Puskuroitu liuos sisältää vetyperoksidia, puhdistusainetta ja 0,015 mol/l natriumatsidia.

Transkriptio

1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK testiä, joita käytetään Autostainer Link 48 -laitteen kanssa Käyttötarkoitus In vitro -diagnostiikkaan. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx on kvalitatiivinen immunohistokemiallinen testi, jossa käytetään Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 -vasta-ainetta, ja joka on tarkoitettu PD-L1-proteiinin tunnistamiseen formaliinifiksoidusta, parafiiniin valetusta (FFPE) ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) kudoksesta käyttäen EnVision FLEX -visualisointijärjestelmää Autostainer Link 48 -laitteella. PD-L1-proteiinin ilmentymisen määritys perustuu Tumor Proportion Score (TPS) -lukemaan, joka ilmaisee sellaisten elinkelpoisten tuumorisolujen osuuden, joissa havaitaan kalvon osittainen tai täydellinen värjäytyminen eri voimakkuuksilla. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx on tarkoitettu helpottamaan ei-pienisoluista keuhkosyöpää (NSCLC) sairastavien potilaiden tunnistusta KEYTRUDA -hoitoa (pembrolitsumabi) varten. Katso KEYTRUDA -tuoteselosteesta ilmentymisen raja-arvot, joihin hoito perustuu määrätyissä kliinisissä olosuhteissa. Yhteenveto ja selitys Kun PD-1-ligandit PD-L1 ja PD-L2 sidotaan T-solujen PD-1-reseptoriin, estetään T-solujen lisääntyminen ja sytokiinin tuotanto. Joissain tuumoreissa esiintyy PD-1-ligandien lisääntymistä, ja tämän signalointireitin avulla voidaan ehkäistä tuumorien T-solun aktiivisen immuniteetin säilymistä. KEYTRUDA on humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu PD-1-reseptoriin ja estää sen vuorovaikutuksen PD-L1:n ja PD-L2:n kanssa ja, vapauttaa PD-1:n reittivälitteisen immuunivasteen eston, mukaan lukien tuumorin kasvua ehkäisevän immuunivasteen eston. Isogeenisissä hiiren tuumorimalleissa PD-1-toiminnan estäminen johti vähentyneeseen tuumorin kasvuun (1). Menetelmän periaate PD-L1 IHC 22C3 pharmdx sisältää optimoidut reagenssit ja protokollan, jotka vaaditaan formaliinifiksoitujen, parafiiniin valettujen (FFPE) näytteiden IHC-värjäykseen Autostainer Link 48 -laitteen avulla. Kun näytteet on inkuboitu primaarilla monoklonaalisella PD-L1- vasta-aineella tai Negative Control Reagent (NCR) -reagenssilla, ne inkuboidaan primaarivasta-aineen isäntälajeille ominaisella linkkerivasta-aineella ja sen jälkeen käyttövalmiilla visualisointireagenssilla, joka koostuu sekundaarisista vasta-ainemolekyyleistä ja piparjuuriperoksidaasimolekyyleistä yhdistettynä dekstraanipolymeerirunkoon. Myöhemmin lisätyn kromogeenin entsymaattinen muuttuminen saa aikaan näkyvän reaktiotuotteen saostumisen antigeenikohdassa. Kromogeenireaktion väriä muokataan kromogeenin vahvistusreagenssilla. Sen jälkeen näyte voidaan vastavärjätä ja peittää peitinlasilla. Tulokset tulkitaan valomikroskoopilla. Mukana toimitetut materiaalit Jokaisessa pakkauksessa on 19,5 ml PD-L1-primaarivasta-ainetta (proteiinipitoisuus noin 3 µg/ml) sekä reagenssit, joita tarvitaan 50 testin suorittamiseen enintään 15 testikerralla. Alla luetellut materiaalit riittävät 50 testiin (50 aluslasia inkuboidaan PD-L1- primaarivasta-aineella ja 50 aluslasia inkuboidaan vastaavalla Negative Control Reagent -reagenssilla, yhteensä 100 aluslasia). Testien määrä perustuu siihen, että aluslasia kohden käytetään 2 x 150 µl reagenssia lukuun ottamatta DAB+-liuosta ja Target Retrieval Solution -liuosta. Pakkauksen materiaalit riittävät enintään 15 värjäyskertaan. Määrä Kuvaus 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Puskuroitu liuos sisältää vetyperoksidia, puhdistusainetta ja 0,015 mol/l natriumatsidia. 1 x 19,5 ml Primaarivasta-aine: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Hiiren monoklonaalinen (IgG 1 ) PD-L1-vasta-aine puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja 0,015 mol/l natriumatsidia. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Hiiren monoklonaalinen IgG-kontrollivasta-aine puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja 0,015 mol/l natriumatsidia. 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Kanin sekundaarinen vasta-aine hiiren immunoglobuliineille puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja 0,015 mol/l natriumatsidia. P03928FI_04/SK / p. 1/16

2 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dekstraani yhdistettynä peroksidaasimolekyyleihin ja vuohen sekundaarisiin vasta-ainemolekyyleihin kanin ja hiiren immunoglobuliineille puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja antimikrobista ainetta. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Puskuroitu liuos, sisältää vetyperoksidia ja antimikrobista ainetta. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobentsidiini-tetrahydrokloridi orgaanisessa liuoksessa. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Kuparisulfaatti vedessä. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Puskuroitu liuos, ph 6,1, sisältää puhdistusainetta ja antimikrobista ainetta. 15 aluslasia PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Jokaisessa aluslasissa on kaksi pelletöityä, formaliinifiksoitua, parafiiniin valettua solulinjaa: NCI-H226* kohtalaisella PD-L1-proteiini-ilmentymisellä ja MCF-7 negatiivisella PD-L1-proteiini-ilmentymisellä. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1- negatiivinen NCI-H226: PD-L1- positiivinen *Tohtori AF Gazdar ja tohtori JD Minna (NIH) tunnetaan työstään NCI-H226:n kehittämisessä (ATCC-numero: CRL-5826 ) (2). Huomautus: Kaikki toimitukseen kuuluvat reagenssit on suunniteltu erityisesti tätä sarjaa varten. Jotta testi toimii kuvatulla tavalla, ei saa käyttää muita korvaavia aineita kuin EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (koodi K8005) -liuosta. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx on suunniteltu käytettäväksi nimenomaan Autostainer Link 48 -laitteen kanssa. Lisätietoja on Autostainer Link 48- ja PT Link -käyttöoppaissa. Tarvittavat materiaalit, jotka eivät sisälly toimitukseen PT Link Pre-treatment Module (koodi PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (koodi AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (koodi K8007) Hematoxylin (koodi K8008) Tislattu tai deionisoitu vesi (reagenssilaatu) Ajastin Positiiviset ja negatiiviset kudokset, joita käytetään kontrolleina (katso Laadun valvonta) Mikroskoopin aluslasit: Dako FLEX IHC Microscope Slides (koodi K8020) tai varatut Fisherbrand Superfrost Plus -aluslasit Peitinlasit Pysyvä kiinnitysaine sekä apureagenssit peitelasien kiinnitykseen Valomikroskooppi (objektiivin suurennus 4x 40x) Varotoimenpiteet 1. In vitro -diagnostiikkaan. 2. Ammattikäyttöön. 3. Tämä tuote sisältää natriumatsidia (NaN3), joka on sellaisenaan erittäin myrkyllinen kemikaali. Tuotepitoisuuksilla NaN3:a ei ole luokiteltu vaaralliseksi, mutta se voi reagoida lyijy- ja kupariputkien kanssa ja muodostaa erittäin räjähdysherkkiä metalliatsidikertymiä. Tuote hävitetään huuhtelemalla runsaalla vedellä, jotta estetään metalliatsidien kertyminen putkiin (3). 4. Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker ja Visualization Reagent sisältävät eläinalkuperää olevaa materiaalia. P03928FI_04/SK / p. 2/16

