11111111111111! 11,1!111111,1, 1 11! 1 111111 111111 111 1

11111111111111! 11,1!111111,1, 1 11! 1 111111 111111 111 1 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSICRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.01.1999 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 C 12N 15/45, A 61K 39/155 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 905184 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 19.10.1990 (24) Alkupäivä - Löpdag 03.03.1989 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 19.10.1990 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US89/00814 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 22.04.1988 US 184648 P (73) Haltija - Innehavare 1. Pharmacia & Upjohn Company, 301 Henrietta Street, Kalamazoo, MI 49001, USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Wathen, Michael, 3183 St. Anthony Drive, Portage, MI 49081, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab, Jaakonkatu 3 A, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä Förfarande för framställning av ett vaccin mot typ 3 av månskligt parainfluensavirus och i förfarandet anvåndbart expressionssystem (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP A 214555 (C 12N 15/00, Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd), CA vol. 107, nro 234398r, Spriggs et al., CA vol. 107, nro 212921d, Van Wyke et al. (57) Tiivistelmä - Sammandrag Tämä keksintö käsittää uusia kimeerisiä glykoproteiineja, jotka ovat hyödyllisiä valmistettaessa virusspesifisiä immuunivasteita ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3, PIV3, vastaan. Glykoproteiineja koodaavilla rakennegeeneillä transformoidut isäntäsolut, ilmenemis- ja replikaatioplasmidit, jotka sisältävät rakennegeenit, glykoproteiineista tehdyt rokotteet ja menetelmät ihmisten suojelemiseksi rokottamalla kyseessä olevilla rokotteilla ovat myös osa tätä keksintöä. Denna uppfinning avser nya kimeriska glykoproteiner, vilka är användbara för framställning av virusspesifika immunsvar mot human parainfluensa-virus typ 3, PIV3. Värdceller transformerade med strukturgener som kodar glykoproteinerna, expressionsoch replikationsplasmider innehållande strukturgener, vaccin framställda av glykoproteiner och förfarande för skyddande av människor genom vaccinering med vaccin i fråga är också en del av denna uppfinning.

Menetelmä rokotteen valmistamiseksi ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3 varten ja menetelmässä käytettävä ilmentämisjärjestelmä Tämä keksintö käsittää uuden ilmentämisjärjestelmän, joka on käyttökelpoinen, kun 5 valmistetaan erityisiä virusimmuunivasteita ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppiä 3, PIV3, vastaan. Isäntäsolut, jotka on transformoitu geeneillä, jotka koodaavat uudenlaisia glykoproteiineja, ilmentämis- ja replikaatioplasmidit, jotka sisältävät rakennegeenejä, ja menetelmä glykoproteiineista tehtyjen rokotteiden valmistamiseksi ovat myös osa tätä keksintöä. 10 Ihmisen parainfluenssa-viruksen tyyppi 3, PIV3, on ankaran alemman hengitystiesairauden tärkeä alkuperäinen aiheuttaja pikkulapsissa ja nuorissa lapsissa. Virusta esiintyy maailmanlaajuisesti ja se infektoi käytännöllisesti katsoen kaikki alle neljävuotiaat lapset. Akuutti hengitystiesairaus ja myöhemmät lisätaudit ovat erityisen vakavia pikkulapsilla ja nuorilla lapsilla, mikä johtuu hengitystiejärjestelmän kyp- 15 symättömyydestä ja saattavat vaatia sairaalassa oloa vakavissa tapauksissa. Alemmat hengitystieinfektiot koskevat hengitystien kaikkia osia, liittyvät yleensä kuumeeseen, yskään, valuvaan nenään ja väsymykseen ja määritetään kliinisesti keuhkoputkentulehdukseksi, ilmatiehyttulehdukseksi, keuhkokuumeeksi, kuristustaudiksi tai virusinfektioksi. Vanhemmat lapset ja aikuiset myös usein infektoituvat uudelleen, 20 vaikka uusiutuvat infektiot tyypillisesti johtavat vähemmän ankaraan ylemmän hengitystien sairauteen. Yritykset kehittää tehokkaita PIV3-rokotteita eivät ole suureksi osaksi onnistuneet... 1 1. Kliiniset tutkimukset käyttämällä eläviä tai inaktivoituja PIV3-rokotteita osoittavat. erityisten virusseerumivasta-aineiden lisääntymisen, mutta ne eivät antaneet merkit-.. 25 tävää suojaa sairautta vastaan.... Yhdistelmälehmärokkovirusilmentämisjärjestelmän tiedetään erikseen ilmentävän PIV3:n F- ja HN-glykoproteiineja ja erikseen aiheuttavan suojaavia immuunivasteita puuvillarotissa, Collins, P.L., et al, Expression of the F and HN Glycoproteins of Human Parainfluenza Virus Type 3 by Recombinant Vaccinia Viruses: Contri- 30 butions of the Individual Proteins to Host Inununity, Journal of Virology 61: 3416-3423 (1987). Yhdistelmälehmärokkovirusilmentämisjärjestelmän tiedetään myös aiheuttavan erityisiä neutralisoivia PIV3-seerumivasta-aineita ja antavan vastustuskykyä PIV3-replikaatiolle hengitystiessä kädellisillä, Collins, P.L. et al., Journal of Virology 62: 1293-1296 (1988). Immunisaatio puhdistettujen F- ja HN-glykopro-

2 teiinien seoksella aiheutti virusta neutraloivaa aktiivisuutta ja tuotti täydellisen suojan infektiolle hamstereissa, Ray, R., et al., Journal of Virology 62: 783-787 (1988). Tässä hakemuksessa on kuvattu polypeptidi, joka koostuu signaalijaksosta ja ainakin yhdestä immunogeenisesta kappaleesta, joka on molemmista ihmisen parainfluens- 5 sa-viruksen tyypin 3 F- ja HN-glykoproteiineista. Tämän proteiinin valmistus käyttämällä yhdistelmätekniikoita on osa tätä keksintöä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. Seuraavia määrättyjä termejä käytetään tässä yksityiskohtaisessa selityksessä. Tenni "soluviljelmä" viittaa kasvaviin soluihin, jotka on saatu joko monisoluisesta kasvista 10 tai eläimestä, jolloin soluviljely sallii solujen pysyä elinkykyisinä alkuperäisen kasvin tai eläimen ulkopuolella. Termi "alavirtaan" identifioi jaksoja, jotka jatkuvat kauempana ilmentämisen suunnassa: esimerkiksi koodaava alue on alavirtaan aloituskodonista. Termi "ylävirtaan" identifioi jaksoja, jotka jatkuvat ilmentämiselle vastakkaiseen suuntaan; esimerkiksi bakteerin promoottori on ylävirtaan transkrip- 15 tioyksiköstä, aloituskodoni on ylävirtaan koodaavasta alueesta. Termi "mikro-organismi" sisältää sekä yksisoluisen prokaryootin että eukaryoottiorganismeja, kuten bakteerit, aktinomykeetit ja hiivan. Termi "operoni" on geenin ilmentämisen ja säätelyn täydellinen yksikkö, joka sisältää rakennegeenit, säätelygeenit ja valvontaelementit DNA:ssa, jonka säätelygeenituote tunnistaa. Termi "plasmidi" viittaa itsenäi- 20 sesti replikoituvaan kromosomin ulkopuoliseen rengasmaiseen DNA:han ja sisältää sekä ilmenevän tyypin että ilmenemättömän tyypin. Kun yhdistelmämikro-organismin tai soluviljelmän selitetään olevan isäntänä ilmentämispiasmidille, termi 0 "ilmentämisplasmidi" sisältää sekä kromosomin ulkopuolisen DNA:n että DNA:n, 4 e joka on liitetty isännän kromosomiin/kromosomeihin. Kun isäntäsolu ylläpitää plas- 25 midia, solut replikoivat pysyvästi plasmidin mitoosin aikana joko itsenäisenä raken- teena tai isäntäsolun genomiin liitettynä osana. Termi "promoottori" on DNA:n alue, joka liittyy RNA-polymeraasin sitomiseen, jotta se aloittaisi transkription. Termi. "DNA-jakso" viittaa yksi- tai kaksijuosteiseen DNA-molekyyliin, joka koostuu nuk- leotidiemäksistä, adenosiinista, tymidiinistä, sytosiinistä ja guanosiinista. Sanonta 30 "olennaisesti puhdas" viittaa proteiinin koostumukseen, joka ei sisällä muita para-.. influenssa-virusproteiineja kuin halutun kimeerisen yhdistelmäglykoproteiinin..,.. Vaikka olennaisesti puhtaat proteiinit saattavat olla kontaminoituja pienellä määrällä.. isäntäsoluaineosia, proteiini on vailla kontaminoivaa viruksen rakenne- tai muuta proteiinia, jota on tuotettu replikoimalla parainfluenssaviruksia. Sanonta "sopiva 35 isäntä" viittaa soluviljelmään tai mikro-organismiin, joka sopii yhteen yhdistelmäplasmidin kanssa ja sallii plasmidin replikoitua, liittyä genomiinsa tai ilmentyä.

