiden kohteena on helpommin saavutettavissa lokaalisesti kuin systeemisesti. Merkittävimmät haasteet ihosairauksien hoidossa antisense-tekniikalla liittyvät mm. lääkeainemolekyylin kohdentamiseen haluttuihin soluihin ja kuljetukseen stratum corneumin läpi. Molekyylin on läpäistävä stratum corneum ja päästävä vaikuttamaan haluttuihin soluihin mahdollisimman vähäisillä systeemisillä vaikutuksilla ja mahdollisen suurella hyötyosuudella. Jotta tämä olisi mahdollista, olisi löydettävä hyviä menetelmiä, joilla voidaan edesauttaa ja konrolloida oligonukleotidianalogin kulkua yksilöllisellä tasolla stratum corneumin läpi. Tämä edellyttää vielä useiden eri muuttujien tutkimista eri menetelmillä. Jos lähtökohtana formuloinnille on farmakologiset ja toksikologiset vaatimukset täyttävä antisenseoligonukleotidi, ovat haasteita ihoannostelun kannalta: 1) stratum corneumin läpäiseminen; 2) metabolia; 3) kohdentaminen ja 4) annostelun säätely. Näihin voidaan vaikuttaa: A) kemiallisilla modifikaatioilla ja kuljetinkonjugaateilla tai -komplekseilla ja B) annostelustrategioilla. Edellytyksenä on kuitenkin, että A:n tai B:n seurauksena kehitettävä terapeuttinen sovellus täyttää edelleen farmakologiset ja toksikologiset vaatimukset. Lopuksi on tärkeää, että sovellus on kustannuksiltaan järkevä ja mahdollisesti kaupallistettavissa sekä kotona tapahtuvaan terapiaan soveltuva sekä farmakoekonomisesti kannattava vaihtoehto olemassa olevaan käypään hoitoon nähden. Paljon on siis vielä tutkittavaa ennen kuin antisense oligonukleotideja toimitetaan avoapteekista. 8. KIRJALLISUUSVIITTEET Agrawal, S., Zhang, R Pharmacokinetics of phosphorothioate oligonucleotides and their novel analogs. Kirjassa: Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmacological and Therapeutic Agents. Toim. B. Weiss, CRC Press LCC, Boca Raton, Florida. s Agrawal, S In vivo pharmacokinetics of oligonucleotides. Kirjassa: Applied Antisense Oligonucleotide Technology. Toim: C.A. Stein, A.M. Krieg, Wiley-Liss, Inc, New York. s

13 Akhtar, S., Hughes, M. D., Khan, A., Bibby, M., Hussain, M., Nawaz, Q., Double, J., Sayyed P The delivery of antisense therapeutics. Adv. Drug Deliv. Rev. 44, Alexeev, V., Yoon K Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA- DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 13, Alexeev, V., Igoucheva, O., Domashenko, A., Cotsarelis, G., Yoon, K Localized in vivo genotypic and phenotypic correction of the albino mutation in skin by RNA-DNA oligonucleotide. Nat. Biotechnol. 18, Antisense Research Limited ( ). Aramaki, Y., Arima, H., Takahashi, M., Miyaazaki, E., Sakamoto, T., Tsuchiya, S Intradermal delivery of antisense olicgonucleotides by the pulse depolarization iontophoretic system. Biol. Pharm. Bull. 26, Arora, V., Hannah, T. L., Iversen, P. I., Brand, R. M Transdermal use of phoshrorodiamidate mopholino oligomer AVI Inhibits cytochrome P450 3A2 activity in male rats. Pharm. Res. 19, Baker, G. E., Tyring, S. K Therapeutic approaches to papillomavirus infections. Dermatol Clin. 15, Banga, A. K., Prausnitz, M. R Assessing the potential of skin electroporation for the delivery of protein- and gene-based drugs. Tibtech. 16, Brand, R. M., Iversen, P Iontophoretic delivery of telomeric oligonucleotide. Pharm. Res. 13, Brand, R. M., Wahl, A., Iversen, P I. Effects of size and sequence on the iontophoretic delivery of oligonucleotides. J. Pharm. Sci. 87, Brand, R. M., Haase, K., Hannah, T. L., Iversen, P. L II. An experimental model for interpreting percutaneous penetration of oligonucleotides that incorporates the role of keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 111, Brand, R. M., Iversen, P. I Transdermal delivery of antisense compounds. Adv. Drug Deliv. Rev. 44, Brand, R. M., Hannah, T. L., Norris, J., Iversen, P. L Transdermal delivery of antisense oligonucleotides can induce changes in gene expression in vivo. