11111111111111 11 [II 1111 F (000101453B (12) PATENTTIJULKAISU PATENTS1CRIFT (10) FI 101453 B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 30.06.98 (51) Kv.lk.6 - Int.k1.6 SUOMI-FINLAND (FI) A 61K 39/012, C 12N 15/30, 15/83 C 07K 14/455, A 61K 39/395 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 892714 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 02.06.89 (24) Alkupåivä - Löpdag 02.06.89 Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 04.12.89 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 03.06.88 US 202721 P (73) Haltija - Innehavare 1. F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, 4002 Basel, Switzerland, (CH) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Altenburger, Werner, 135 Esterliweg, 4125 Riehen, Switzerland, (CH) 2. Singer, Mary-Helen, 4 Starenstrasse, 4103 Bottmingen, Switzerland, (CH) 3. Chizzonite, Richard Anthony, 10 Barnsdale Road, Clifton, NJ 07013, USA, (US) 4. Kramer, Richard Allen, 9 North Edgewood Avenue, West Orange, NJ 07052, USA, (US) 5. Lomedico, Peter Thomas, 53 Club Road, Upper Montclair, NJ 07043, USA, (US) 6. McAndrew, Stephen J., 95 Second Street, Athens, OH 45701, USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab, Iso Roobertinkatu 23, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmiä ja DNA-sekvenssejä rekombinantti-kokkidioosirokotteiden valmistamiseksi Förfarande och DNA-sekvenser för framställning av rekombinant-coccidiosisvaccin (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism: BH 9708 ATCC BH 9710 ATCC BH 9712 ATCC BH 9709 ATCC BH 9711 ATCC HB 9707 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee Eimerian pinta-antigee- Uppfinningen avser DNA-sekvenser, viinejä koodaavia DNA-sekvenssejä, tällai- ka kodar för Eimeria -ytantigener, re - sia DNA - sekvenssejä sisältäviä yhdis - kombinanta vektorer, vilka innehåller telmävektoreita, tällaisia vektoreita dylika DNA-sekvenser, transformerade sisältäviä isäntäeliöitä ja menetelmiä värdorganismer, vilka innehåller dyliantigeenien tuottamiseksi näitä trans- ka vektorer, och förfaranden för framformoituja mikro-organismeja käyttäen. ställning av antigenerna under använd- Eimerian pinta-antigeenejä käytetään ning av de transformerade mikroorgasiipikarjan suojaamiseksi kokkidioosia nismerna.eimeria-ytantigenerna används vastaan, jolloin pinta-antigeenejä voi- för skyddande av fjäderfä för koccididaan antaa eläimille joko puhdistettui- os, varvid ytantigenerna kan adminisna proteiineina tai proteiineja koodaa- treras antingen som renade proteiner van DNA:n muodossa sopivassa virusvek - eller i form av DNA, som kodar för protorissa, kuten lehmärokkoviruksessa. teinerna i en lämplig virusvektor, såsom i kokoppvirus.
1 101453 Menetelmiä ja DNA-sekvenssejä rekombinantti-kokkidioosirokotteiden valmistamiseksi Kokkidioosi on siipikarjan tauti, jonka aiheuttavat 5 Eimeria-suvun solunsisäiset alkueläinloiset. Tauti on endeeminen suurissa, intensiivisissä siipikarjankasvatusyksiköissä, ja taudin hallintakustannukset kemoterapialla ylittävät 100 miljoonaa dollaria vuodessa pelkästään Amerikan Yhdysvalloissa. Resistenssin kehittyminen kokkidien 10 vastaisille lääkeaineille vaatii uusien aineiden jatkuvaa kehittämistä, aikana, jolloin lääkkeiden kehittäminen on tulossa yhä kalliimmaksi, ja kuluttajien hyväksyntä ravintoeläimissä olevia lääkeainejäämiä kohtaan on vähenemässä. Suojaava immuniteetti luonnollista kokkidioosi-in- 15 fektiota vastaan on hyvin dokumentoitu. Kontrolloidun, päivittäisen