3 Tämä keksintö sisältää sarjan molekyyligeneettisiä käsittelyjä, jotka voidaan saada aikaan eri tunnetuilla tavoilla. Käsittelyistä voidaan tehdä yhteenveto, joka sisältää cdna:n saamisen proteiinista, DNA:n kloonauksen ja kandenttunisen E. colissa ja halutun cdna:n ilmentämisen sopivassa isännässä. Seuraavassa selitetään yksityis- 5 kohtaisesti eri menetelmiä, jotka ovat käytettävissä proteiinin ilmentämiseen, ja sitten seuraavat erityiset esimerkit suosituista menetelmistä. Yleensä tässä keksinnössä tarvittava nimistä ja yleiset laboratoriomenetelmät voidaan löytää teoksesta Maniatis, et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982). 10 Kaikki E. coli -kannat kasvatetaan Luria-lihaliemessä (LB) glukoosin kanssa, Difcon antibioottielatusaineessa #2 ja M9-elatusaineessa, joita on täydennetty glukoosilla ja happohydrolysoiduilla kaseiiniaminohapoilla. Kantoja, jotka olivat vastustuskykyisiä antibiooteille, ylläpidettiin lääkekonsentraatioilla, joita on selittänyt Maniatis. Transformaatiot suoritettiin menetelmän mukaan, jonka Rowekamp ja 15 Firtel ovat selittäneet, Dev. Biol., 79: 409-418 (1980). Kaikkia entsyymejä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaan. Transformantit analysoitiin pesäkehybridisaation avulla, kuten on selitetty artikkelissa Grunstein ja Wallis, Methods in Enzymology, 68: 379-388. Hybridisaation jälkeen koetin-dna:t poistetaan ja säilytetään, ja suodattimia pes- 20 tään 0,1 % SDS:ssä, 0,2 x SSC:ssä kaiken kaikkiaan 3 tuntia, jonka aikana vaihdetaan 5 kertaa 400 ml liuosta. Suodattimet kuivataan täydellisesti ilmassa, asetetaan paikoilleen ja suoritetaan autoradiografia käyttämällä Kodak X-OMAT AR -filmiä ja Dupont Cronex Lightening Plus -vahvistusvarjostimia sopivan pitkän ajan -70 C:ssa. 25 Plastnidien sekvensoimista varten valmistetaan puhdistettua plasmidi-dna:ta mene- telmien mukaan, joita on selittänyt Maniatis. Valmistetaan DNA-kappaleita, joiden päät on leimattu ja DNA-kappaleet analysoidaan Maxamin ja Gilbertin kemiallisten sekvensointimenetelmien avulla, joita on muutettu, kuten Collins ja Wertz ovat selittäneet, J. Virol. 54: 65-71 (1985)... ' : ' 30 Nukleotidikoot annetaan joko kiloemäksinä (Kb) tai emäspareina (bp). Nämä ovat :.. agaroosigeelielektroforeesista saatuja arvioita. Ensimmäinen askel proteiinin ilmentämisen aikaansaamisessa on saada DNA-jakso, joka koodaa proteiinia cdna-klooneista. Tämä jakso kloonataan sitten ilmentämis-

4 plasmidiin, joka pystyy ohjaamaan geenin transkriptiota ja sallii transkriptin tehokkaan translaation. Kirjastomenetelmää cdna:n saamiseksi, joka koodaa proteiineja, on selittänyt yleisesti Maniatis, ja erityisesti artikkeli Elango, et al., Human Parainfluenza Type 3 Virus Hemagglutinin-Neurarninidase Glycoprotein: Nucleotide 5 sequence of mrna and Limited Amino Acid Sequence of the Purified Protein, J. Virol. 57: 481-489 (1986) ja Spriggs, et al., Fusion Glycoprotein of Human Parainfluenza Virus Type 3: Nucleotide Sequence of the Gene, Direct Identification of the Cleavage-Activation Site, and Comparison with Other Paramyxoviruses, Virology 152: 241-251 (1986). 10 Valmistetaan klooneja liittämällä cdna Pst I:llä pilkottuun pbr322:een, johon on entsymaattisesti lisätty dgtp:n homopolymeerialueita 3'-päihin pilkkomiskohtaan. dctp:n homopolymeerialueita lisätään entsymaattisesti cdna-molekyylien 3'- päihin Maniatiksen selittämien menetelmien mukaan. Pitäisi lisätä 10-30 dctp- tai dgtp-tähdettä, jotta kloonaustehokkuus tehtäisiin suurimmaksi mandolliseksi. 15 cdna ja plastnidi liitetään yhteen ja transformoidaan E. coliin. Kloonit, jotka sisältävät täysipituisen cdna:n, saadaan selville leimatun virus-cdna-koettimen tai geenijaksojen osille komplementaaristen oligonukleotidikoettimien avulla, minkä jälkeen seuraa restriktioentsyymianalyysi ja DNA-sekvensointi. Oligonukleotidit syntetisoidaan kemiallisesti kiinteä faasi fosforamidiitti-triesteri. 20 -menetelmän mukaan, jonka Beaucage ja Caruthers ovat ensin selittäneet, Tetrahedron Letters, 22 (20): 1859-1862 (1981), käyttämällä automatisoitua syntetisaattoria, kuten on selitetty artikkelissa Needham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res., 12 6159-6168 (1984). Oligonukleotidit puhdistetaan joko alkuperäisen akryyliamidi- geelielektroforeesin avulla tai anioninvaihto-hplc:n avulla, kuten Pearson ja : : 25 Regnier ovat selittäneet, J. Chrom., 255: 137-149 (1983). Synteettisten oligonukleotidien jakso voidaan osoittaa oikeaksi käyttämällä Maxamin ja Gilbertin kemiallista hajoamismenetelmää, Grossman ja Moldave, toim., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65: 499-560 (1980). Jotta saataisiin kloonatun geenin korkea ilmentämistaso prokaryoottijärjestelmässä, 30 on olennaista rakentaa ilmentämisvektoreja, jotka sisältävät vähintään voimakkaan II". promoottorin ohjaamaan mrna-transkriptiota, ribosomiin sitoutumispaikan trans-. laation aloitusta varten, ja transkription lopettajan. Esimerkkeinä tätä tarkoitusta. e.. varten olevista säätelyalueista ovat E. colin biosynteettisen tryptofaanireaktioketjun promoottori- ja operaattorialue, kuten Yanofsky, Kelley ja Horn ovat selittäneet, J. 35 Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984) ja lambda-faagin vasemmanpuoleinen promoot-