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 11, 1-6 Choi, B. M., Kwak, H.. J., Jun, C. D, Park, S. D., Kim, K. Y., Kim, H. R., Chung, H. T Control of scarring in adult wounds using antisense transforming growth factor-beta 1 oligodeoxynucleotides. Immunol Cell Biol. 74, Citro G., D'Agnano I., Leonetti C., Perini R., Bucci B., Zon G., Calabretta B., Zupi G C-myc antisense oligodeoxynucleotides enhance the efficacy of cisplatin in melanoma chemotherapy in vitro and in nude mice. Cancer Res. 58, Crooke, R. M., Graham, M. J., Cooke, M. E., Crooke, S. T In vitro pharmacokinetics of phosphorothioate antisense oligonucleotides. J Pharmacol Exp Ther. 275, 462,473 Crooke, R. M., Crooke, S. T., Graham, M. J., Cooke, M. E Effect of antisense oligonucleotides of cytokine release from human keratinocytes in an in vitro model of skin. Toxicol Appl Pharmacol. 140, Crooke, R. M., Graham, M. J., Martin, M. J., Lemonidis, K. M., Wyrzyjuewiecz, W Metabolism of antisense oligonucleotides in rat liver homogenates. J Pharmacol Exp Ther. 292: Crooke, S.T. Advance in understanding the pharmacological properties of antisense oligonucleotides Kirjassa: Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmcological and Therapeutic Agents. Toim. B. Weiss, CRC Press LCC, Boca Raton, Florida. s. 37. Dallas A., Vlassov A. V RNAi: A novel antisense technology and its therapeutic potential. Med Sci Monit. 28, Dapic, V., Bates, P. J., Trent, J. O., Rodger, A., Thomas, S. D., Miller, D. M Antiproliferative activity of G-quartet-forming oligonucleotides with backbone and sugar modifications. Biochemistry. 41: Dokka, S., Rojanasakul, Y Novel non-endocytic delivery of antisense oligonucleotides. Adv. Drug. Deliv. Rev. 44, Dokka, S., Cooper, S. R., Kelly, S., Hardee, G. E., Karras, J. G Dermal delivery of topically applied oligonucleotides via follicular transport in mouse skin. J. Invest. Dermatol. 124, EMEA CHMP SWP Reflection paper on the assessment of the genotoxic potential of antisense oligodeoxynucleotides. Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/199726/2004 (p. 1-2) European Commission Register of designated Orphan Medicinal Products. ( ) Gamber, H. G, Reed, M. W., Cox, T., Virosco, J. S., Adams, A. D., Gall, A. A., Scholler, J. K., Meyr, R. B., Jr Facile preparation of nuclease resistant 3 -modified oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 21: Gao, W. Y., Stein, C. A., Cohen, J. S., Dutschman, G. E., Cheng, Y. C Effect of phosphorothioate homo-oligodeoxynucleotides on herpes simplex virus type-2 induced DNA polymerace. J Biol Chem. 264, Gao, W. Y., Hanes, R. N., Vazquez-Padua, M. A., Stein, C. A., Cohen, J. S., Chen, Y. C Inhibition of herpes simplex virus type 2 growth by phosphorothioatedeoxyoligonucleotides. Antimicrob Agents Chemother 34, Geary, R. S., Watanabe, T. A., Truong, L., Freier, S., lesnik, E. A., Siofi, N. B., Sasmor, H., Manoharan, M., Levin, A. A Pharmacokinetic properties of 2 -O-(2-methoxyethyl)-modified oligonucleotide analogs in rats. J Pharmacol Exp Ther. 296: Glover, J. M., Leeds, J. M., Mant, T. G. K, Amin, D., Kisner, D. L., Zuckerman, J. E., Geary, R. S., Levin, A. A., Shanahan, W. R., Jr Phase I safety and pharmacokinetic profile of an intercellular adhesion molecule-1 antisense oligodeoxynucleotide (ISIS 2302). J Pharmacol Exp Ther. 282: Grajkowski, A., Pedras-Vasconcelos, J., Wang, V., Ausin, C., Hess, S., Verthelyi, D., Beaucage, S. L Thermolytic CpG-containing DNA oligonucleotides as potential immunotherapeutic prodrugs. Nucleic Acids Res. 33, Green, P Iontophoretic delivery of peptides drugs. J. Contr. Rel. 41, Guy, R.H (Ed.) - Special issue Iontophoresis. Adv. Drug Del. Rev. 9, Hadgraft, J., Guy, R Transdermal Drug Delivery - Development Issues and Research Initiatives. Marcel Dekker, New York Havu V., Hannuksela M., Jansén C., Karvonen J., Reunala T., (Toim.) Kirjassa: Ihotaudit. Helsinki. Duodecim Hoffman, R. M Topical liposomes targeting of dyes, melanins, genes and proteins selectively to hair follicles. J. Drug Target. 