elinkykyisten ookystien pienten määrien antamisen useiden viikkojen ajan on osoitettu johtavan täydelliseen immuniteettiin normaalisti virulentilla annoksella annettavaa infektiota vastaan [Rose ym., Parasito- 20 logy 2a:25 (1976); Rose ym., Parasitology fia:199 (1984)]. Hankitun resistenssin osoittaminen infektiota kohtaan viittaa siihen, että on mandollista muodostaa rokote immuniteetin aiheuttamiseksi nuorissa kanoissa, millä päästään kemiallisten kokkidistaattien tarpeesta. Itse asiassa 25 tällaista ajatusta on kokeiltu Sterwin Laboratoriesin, Opelika, Alabama, USA, Coccivace-valmisteessa. Kokkidioosirokotteen tuottaminen tavoitteenaan Murray ym., EP-patenttihakemus, julkaisu no. 167 443, tuottivat sellaisia uutteita Eimeria tenellan sporotsoiiteista 30 tai sporuloineista ookystista, jotka sisältävät ainakin 15 polypeptidiä, joista monilla oli yhteys sporotsoiitin pintaan. Näiden uutteiden ruiskuttaminen kanoihin vähensi umpisuolen leesioita, kun niihin oli tartutettu virulentteja E. tenellan sporuloineita ookystia suun kautta. Sit- 35 temin Schenkel ym., US-patentti no. 4 650 676, esittivät monoklonaalisten vasta-aineiden tuoton E. tenellan merot-
2 101453 soiitteja vastaan. Näitä vasta-aineita käyttäen Schenkel ym. tunnistivat joukon antigeenejä, joita vastaan vastaaineet kohdistuivat. Esi-inkuboimalla E. tenellan sporotsoiitteja näiden vasta-aineiden kanssa ja sitten viemällä 5 käsitellyt sporotsoiitit kanojen umpisuoleen, Schenkel ym. pystyivät osoittamaan jonkin verran laskua umpisuolen leesioiden määrissä verrattuna käsittelemättömiin sporotsoiittikontrolleihin. Edistysaskeleet yhdistelmä-dna-teknologiassa ovat 10 tuoneet tarjolle toisen lähestymistavan, nimittäin alayksikkörokotteet. Nykyisiä yhdistelmä-dna-menetelmiä sovellettaessa tiettyjä DNA-sekvenssejä sijoitetaan sopivaan DNA-vehikkeliin, eli vektoriin, sellaisten yhdistelmä-dnamolekyylien muodostamiseksi, jotka voivat replikoitua 15 isäntäsoluissa. Plasmideiksi kutsuttuja renkaanmuotoisia kaksijuosteisia DNA-molekyylejä käytetään usein vektoreina, ja tällaisen yhdistelmä-dna:n valmistamiseen kuuluu restriktioendonukleaasientsyymien, jotka pystyvät katkaisemaan DNA:ta tiettyjen emässekvenssien kohdalta, käyttö. 20 Kun restriktioentsyymi on tehnyt katkokset plasmidissa ja vieraan DNA:n segmentissä, joka aiotaan sijoittaa siihen, nämä kaksi DNA-molekyyliä voidaan liittää toisiinsa ligaasiksi kutsutulla entsyymillä. Yleisiä menetelmiä tällaisten yhdistelmä-dna-molekyylien valmistamiseksi ovat 25 kuvanneet Cohen ym., [US-patentti no. 4 237 224], Collins ym., [US-patentti no. 4 304 863] ja Maniatis ym. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]. Koska ne havainnollistavat suurta osaa tekniikan tasosta, niihin viitataan tässä. 30 Valmistamisen jälkeen yhdistelmä-dna-molekyylejä voidaan käyttää insertoidun geenisekvenssin määrittelemän tuotteen tuottamiseen vain, jos joukko ehtoja täytetään. Tärkeimpänä on vaatimus, että rekombinanttimolekyylin on oltava yhteensopiva isäntäsolun kanssa ja siten kyettävä 35 replikoitumaan siinä autonomisesti. Viimeaikaisissa töissä on käytetty paljon Escherichia colia isäntäeliönä, koska