5 tori (PL), kuten Herskowitz ja Hagen ovat selittäneet, Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980). E. colissa tuotetut proteiinit eivät laskostu kunnolla kysteiinitähteiden vuoksi ja koska sopivat translaation jälkeiset muuttelut puuttuvat. E. colista puhdistamisen aikana 5 ilmennetyt proteiinit täytyy ensin denaturoida ja sitten renaturoida. Tämä voidaan suorittaa liuottamalla E. colin tuottamat proteiinit guanidiini-hci:ssä ja pelkistämällä kaikki kysteiinitähteet B-merkaptoetanolilla. Sitten proteiini renaturoidaan joko hitaasti dialysoimalla tai geelisuodatuksen avulla, US-patenttijulkaisu 4 511 503. Proteiinien selville saaminen saavutetaan alalla tunnettujen menetelmien avulla ku- 10 ten radioimmunokokeiden tai Western blotting -tekniikoiden tai immunosaostuksen avulla. Puhdistaminen E. colista voidaan saavuttaa seuraamalla US-patenttijulkaisussa 4 511 503 selitettyjä menetelmiä. Heterologisten proteiinien ilmeneminen hiivassa on hyvin tunnettua ja selitettyä. Methods in Yeast Genetics, Sherman, et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) 15 on hyvin tunnettu työ, joka selittää eri menetelmiä, joita käytetään proteiinien tuottamiseen hiivassa. Geenin korkeaa ilmentämistasoa varten hiivassa on olennaista liittää geeni vahvaan promoottorijärjestelmään, kuten prokaryootissa, ja myös antaa tehokkaita transkription lopetus/polyadenylaatio-jaksoja hiivan geenistä. Hyödyllisten promoottorien 20 esimerkkeihin kuuluvat GAL1,10, Johnston ja Davis, Mol. and Cell. Biol., 4: 1440-1448, (1984), ADH2, Russell, et al., J. Biol. Chem. 258: 2674-2682, (1983), PHO5,.. EMBOJ. 6: 675-680, (1982), ja MFa 1. Monikopioplasmidi, jossa on valikoiva merkitsijä, kuten Lue-2, URA-3, Trp-1, tai His-3, on myös toivottava. MFa 1 -pro- moottori on suosittu. MFa1-promoottori toimii a-pariutumistyypin isännässä va-. 25 kiosti, mutta ei toimi diploideissa tai a-pariutumistyypin soluissa. Sitä voidaan kuitenkin säädellä nostamalla tai laskemalla lämpötilaa isännissä, joilla on ts-mutaatio yhdessä SIR-lokuksista. Tällaisen mutaation vaikutus 35 C:ssa a-tyypin soluun on normaalisti toimimattoman geenin muuttaminen koodaamaan a-pariutumistyyppiä. : Toimimattoman a-pariutumistyypin geenin ilmeneminen puolestaan saa MFa 1-30 promoottorin toimimattomaksi. Kasvulämpötilan laskeminen 27 C:een kääntää ko- ko tapahtumasarjan kulun, so. kääntää a-pariutumistyypin pois päältä ja laittaa MFal:n päälle, Herskowitz ja Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones, ja Broach, toim., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209, (1982).

6 Minkä tahansa erittäin ilmenevän geenin, kuten ADHlat, MFa 1:n, tai TP1:n, 3'- pään jaksot tarjoavat polyadenylaatiojaksoja, Alber ja Kawasaki, J. of Mol. and Appl. Genet. 1: 419-434, (1982). Lukuisia hiivan ilmentämisplasmideja, kuten YEp6:ta, YEp13:a, YEp24:ä, voidaan 5 käyttää vektoreina. Mielenkiinnon kohteena oleva geeni voidaan fuusioida mihin tahansa yllä mainittuun promoottoriin ja sitten liittää plasmideihin eri hiivaisännissä ilmentämistä varten. Nämä plasmidit on yksityiskohtaisesti selitetty kirjallisuudessa, Botstein, et al., Gene, 8: 17-24, (1979); Broach, et al., Gene, 8: 121-133, (1979). Käytetään kahta menetelmää hiivasolujen transformoimisessa. Yhdessä tapauksessa 10 hiivasolut ensin muutetaan protoplasteiksi käyttämällä tsymolyaasia, lytikaasia tai glusulaasia, minkä jälkeen seuraa DNA:n ja polyetyleeniglykolin (PEG) lisäys. PEG:llä käsitellyt protoplastit sitten regeneroidaan 3-prosenttisessa agarelatusaineessa valikoivissa olosuhteissa. Yksityiskohtia tästä menetelmästä annetaan artikkeleissa Beggs, Nature (Lontoo), 275: 104-109 (1978); ja Hinnen, et al., Proc. Natl. 15 Acad. Sci. USA, 75: 1929-1933 (1978). Toinen menetelmä ei sisällä soluseinän poistoa. Sen sijaan soluja käsitellään litiumkloridilla tai asetaatilla ja PEG:llä ja ne laitetaan valikoiville maljoille, Ito, et al., J. Bact., 153: 163-168, (1983). cdna voidaan liittää eri ilmentämisvektoreihin käytettäväksi isäntäsoluviljehnien transformoimiseen. Kaikki vektorit sisältävät geenijaksoja, jotka aloittavat proteiini- 20 en, jotka sopivat yhteen transformoitavan isäntäsolun kanssa, transkription ja translaation.... Lisäksi vektorit mieluummin sisältävät merkitsijän, joka tarjoaa fenotyyppisen omi- naisuuden transformoitujen isäntäsolujen valikointia varten, kuten dihydrofolaattire-.... duktaasin tai metallotioneiinin. Lisäksi replikoiva vektori saattaa sisältää replikaa- 25 tioyksikön. Hyönteis- tai nisäkässoluviljelmät ovat hyödyllisiä proteiinien tuotantoa varten. Ni-.... säkässolujärjestelmät ovat usein yksisolukerrosmuodossa, vaikka nisäkässolusus- pensioita voidaan myös käyttää. Valaiseviin esimerkkeihin nisäkässolulinjoista kuuluvat VERO- ja HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) -solulinjat, :..: 30 W138-, BHK-, COS-7- tai MDCK-solulinjat. II 1 Vektori, jota käytetään isäntäsolun transformoimisessa, sisältää mieluummin geenijaksoja, jotka aloittavat proteiinin geenijakson transkription ja translaation. Näitä jaksoja pidetään ilmentämisen valvontajaksoina. Kun isäntäsolu on peräisin nisäkkäästä tai hyönteisestä, valaisevia hyödyllisiä ilmentämisen valvontajaksoja saadaan

7 SV-40:n promoottorista, Science, 222, 524-527 (1983), CMV I.E. -promoottorista, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 659-663 (1984), metallotioneiini-promoottorista, Nature, 296, 39-42, (1982) tai baculoviruksen polyhedriini-promoottorista (hyönteissolut), Virol., 131, 561-565 (1983). Plasmidi, joka replikoi tai liittää DNA-materiaalia, jo- 5 ka sisältää ilmentämisen valvontajaksoja, pilkotaan käyttämällä restriktioentsyymejä ja koko sovitetaan tarpeelliseksi tai toivottavaksi ja liitetään proteiineja koodaavaan cdna:han käyttämällä alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Kun käytetään korkeampia eläimiä isäntäsoluina, täytyy sisällyttää tunnetuista nisäkäsgeeneistä polyadenylaatio- tai transkription lopetusjaksot vektoriin. Esimerkki 10 lopetusjaksosta on härän kasvuhormonigeenin polyadenylaatiojakso. Lisäksi voidaan vektoriin sisällyttää geenijaksoja, jotka valvovat replikaatiota isäntäsolussa, kuten jaksoja, jotka on löydetty härän papilloomavirustyypin vektoreista, Saveria-Campo, "Bovine papilloma-virus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA Cloning Vol.II--A practical approach, Glover, ed., IRL Press, Arlington, Virginia 15 213-238 (1985). Suosittu ilmentämisvektori, joka on hyödyllinen proteiinien ilmentämistä varten kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) -soluissa, on psvcow7-sukkulavektori, joka replikoituu sekä CHO- että E. coli -soluissa käyttäen hyväksi ampisilliinivastustuskyky- ja dihydrofolaattireduktaasigeenejä merkitsijöinä E. coli- ja CHO-soluissa 20 vastaavasti. psvcow7-plasmidi tarjoaa myös naudan kasvuhormonin polyadenylaatiojakson, joka on tarpeellinen CHO-soluissa ilmentämistä varten. psvcow7- plasmidi pilkotaan ja viruksen promoottori ja cdna:t liitetään. Suosittu ilmentämisvektori, joka on hyödyllinen muodostettaessa yhdistelmäbaculovirusta proteiinien ilmentämistä varten hyönteissoluissa, on pac373, Smith, 25 et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165 (1983). Piasmidi replikoituu E. coli -soluissa käyttäen hyväksi ampisilliinivastustuskykyä, ja tarjoaa eukaryoottisen promoottorin ja polyadenylaatiosignaalin baculoviruksen polyhedriini-geenistä geenien ilmentämistä varten. pac373-plasmidi pilkotaan ja cdna liitetään promoottorin viereen. Tämä uusi plasmidi transfektoidaan yhdessä baculoviruksen (Autographa californi- 30 ca, nukleaarinen polyhedroosivirus) DNA:n kanssa hyönteissoluihin kalsiumfosfaattisaostuksen avulla. Yhdistelmä-baculovirus, jossa cdna:n sisältävä pac373- polyhedriini-geeni on korvannut virukseen kuuluvan polyhedriini-geenin homologisen rekombinaation avulla, saadaan selville täpläsuodatinhybridisaation avulla käyttämällä koettimena 32P:lla leimattua cdna:ta, Summers ja Smith, A Manual of 35 Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M