3 5. Näytteitä (ja kaikkia niille altistuvia materiaaleja) on käsiteltävä ennen kiinnitystä ja kiinnityksen jälkeen mahdollisina tartunnanlevittäjinä, ja niiden hävittämisessä on noudatettava asianmukaisia varotoimia (4). 6. Jos ilmoitettuja inkubointiaikoja, lämpötiloja tai menetelmiä ei noudateta, tulokset voivat olla virheellisiä. 7. Reagenssit on laimennettu sopiviksi. Niiden lisälaimennus voi hävittää antigeenin värjäyksen. 8. Visualization Reagent -reagenssin, Liquid DAB+ -kromogeenin ja valmistellun DAB+ Substrate-Chromogen -liuoksen ominaisuudet voivat heiketä, jos ne altistuvat liialliselle valolle. Järjestelmän osia ei saa säilyttää eikä värjäystä saa suorittaa voimakkaassa valossa, esim. suorassa auringonvalossa. 9. Parafiinijäämät voivat aiheuttaa virheellisen negatiivisen tuloksen. 10. Käytettäessä muita kuin suositeltuja reagenssimääriä näkyvä PD-L1-immunoreaktiivisuus voi hävitä. 11. Pienestä tutkimuksesta saatujen tulosten mukaan dynaaminen PD-L1-ilmentymisalue on samanlainen primaarilla ja metastaattisella NSCLC-näyteparilla. On mahdollista, että primaarikasvainten ja metastaattisten kohteiden PD-L1-ilmentyminen voi olla erilainen samalla potilaalla. 12. Isot kudosnäytteet voivat vaatia 3 x 150 µl reagenssia. 13. Yleisesti ottaen alle 18-vuotiaat eivät saa käsitellä tätä ainetta. Käyttäjät on huolellisesti perehdytettävä oikeisiin työmenetelmiin, tuotteen haitallisiin ominaisuuksiin ja tarvittaviin käyttöturvallisuutta koskeviin ohjeisiin. Lisätietoa saa käyttöturvallisuustiedotteesta (KTT). 14. Käytä asianmukaisia henkilönsuojaimia silmä- ja ihokosketuksen välttämiseksi. 15. Käyttämätön liuos on hävitettävä paikallisten ja kansallisten määräysten mukaisesti. 16. Käyttöturvallisuustiedote toimitetaan ammattikäyttäjille pyynnöstä. Vaara DAB+ Chromogen: 1 5 % bifenyyli-3,3',4,4'-tetryylitetra-ammonium-tetrakloridi H350 Voi aiheuttaa syöpää. H341 Epäillään aiheuttavan perimävaurioita. P201 Lue erityisohjeet ennen käyttöä. P202 Lue varoitukset huolellisesti ennen käsittelyä. P280 Käytä suojakäsineitä. Käytä silmiensuojainta/kasvonsuojainta. Käytä suojavaatetusta. P308 + P313 Altistumisen tapahduttua tai jos epäillään altistumista: Hakeudu lääkäriin. P405 Varastoi lukitussa tilassa. P501 Hävitä sisältö ja pakkaus paikallisten, alueellisten, kansallisten ja kansainvälisten määräysten mukaisesti. Varoitus EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5 % sitruunahappo H319 Ärsyttää voimakkaasti silmiä. H411 Myrkyllistä vesieliöille, pitkäaikaisia haittavaikutuksia. P280 Käytä silmiensuojainta/kasvonsuojainta. P273 Vältettävä päästämistä ympäristöön. P264 Pese kädet huolellisesti käsittelyn jälkeen. P305 + P351 + P338 JOS KEMIKAALIA JOUTUU SILMIIN: Huuhdo huolellisesti vedellä usean minuutin ajan. Poista piilolinssit, jos sen voi tehdä helposti. Jatka huuhtomista. P337 + P313 Jos silmä-ärsytys jatkuu: Hakeudu lääkäriin. P501 Hävitä sisältö ja pakkaus paikallisten, alueellisten, kansallisten ja kansainvälisten määräysten mukaisesti. Säilytys Säilytä kaikki PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -komponentit, myös Control Slides -kontrollialuslasit, pimeässä, 2 8 C:ssa, kun ne eivät ole käytössä Autostainer Link 48 -laitteella. Tuotetta ei saa käyttää pakkaukseen painetun viimeisen käyttöpäivän jälkeen. Mikäli reagensseja säilytetään muissa kuin tässä pakkausselosteessa kuvatuissa olosuhteissa, käyttäjän on varmistettava niiden käyttökelpoisuus. Selviä merkkejä tuotteen käyttökelvottomuudesta ei ole, joten positiiviset ja negatiiviset kontrollit tulee suorittaa samanaikaisesti potilasnäytteiden kanssa. Näytteen valmistelu Näytteet on käsiteltävä kudoksen säilyttämiseksi IHC-värjäystä varten. Kaikilla näytteillä tulee noudattaa kudoksen käsittelyn vakiomenetelmiä. Parafiiniin valetut näytteet Käyttöön soveltuvat formaliinifiksoidut, parafiiniin valetut kudokset. Muita fiksatiiveja ei ole validoitu, ja ne voivat antaa virheellisiä tuloksia. Suositeltu fiksaatioaika on tuntia neutraalissa puskuroidussa 10 % formaliinissa (NBF); rajatuilla näytteillä tehdyn tutkimuksen mukaan tunnin fiksaatioajat 10 % NBF:ssa eivät kuitenkaan vaikuttaneet systemaattisesti PD-L1:n tunnistamiseen. Jos fiksaatioaika on 3 tuntia tai alle, PD-L1-tunnistus voi vaihdella. Näytteet tulee lohkoa 3 4 mm paksuuteen, kiinnittää formaliinilla, kuivata ja puhdistaa alkoholilla ja ksyleenillä, ja sen jälkeen infiltroida sulalla parafiinilla. Parafiinin lämpötila ei saa olla yli 60 C. 5 vuoden ikäiset ja sitä vanhemmat FFPE-kudosleikkeet voivat aiheuttaa PD-L1-immunoreaktiivisuuden häviämisen. Kudosnäytteet leikataan 4 5 µm kokoisiksi paloiksi. Paloitellut kudokset asetetaan Dako FLEX IHC -mikroskooppialuslaseille (koodi K8020) tai Fisherbrand Superfrost Plus -aluslaseille ja sitten uuniin 58 ± 2 C:seen 1 tunniksi. Antigeenisyyden säilyttämiseksi aluslasille kiinnitetyt kudosnäytteet säilytetään pimeässä, 2 8 C:n (mielellään) tai korkeintaan 25 C:n huonelämpötilassa ja värjätään 6 kk kuluessa paloittelusta. Aluslaseja ei saa säilyttää tai käsitellä yli 25 C:n lämpötilassa missään vaiheessa kiinnityksen jälkeen, jotta varmistetaan kudoksen eheys ja antigeenisyys. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n käyttöä dekalsifioiduilla kudoksilla ei ole validoitu eikä käyttöä suositella. P03928FI_04/SK / p. 3/16

4 Reagenssin valmistelu Seuraavat reagenssit on valmisteltava ennen värjäystä: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Valmistele riittävä määrä 1x Target Retrieval Solution, Low ph -liuosta laimentamalla Target Retrieval Solution, Low ph (50x) -liuos suhteessa 1:50 tislatulla tai deionisoidulla vedellä (reagenssilaatu); 1x Target Retrieval Solution -liuoksen ph:n tulee olla 6,1 ± 0,2. 1x Target Retrieval Solution, jonka ph on alle 5,9, voi antaa virheellisiä tuloksia. Yhdestä 30 ml:n pullosta Target Retrieval Solution, Low ph (50x) -liuosta laimennussuhteella 1:50 saadaan 1,5 l 1x reagenssia, joka riittää yhden PT Link -säiliön täyttämiseen, ja jolla voidaan käsitellä enintään 24 aluslasia yhdellä käyttökerralla. Hävitä 1x Target Retrieval Solution kolmen käytön jälkeen; liuos on käytettävä 5 päivän kuluessa laimentamisesta. Lisää EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) -liuosta on saatavilla tarvittaessa koodilla K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Valmistele riittävä määrä Wash Buffer -pesupuskuria laimentamalla Wash Buffer (20x) suhteessa 1:20 tislatulla tai deionisoidulla vedellä (reagenssilaatu) pesuvaiheita varten. Käyttämätöntä 1x liuosta saa säilyttää 2 8 ºC:ssa enintään kuukauden ajan. Hävitä puskuri, jos se näyttää samealta. Katso lisätietoja Autostainer Link 48 -laitteen käyttöohjeesta. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) -pesupuskuria on saatavilla koodilla K8007. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Liuos on sekoitettava hyvin ennen käyttöä. Liuoksen mahdollinen saostuminen ei vaikuta värjäyksen laatuun. Valmistele DAB+ Substrate-Chromogen Solution lisäämällä 1 tippa Liquid DAB+ Chromogen -kromogeenia 1 ml:aan DAB+ Substrate Buffer -puskuria ja sekoita. Valmisteltu Substrate-Chromogen säilyy 5 päivää pimeässä ja 2 8 C:ssa. Tärkeitä huomioita: Jos DAB+ Substrate Buffer -pullo käytetään kokonaan, lisätään 9 tippaa DAB+-kromogeenia. Vaikka etiketissä mainitaan 7,2 ml, tämä on käytettävissä oleva määrä, joka ei sisällä pullon kuollutta tilavuutta. Liquid DAB+ Chromogen -kromogeenin väri pullossa voi vaihdella kirkkaasta vaaleaan purppuraan ja ruskeaan. Tämä ei vaikuta tuotteen ominaisuuksiin. Laimenna edellä annettujen ohjeiden mukaan. Jos Liquid DAB+ Chromogen -kromogeenia lisätään liikaa DAB+ Substrate Buffer -puskuriin, positiivinen signaali häviää. Värjääminen Autostainer Link 48 -ratkaisulla Menetelmään liittyviä huomautuksia Ennen käyttöä on luettava nämä ohjeet huolellisesti ja perehdyttävä kaikkiin osiin ja instrumentteihin (katso Varotoimet). Kaikkien reagenssien on annettava tasaantua huonelämpötilaan (20 25 C) ennen immunovärjäystä. Myös kaikki inkuboinnit on suoritettava huonelämpötilassa. Kudosnäytteet eivät saa kuivua värjäyksen aikana. Kuivuneissa kudosnäytteissä voi näkyä enemmän epäspesifistä värjäytymistä. Vaaditut värjäysvaiheet ja inkubointiajat on esiohjelmoitu Dako Link -ohjelmistoon. Lisätietoja protokollien ohjelmoinnista sekä aluslasien ja reagenssien latauksesta löytyy Autostainer Link 48- ja PT Link -käyttöoppaista. Huomautus: Tämän järjestelmän mukana toimitetut reagenssit ja ohjeet on suunniteltu toimimaan optimaalisesti, kun niitä käytetään suositeltujen reagenssien ja materiaalien kanssa. Reagenssien lisälaimennus tai inkubointiaikojen tai lämpötilojen muuttaminen voivat aiheuttaa virheellisiä tai ristiriitaisia tuloksia. Värjäysmenetelmä Valitse Dako Link -alasvetovalikosta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -värjäysprotokolla. Kaikki vaaditut värjäysvaiheet ja inkubointiajat on esiohjelmoitu Autostainer Link 48 -laitteeseen. Jos asianomaisia PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -protokollia ei löydy palvelimeltasi, ota yhteys paikalliseen huoltoedustajaan niiden hankkimiseksi. Vaihe 1: Parafiinin poisto, kuivaus ja kohteen paljastus (3-in-1) Katso lisätietoja PT Link -käyttöoppaasta. Aseta PT Linkin (koodi PT100/PT101/PT200) esilämmitys ja jäähdytys 65 C:seen. Aseta lämpö 97 C:seen 20 minuutiksi. Täytä jokaiseen PT Link -säiliöön 1,5 l Target Retrieval Solution, Low ph -liuosta, 1x työliuos, jotta kudosnäytteet peittyvät. Esilämmitä Target Retrieval Solution 65 C:seen. Upota Autostainer-kelkat, joihin FFPE-kudosnäytteet on kiinnitetty, esilämmitettyyn Target Retrieval Solution, Low ph -liuokseen (1x työliuos) PT Link -säiliöön. Inkuboi 20 minuuttia 97 C:ssa. Kun kohteen paljastuksen inkubointi on tehty ja lämpötila on laskenut 65 C:seen, poista Autostainer-aluslasikelkat aluslaseineen PT Link -säiliöstä ja aseta Autostainer-kelkka aluslaseineen välittömästi säiliöön (esim. PT Link Rinse Station, koodi PT109), jossa on laimennettua, huonelämpötilassa olevaa pesupuskuria (koodi K8007). Inkuboi aluslaseja laimennetussa, huonelämpötilassa olevassa Wash Buffer -pesupuskurissa 5 minuutin ajan. Vaihe 2: Värjääminen Parafiinin poisto-, kuivaus- ja kohteen paljastustoimenpiteiden (3-in-1) jälkeen, Autostainer-kelkat aluslaseineen asetetaan Autostainer Link 48 -laitteeseen. Laite suorittaa värjäyksen käyttäen asianmukaista reagenssia, valvoo inkubointiaikaa ja huuhtelee aluslasit reagenssien välillä. Reagenssiajat on esiohjelmoitu Dako Link -ohjelmistoon. Vaihe 3: Vastavärjäys Aluslaseja vastavärjätään 5 minuutin ajan. Käytettävä aine: Hematoxylin (Link) (koodi K8008). Hematoksyliinin inkubointiaika on esiohjelmoitu protokollaan. P03928FI_04/SK / p. 4/16

5 Vaihe 4: Kiinnitys Vaaditaan vedetön ja pysyvä kiinnitysaine. Huomautus: Värjätyt aluslasit voivat haalistua johtuen eri syistä, mm. vastavärjäyksestä, kiinnitysaineista ja -menetelmistä sekä aluslasien säilytyksestä. Haalistumisen ehkäisemiseksi aluslaseja tulee säilyttää pimeässä ja huonelämpötilassa (20 25 C). Laadun valvonta PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -reagenssien laadunvalvonta perustuu immunohistokemiaan ja edellä kuvattuihin kohteen paljastus- ja värjäystoimenpiteisiin. Poikkeaminen suositelluista toimenpiteistä kudoksen kiinnityksessä, käsittelyssä ja valamisessa käyttäjän laboratoriossa voi aiheuttaa merkittävää tulosten vaihtelua. Laadunvalvonnasta tulee huolehtia jokaisen värjäyskerran yhteydessä. Laadunvalvontamateriaalit kuvataan taulukossa 1, ja niitä ovat: H&E-värjätty potilaskudosnäyte; laboratorion toimittamat positiiviset ja negatiiviset kontrollikudokset sekä Dakon toimittama Control Cell Line Slide (5). Yhdysvalloissa ohjeita laadunvalvontaan tarjoaa College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry; lisätietoja löytyy myös oppaasta CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (5, 6, 7). Testin verifiointi Ennen värjäysjärjestelmän ensimmäistä käyttöä diagnostiseen tarkoitukseen käyttäjän on varmistettava testin toimivuus laboratorion toimittamilla kudoksilla, joilla on tunnetut IHC-ominaisuudet ja jotka edustavat tunnettuja positiivisia ja negatiivisia kudoksia. Laadunvalvontatoimet on kuvattu edellä laadunvalvontaa käsittelevässä kohdassa. Nämä laadunvalvontatoimet on toistettava jokaisen uuden vasta-aine-erän kohdalla tai aina kun testiparametrit muuttuvat. Mahdollisten ongelmien määritys, syyt ja ehdotetut korjaustoimet ilmenevät taulukosta 12. Lukemien tulkinta - NSCLC Kaikki elinvoimaiset tuumorisolut koko aluslasilla arvioidaan ja sisällytetään PD-L1-lukemaan. PD-L1-värjätyllä aluslasilla on oltava vähintään 100 elinvoimaista tuumorisolua, jotta näyte on riittävä PD-L1-arviointia varten. Onnistunut PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -värjättyjen näytteiden lukeman määritys edellyttää, että arvioidaan asianmukaiset solut, tunnistetaan oikea solun sijainti ja tulkitaan oikein värjäyksen voimakkuus. Aluslevyjen arvioinnin suorittaa patologi valomikroskoopin avulla. Immunohistokemiallisen värjäyksen arviointiin ja lukeman määritykseen vaaditaan 10 40x suurennuksen omaava objektiivi. Jokainen tuumorisolujen havaittavissa oleva kalvon värjäytyminen sisällytetään lukeman määritykseen. Havaittu solukalvon värjäytyminen osittain tai kokonaan ( 1+) määritetään erillään sytoplasmisesta värjäytymisestä. Sytoplasminen värjäytyminen