3 101453 _. se on yhteensopiva laajan joukon rekombinanttiplasmideja kanssa. Riippuen käytetystä vektori/isäntäsolu -systeemistä, yhdistelmä-dna-molekyyli viedään isäntään transformaatiolla, transduktiolla tai transfektiolla. 5 Yhdistelmäplasmidien läsnäolon havaitseminen isäntäsoluissa voidaan järjestää kätevästi käyttämällä plasmidien merkkiaktiivisuuksia, kuten antibioottiresistenssiä. Siten ampisillinia hajottavan entsyymin tuottoa koodaavaa plasmidia kantava isäntä voitaisiin selektoida 10 muuttamattomien solujen joukosta kasvattamalla isäntää ampisilliinia sisältävässä elatusaineessa. Antibioottiresistenssimerkkiominaisuuksista voidaan lisäksi hyötyä, kun plasmidi koodaa toista antibioottia hajottavaa aktiivisuutta kohdassa, josta valittu restriktioendonukleaasi 15 katkaisee ja johon vieras geenisekvenssi sijoitetaan. Isäntäsoluille, jotka sisältävät oikealla tavalla rekombinantteja plasmideja, on silloin tunnusmerkillistä resistenssi ensimmäiselle antibiootille, mutta herkkyys toiselle. 20 Pelkkä yhdistelmäplasmidin sijoittaminen isäntäsoluun ja muutetun isännän eristäminen eivät sinänsä varmista, että haluttua geenituotetta tuotetaan merkitseviä määriä. Tämän tapahtumiseksi vieraan geenisekvenssin täytyy olla oikealla tavalla kiinnittynyt plasmidissa olevaan 25 DNA-transkription signaalialueeseen, jota kutsutaan promoottoriksi. Vaihtoehtoisesti, vieraalla DNA:lla voi olla oma promoottori mukanaan, kunhan isäntä vain tunnistaa sen. Alkuperästään riippumatta promoottori on DNA-sekvenssi, joka ohjaa RNA-polymeraasin sitoutumista ja siksi 30 "promotoi" (edistää) DNA:n transkriptiota lähetti-rna:ksi (mrna:ksi). Kun promootio on vahva, niin että voidaan saada suuria määriä mrna:ta, halutun geenituotteen lopullinen tuotanto riippuu mrna:n proteiiniksi translaation tehok- 35 kuudesta. Tämä puolestaan riippuu ribosomien mrna:han sitoutumisen tehokkuudesta. E. colissa mrna:n ribosomeja
4 101453 sitovaan kohtaan kuuluu initiaatiokodoni (AUG) ja siitä ylävirtaan oleva Shinen-Dalgarnon sekvenssi (SD-sekvenssi). Tämä sekvenssi, joka sisältää 3-9 nukleotidia ja sijaitsee 3-11 nukleotidin päässä AUG-kodonista, on komple- 5 mentaarinen E. colin ribosomien 16S-RNA:n (16S rrna:n) 3'- päälle [Shine ja Dalgarno, Nature 251:34 (1975)]. Ilmeisesti ribosomien sitoutumista mrna:han helpottaa emäspariutuminen mrna:n SD-sekvenssin ja 16S rrna:n 3'-pään välillä. Katsausartikkeliksi geeniekspression maksimoimises- 10 ta ks. Roberts ja Lauer, Methods in Enzymology 5a:473 (1979). Vaihtoehtoinen ekspressiosysteemi on kehitetty perustuen lacz-operoniin yhdessä lambdafaagivektorien kanssa (Huynh ym. teoksessa DNA Cloning: Volume I, D. M. Glover, 15 toim.). Tässä systeemissä B-galaktosidaasin rakennegeeni yhdessä sen ekspressiota säätelevän indusoitavissa olevan promoottorin kanssa on liitetty osaksi faagivektoria. Ainutkertainen kloonauskohta B-galaktosidaasigeenin 3 ' -päässä johtaa geenifuusioon insertoitaessa mrna:n tai genomi- 20 sen DNA:n fragmentin cdna-kopio, joka sisältää proteiinia koodaavan alueen. 8-galaktosidaasigeenin ekspressio johtaa sellaisen fuusioproteiinin tuottamiseen, joka sisältää 114 kda 8- galaktosidaasista ja cdna-insertin koodaaman karboksiter- 25 minaalisen polypeptidin, olettaen, että insertissä on avoin lukukehys samanvaiheisena kuin 8-galaktosidaasin lukukehys. Faagi, joka sisältää geenin, jonka tuotteen tunnistaa monoklonaalinen tai polyklonaalinen antiseerumi, voidaan siten tunnistaa kirjaston immunologisella seulon-. 30 nalla sen jälkeen, kun fuusioproteiinin ekspressio on indusoitu käyttäen B-D-tiogalaktopyranosidia (IPTG) laczrepressorin inaktivoimiseksi. Tässä ekspressiovektorisysteemissä yhdistyvät faagisysteemin teho DNA:n pakkaamisessa ja sen viemisessä E. coli -soluihin sekä 8-galaktosi- 35 daasin kanssa tapahtuneiden polypeptidifuusioiden parempi stabiilisuus.