8..... Isäntäsolut ovat kompetentteja tai ne tehdään kompetenteiksi transfektiota varten eri keinoilla. On useita hyvin tunnettuja menetelmiä DNA:n viemiseksi eläinsolujen sisään. Näihin kuuluvat: kalsiumfosfaattisaostus, vastaanottajasolujen fuusiointi DNA:n sisältävien bakteeriprotoplastien kanssa, vastaanottajasolujen käsittely 20 DNA:n sisältävien liposomien kanssa, ja DNA:n mikroinjektio suoraan solujen sisään. Transfektoituja soluja viljellään alalla hyvin tunnetuilla keinoilla, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson ja Ross, Inc., (1977). Yhdistelmäglykoproteiinit, jotka on ilmennetty yhdessä edellä olevista eukaryoottisista ilmentämisjärjestehnistä, eristetään solususpensioista, jotka on saatu ai- 25 kaan isäntäsolujärjestelmän hajottamisella hyvin tunnettujen mekaanisten tai entsymaattisten keinojen avulla. Proteiinit, jotka on tarkoitettu eritettäväksi soluista, eristetään elatusaineista ilman, että soluja hajotetaan. Glykoproteiinien puhdistamista varten on hyödyllistä ensin levittää solulimafraktio linssilektiinipylvään päälle, joka erityisesti sitoo glykoproteiineja. Eluoidut glykoproteiinit levitetään sitten vas-. 30 ta-ainetta sisältävän affmiteettipylvään päälle..... :.. University, College Station, TX, 29-30 (1986). Yhdistelmä-baculoviruksella infektoidut hyönteissolut voidaan myös erottaa niiden okkluusio-negatiivisen morfologian perusteella, koska cdna:n liittäminen polyhedriini-geeniin estää tämän okkluusiota muodostavan proteiinin synteesin. 5 ptfw9 on suosittu ilmentämisvektori, jota käytetään yhdessä naudan papilloomaviruksen (BPV) kanssa proteiinien ilmentämistä varten. (ptfw9-plasmidi talletettiin Budapestin sopimuksen mukaan. ptfw9-plasmidia pidetään yllä E. coli -isännässä ja se on talletettu Northern Regional Research Centerin kokoelmiin, Peoria, Illinois, USA, 17. marraskuuta, 1986 tulonumerolla NRRL B-18141.) Plasmidi rep- 10 likoituu E. colissa käyttäen hyväksi ampisilliinivastustuskykyä ja tarjoaa hiiren metallotioneiini-promoottorin ja SV40:n polyadenylaatio-signaalin geenien ilmentämistä varten. ptfw9-plasmidi pilkotaan ja cdna liitetään promoottorin viereen. Tämä uusi plasmidi sitten pilkotaan, jotta BPV voidaan liittää. Yhdistelmäplasmidi transfektoidaan eläinsoluihin kalsiumfosfaattisaostuksen avulla ja valikoidaan transfor- 15 moituneiden solujen pesäkkeet. Tyypillinen glykoproteiini voidaan jakaa kolmeen alueeseen. Aminotenninaalisessa päässä on hydrofobinen alue, joka on nimeltään signaalijakso. Tämä aminohappojen jakso antaa merkin glykoproteiinin kuljettamisesta solukalvolle. Kuljettamisen jälkeen signaalijakso poistetaan pilkkomalla. Signaalijaksosta alavirtaan on kypsän 35 glykoproteiinin solun ulkopuolinen alue. Tämä on glykoproteiinin immunogeeninen osa, koska vasta-aineet pääsevät sen luokse. Glykoproteiinin karboksyyliterminaali-

9 sessa päässä on hydrofobinen ankkurialue, joka aiheuttaa glykoproteiinin pysymisen solukalvossa. PIV F on tyypillinen glykoproteiini, koska se sisältää aminoterminaalisen signaalijakson ja karboksyyliterminaalisen ankkurijakson, Spriggs, et al., Virology 152: 241-25, (1986). Kuitenkin PIV 3 HN -glykoproteiini on erikoinen, koska 5 sen aminoterminaalinen pää toimii sekä signaali- että ankkurialueena, Elango, et al., J. Virol. 57: 481-489, (1986). Glykoproteiini voidaan määrätä eritettäväksi soluista ympäröiviin elatusaineisiin. Tämä toteutetaan aiheuttamalla glykoproteiinin aikainen lopetus ennen ankkurialueen translaatiota, Lasky, et al., Biotechnology, 2: 527-532 (1984). Aikainen lopetus 10 voidaan toteuttaa liittämällä translaation yleislopettajaoligonuldeotidi sopivaan kohtaan geenin DNA:ssa. Nämä oligonukleotidit ovat kaupallisesti saatavilla. Aikainen lopetus voidaan myös toteuttaa muuttamalla lukukehystä, täten aiheuttamalla translaation lopetuskodoni. Seuraavassa selitetty kimeerinen glykoproteiini koostuu PIV3 F:n signaali- ja solun 15 ulkopuolisesta alueesta, jotka on liitetty PIV3 HN:n solun ulkopuoliseen alueeseen, ja siihen viitataan FHN:llä. Jos edellä selitetty FHN-geeni on sopivasti sijoitettu eukaryoottiseen ilmentämisvektoriin, FHN-geeni on suunniteltu ilmentämään kimeeristä glykoproteiinia, joka kuljetettaisiin solun pinnalle ja esitettäisiin elatusaineisiin. Pääosa PIV3 HN-proteiinin solulima-alueesta sisältyy koodaavaan alueeseen, johon 20 ulottuu Dral- (proteiinikoodausalueen nuldeotidipaikka 452) ja PstI-restriktioentsyymikohta (proteiinikoodausalueen nukleotidipaikka 1709). Tämä jakso ei koodaa glykoproteiinin signaali/ankkuri -aluetta. Pääosa PIV3 F -proteiinin solulima-alueesta :....... sisältyy koodaavaan alueeseen, joka on ennen XbaI-restriktioentsyymikohtaa (pro-. teiinikoodausalueen nukleotidipaildca 1398). Tämä jakso koodaa signaalialueen ja -: 25 pääosaa antigeenisesta alueesta, mutta ei F-glykoproteiinin ankkurialuetta.. Jotta HN-glykoproteiinijakso voitaisiin liittää PIV3:n F-glykoproteiiniin, HN-geeni pilkotaan PstI:llä ja pää tehdään tylpäksi T4 DNA -polymeraasin avulla. XbaIlinkkeri (New England Biolabs), jossa on jakso..- 30 CTAGTCTAGACTAG CATCAGATCTGATC liitetään päähän. Geeni erotetaan jäljelle jääneestä linkkeristä agaroosigeelielektroforeesin avulla. Edellä oleva linkkeri sisältää oikeassa vaiheessa olevan translaation lopetussignaalin, joka pysäyttää proteiinisynteesin. HN-geeni sitten pilkotaan DraHlä ja XbaI-linkkeri (New England Biolabs), jossa on jakso