5, Hudziak, R. M., Barofsky, D., Barofsky, D. F., Weller, D. L., Huang, S.-B., Weller, D. D Resistance of morpholino phophorodiamidate oligomers to enzymic degration, Antisense Nucl Acid Drug Dev. 6,

14 Huang, C., Li, J., Chen, N., MA, W., Bowden, G. T., Dong, Z Inhibition of atypical PKC blocks ultraviolet-induced AP-1 activation by specifically inhibiting ERKs activation. Mol Carsinog. 27, Jansen, B., Wacheck, V., Heere-Ress, E., Schlagbauer-Wadl, H., Hoeller, C., Lucas, T., Hoermann, M., Hollenstein, U., Wolff, K., Pehamberger, H Chemosensitisation of malignant melanoma by BCL2 antisense therapy. Lancet. 356, Kim, H. M., Choi, D. H., Lee, Y. M Inhibition of woundinduced expression of transforming growth factor-beta 1 mrna by its antisense oligonucleotides. Pharmacol Res 37, Kost, J Phonophoresis. Kirjassa: Electronically Controlled Drug Delivey. Toim. B. Berner ja S.M. Dinh. CRC Press LCC, Boca Raton, Florida. s Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. DNA metabolism Kirjassa: Principles of Biochemistry Toim. A. L. Lehninger, D. L. Nelson, M. M. Cox, Worth Publishers, Inc., New York, s Leonetti, C., Biroccio, A.., Candiloro, A., Citro, G., Fornari, C., Mottolese, M., Del Bufalo, D., Zupi, G Increase of cisplatin sensitivity by c-myc antisense oligodeoxynucleotides in a human metastatic melanoma inherently resistant to cisplatin. Clin Cancer Res. 5, Li, S. K., Ghanem, A.-H., Teng, C.-L., Hardee, G. E., Higuchi, W. I Iontophoretic transport of oligonucleotides across human epidermal membranee: A study of the Nernst-Planck Model. J. Pharm. Sci. 90, Lieb, L. M., Liimatta, A. P. Bryan, R. N., Brown, B. D., Kruegger, G. G Description of the intrafollicular delivery of large molecular weight molecules to follicles of human scalp in vitro. J Pharm Sci. 86, Lin, M., Hultquist, K. L., Oh, D. H., Bauer, E. A., Hoeffler, W. K Inhibition of collagenase type 1 expression by psoralen antisense oligonucleotides in dermal fibroblasts. FASEB J. 9, Lin, WQ, Cormier, M, Samiee, A.G. Johnson, B. Teng, C.-L., Hardee, G. E., Daddona, P. E Transdermal delivery of antisense oligonucleotides with microprojection patch (Macroflux ) Technology. Pharm. Res. 18, Lombry C., Dujardin, N., Preat, V Transdermal delivery of macromolecules using skin electroporation. Pharm. Res. 17, Martin, R. J., Dnyer, S. P., Hadgaft, J Skin metabolism of topically applied compounds. Int J Pharm. 39: Mehta, R. C., Stecker, K. K., Cooper, S. R., Templin, M. V., Tsai, Y. J., Condon, T. P., Bennet, C. F., Hardee, G. E Intercellular adhesion molecule-1 suppression in skin by topical delivery of antisense oligonucleotides. J Invest Dermatol. 115: Mitragotri, S., Blankstein, D. and Langer, R Ultrasoundmediated transdermal delivery. Science. 269, Nestle, F. O., Mitra, R. S., Bennet, C. F., Chan, H., Nickoloff, B. J Cationic lipid is not required for uptake and selective inhibitory activity of ICAM-1 phosphorothioate antisense oligonukleotides in keratinosytes. J. Invest. Dermatol. 103, Noonberg, S. B., Garovoy, M. R., Hunt, C. A Charasterics of oligonucleotide uptake in human keratinocyte cultures. J. Invest. Dermatol. 101, Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Smith, K. A., Selick, H. E Iontophoretic delivery of oligonucleotides across full thickness hairless mouse skin. J. Pharm. Sci. 84, Pannier, A. K., Arora, V., Iversen, P. L., Brand, R. M Transdermal delivery of phosphorodiamidate morpholino oligomers across hairless mouse skin. Int J Pharm. 275, Phillips, M. I., Zhang, Y. C Basic Principles of Using Antisense Oligonucleotides In Vivo. Kirjassa: Methods in Enzymology 313. Antisense technology. Part A. Academic Press, San Diego, USA, s Potts, R. O., Mak, V. H., Guy, R. H., Francoeur, M. L Strategies to enhance permeability via stratum corneum lipid pathways. Adv Lipid Res. 24, Rebowski, G., Wojcik, M., Boczkowska, M., Gendaszewska, E., Soszynski, M., Bartosz, G., Niewiarowski, W Antisense hairpin loop oligonucleotides as inhibitors of expression of multidrug resistance-associated protein 1: their stability in fetal calf serum and human plasma. Acta Biochimica Polonica. 48: Regnier, V., De Morre, N., Jadoul, A., Préat, V Mechanisms of a phosphorothioate oligonucleotide delivery by skin electroporation. Int. J. Pharm. 184, Regnier, V., Preat, V Localization of FITC-labeled phosphorothioate oligodeoxynucleotide in the skin after topical delivery by iontophoresis and electroporation. Pharm. Res. 15, Regnier, V., Tahiri, A., André, N., Lemaître, M., Le Doan, T., Préat, V Electroporation-mediated delivery of 3 -protected phosphodiester oligodeoxynucleotides to the skin. J. Contr. Rel. 67, Sakamoto, T., Miyazaki, E., Aramaki, Y., Arima, H., Takahashi, M., Kato, Y., Koga, M., Tsuchiya, S Improvement of dermatitis by iontophoretically delivered antisense oligonucleotides for interleukin- 10 in NC/NGA mice. Gene Terapy. 11, Sands, H., Gorey-Feret, L. J., Cocuzza, A. J., Hobbs, F. W., Chidester, D., Trainor, G. L Biodistribution and metabolism of internally 3H-labeled oligonucleotides. I. Comparison of a phosphodiester and a phosphorothioate. Mol Pharmacol. 45: Sands, H., Gorey-Feret, L.J., Ho, S. P., Bao, Y., Cocuzza, A. J., Chidester, D., Hobbs, F. W Biodistribution and metabolism of internally 3H-labeled oligonucleotides. II. 3,5 -blocked oligonucleotides. Mol Pharmacol. 47: Seeberger, P. H., Caruthers, M. H. Modified oligodeoxynucleotides as antisense therapeutics Kirjassa: Applied Antisense Oligonucleotide Technology. Toim: C.A. Stein, A.M. Krieg, Wiley- Liss, Inc, New York. s Shaw, J. P., Kent, K., Bird, J., Fishback, J., Froehler, B Modified deoxyoligonucleotides stable to exonuclease degration in serum. Nucleic Acids Res. 19: Shillitoe, E. J., Kamath, P., Chen, Z Papillomaviruses as targets for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 1, Smith, J.B., Wickstrom, E. Preclinical antisense DNA therapy of cancer mice Kirjassa: Methods in Enzymology 314. Antisense technology. Part B. Applications. Academic Press, San Diego, USA, s Stein, C.A., Cheng, Y.C Antisense oligonucleotides as therapeutic agents: is the bullet really magical? Science 261: Suhonen, M Lääkeaineen perkutaani-imeytyminen ja sen edistäminen. Suomen apteekkarilehti. 10/18-19 Summerton, J., Weller, D Morpholino antisense oligomers: design, preparation and properties. Antisense Nucleic Acid Drugs Development. 7: Tang, J.Y, Tensamani, J., Agrawal, S Self-stabilized antisense oligonucleotide phosphorothioates: properties and anti-hiv activity. Nucleic Acids Res Tari, A. M Preparation and Application of Liposome- Incorporated Oligodeoxynucleotides. Kirjassa: Methods in Enzymology 313. Antisense technology. Part A. Academic Press, San Diego, USA, s