katsotaan epäspesifiseksi värjäytymiseksi eikä sitä oteta huomioon värjäytymisvoimakkuuden arvioinnissa. Normaaleihin soluihin ja kasvaimiin liittyviä immuunisoluja kuten lymfosyyttejä tai makrofageja ei saa sisällyttää lukeman määritykseen PD-L1- positiivisuutta määritettäessä. NCR-värjätyillä tuumorinäytteillä spesifisen värjäyksen on oltava 0 ja taustavärjäyksen 1+. Tumor Proportion Score (TPS) ilmaisee niiden elinkelpoisten tuumorisolujen osuuden, joissa näkyy osittainen tai täydellinen kalvon värjäytyminen ( 1+). Näytteellä katsotaan olevan PD-L1-ilmentyminen, jos elinkelpoisten tuumorisolujen TPS 1 % ilmaisee jonkinasteisen kalvon värjäytymisen. Näytteellä katsotaan olevan korkea PD-L1-ilmentyminen, jos elinkelpoisten tuumorisolujen TPS 50 % ilmaisee jonkinasteisen kalvon värjäytymisen. Aluslasit on tarkistettava jokaisella värjäyskerralla taulukossa 1 kuvatussa järjestyksessä, jotta varmistetaan värjäyksen kelpoisuus ja mahdollistetaan näytekudoksen värjäyksen arviointi. Lisäohjeita löytyy PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Interpretation Manual -oppaasta. Lisäsuosituksia PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -värjäyksen tulkintaan 1. Solukalvon värjäyksen todentamisessa käytetään objektiivia, jonka suurennus on 10 40x. 2. Muutkin kuin kohdealueet, kuten tuumoriin liittyvät immuunisolut (esim. makrofagit) ja strooma voivat myös värjäytyä PD-L1- positiivisesti, mutta niitä ei oteta mukaan lukeman määritykseen. Taulukko 1. Suositeltu aluslasien arviointijärjestys Näytteet Perustelu Vaatimukset 1. H&E (Laboratorion toimittama) Kudosnäytteen hematoksyyli- ja eosiinivärjäys (H&E) arvioidaan ensin, jotta saadaan selville kudoksen histologia ja säilyvyys. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx- ja H&E-värjäys suoritetaan näytteen samasta parafiinilohkosta peräisin oleville leikesarjoille. Kudosnäytteiden tulee olla vahingoittumattomia, hyvin säilyneitä ja niiden on 2. Control Cell Line Slide (Dakon toimittama) PD-L1-primaarivasta-aineella värjätty PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n Control Cell Line Slide tutkitaan sen varmistamiseksi, että kaikki reagenssit toimivat oikein. Control Cell Line Slide -aluslasissa on PD-L1-positiivinen solulinjapelletti ja PD-L1- negatiivinen solulinjapelletti. vahvistettava tuumori-indikaatio. Yksi Control Cell Line Slide tulee värjätä PD-L1-primaarivasta-aineella jokaisella värjäyskerralla. NCI-H226:n (PD-L1-positiivinen kontrollisolulinja) hyväksymiskriteerit: Solukalvon värjäytyminen 70 % soluista, keskimääräinen värjäyksen voimakkuus 2+. Epäspesifisen värjäyksen voimakkuus < 1+. MCF-7:n (PD-L1-negatiivinen kontrollisolulinja) hyväksymiskriteerit: Epäspesifinen värjäys. Epäspesifisen värjäyksen voimakkuus < 1+. Huomaa, että toisinaan voidaan havaita joidenkin MCF-7-solupelletin solujen värjäytymistä. Käytetyt hyväksymiskriteerit: 10 kokonaista solua, erillinen plasmakalvon värjäytyminen tai sytoplasminen värjäytyminen 1+ voimakkuudella MCF-7-solupelletin rajoissa hyväksytään. Jos kumpikaan kontrollisolulinja ei täytä näitä kriteerejä, kaikki potilasnäytteen tulokset katsotaan kelpaamattomiksi. P03928FI_04/SK / p. 5/16

6 3. Positiivisen kontrollikudoksen aluslasit (Laboratorion toimittama) 4. Negatiivisen kontrollikudoksen aluslasit (Laboratorion toimittama) 5. Tonsillakontrollikudos (valinnainen) (Laboratorion toimittama) 6 Negative Control Reagent -reagenssilla värjätty potilaskudosaluslasi 7 PD-L1- primaarivastaaineella värjätty potilaskudosaluslasi Seuraavaksi tutkitaan positiivisen kontrollikudoksen aluslasit, jotka on värjätty sekä PD-L1- primaarivasta-aineella että Negative Control Reagent -reagenssilla. Näillä aluslaseilla varmistetaan, että kiinnitysmenetelmä ja epitoopin paljastusmenetelmä toimivat. Tunnettuja positiivisen kudoksen kontrolleja saa käyttää vain käsiteltyjen kudosten ja testireagenssien oikean toimivuuden seurantaan, EI diagnoosin tekemiseen potilasnäytteistä. Negatiivisen kontrollikudoksen aluslasit (eli PD-L1-negatiiviset), jotka on värjätty sekä PD-L1- primaarivasta-aineella että Negative Control Reagent -reagenssilla, tutkitaan seuraavaksi, jotta voidaan varmistaa kohdeantigeenin merkitseminen primaarivastaaineella. Vaihtoehtoisesti positiivisen kontrollikudoksen negatiiviset alueet voivat toimia negatiivisena kontrollikudoksena, mutta käyttäjän on varmistettava tämä. Käytä ihmisen tonsillakudosta, joka on kiinnitetty, käsitelty ja valettu samaan tapaan kuin potilaan näytteet, lisäkontrollimateriaalina testin herkkyyden, spesifiyden ja taustan värjäyksen varmistamiseksi. Tutki potilasnäytteet, jotka on värjätty PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n Negative Control Reagent -reagenssilla. Negative Control Reagent -reagenssia käytetään primaarivasta-aineen sijaan apuna antigeenikohdan spesifisen värjäyksen tulkinnassa. Tutki viimeksi kokonaan potilasnäytealuslasi, joka on värjätty PD-L1 IHC 22C3 pharmdx :n PD-L1-primaarivastaaineella. Katso kohdista Yhteenveto ja selitys, Rajoitukset sekä Ominaisuudet lisätietoja PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n immunoreaktiivisuudesta. Kontrollien tulee olla kirurgisia tai biopsianäytteitä samasta tuumoriindikaatiosta kuin potilaan näyte, kiinnitettynä, käsiteltynä ja valettuna mahdollisimman pian samalla tavalla kuin potilaan näytteet. Värjäystulosten tulkinnassa on käytettävä vahingoittumattomia näytteitä, sillä nekroottiset tai degeneroituneet solut värjäytyvät usein epäspesifisesti. Positiivisiksi kudoskontrolleiksi valittujen kudosten on tuotettava heikko tai kohtalainen positiivinen värjäytyminen PD-L1-värjäyksessä, jotta niistä on apua hienoisten muutosten havaitsemiseksi testiherkkyydessä. Jokaisella testauskerralla tulee käyttää kaksi positiivisen kudoskontrollin aluslasia. PD-L1-värjätty aluslasi: Ruskea plasmakalvon väritys tulee ottaa huomioon. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Negative Control Reagent -reagenssilla värjätty aluslasi: Ei kalvon värjäytymistä. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Jos positiiviset kudoskontrollit eivät pysty osoittamaan riittävää positiivista värjäystä, testinäytteillä saatuja tuloksia ei kelpuuteta. Kontrollien tulee olla kirurgisia tai biopsianäytteitä samasta tuumoriindikaatiosta kuin potilaan näyte, kiinnitettynä, käsiteltynä ja valettuna mahdollisimman pian samalla tavalla kuin potilaan näytteet. Jokaisella värjäyskerralla tulee käyttää kaksi negatiivisen kudoskontrollin aluslasia. PD-L1-värjätty aluslasi: Ei kalvon värjäytymistä tuumorisoluissa. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Negative Control Reagent -reagenssilla värjätty aluslasi: Ei kalvon värjäytymistä. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Jos negatiivisen kontrollikudoksen aluslaseissa ilmenee spesifistä solukalvon värjäytymistä, potilasnäytteen tuloksia ei kelpuuteta. Kryptaepiteelin alueilla tulisi näkyä voimakasta positiivista värjäystä ja germinaalikeskuksissa heikkoa tai vähäistä follikulaaristen makrofagien värjäytymistä. Negatiivista värjäytymistä tulisi näkyä endoteelissa, fibroblasteissa sekä pintaepiteelissä. Solukalvon värjäytymisen puuttuminen osoittaa primaarivasta-aineen merkinneen kohdeantigeenin spesifisesti. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Positiivisen värjäyksen voimakkuus tulee arvioida suhteessa epäspesifiseen taustavärjäykseen, jota havaitaan potilaan Negative Control Reagent -reagenssin aluslasilla samalla värjäyskerralla. Kuten kaikissa immunohistokemiallisissa testeissä negatiivinen tulos tarkoittaa, että antigeeniä ei ole havaittu, mutta ei välttämättä sitä, että testatuissa soluissa tai kudoksessa ei ole antigeeniä. Kaikki elinkelpoiset tuumorisolut koko PD-L1-värjätyllä potilaan aluslasilla on arvioitava ja otettava mukaan PD-L1-lukeman määritykseen. Näytteessä tulee olla vähintään 100 elinkelpoista tuumorisolua, jotta se kelpaa PD-L1- arviointiin. Yleiset rajoitukset 1. Immunohistokemia tarkoittaa monivaiheista diagnosointia, ja se edellyttää erityiskoulutusta sopivien reagenssien valintaa, kudoksen valintaa, kiinnitystä ja käsittelyä, immunohistokemiallisen aluslasin valmistelua sekä värjäystulosten tulkintaa varten. 2. Kudoksen värjäytymiseen vaikuttaa kudoksen käsittely ja prosessointi ennen värjäystä. Epäasianmukainen kiinnitys, jäädytys, sulatus, pesu, kuivaus, lämmitys, paloittelu tai muiden kudosten tai nesteiden aiheuttama kontaminaatio voi aiheuttaa vääristymiä, vasta-aineen sitomista tai vääriä negatiivisia tuloksia. Ristiriitaiset tulokset voivat johtua kiinnitys- ja upotusmenetelmien vaihteluista tai kudoksen poikkeamista. 3. Liiallinen tai puutteellinen vastavärjäys voi vaarantaa tulosten oikean tulkinnan. 4. Positiivisen värjäyksen tai sen puuttumisen kliininen tulkinta on tehtävä kliinisen presentaation, morfologian tai muiden histopatologisten kriteerien perusteella. Värjäyksen tai sen puuttumisen kliininen tulkinta on tehtävä morfologisissa tutkimuksissa ja oikeilla kontrolleilla sekä muilla diagnostisilla testeillä. Värjätyn preparaatin tulkinnasta vastaa pätevä patologi, joka tuntee käytetyt vasta-aineet, reagenssit ja menetelmät. Värjäys on suoritettava sertifioidussa, lisensoidussa laboratoriossa, ja sitä valvoo patologi, joka vastaa värjättyjen aluslasien tarkastuksesta ja varmistaa positiivisten ja negatiivisten kontrollien riittävyyden. P03928FI_04/SK / p. 6/16

7 5. B-hepatiittivirustartunnan saaneiden henkilöiden kudoksissa, jotka sisältävät B-hepatiitin pinta-antigeeniä (HBsAg), voi ilmetä epäspesifistä värjäytymistä johtuen piparjuuriperoksidaasista (7). 6. Reagenssit voivat aiheuttaa odottamattomia reaktioita testaamattomilla kudostyypeillä. Odottamattomia reaktioita ei voida sulkea kokonaan pois myöskään testattujen kudosten kohdalla, mikä johtuu antigeeni-ilmentymisen biologisesta vaihtelusta neoplasmoissa tai muissa patologisissa kudoksissa. Mikäli odottamattomia reaktioita dokumentoidaan, ota yhteyttä Dakon tekniseen tukeen. 7. Väärät positiiviset tulokset voivat johtua proteiinien ei-immunologisesta sitomisesta tai substraattireaktiotuotteista. Ne voivat johtua myös pseudoperoksidaasin toiminnasta (erytrosyytit) ja endogeenisesta peroksidaasin toiminnasta (sytokromi C) (7). 8. Tämän järjestelmän mukana toimitetut reagenssit ja ohjeet on suunniteltu toimimaan mahdollisimman hyvin. Reagenssien lisälaimennus tai inkubointiaikojen tai lämpötilojen muuttaminen voivat aiheuttaa virheellisiä tai ristiriitaisia tuloksia. Tuotekohtaiset rajoitukset 1. Väärät negatiiviset tulokset voivat johtua antigeenin degradaatiosta kudoksessa ajan myötä. Näytteet on värjättävä 6 kuukauden kuluessa kudoksen kiinnittämisestä aluslasille, kun niitä säilytetään pimeässä, 2 8 C:ssa (mielellään) tai huonelämpötilassa enintään 25 C:ssa. 2. Optimaalisten ja toistettavien tulosten takaamiseksi PD-L1-proteiini vaatii esikäsittelyn kohteen paljastamiseksi, kun kudokset kiinnitetään normaalisti (neutraalilla puskuroidulla formaliinilla) ja valetaan parafiiniin. 3. Reagensseja ei saa korvata tämän tuotteen eri eränumeron omaavilla reagensseilla tai muiden valmistajien tuotteilla. Ainoa poikkeus on EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), joka on tarvittaessa saatavissa koodilla K Värjättyjä kontrollisolulinjoja tulee käyttää vain värjäyksen validointiin, ei värjäysreaktion lukeman määritykseen kudosnäytteissä. 5. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n käyttöä kudoksiin muilla fiksatiiveilla kuin formaliinilla ei ole validoitu. 6. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n käyttöä ohutneulanäytteillä ei ole validoitu. Kliinisen toimivuuden arviointi KEYNOTE-024: Kontrolloitu tutkimus hoitamattomilla NSCLC-potilailla Pembrolitsumabin turvallisuutta ja tehokkuutta tutkittiin KEYNOTE-024-tutkimuksessa, joka on kontrolloitu monikeskustutkimus, hoitamattoman metastaattisen NSCLC:n hoidossa. Potilailla oli PD-L1-ilmentyminen 50 %:n Tumor Proportion Score (TPS) -lukemalla määritettynä PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n avulla (9). Potilaat satunnaistettiin (1:1) siten, että heille annettiin pembrolitsumabia 200 mg:n annoksena 3 viikon välein (n = 154) tai tutkijan valinnan mukaan platinapohjaista kemoterapiaa (n = 151; mukaan lukien pemetreksedi+karboplatiini, pemetreksedi+sisplatiini, gemsitabiini+sisplatiini, gemsitabiini+karboplatiini tai paklitakseli+karboplatiini. Eilevyepiteeliperäisen sairauden kohdalla potilaille annettiin pemetreksediylläpitohoitoa). Potilaita hoidettiin pembrolitsumabilla kielletylle toksisuustasolle tai sairauden etenemiseen saakka. Hoito saattoi jatkua sairauden edetessä, jos potilas oli kliinisesti vakaa ja tutkija arvioi potilaan saavan hoidosta kliinistä hyötyä. Tutkimuksesta suljettiin pois potilaat, joilla oli kasvaimessa EGFR- tai ALK-mutaatioita; systeemistä terapiaa 2 vuoden kuluessa vaativa autoimmuunisairaus, immunosuppressiota vaativa terveydentila tai jotka olivat saaneet yli 30 Gy sädehoitoa edeltävien 26 viikon aikana. Tuumorin tila arvioitiin 9 viikon välein. Kemoterapiapotilaat, joilla todettiin riippumattomasti taudin eteneminen, saattoivat siirtyä toiseen ryhmään ja saada pembrolitsumabia. KEYNOTE-024-tutkimukseen osallistuneiden 305 potilaan perusominaisuudet: keski-ikä 65 vuotta (54 % vähintään 65-vuotiaita); 61 % miehiä; 82 % valkoisia ja 15 % aasialaisia; ECOG-toimintakykyluokka 0 ja 1 (35 % ja 65 %). Sairaus oli luonteeltaan levyepiteeliperäistä (18 %) ja ei-levyepiteeliperäistä (82 %); M1 (99 %) ja aivometastaaseja (9 %). Primaariteho mitattiin elossaoloaikana ennen taudin etenemistä (PFS), jonka arvioi sokkoutettu riippumaton keskitetty arvioijataho (BICR) hoitovasteen arviointikriteerien (RECIST 1.1) mukaisesti. Sekundaarinen teho mitattiin kokonaiselossaoloaikana (OS) ja objektiivisesti arvioituna hoitovasteena (ORR), jonka BICR arvioi RECIST 1.1 -kriteerien mukaisesti. Taulukossa 2 on yhteenveto hoitoaieanalyysin mukaisen tutkimuspopulaation (ITT) keskeisistä tehokkuusmittareista. P03928FI_04/SK / p. 7/16