10 TGCTCTAGAGCA ACGAGATCTCGT liitetään päähän. Tämä linkkeri ei sisällä oikeassa vaiheessa olevaa translaation lopetussignaalia ja sallii proteiinin lukemisen F-jakson läpi HN-jaksoon. Linkkerit sisäl- 5 tävä HN-geenikappale (1,3 Kb) pilkotaan XbaI:llä ja erotetaan jäljelle jääneistä linkkereistä agaroosigeelielelctroforeesin avulla. PIV3 F-geeni pilkotaan XbaI:llä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. 1,3 Kb HN-kappale liitetään sitten F-geeniin XbaI-kohtaan ja transformoidaan E. coli HB101:een. Kimeerisen glykoproteiini-geenin sisältävä klooni eristetään ja liitoskohdat F- ja HN-DNA-jak- 10 sojen välillä osoitetaan oikeiksi Maxam-Gilbert-sekvensoinnin avulla. Kimeerinen PIV3-glykoproteiini voidaan sijoittaa sopivaan ilmentämisvektoriin. Edellä olevat restriktioentsyymikohdat valittiin, koska ne sallivat F- ja HN-glykoproteiinien merkityksellisten alueiden suuren osan ilmentämisen. Kuitenkin muita glykoproteiinien osia voitaisiin ilmentää valitsemalla muita restriktioentsyymikohtia 15 F- ja HN-koodausjaksoista näiden geenien fuusiota varten. Esimerkiksi HaeIII-, Kpnl-, tai N1aIV-restriktioentsyymejä voitaisiin käyttää pilkkomisessa HN-geenin 5'-päässä. Bal I -, Bgl II -, tai HaeIII-restriktioentsyymejä voitaisiin käyttää pilkkomisessa HN-geenin 3'-päässä. Entsyymejä voitaisiin käyttää missä tahansa kanden yhdistelmässä, jolloin on yksi entsyymi kummastakin ryhmästä, jotta saataisiin im- 20 munogeenisia proteiinikappaleita. gpf-geenille voitaisiin käyttää Bgl II-, HaeIII-, NsiI-, tai XhoII-restriktioentsyymejä XbaLn sijaan. Linkkerioligonukleotideja voitaisiin lisätä korjaamaan lukukehystä liitoskohta-alueilla. Kaksi oligonukleotidia, jotka korjaisivat kaksi mandollista lukukehyksen muutosta, ovat SalI-linkkerit 25 GGTCGACC CCAGCTGG ja CGGTCGACCG GCCAGCTGGC jotka ovat kaupallisesti saatavilla. Myös, kun halutaan ankkurialue glykoproteiiniin, linkkerioligonuldeotidi lisätään toiseen liitoskohtaan, mikä sallii gpf-ankkurialueen... synteesin. Vaihtoehtoisia strategioita voitaisiin suunnitella kimeerisen FHN-proteii-. 30 nin ilmentämistä varten eri jaksojen liittämisen tai häviämisen avulla. Päätunnus-... merkki proteiinille on signaalijakson ja kanden glykoproteiinin immunologisesti tär-.. keiden alueiden säilyttäminen. FHN-geenin liittäminen CHO-, BPV- tai baculovirus-ilmentämisvektoreihin on kuten on jo selitetty.

11 Kimeerinen FHN-glykoproteiini tarjoaa etuja verrattuna yksittäisten glykoproteiinien ilmentämiseen. Koska FHN on yksi ainoa proteiini, se vaatii puhdistamista varten puolet siitä työstä ja reagensseista, jotka tarvitaan erillisten F- ja HN-glykoproteiinien puhdistamiseen. Kimeerinen FHN-glykoproteiini myös eritetään elatusainei- 5 suin, mikä helpottaa puhdistamista. F-glykoproteiini voidaan muuttaa eritettäväksi glykoproteiiniksi katkaisemalla se ennen ankkurialuejaksoja. Kuitenkin PIV3 HN -glykoproteiini sisältää signaali/anklcurialueen sen aminoterminaalisessa päässä. Siksi tämän glykoproteiinin katkaiseminen ei synnytä eritettävää muotoa. Signaalitankkurialue voitaisiin korvata vieraan glykoproteiinin signaalialueella, mutta tämä 10 lisäisi vieraita proteiinijaksoja mandolliseen rokotteeseen. Konventioiden, joita käytetään plasmidien ja kappaleiden kuvaamisessa taulukoissa 1-6, on tarkoitus olla samanmerkityksisiä kuin tavaksi tulleiden rengasmaisten plasmidien ja niiden kappaleiden kuvausten. Toisin kuin rengasmaiset kuviot, yksiviivakuviot taulukoissa kuvaavat sekä rengasmaista että suoraa kaksijuosteista DNA:ta, 15 jossa on aloitus tai transkriptio tapahtuu vasemmalta oikealle (5':sta 3':uun). Tähdet (*) kuvaavat nukleotidien täyttämistä, jotta plasmidien rengasmainen muoto tehtäisiin täydelliseksi. Kappaleilla ei ole tähtimerkkejä, koska ne ovat kaksijuosteisen DNA:n suoria osia. Endonukleaasikohdat osoitetaan viivan yläpuolella. Geenimerkitsijät osoitetaan viivan alapuolella. Merkitsijöiden suhteellinen väli ei osoita to- 20 dellisia etäisyyksiä, vaan niiden on vain tarkoitus osoittaa niiden suhteellinen sijainti kuvitetussa DNA-jaksossa. Esimerkki 1 G-C-häntien poisto F-glykoproteiini-geenistä, taulukko 1 Jotta saataisiin F-glykoproteiinin enimmäisilmeneminen, G-C-nukleotidit, joita käytetään cdna:n liittämiseksi pbr322-plasmidiin, täytyy poistaa cdna:n päistä. 25 Jotta liitettäisiin FHN-cDNA sopivasti CHO-soluja varten olevaan suosittuun ilmentämisvektoriin (psvcow7, selitetty jäljempänä), tai baculovirusta varten olevaan suosittuun ilmentämisvektoriin (pac373, selitetty jäljempänä), on välttämätöntä hankkia BamHI-kohta ylävirtaan proteiinikoodausjaksosta. Menetelmät F-glykoproteiinin koko jakson sisältävien cdna-kloonien synteesiä varten on selitetty. Spriggs, 30 et al., Virology 152: 241-251, (1986). cdna, joka sisältää ehjän PIV3-F-geenin (pgpf1), pilkotaan BstX1:11ä ja NdeI:llä. BstXI pilkkoo F-geenin paikassa 39, joka kuuluu geenin aloituskodoniin, NdeI pilkkoo paikassa 1599. Oligonukleotidi 1 liitetään BstXI-pilkkomiskohtaan ja oligonukleotidi 2 liitetään NdeI-pilkkomiskohtaan. Oligonukleotidi 1 sisältää DNA-jaksot 10 35 emäksestä ennen koodausaluetta BstXI-pilkkomiskohtaan F-geenin koodausalueella

12 (-10:stä +39:ään), ja oligonukleotidilla on BamHI-kohta 5'-päässään. Oligonukleotidi 2 sisältää DNA-jaksot NdeI-pilkkomiskohdasta F-geenin lopetuskodoniin (+1599:stä +1620:een). Oligonukleotidi 2:n 3'-päässä on NruI-restriktioentsyymikohta, mitä seuraa BamHI-restriktioentsyymikohta. 5 Oligonukleotidien liittämisen jälkeen DNA pilkotaan BamHI:llä ja F-geeni (kappale 1, 1,6 Kb) puhdistetaan geelissä. Kappale 1 liitetään pbr322-plasmidiin (Pharmacia), joka on pilkotti' BamHI:llä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. Plasmidi (pgpf2) transformoidaan E. coli HB 101:een. pgpf2:n juuri syntetisoidut alueet sekvensoidaan Maxam-Gilbert-menetelmän avulla oikean synteesin ja 10 liittämisen tarkistamiseksi. Oligonukleotidi 1 CGGATCCACTGAACATGATGCAACCTCAATACTGCTAATTATTACAACCATGATT GCCTAGGTGACTTGTACTACGTTGGAGTTATGACGATTAATAATGTTGGTA Oligonukleotidi 2 15 TA TGTATTAACAAACAAATGATCGCGACGGATCCG ACATAATTGMGMACTAGCGCTGCCTAGGC Esimerkki 2 Kimeerisen PIV3-FHN-geenin rakentaminen, taulukko 2 A. PIV3-HN-glykoproteiinigeenin valmistaminen Kloonit, jotka sisältävät PIV3-11N-geenin koko koodausalueen ja menetelmät tällais- 20 ten kloonien eristämistä varten on selitetty. Elango et al., J. Virol. 57: 481-489, (1986). cdna-klooni, joka sisältää PIV3-HN-geenin (pgphn1), pilkotaan PstI:llä. Tämä entsyymi pilkkoo HN-geenin 3'-päätä kohti (nuldeotidi +1714). Kappaleen päät tehdään tylpiksi T4 DNA-polymeraasilla ja sitten defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. XbaI-linkkeri (New England Biolabs; linkkeri 1), jolla on 25 jakso. II.. : ' CTAGTCTAGACTAG GATCAGATCTGATC liitetään päähän. cdna erotetaan jäljelle jääneestä linkkeristä elektroforeesin avulla 1,2 % agaroosigeelissä. 1,7 Kb kappale (kappale 2), joka sisältää HN-geenin, irro- 30 tetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. Edellä oleva linkkeri sisältää oikeassa vaiheessa olevan translaation lopetussignaalin, joka pysäyttää proteiinisyn-