15 Teraki, Y., Shiohara, T Apoptosis and the skin. Eur J Dermatol. 9, Tezel, A., Dokka, S., Kelly, S., Hardee, G. E., Mitragotri, S Topical delivery of antisense oligonucleotides using low-frequency sonophoresis. Pharm Res. 21, Tezel, A., Sens, A., Tuchscherer, J., Mitragotri, S Synergistic effect of low-frequency ultrasound and surfactants on skin permeability. J Pharm Sci. 91, Turner, M., Ferry, L., Price, M., Cullander, C., Guy R.H Iontophoresis of poly-l-lysine: the role of molecularweight. Pharm. Res. 14, Täuber, U. Drug metabolism in the skin: advantages and disadvantages Kirjassa: Transdermal Drug Delivery. Toim. J. Hadgaft, R.H. Guy, Marcel Dekker Inc., New York ja Basel. s Vlassov, V. V., Nechaeva, M. V., Karamychev, V. N., Yakubov, L. A Iontophoretic delivery of oligonucleotide derivates into mouse tumor. Antisense Res Dev. 4, Wagner, R. W., Matteucci, M. D., Lewis, J. G., Gutierrez, A. J. Moulds, C., Froehler, B. C Antisense gene inhibition by oliconucleotides containing C-5 propyne pyrimidines. Science 260, Wallace, T. L., Cossum, C. A Current knowledge and future issues. Kirjassa: Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA Novel Pharmacological and Therapeutic Agents. Toim. B. Weiss, CRC Press LCC, Boca Raton, Florida. s Walsh, G Antisense technology. Kirjassa Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology 2nd Edition, s John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, England Weawer, J. C., Chizmadzhev, Y. A Theory of electroporation: A review. Bioelectrochem. Bioenerg. 41, Weiner, N Targeted follicular delivery of macromolecules via liposomes. Int J Pharm. 162, White, P. J., Gray, A.. C., Fogarthy, R. D., Sinclair, R. D., Thumiger, S. P., Werthem, G. A., Wraight, C. J C-5 propyne-modified oligonucleotides penetrate the epidermis in psoriatic and not normal human skin after topical application. J Invest Dermatol. 119: Williams, S. A., Buzby, J. S Cell-specific Optimization of Phosphorothioate Antisense Oligodeoxynucleotide Delivery by Cationic Lipids. Kirjassa: Methods in Enzymology 313. Antisense technology. Part A. Academic Press, San Diego, USA, s Wingens, M., Pfundt, R., van Vlijmen-Willems, I. M. J. J., van Hooijdonk, C. A. E. M., van Erp, P. E. J., Schalkwijk, J Sequence-spesific inhibition of gene expression in intact human skin by epicutaneus application of chimeric antisense oligodeoxynucleotides. Lab. Invest. 79, Wraight, C. J., White, P. J Antisense oligonucleotide in cutaneus therapy. Pharmacology & Therapeutics. 90: Wu, H., Ramachandran, C., Bielisnska, A. U., Kristen, K, Sun, R., Weiner, N. D., Roessler, B. J Topical transfection using plasmid DNA in water-in-oil nanoemulsion. Int. J. Pharm. 221,

16 Liite 1 Paikallinen hoito Systeeminen hoito I Oligonukleotidi: emäskoostumus varaus lipo-/hydrof. modifiointi + Vehikkeli lipo-/hydrof. II konsentraatio + annostelumenetelmä III Karvatupet ym. huokoset Stratum corneum Epidermiksen elävät solut Verinahka/ verenkiero IV ELIMINAATIO I -II Passiivinen imeytyminen, kemialliset enhanserit, iontoforeesi, elektroporaatio, sonoforeesi III Mikroneulat (+ iontoforeesi) IV Mikroneulat (+ iontoforeesi) Kuva 8. Malli oligonukleotidien kulkeutumisesta ihoon tai sen läpi. Taulukko 2. Harvinaisten sairauksien hoitoon EU-alueella käytettäviä oligonukleotideja Päätöksen n:o Indikaatio Lupa myönnetty EU/3/01/063 krooninen lymfaattinen leukemia 11/2001 EU/3/01/065 multippeli myelooma 11/2001 EU/3/02/091 korkea-asteinen gliooma 3/2002 EU/3/02/106 ulseratiivinen koliitti 7/2002 EU/3/03/160 neovaskulaarinen glaukooma 10/2003 EU/3/03/161 keskosen retinopatia 10/2003 EU/3/05/327 gliooma 10/2005 EU/3/06/352 haimasyöpä 3/2006 EU/3/06/353 munuaiskarsinooma 3/2006 EU/3/06/357 muskulaarinen dystrofia 3/2006 Lähde: European Commission (2006), Register of designated Orphan Medicinal Products 15