5 101453 Alayksikkölähestymistavassa rokotteisiin, alayksikkö koko infektiivisestä organismista viedään isäntäeläimeen immunologisesti relevantissa yhteydessä. Alayksikkö voisi olla loisesta puhdistettu proteiini, heterologisessa 5 systeemissä ekspressoitu rekombinanttiproteiini tai -proteiinifragmentti, yksittäisen neutralisoivan determinantin sisältävä synteettinen peptidi tai proteiini, joka on sijoitettu virusvektoriin, kuten lehmärokkovirukseen. Isännän immuunijärjestelmä kehittää spesifisen vasteen alayk- 10 sikköä vastaan altistumatta koskaan kokonaiselle loiselle. Kohdatessaan virulentin annoksen infektiivistä organismia isännän immuunijärjestelmä kehittää onnistuneen puolustuksen vain sen rokotealayksikön ohjaamana, jolle se oli aikaisemmin altistettu. 15 Kirjallisuudesta voi löytää todistusaineistoa, että verenkierron vasta-aineet, sekretorinen IgA suolen epiteelissä [Davis ym., Immunology 24:879 (1978)] ja soluvälitteinen immuunijärjestelmä [Giambroni ym., Poultry Science 59:38 (1980)] ovat mukana hankitussa resistenssissä kok- 20 kidioosia vastaan. Katsausartikkeliksi ks. P. S. Davis teoksessa Avian Immunology, M. E. Rose, toim., British Poultry Science, Ltd., Edenberg, s. 361-385 (1981). Immuunijärjestelmän eri haarojen todennäköinen mukanaolo tarkoittaa, että täydelliseen ja kestävään suojaan voidaan 25 vaatia kyky jäljitellä tiettyjä seikkoja luonnollisessa infektioprosessissa. Näihin seikkoihin kuuluvat paikallinen altistus kohdassa, jossa suojaa halutaan, tulehdusvasteen herättäminen antigeeniä prosessoivien solujen saamiseksi paikalle, sopivan loisantigeenin esittely ja mandol- 30 linen assosiaatio MHC-determinanttien kanssa tietyssä membraanikonfiguraatiossa. Tämä keksintö kohdistuu menetelmään proteiinin valmistamiseksi, jolla on yksi tai useampi Eimerian pinta-antigeenin immunoreaktiivinen ja/tai antigeeninen deter- 35 minantti ja jonka pinta-antigeenin näennäinen molekyylipaino on noin 28, 37, 120 tai yli 200 kilodaltonia ja joka
6 101453 spesifisesti sitoutuu yhteen tai useampaan niistä monoklonaalisista vasta-aineista, jotka on talletettu American Type Culture Collectioniin ja joille on annettu talletusnumerot HB 9707 - HB 9712. Proteiineilla on kuvioissa 15, 5 17, 19 ja 21 näkyvät amonihapposekvenssit. Mainittuja proteiineja voidaan käyttää siipikarjan immunisoimiseen kokkidioosia vastaan. että Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, 10 (a) eristetään DNA-sekvenssi, joka on valittu ryh- mästä, jonka muodostavat kuvioissa 14, 16, 18 ja 20 esitetyt DNA-sekvenssit, ja viedään se plasmidiin; (b) transformoidaan bakteerisoluja vaiheen (a) mukaisesti saaduilla rekombinanttiplasmideilla; 15 (c) viljellään transformoidut bakteerisolut vil- jelyalustassa; (d) indusoidaan mainitun DNA:n koodaaman proteiinin ekspressiota, jolla proteiinilla on aminohapposekvenssi, joka on valittu kuvioissa 15, 17, 19 ja 21 esitetyistä 20 sekvensseistä; (e) liuotetaan ekspressoitu proteiini ensin keräämällä bakteerisolut ja rikkomalla ne; ja (f) puhdistetaan liuotettu Eimeria-rekombinanttiproteiini. 25 Tässä kuvataan edelleen edellämainittuja proteiine- ja vastaan suunnattuja vasta-aineita, erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita, kuten monoklonaaliset vastaaineet, joilla on hakunumerot HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 ja HB 9712. 30 Vielä lisäksi tämä keksintö tuo käytettäviksi edel- lämainittuja proteiineja koodaavia DNA-sekvenssejä. Lisäksi kuvataan DNA-sekvenssejä sisältäviä yhdistelmävektoreita, erityisesti yhdistelmävektoreita, jotka kykenevät ohjaamaan mainittujen DNA-sekvenssien ekspressiota yhteenso- 35 pivassa isäntäeliössä, ja tällaisilla yhdistelmävektoreilla transformoituja isäntäorganismeja, erityisesti trans-