13 teesin. HN-geeni sitten pilkotaan DraI:llä. Tämä entsyymi pilkkoo HN-geenin signaali/anidcuri-koodausalueen 3'-päästä (nukleotidi +452). XbaI-linkkeri (New England Biolabs; linkkeri 2), jossa on jakso TGCTCTAGAGCA 5 ACGAGATCTCGT liitetään päähän. Tämä linkkeri ei sisällä oikeassa vaiheessa olevaa translaation lopetussignaalia. DNA pilkotaan Xbal:llä ja erotetaan jäljelle jääneistä linkkereistä elektroforeesin avulla 1,2 % agaroosigeelissä. 1,3 Kb kappale, joka sisältää HN-geenin merkityksellisen alueen, irrotetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. 10 B. HN-cDNA:n liittäminen PIV3-F-glykoproteiinigeeniin pgpf2-plasmidi pilkotaan»alllä ja defosforyloidaan bakteerin alkalisella fosfataasilla. 1,3 Kb kappale liitetään XbaI-kohtaan, jolloin saadaan kimeerinen FHNgeeni (pgpfhn1). Plasmidi transformoidaan E. coli HB 101:een. Kloonit eristetään ja valikoidaan ne kloonit, joissa HN-cDNA on oikein päin F-geenissä pilkkomalla 15 BamHI:llä ja Pvull:11a, mikä synnyttää FHN-geenistä noin 2,5 Kb ja 350 bp kappaleet. Jos HN-kappale on väärin päin, saadaan BamHI:llä ja Pvull:Ila pilkkomalla noin 1,5 Kb ja 1,3 Kb kappaleet. Oikein päin olevan kloonin liitoskohta-alueet sekvensoidaan Maxam-Gilbert-tekniikan avulla, jotta varmistetaan HN-kappaleen liittyminen oikein. 20 Esimerkki 3 DNA-oligonukleotidien käyttäminen geenien synnyttämiseksi, jotka koodaavat eri pituisia kimeerisiä FHN-glykoproteiineja, taulukko 3 F-HN-glykoproteiinien eri alueita sisältäviä kimeerisiä FHN-glykoproteiineja koodaavia geenejä voidaan synnyttää käyttämällä restriktioentsyymien yhdistelmää ja oligonukleotideja. Tämä menetelmä sallii F- ja HN-glykoproteiinien liittämisen mi- 25 hin tahansa haluttuun kohtaan niiden aminohapporungossa, sallii alueiden liittämisen tai poistamisen, jotka todennäköisesti sisältävät epitooppeja, jotka isännän immuunijärjestelmä tunnistaa. Jos halutaan, voidaan myös vaihtaa yksittäisiä aminohappoja. Syntetisoidaan oligonukleotideja, jotka vastaavat DNA-jaksoa halutusta liitoskohdasta sopivaan restriktioentsyymikohtaan. Tällä restriktioentsyymillä pilko- 30 taan glykoproteiinigeeni ja oligonuideotidi liitetään geeniin restriktioentsyymikohtaan, jolloin syntyy halutun pituinen DNA-kappale. Syntetisoidaan oligonukleotideja, joiden päät sopivat yhteen restriktioentsyymikohtien kanssa, mikä helpottaa liittymistä.

14 A. HN-glykoproteiini-cDNA:n liittäminen F-glykoproteiinigeeniin pgphn1-kloori pilkotaan Pstl:llä ja DraI:llä. 1,3 Kb kappale, joka vastaa cdnaaluetta nukleotidipaikasta 452 1714:ään (kappale 4), puhdistetaan geelissä. Sitten oligonukleotidit, jotka vastaavat HN-cDNA:n viereisiä alueita, liitetään kappale 4:n 5 molempiin päihin. Näissä oligonukleotideista olevat DNA-jaksot saattavat koodata lisäepitooppeja, joita on löydetty HN-glykoproteiinista. Yksittäiset oligonuldeotidit suunniteltiin sisältämään alueita, jotka saattavat sisältää ainutlaatuisia epitooppeja. HN-cDNA:n 5'-päähän liitetty oligonukleotidi saattaa koostua joko oligonukleotidista 3 (cdna-nukleotidit 395:stä 452:een), oligonukleotideista 3-4 (cdna-nukleotidit 10 355:stä 452:een), oligonukleotideista 3-4-5 (cdna-nukleotidit 275:stä 452:een), oligonukleotideista 3-4-5-6 (cdna-nukleotidit 218:sta 452:een), tai oligonukleotideista 3-4-5-6-7 (cdna-nukleotidit 162:sta 452:een). Sulut sisältävät nuldeotidit, jotka sisällytettäisiin vain päässä olevaan oligonukleotidiin. Esimerkiksi mukaan liitettyjä nuideotideja ei sisällytettäisi oligonukleotidiin 5, jos oligonukleotidi 6 olisi 15 määrä lisätä. Nämä mukaan liitetyt nukleotidit koodaavat XbaI-kohtaa. Mukaan liitettyjä nukleotideja ei sisällytetä, kun on määrä lisätä oligonuldeotidi/oligonukleotideja, jotta sallittaisiin oligonukleotidien yhteen sopivien päiden liittyminen. Esimerkiksi 3-oligonukleotidin 5'-pää sopii yhteen 4-oligonukleotidin 3'-pään kanssa, kun sulkujen sisältäviä nukleotideja ei sisällytetä oligonukleotidiin 3. Oligonuldeo- 20 tidi 8 liitetään HN-geenikappaleen 3'-päähän. Tämän oligonuldeotidin 5'-pää sopii yhteen 4-kappaleen 3'-pään kanssa. Tämän oligonukleotidin 3'-pää sisältää oikeassa vaiheessa olevan translaation lopetussignaalin, jota seuraa XbaI-restriktioentsyymikohta. Kun oligonukleotidit on liitetty HN-cDNA-kappaleeseen, DNA pilkotaan XbaLllä ja '...* 25 suurentunut HN-cDNA-kappale (kappale 5) puhdistetaan geelissä. Uusi HN-cDNA-.. kappale sitten liitetään XbaI:llä pilkottuun pgpf2:een. DNA transformoidaan E. coli HB 101:een ja eristetään kloori (pgpfhn2), joka sisältää 1-IN-geenin oikein.. päin F-geenissä. Oikea suunta määritetään pilkkomalla sopivilla restriktioentsyy- meillä. Kimeerisen geenin juuri syntetisoidut alueet osoitetaan oikeiksi Maxarn-,.. 30 Gilbert-sekvensoinnin avulla. Klooni voidaan sitten sijoittaa eri ilmentämisvekto-... reihin, kuten seuraavassa on selitetty....

15 B. Oligonukleotidit 3) (GTCTAGA AATTAGGA)ATGATAATCAAGAAGTGCCTCCACAAAGAATAA (CAGATCT)TTAATCCT TACTATTAGTTCTTCACGGAGGTGMCTTATT 5 CACATGATGTGGGCATAAAACCTT GTGTACTACACCCGTA1TTTGGAA 4) (GTCTAGA TATACCGA)TATCATTGACACAACAAATGTCGGATCTTAGGAAATT (CAGATCT)ATATGGCT ATAGTAACTGTGTTGMACAGC CTAGAATCCTTTAA CA'TTAGTGAAATTACAATTAGGA GTAATCACTTTAATG 10 5) (GTCTAGA TCTAATAC)AGTCAGGAGTGAATACAAGGC1TCTTACAATTCAG (CAGATCT)AGATTATG TCAGTCCTCACTTATGTTCCGAAGAATGTTAAGTC AGTCATGTCCAGAATTATATACCGA TCAGTACAGGTCTTAAT 15 6) (GTCTAGA CAATGAGT)TTATGGAAGTTACAGAA.AAGATCCAAATGGCATCGG (CAGATCT)GTTACTCA AATACCTTCAATGTC 1 iti CTAGGTTTACCGTAGCC ATAATATTAATGATCTAATAC TATTATAATTACT : 20 7) 8) GTCTAGATTCCATCAAAAGTGAAAAAGCCCATGAATCATTGCTACAA CAGATCTAAGGTAGI ITI CACTTTTTCGGGTACTTAGTAACGATGTT GACGTAAACAATGAGT CTGCATTT GTTAATCTAGAG ACGTCAATTAGATCTC Esimerkki 4 Ankkurialueen sisältävän kimeerisen PIV3-FHN-glykoproteiinigee-.:. 25 nin rakentaminen, taulukko 4 Esimerkit 2 ja 3 valaisevat geenien synteesiä, jotka koodaavat kimeerisiä FHNglykoproteiineja, jotka eivät sisällä ankkurialueita ja sen vuoksi ne eritetään ilmentävien solujen elatusaineeseen. Voidaan syntetisoida geeni, joka koodaa kimeeristä FHN-glykoproteiinia, joka sisältää ankkurialueen. Ankkuri aiheuttaisi kimeerisen 30 glykoproteiinin jäämisen solukalvoihin samalla tavalla kuin useimpien virusten gly-