8 Taulukko 2: KEYNOTE-024-tutkimuksen tehokkuustulokset Loppupiste KEYTRUDA 200 mg 3 viikon välein n = 154 Kemoterapia n = 151 PFS* Potilaat (%), joilla potilastapahtumia 73 (47 %) 116 (77 %) Riskitiheyssuhde 0,50 (0,37, 0,68) --- p-arvo < 0, Mediaani kuukausina 10,3 (6,7, NA) 6,0 (4,2, 6,2) OS Potilaat (%), joilla potilastapahtumia 44 (29 %) 64 (42 %) Riskitiheyssuhde 0,60 (0,41, 0,89) --- p-arvo 0, Mediaani kuukausina Ei tulosta (NA, NA) Ei tulosta (9,4, NA) Objektiivinen vaste* ORR % 45 % (37, 53) 28 % (21, 36) Täydellinen vaste % 4 % 1 % Osittainen vaste % 41 % 27 % Vasteen kesto Mediaani kuukausina (alue) Ei tulosta (1,9+, 14,5+) %, kesto > 6 kk 88 % 59 %# * BICR arvioi RECIST 1.1 -kriteerien mukaisesti. Riskitiheyssuhde (KEYTRUDA verrattuna kemoterapiaan) perustuu ositettuun Coxin suhteellisen riskin malliin. Perustuu ositettuun log rank -testiin. Perustuu potilaisiin, joilla on paras kokonaisvaste vahvistettuna täydellisenä tai osittaisena vasteena. Perustuu Kaplan-Meier-arvioihin; sisältää 43 potilasta ja vasteet 6 kuukaudelta tai pidemmältä ajalta. # Perustuu Kaplan-Meier-arvioihin; sisältää 16 potilasta ja vasteet 6 kuukaudelta tai pidemmältä ajalta. NA = ei saatavilla 6,3 (2,1+, 12,6+) Kuva 1: Kaplan-Meierin käyrä: kokonaiselossaoloaika, KEYNOTE Kokonaiselossaoloaika Overall Survival (%) (%) Treatment Hoitomuoto arm KEYTRUDA Chemotherapy Kemoterapia Time Aika in Months kk Riskipotilasmäärä Number at KEYTRUDA: KEYTRUDA: Kemoterapia: Chemotherapy: KEYNOTE-010: Aiemmin kemoterapialla hoidettujen NSCLC-potilaiden kontrollitutkimus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n kliinistä hyötyä tutkittiin KEYNOTE-010-tutkimuksessa, joka on avoin, satunnaistettu, kliininen monikeskustutkimus, KEYTRUDA-lääkkeen turvallisuuden ja tehon määrittämiseksi potilailla, joilla oli aiemmin platinapohjaisella kemoterapialla (10) hoidettu edennyt NSCLC. (9). Potilailla oli PD-L1-ilmentyminen 1 % TPS määritettynä PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n kliinisen tutkimusversion (CTA) avulla. Potilailla, joilla oli EGFR-mutaatio tai ALK-uudelleenjärjestymä, sairaus myös eteni näiden mutaatioiden hyväksytyllä hoidolla ennen pembrolitsumabin antamista. Potilaat satunnaistettiin (1:1:1) ja heille annettiin P03928FI_04/SK / p. 8/16

9 pembrolitsumabia annoksella 2 (n=344) tai 10 mg/kg (n=346) 3 viikon välein tai dosetakselia annoksella 75 mg/m 2 3 viikon välein (n=343) sairauden etenemiseen tai kiellettyyn toksisuustasoon saakka. Tutkimuksesta suljettiin pois potilaat, joilla oli autoimmuunisairaus; immunosuppressiota vaativa terveydentila tai joille oli annettu yli 30 Gy sädehoitoa edellisten 26 viikon aikana. Tuumorin tila arvioitiin 9 viikon välein. Primaarit tehokkuusmittarit olivat kokonaiselossaoloaika (OS) ja elossaoloaika ennen taudin etenemistä (PFS), minkä BICR arvioi RECIST 1.1 -kriteerien perusteella. CTA:n perusteella tutkimukseen satunnaistettiin yhteensä NSCLC-potilasta. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n kliinisen hyödyn arvioimiseksi arkistoituja tutkimusnäytteitä testattiin takautuvasti Yhdysvalloissa laboratoriossa PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n avulla. Yhteensä potilaasta 529 potilaan tuumorikudos testattiin retrospektiivisesti PD-L1 IHC 22C3 pharmdx -testillä. 413 potilaan näytteissä oli PD-L1-ilmentyminen ( 1 % elinkelpoisista tuumorisoluista ilmeni jonkin asteinen kalvon värjäytyminen), ja 94 potilaan näytteessä ei ollut PD-L1-ilmentymistä (< 1 % elinkelpoisista tuumorisoluista ilmeni jonkin asteinen kalvon värjäytyminen). 413 potilaasta, joilla oli PD-L1-ilmentyminen, 163 potilaalla oli korkea PD-L1-ilmentyminen ( 50 % elinkelpoisista tuumorisoluista ilmeni jonkin asteinen kalvon värjäytyminen). CTA:n ja PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n välinen yhtäpitävyystaso ilmenee taulukosta 3. Taulukko 3: CTA:n ja PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n välinen yhtäpitävyys Yhtäpitävyysarvot PD-L1 raja-arvo Negatiivinen yhtäpitävyysprosentti (95 % luottamusväli (CI)) Positiivinen yhtäpitävyysprosentti (95 % luottamusväli (CI)) CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 TPS 1 % 94,5 % [91,4 % 96,6 %] 80,0 % [76,9 % 82,8 %] pharmdx TPS 50 % 98,3 % [97,1 % 99,0 %] 73,2 % [67,9 % 77,9 %] Niiden satunnaistettujen potilaiden kohdalla, joilla PD-L1-ilmentyminen tapahtui PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä, demografiset ja muut perusominaisuudet olivat hyvin tasapainossa hoitomuotojen välillä. Mediaani-ikä oli 63 vuotta (44 % vähintään 65-vuotiaita). Suurin osa potilaista oli valkoisia (77 %) ja miehiä (58 %); ECOG-toimintakykyluokka oli 0 (29 %) tai 1 (71 %). 78 % potilaista oli tupakoinut aiemmin tai tupakoi tällä hetkellä. 22 %:lla potilaista oli levyepiteelihistologia ja 69 %:lla ei-levyepiteelihistologia. Koko kliinisessä tutkimuksessa demografiset ja perusominaisuudet olivat samalla tavalla tasapainossa pembrolitsumabi- ja dosetakselihoidoissa. Tehokkuustulosten yhteenveto on taulukoissa 4 ja 5. KEYTRUDA antoi kestävän kliinisen hyödyn NSCLC-potilaille, joilla oli PD-L1- ilmentymä (TPS 1 %), mikä vahvistui korkean PD-L1-ilmentymisen (TPS 50%) omaavilla potilailla määritettynä PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä. Hyödyn suuruutta voitiin verrata koko kliinisen tutkimuksen hyötyyn. Seuraavissa taulukoissa on yhteenveto keskeisistä tehokkuusmittareista koko populaatiossa, jolla oli PD-L1-ilmentyminen (TPS 1 %) ja korkean PD-L1-ilmentymisen (TPS 50 %) alijoukossa koko kliinisessä tutkimuksessa (TPS 1 % CTA:n mukaan) ja populaatiossa, jolla on PD-L1-ilmentyminen PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n mukaan. Kaplan-Meierin käyrä, OS (TPS 1 %), määritettynä PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä näkyy kuvassa 2. Tehokkuustulokset olivat samanlaiset 2 mg/kg:n ja 10 mg/kg:n KEYTRUDA-hoitomuodoissa. Taulukko 4: KEYTRUDA-vaste aiemmin hoidetuilla NSCLC-potilailla: Koko kliininen tutkimus ja PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Positiiviset potilaat: PD-L1 TPS 1 % Loppupiste KEYTRUDA KEYTRUDA Dosetakseli 2 mg/kg 3 viikon välein 10 mg/kg 3 viikon välein 75 mg/m 2 3 viikon välein Kliininen tutkimus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Kliininen tutkimus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Kliininen tutkimus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Potilaiden määrä OS Kuolemat (%) 172 (50 %) 59 (42 %) 156 (45 %) 59 (42 %) 193 (56 %) 67 (51 %) Riskitiheyssuhde* 0,71 (0,58, 0,88) 0,54 (0,37, 0,78) 0,61 (0,49, 0,75) 0,57 (0,39, 0,82) p-arvo < 0,001 < 0,001 < 0,001 0, Mediaani kuukausina 10,4 (9,4, 11,9) 11,8 (9,6, NA) 12,7 (10,0, 17,3) 12,0 (8,7, NA) 8,5 (7,5, 9,8) 7,5 (6,3, 9,9) PFS Tapahtumat (%) 266 (77 %) 97 (63 %) 255 (74 %) 103 (73 %) 257 (75 %) 94 (72 %) Riskitiheyssuhde* 0,88 (0,73, 1,04) 0,68 (0,50, 0,92) 0,79 (0,66, 0,94) 0,79 (0,59, 1,06) p-arvo 0,068 0, ,005 0, Mediaani kuukausina Kokonaishoitovaste ORR % 3,9 (3,1, 4,1) 4,9 (4,1, 6,2) 4,0 (2,6, 4,3) 4,0 (2,2, 4,6) 4,0 (3,1, 4,2) 18 % (14, 23) 24 % (17, 32) 18 % (15, 23) 20 % (14, 28) * Riskitiheyssuhde (KEYTRUDA vs. dosetakseli) perustuu ositettuun Coxin suhteellisen riskin malliin. Perustuu ositettuun log rank -testiin. BICR arvioi RECIST 1.1 -kriteerien mukaisesti. Kaikki vasteet olivat osittaisia vasteita. 9 % (7, 13) 3,8 (2,2, 4,2) 5 % (2, 11) P03928FI_04/SK / p. 9/16

10 Taulukko 5: KEYTRUDA-vaste aiemmin hoidetuilla NSCLC-potilailla: Koko kliininen tutkimus ja PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Positiiviset potilaat: PD-L1 TPS 50 % KEYTRUDA KEYTRUDA Dosetakseli Loppupiste 2 mg/kg 3 viikon välein 10 mg/kg 3 viikon välein 75 mg/m 2 3 viikon välein Kliininen tutkimus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Kliininen tutkimus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Kliininen tutkimus Potilaiden määrä OS PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Kuolemat (%) 58 (42 %) 18 (32 %) 60 (40 %) 19 (32 %) 86 (57 %) 25 (53 %) Riskitiheyssuhde* 0,54 (0,38, 0,77) 0,45 (0,24, 0,84) 0,50 (0,36, 0,70) 0,29 (0,15, 0,56) p-arvo < 0,001 0,00541 < 0,001 < 0, Mediaani kuukausina PFS 14,9 (10,4, NA) Ei tulosta (9.3, NA) 17,3 (11,8, NA) Ei tulosta (8,3, NA) 8,2 (6,4, 10,7) 7,2 (4,4, 8,3) Tapahtumat (%) 89 (64 %) 33 (59 %) 97 (64 %) 34 (57 %) 118 (78 %) 33 (70 %) Riskitiheyssuhde* 0,58 (0,43, 0,77) 0,47 (0,28, 0,80) 0,59 (0,45, 0,78) 0,41 (0,24, 0,70) p-arvo < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0, Mediaani kuukausina Kokonaishoitovaste ORR % 5,2 (4,0, 6,5) 5,9 (4,2, 9,0) 5,2 (4,1, 8,1) 4,8 (2,8, NA) 4,1 (3,6, 4,3) 30 % (23, 39) 37 % (25, 52) 29 % (22, 37) 28 % (18, 41) * Riskitiheyssuhde (KEYTRUDA vs. dosetakseli) perustuu ositettuun Coxin suhteellisen riskin malliin. Perustuu ositettuun log rank -testiin. BICR arvioi RECIST 1.1 -kriteerien mukaisesti. Kaikki vasteet olivat osittaisia vasteita. 8 % (4, 13) 3,9 (2,0, 4,3) 4 % (1, 15) Kuva 2: Kaplan-Meier-käyrä, kokonaiselossaoloaika hoitomuodon mukaan (TPS 1 % määritettynä PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä, hoitoaieanalyysin mukainen populaatio) Kokonaiselossaoloaika (%) Dosetakseli 75 mg/m 2 Q3W MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W n riski Dosetakseli 75 mg/m 2 Q3W 131 Aika kk MK mg/kg Q3W 140 MK mg/kg Q3W 142 Lisäksi tehtiin kestävyysanalyyseja mahdollisen puuttuvien tietojen vaikutuksen määrittämiseksi potilailla, joilla oli PD-L1-ilmentyminen (TPS 1 %) määritettynä PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä, mutta joilla ei välttämättä ollut PD-L1-ilmentymistä (TPS < 1 %) määritettynä CTA:lla. Tällaisia testituloksia saaneet potilaat kuuluvat PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n käyttötarkoitus/diagnosointitarkoitus (ITD)/populaatio -kohteeseen; mutta heidät suljettiin pois kliinisestä tutkimuksesta, koska PD-L1-ilmentymistä ei ollut CTA-seulonnassa. Näiden puuttuvien tietojen huomioimiseksi suoritettiin herkkyysanalyysi mahdollisen hasardisuhdealueen (HR) selvittämiseksi PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä määritettynä TPS 1 %- ja TPS 50 % -alipopulaatioissa ITD-kehyksessä, jotta varmistettiin yhtenäisyys CTA:lla määritetyn havaitun hasardisuhteen kanssa. HR-herkkyysanalyysin tulokset osoittivat, että mahdollinen oletetun hoitovaikutuksen vaimennus ITD-kehyksessä ei vaikuta HR-arvioihin. P03928FI_04/SK / p. 10/16

11 Ei-kliininen tulosten arviointi Analyyttinen herkkyys/spesifisyys PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n analyyttinen herkkyys testattiin 127 yksittäisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) kohdalla FFPEnäytteillä I-IV käyttäen valmistettua tuotantoerää. PD-L1-ilmentymisen arvioinnissa havaittiin värjäytymistä % positiivisen tuumorisolun alueella värjäysvoimakkuuden ollessa 0 3. Normaalit kudokset: Taulukossa 6 on yhteenveto Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 -vasta-aineen immunoreaktiivisuudesta suositellussa normaalien kudosten paneelissa. Plasmakalvon värjäytymistä havaittiin immuunisoluilla ja epiteelialkuperää olevilla soluilla. Sytoplasmista värjäytymistä havaittiin joillakin solutyypeillä, mutta sitä ei kirjattu positiiviseksi värjäytymiseksi. Kaikki kudokset oli fiksoitu formaliinilla ja valettu parafiiniin ja värjätty PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä tämän pakkausselosteen ohjeiden mukaan. Testatuissa solu- tai kudostyypeissä ei havaittu odottamattomia tuloksia. Havaittu värjäytyminen vastasi raportoituja PD-L1 IHC -ilmentymisen tutkimustuloksia normaalikudoksissa (11, 12). Taulukko 6: Yhteenveto PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n normaalikudoksen reaktiivisuudesta Kudostyyppi (testattu määrä) Positiivinen plasmakalvon värjäys: Kudoksen osat Positiivinen sytoplasminen värjäys: Kudoksen osat Epäspesifinen värjäys Aivolisäke (3) 1/3 Aivolisäkkeen etulohko 1/3 Aivolisäkkeen etulohko 0/3 1/3 Aivolisäkkeen takalohko 1/3 Aivolisäkkeen takalohko Eturauhanen (2) 2/2 Epiteeli 0/2 0/2 Haima (3) 0/3 0/3 0/3 Hermo, ääreis (3) 0/3 1/3 Sidekudos/suonet 0/3 Iho (3) 0/3 0/3 0/3 Isotaivot (3) 0/3 0/3 0/3 Kateenkorva (3) 3/3 Ydinepiteeli 0/3 0/3 Keuhko (3) 3/3 Alveolaariset makrofagit 0/3 0/3 Kilpirauhanen (3) 0/3 0/3 0/3 Kives (3) 0/3 0/3 0/3 Kohdunkaula (3) 1/3 Epiteeli 0/3 0/3 Kohtu (3) 0/3 0/3 0/3 Koolon (3) 2/3 Makrofagit 0/3 0/3 Lihas, poikkijuovainen (3) 0/2 0/2 0/2 Lihas, sydän (3) 0/3 0/3 0/3 Lisäkilpirauhanen (3) 1/3 Rauhasepiteeli 0/3 0/3 Lisämunuainen (3) 0/3 1/3 Ydinsolut 0/3 Luuydin (3) 3/3 Megakaryosyytit 3/3 Megakaryosyytit 0/3 Maksa (3) 1/3 Makrofagit 0/3 0/3 1/3 Hepatosyytit Mesoteelisolut (2) 0/2 0/2 0/2 Munasarja (3) 0/3 0/3 0/3 Munuainen (3) 1/3 Tubulaariepiteeli 0/3 0/3 Ohutsuoli (3) 0/3 0/3 0/3 Perna (3) 2/3 Makrofagit 0/3 0/3 Pikkuaivot (3) 0/3 0/3 0/3 Rinta (3) 0/3 0/3 0/3 Ruokatorvi (3) 0/3 0/3 0/3 Sylkirauhanen (3) 0/3 0/3 0/3 Tonsilla (3) 3/3 Kryptaepiteeli 0/3 0/3 2/3 Germinaalikeskus (makrofagit) Vatsa (3) 2/3 Lymfosyytit 1/3 Maharauhaset 1/3 Maharauhaset 0/3 Neoplastiset kudokset: Taulukossa 7 on yhteenveto Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 -vasta-aineen immunoreaktiivisuudesta neoplastisten kudosten paneelissa. Plasmakalvon värjäytymistä havaittiin immuunisoluilla ja epiteelialkuperää olevilla soluilla. Sytoplasmista värjäytymistä havaittiin joillakin solutyypeillä, mutta sitä ei kirjattu positiiviseksi värjäytymiseksi. Kaikki kudokset oli fiksoitu formaliinilla ja valettu parafiiniin ja värjätty PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:llä tämän pakkausselosteen ohjeiden mukaan. Testatuissa tuumorinäytteissä ei havaittu odottamattomia tuloksia. Havaittu värjäytyminen vastasi raportoituja tutkimuksia PD-L1 IHC -ilmentymisestä neoplastisissa kudoksissa (11-14). Taulukko 7: Yhteenveto PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n neoplastisen kudoksen reaktiivisuudesta PD-L1-positiivinen / Kasvaintyyppi Sijainti kokonaismäärä N = 159 Adenokarsinooma Eturauhanen 0/5 GI, etäpesäke keuhkoon 0/1 Haima 0/2 Haima, duktaalinen 0/3 Keuhko 1/4 Kilpirauhanen, follikulaarinen 0/1 Kilpirauhanen, follikulaarinen-papillaarinen 0/1 Kilpirauhanen, papillaarinen 0/3 Kohdunkaula, endoservikaalinen tyyppi 0/1 Kohtu, endometriumi 0/3 Kohtu, kirkas solu 0/1 Koolon 0/5 Koolon, etäpesäke maksaan 0/1 Koolon, musiini 0/1 Munasarja 0/1 P03928FI_04/SK / p. 11/16