16 koproteiinien jäämisen. Ankkurialue voi olla glykoproteiinin karboksyyliterminaalisessa päässä siten, että kimeerisen molekyylin immunogeeniset alueet sekä F- että HN-glykoproteiineista työntyisivät ulos solun ulkopuoliseen nesteeseen. Jäljempänä selitetty geeni koodaa kimeeristä glykoproteiinia, joka koostuu PIV3-F:n solun ulko- 5 puolisesta alueesta, PIV3-HN:n solun ulkopuolisesta alueesta, ja PIV3-F:n ankkurialueesta edellä olevassa järjestyksessä aminopäästä karboksyylipäähän. A. HN-cDNA-kappaleen liittäminen PIV3-F-glykoprotelinigeeniin pgphn1-klooni pilkotaan DraI:llä ja PstI:llä. Oligonukleotidi 9 ensin liitetään DNA-kappaleeseen (oligonukleotidi sopii yhteen DraI-kohdan kanssa). Oligonuk- 10 leotidi 10 sitten liitetään DNA-kappaleeseen (sopii yhteen PstI-kohdan kanssa). Molemmat oligonukleotidit sisältävät XbaI-restriktioentsyymikohdat. 9) TGCTCTAGAGCA ACGAGATCTCGT 10) GTCTAGAG 15 ACGTCAGATCTC Ligaation jälkeen DNA pilkotaan XbaLllä ja HN-cDNA:n 1,3 Kb kappale (kappale 6) puhdistetaan geelissä. Kappale 6 sitten liitetään Xbal:llä pilkottuun pgpf2:een. DNA transformoidaan E. coli HB 101:een. Kloonit eristetään ja valikoidaan ne, joissa DNA-kappale on oikein päin kuten on selitetty esimerkissä 2. Oikein päin 20 olevien kloonien liitoskohta-alueet sitten osoitetaan oikeiksi Maxam-Gilbert-sekvensoinnin avulla. Tämä kloori (pgpfhn3) voidaan sijoittaa eri ilmentämisvektoreiliin, kuten on selitetty seuraavassa. Esimerkki 5 Kimeerisen PIV3-HNF-glykoproteiinigeenin rakentaminen Osa PIV3-F-glykoproteiinin solun ulkopuolisesta alueesta voidaan sijoittaa HN- 25 glykoproteiinin karboksyyliterminaaliseen päähän. Tämä kimeerinen glykoproteiini koostuisi signaali/ankkuri-alueesta HN:n aminopäästä, pääosasta HN:n solun ulkopuolisesta alueesta, ja osasta F:n solun ulkopuolisesta alueesta edellä olevassa järjestyksessä aminopäästä karboksyylipäähän. A. PIV3-HN-glykoproteiinigeenin valmistaminen, taulukko 5 30 Jotta valmistettaisiin pgphn1-klooni ilmentämistä varten, cdna-kloonauksessa käytetyt G-C-hännät täytyy poistaa ja sijoittaa yhteen sopivat restriktioentsyymikohdat DNA:n päihin. pgphn1-klooni pilkotaan HphI:11ä. HphI pilkkoo cdna-

17 geenin koodausjakson paikassa 75. Seuraava oligonukleotidi sitten liitetään cdnakappaleeseen: 11) GGATCCAAATCCGAGATGGAATACTGGAAGCACACCAATCACGGGAAAGATGCTGG CCTAGGTTTAGGCTCTACCTTATGACCITCGTGTGGTTAGTGCCCITTCTACGACC 5 TAATGAGCTGGAAACATCCATGGCTACTCATGGC ATTACTCGACCMGTAGGTACCGATGAGTACC Oligonukleotidi 11 liittyy HphI-kohtaan ja synnyttää BamHI-restriktioentsyymikohdan cdna-kappaleen 5'-päähän. Oligonukleotidi 11:n liittyminen jälkeen DNA pilkotaan BamHI:llä ja PstI:llä (PstI pilkkoo nukleotidipaikassa 1714 HN-geenissä). 10 DNA ajetaan 1,2 % agaroosigeelielektroforeesissa. 1,7 Kb HN-cDNA-kappale (kappale 7) irrotetaan geelistä ja DNA puhdistetaan agaroosista. Kappale 7 sitten liitetään puc19:ään, jota on pilkottu BamHI:llä ja PstI:llä, jolloin saatiin pgphn2. Plasmidi transformoidaan E. coli HB 101:een ja plasmidi-dna eristetään. B. F-cDNA-kappaleen liittäminen PIV3-HN-glykoproteiinigeeniin, taulukko 6 15 pgpf1 pilkotaan BstEII:lla ja XbaI:llä. BstEII pilkkoo paikassa 190 ja XbaI paikassa 1398 F-cDNA-geenijaksossa. Seuraavat oligonuldeotidit sitten liitetään cdnakappaleeseen. 12) CCTGCAGGTG GGACGTCCACCACTG. ' 20 13) CTAGAATAATAGTCGCGAGGATCCTGCAGG TTATTATCAGCGCTCCTAGGACGTCC... Oligonukleotidi 12 liittyy BstII-kohtaan ja synnyttää PstI-restriktioentsyymikohdan cdna-kappaleen 5'-päähän. Oligonukleotidi 13 liittyy XbaI-kohtaan ja synnyttää translaation lopetuskodonin, NruI-restriktioentsyymikohdan, BamHI-restriktio- 25 entsyymikohdan ja PstI-restriktioentsyymikohdan ilmaistussa järjestyksessä (5':sta 3':uun) cdna-kappaleen 3 1-päähän. DNA sitten pilkotaan PstI:llä ja 1,2 Kb F- cdna-kappale (kappale 8) puhdistetaan geelissä. Kappale 8 sitten liitetään pgphn2:een, jota on pilkottu PstI:llä. Plasmidi transformoidaan E. coli HB101:een. Kloonit eristetään ja niistä valikoidaan kloonit, joissa F-cDNA on oikein päin IIN-.., 30 geenissä pilkkomalla BamHI:llä ja NruI:llä, mikä saa aikaan 2,9 Kb kappaleen. Jos 4. 1 0 4 I F-cDNA on väärin päin, syntyy 1,7 Kb kappale. Oikein päin olevan kloonin liitoskohta-alueet osoitetaan sitten oikeiksi Maxam-Gilbert-sekvensoinnin avulla. Tämä

18 klooni (pgphnf1) voidaan sijoittaa eri ilmentämisvektoreihin, kuten jäljempänä on selitetty. Esimerkki 6 PIV3:n kimeerisen FHN-glykoproteiinin ilmeneminen CHOsoluissa 5 A. psvcow7:n rakentaminen psv2dhfr-plasmidi (saatavilla American Type Culture Collectionista tai valmistetaan S. Subramanin ym. menetelmän mukaan, "Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology 2: 854-864 syyskuu 1981) pilkotaan BamHI:llä ja 10 EcoRI:llä, jolloin saadaan 5,0 Kb kappale (kappale 9), joka sisältää ampisilliinivastustuskykygeenin, SV 40:n replikaarion aloituskohdan, ja dhfr-geenin. psvcow7:n toinen osa saadaan pägh2r2-plasmidista, jota on pilkottu samoilla restriktioendonukleaaseilla, joita käytettiin psv2dlifr:n pilkkomisessa, jotta saatiin 2,1 Kb kappale (kappale 10), joka sisältää genomisen naudan kasvuhormonigeenin 15 3'-pään, se on, BGH-gDNA:n. pxgh2r2-plasmidi on julkisesti saatavilla E. coli HB 101 -isännästä, joka on talletettu Northern Regional Research Laboratoriesin kokoelmiin Peoriaan, Illinoisiin (NRRL B-15154). Kappaleet 9 ja 10 liitetään, jolloin saadaan psvcow7 (7,1 Kb). B. pgpfhn-ie-pa:n rakentaminen 20 Esimerkeissä 2-5 rakennettuja geenejä voidaan käyttää kimeerisen glykoproteiinin ilmentämistä varten CHO-soluissa. pgpfhn-1-plasmidia käytetään seuraavassa. esimerkissä. Muita kimeerisiä geenejä käsitellään kuten on selitetty pgpfhn-1:n osalta paitsi, kun toisin on osoitettu. pgpfhn-ie-pa:n kokoaminen toteutetaan kandessa vaiheessa. Ensin gpfhn-cdna pgpfhn1:stä liitetään psvcow7:ään, 25 jolloin saadaan pgpfhn-pa ja sitten sytomegaloviruksen hyvin varhaisen alueen promoottori liitetään aloittamaan PIV3-tyyppisten proteiinien transkriptio, jolloin e saadaan pgpfhn-ie-pa. Vaihe 1. psvcow7-plasmidi pilkotaan EcoRl:llä ja PvuI1:11a ja eristetään kappale,?, 11 (600 bp), joka sisältää naudan kasvuhormonin polyadenylaatiojakson, joka ulot- 30 tuu BGH-geenin eniten 3'-päässä olevan eksonin Pvull-kohdasta EcoRI-kohtaan, jo-.. ka on alavirtaan 3'-päästä. BGH-polyadenylaatiojakson täydellinen yhteenveto löy- :.. tyy seuraavista viitteistä: (1) Eurooppalainen patenttihakemus 0112012, julkaistu 27. kesäkuuta 1984, jossa genomisen BGH-DNA:n identifiointi ja tunnusomaiset piirteet on tuotu esiin; (2) Woychik, R.P. et al., "Requirement for the 3' Flanking

19 Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3944-3948 (heinäkuu 1984); ja D.R. Higgs, et al., Nature 306: 398-400 (24. marraskuuta 1983) ja näissä siteeratut viitteet tuovat esiin sen, että AATAAA-nukleotidijakso on tunnusomaista polyadenylaatiosignaalille paikas- 5 sa, joka on 11:stä 30:een nuldeotidia ylävirtaan (5'-päähän päin) BGH-geenin 3'- päästä. psvcow7:n toinen näyte pilkotaan EcoRl:llä ja BamHI:11ä, jolloin saadaan kappale 12 (5,8 Kb). Kappale 12 voidaan vaihtoehtoisesti saada EcoRUBamHI-kappaleesta psv2dhfr-plasmidista, joka on saatavilla Bethesda Research Laboratoriesilta. 10 Kappale 12 sisältää pbr322:n replikaation aloituskohdan ja ampisilliini-vastustuskykygeenin, joka ilmenee E. colissa, mikä sallii plasmidin valikoimisen E. colissa. Kappale sisältää myös hiiren dihydrofolaattireduktaasi-cdna:n rakennelmassa, joka sallii ilmentämisen nisäkässoluissa. Subramani, et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864 (1981). 15 pgpfhn1-plasmidi pilkotaan BamHI:llä ja NruI:llä, jolloin saadaan kappale 13 (2,7 Kb), joka eristetään geelissä. BamHI-kohta on FHN-mRNA:n translatoimattomia 5'- jaksoja koodaavasta cdna:sta juuri ylävirtaan, ja NruI-kohta on muutama emäs alavirtaan translaation lopetuskodonista. Kappaleet 11, 12 ja 13 liitetään muodostamaan pgpfhn-pa (9,1 Kb), joka on 20 replikaatiovektori, joka pystyy sukkuloimaan E. coli- ja CHO- solujen välillä. pgpfhn-pa-plasmidi transformoidaan E. coliin. Vaihe 2. Vaiheessa 2 pgpfhn-pa vaihdetaan pgpfhn-ie-pa-ilmentärnisplasmidiin liittämällä ihmisen sytomegaloviruksen hyvin varhaisen alueen geenin promoottori (CMV-I.E.-promoottori). CMV-I.E.-promoottori saadaan pilkkomalla CMV-..:.. 25 genomi Pstillä. Ihmisen sytomegaloviruksen (CMV) genomin, joka sisältää hyvin varhaisen päägeenin (CMV I.E.), restriktioendonukleaasipilkkomiskartat on selitetty yksityiskohtaisesti artikkelissa Stinski, et al., J. Virol. 46: 1-14, 1983; Stenberg, et al., J. Virol. 49: 190-199, 1984; ja Thomsen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 659-633, 1984.., :.. 30 Stinskin ja Thomsenin viitteet selittävät 2,0 kiloemäs PstI-kappaletta, joka sisältää hyvin varhaisen päägeenin promoottorin. Kun tämä 2,0 Kb PstI-kappale eristetään ja 9 9 9 : 9 pilkotaan Sau3AI:llä, saadaan tuotteiden joukosta 760 emäsparin kappale. Tämä 760 :.. : emäsparin kappale voidaan erottaa muista tuotteista sen koon ja kappaleessa olevien SacI-pilkkomiskohdan ja BalI-pilkkomiskohdan perusteella. Tämän Sau3AI-kappa-

20 leen sopivan identifikaation vuoksi, Sau3AI-kappaleen hyödyntäminen on CMV- I.E.-promoottorin käytön suosittu menetelmä, kuten tässä julkaisussa. pgpfhn-pa-plasmidi pilkotaan BamHI:llä, ja CMV:n hyvin varhaisen alueen promoottorin sisältävä Sau3AI-kappale liitetään yhteen sopivaan BamHI-kohtaan. Plas- 5 midit, jotka sisältävät CMV-promoottorikappaleen siten, että transkriptio promoottorista syntetisoisi lähetti-rna:n PIV3-tyyppistä proteiinia varten, tunnistetaan pilkkomalla plasmidit SacI:11ä. Tulokseksi saatu plasmidi nimitetään pgpfhn-ie- PA:ksi, jolla on CMV-I.E.-promoottori cdna:n 5'-päässä ja BGH-polyadenylaatiosignaali sen 3'-päässä. Plasmidia pidetään yllä E. colissa kunnes se transfektoidaan 10 CHO-soluihin. C. CHO-solujen transfektio ja viljeleminen pgpfhn-ie-pa-plasmidi transfektoidaan kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO) - soluihin, joilta puuttuu dihydrofolaattireduktaasi (dhfr), käyttämällä DNA:n transfektoimiseksi soluihin kalsiumfosfaattimenetelmää, jonka Graham ym. ovat yksi- 15 tyiskohtaisesti selittäneet, Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1980, pp. 3-25. Käytetty solulinja on DXB-11-mutantti, joka oli alun perin saatavilla L. Chasinilta Kolumbian yliopistosta ja on selitetty täysin artikkelissa Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980). Edellä olevat transfektiomenetelmät ovat riippuvaisia siitä tosiasiasta, että solut, jotka sisäl-. 20 lyttävät transfektoituneet plasmidit, eivät ole enää vajavaisia dhfr:n suhteen ja kasvavat Dulbeccon muutetussa Eaglen elatusaineessa, jossa on proliinia. Jos kimeerinen glykoproteiini ei sisällä ankkurialuetta, eritettävää kimeeristä FHNproteiinia ilmentävien CHO-solujen supernatantti puhdistetaan sentlifugoimalla pienellä nopeudella. Supernatantti levitetään konkonavaliini-a- tai linssilektiini-pylvään päälle. Glykoproteiini eluoidaan laajan pesemisen jälkeen a-d-metyyliglukosidin lineaarisella gradientilla (0-0,5 M), joka on edellä olevassa puskurissa. Eluoitu glykoproteiini dialysoidaan 0,1 % Triton X-100:aa sisältävää PBS:ää vastaan ja levitetään affiniteettipylvään päälle. Affmiteettipylväs koostuu joko polyklonaalisista tai monoklonaalisista vasta-aineista, jotka on suunnattu Sepharose 4B-helmiin (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) liitettyä PIV3:a vastaan tunnettujen tekniikkojen avulla. Pylväs pestään dialyysipuskurissa ja PIV3-FHN-glykoproteiini eluoidaan PBS:llä, joka sisältää 0,1 M glysiiniä (ph 2,5) ja 0,1% Triton X-100:aa. Glykoproteiini dialysoidaan suolaliuosta vastaan ja puhtaus tarkistetaan elektroforeesin avulla SDS-PAGE-geelissä.