12 Kasvaintyyppi Sijainti PD-L1-positiivinen / kokonaismäärä N = 159 Munasarja, endometrioidi 0/1 Munasarja, musiini 0/1 Munasarja, seroosa 0/1 Ohutsuoli 0/2 Peräsuoli 0/4 Pää ja kaula, kova kitalaki 0/1 Rinta, DCIS 0/2 Rinta, invasiivinen duktaalinen 0/7 Rinta, invasiivinen duktaalinen - etäpesäke imusolmukkeeseen 0/1 Ruokatorvi 0/1 Sappirakko 1/5 Sylki-/korvasylkirauhanen 0/2 Umpilisäke 0/1 Vatsa 0/6 Vatsa, musiini 0/1 Adrenokortikaalinen karsinooma Lisämunuainen 0/1 Astrosytooma Isot aivot 0/3 Embryonaalinen karsinooma Kives 0/1 Ependymooma Aivot 0/1 Feokromosytooma Lisämunuainen 0/1 Glioblastooma Aivot 0/1 Hepatoblastooma Maksa 0/1 Hepatosellulaarinen karsinooma Maksa 0/5 Koolon 0/1 Interstitiaalinen Ohutsuoli 0/1 Peräsuoli 0/1 Karsinooma Nenänielu, NPC 0/1 Kondrosarkooma Luu 0/1 Kordooma Lantio-ontelo 0/1 Leiomyosarkooma Pehmytkudos, rinnan seinämä 0/1 Virtsarakko 0/1 Lymfooma Anaplastinen suurisoluinen Imusolmuke 0/1 Diffuusi B-solu Imusolmuke 0/4 Hodgkin Imusolmuke 2/2 Non-Hodgkin Imusolmuke 1/1 Medullaarinen karsinoma Kilpirauhanen 0/1 Medulloblastooma Aivot 0/1 Nenäontelo 0/1 Melanooma Peräsuoli 0/1 Meningeooma Aivot 0/2 Mesoteliooma Vatsakalvo 0/1 Munuaissyöpä Kirkas solu Munuainen 0/6 Papillaarinen Munuainen 0/1 Neuroblastooma Retroperitoneumi 0/1 Neurofibrooma Pehmytkudos, alaselkä 0/1 Iho 0/2 Keuhko 1/2 Kohdunkaula 2/5 Okasolusyöpä Kohtu 0/1 Pää ja kaula 0/2 Ruokatorven okasolusyöpä, etäpesäke imusolmukkeeseen Ruokatorvi 0/7 Osteosarkooma Luu 0/2 Pienisoluinen karsinooma Keuhko 0/1 Primitiivinen neuroektodermaalinen tuumori (PNET) 0/1 Retroperitoneumi 0/1 Rabdomyosarkooma Eturauhanen 0/1 Pehmytkudos, embryonaalinen 0/1 Retroperitoneumi 0/1 Saarekesolukarsinooma Haima 0/1 Seminooma Kives 0/2 Koolon 0/1 Sinettisolukarsinooma Koolonin sinettisolukarsinooma, etäpesäke munasarjaan 0/1 Spermatosytooma Kives 0/2 Synoviaalisarkooma Lantio-ontelo 0/1 Tymooma Välikarsina 1/1 Tyvisolusyöpä Iho 0/1 Virtsarakon syöpä Munuainen 0/1 Virtsarakko 0/6 P03928FI_04/SK / p. 12/16

13 Tarkkuus PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n tarkkuus NSCLC-näytteillä määritettiin Dakon toimesta. Saadut tulokset ilmenevät taulukoista 8-9. Dakon suorittamissa tarkkuustutkimuksissa määritettiin negatiivinen yhtäpitävyysprosentti (NPA) / keskimääräinen negatiivinen yhtäpitävyys (ANA), positiivinen yhtäpitävyysprosentti (PPA) / keskimääräinen positiivinen yhtäpitävyys (APA) sekä yleinen yhtäpitävyys (OA) rajaarvolle 1 % ja raja-arvolle 50 %, kuten taulukoista 8 ja 9 ilmenee. Tarkkuustutkimukset arvioitiin prosenttipisteen bootstrap-menetelmällä keskimääräisten luottamusvälien laskemiseksi. Tutkimuksissa, joissa saatiin 100 % yhtäpitävyys, luottamusvälit laskettiin Wilson Score -menetelmällä riippumattomien parittaisten vertailujen määrän perusteella (vaikuttavat vapausasteet). Taulukko 8: Yhdessä kohteessa testattu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n tarkkuus ( 1%) Tarkkuustutkimus Diagnostinen rajaarvo Tutkimuksen rakenne Laitteiden välinen 1 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kaikilla kuudella Autostainer Link 48 -laitteella. Käyttäjien välinen 1 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kuuden analyytikon toimesta yhdellä Autostainer Link 48 -laitteella. Päivien välinen 1 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kuutena ei-peräkkäisenä päivänä Autostainer Link 48 -laitteella. Erien välinen 1 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (13 PD-L1-negatiivista ja 11 PD-L1-positiivista), joilla oli erilaisia testattiin kolmessa toistossa ja kaikilla kolmella reagenssierällä Autostainer Link 48 -laitteella. Toimenpiteen sisäinen 1 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista (toistettavuus) testattiin kuudessa toimenpiteen sisäisessä toistossa Autostainer Link 48 -laitteella. ANA = keskimääräinen negatiivinen yhtäpitävyys, APA = keskimääräinen positiivinen yhtäpitävyys % yhtäpitävyys NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (94,0 100 %) OA 100 % (96,9 100 %) NPA 100 % (93,9 100 %) PPA 100 % (94,0 100 %) OA 100 % (96,9 100 %) NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (94,0 100 %) OA 100 % (96,9 100 %) ANA 98,3 % (95,9 100 %) APA 97,9 % (94,6 100 %) OA 98,1 % (95,3 100 %) NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (93,8 100 %) OA 100 % (96,8 100 %) Taulukko 9: Yhdessä kohteessa testattu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx:n tarkkuus ( 50%) Tarkkuustutkimus Diagnostinen rajaarvo Tutkimuksen rakenne Laitteiden välinen 50 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kaikilla kuudella Autostainer Link 48 -laitteella. Käyttäjien välinen 50 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kuuden analyytikon toimesta yhdellä Autostainer Link 48 -laitteella. Päivien välinen 50 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kuutena ei-peräkkäisenä päivänä Autostainer Link 48 -laitteella. Erien välinen 50 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista testattiin kolmessa toistossa ja kaikilla kolmella reagenssierällä Autostainer Link 48 -laitteella. Toimenpiteen sisäinen 50 % Kaikki 24 NSCLC-näytettä (12 PD-L1-negatiivista (toistettavuus) testattiin kuudessa toimenpiteen sisäisessä toistossa Autostainer Link 48 -laitteella. % yhtäpitävyys NPA 100 % (94,9 100 %) PPA 100 % (94,9 100 %) OA 100 % (97,4 100 %) ANA 94,0 % (89,3 98,6 %) APA 93,1 % (85,8 98,6 %) OA 93,6 % (87,8 98,6 %) NPA 100 % (94,9 100 %) PPA 100 % (94,9 100 %) OA 100 % (97,4 100 %) ANA 93,3 % (88,5 97,1 %) APA 93,7 % (88,7 97,4 %) OA 93,5 % (88,9 97,2 %) NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (95,6 100 %) OA 100 % (97,4 100 %) NPA = negatiivinen yhtäpitävyysprosenttit; PPA= positiivinen yhtäpitävyysprosentti; OA = kokonaisyhtäpitävyys ANA = keskimääräinen negatiivinen yhtäpitävyys; APA = keskimääräinen positiivinen yhtäpitävyys; OA = kokonaisyhtäpitävyys P03928FI_04/SK / p. 13/16