7 101453 formoituja isäntäorganismeja, jotka kykenevät ekspressoimaan mainitun yhdistelmävektorin sisältämiä edellämainittua proteiinia koodaavia DNA-sekvenssejä. Keksintö koskee myös menetelmää plasmidin valmista- 5 miseksi, joka koodaa edellä mainittua proteiinia. Menetelmälle on tunnusomaista, että (a) insertoidaan DNA-sekvenssi, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat kuvioissa 14, 16, 18 ja 20 esitetyt DNA-sekvenssit, plasmidiin; 10 (b) saatetaan plasmidi lisääntymään bakteerisoluissa; ja (c) eristetään plasmidi-dna bakteerisoluista. Vielä lisäksi tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän transformoitujen bakteerisolujen valmistamiseksi, 15 jotka pystyvät ekspressoimaan DNA-sekvenssiä, joka koodaa edellä mainittua proteiinia. Menetelmälle on tunnusomaista, että transformoidaan bakteerisoluja keksinnön mukaisesti valmistetulla plasmidilla ja viljellään transformoidut bakteerisolut viljelyalustassa. 20 Keksintö antaa myös käyttöön menetelmän vacciniaviruksen valmistamiseksi, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa edellämääriteltyä proteiinia. Menetelmälle on tunnusomaista, että (a) insertoidaan DNA-sekvenssi, joka on valittu 25 ryhmästä, jonka muodostavat kuvioissa 14, 16, 18 ja 20 esitetyt DNA-sekvenssit, vaccinia-viruksen genomiin; ja (b) puhdistetaan vaccinia-virus; ja (c) eristetään vaccinia-virus viljelyalustasta. Vielä lisäksi tässä kuvataan rokotteita siipikarjan 30 suojaamiseksi kokkidioosia vastaan, jotka koostuvat yhdestä tai useammasta edellä mainitusta proteiinista ja fysiologisesti soveliaasta kantajasta. Vielä lisäksi tässä kuvataan rokotteita siipikarjan suojaamiseksi kokkidioosia vastaan, jotka koostuvat mai- 35 nittua proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin sisältävästä
8 1014E3 virusvektorista, joka pystyy ekspressoimaan tätä DNA-sekvenssiä, ja fysiologisesti soveliaasta kantajasta. Tässä esitetään edelleen menetelmä siipikarjan suojaamiseksi kokkidioosia vastaan, jolloin annetaan tehokas 5 annos mainittua rokotetta nuorelle linnulle, joka on altis saamaan kokkidioosin. Tämä keksintö voidaan helpommin ymmärtää tarkastelemalla seuraavaa keksinnön kuvausta ja esimerkkiä yhteydessä seuraaviin kuvioihin, joissa: 10 Kuvio 1 esittää tulokset E. tenellan sporotsoiittien ELISA:sta. Laimennuksia hiiren immuuniseerumista (MS 107-2; avoin kolmio) ja hiiren kontrolliseerumista (X) inkuboitiin 4 x 10 4 elävän puhdistetun sporotsoiitin kanssa. Sporotsoiitteihin sitoutunut spesifinen vasta-aine 15 havaittiin peroksidaasikonjugoidulla hiiren IgG:n vastaisella vasta-aineella ja peroksidaasin substraatilla o-fenyleenidiamiinilla. Absorbanssi aallonpituudella 492 nm luettiin Titertek Multiscano kuoppalevyjen mittauslaitteella. 20 Kuvio 2 esittää tulokset "Western blot" -määrityksestä, joka tehtiin E. tenellan sporotsoiitetista liukoisiksi saatetuista proteiineista. Liukoisiksi saatetut sporotsoiittien proteiinit erotettiin pelkistävässä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa 12,5 %:n geeleissä, 25 siirrettiin nitroselluloosasuodattimille ja saatettiin reagoimaan kunkin vasta-aineen kanssa. Kunkin vasta-aineen tunnistamat spesifiset proteiinit tehtiin näkyviksi peroksidaasikonjugoidulla hiiren IgG:n vastaisella vasta-aineella ja peroksidaasin substraatilla 4-kloori-l-naftolil- 30 la. Vasta-aine, jonka kanssa kukin liuska saatettiin reagoimaan on merkitty liuskan yläpuolelle. Kuvio 3 esittää tulokset "Western blot" -määrityksestä, joka tehtiin E. tenellan sporotsoiiteista ja merotsoiiteista sekä E. acervulinan sporotsoiiteista liukoi- 35 siksi saatetuista proteiineista. Eri monoklonaalisia vas-
9 101453 ta-aineita ja seerumeita inkuboitiin nitroselluloosaan sitoutuneiden Eimerian proteiinien kanssa ja tehtiin näkyviksi kuten kuvion 2 kuvauksessa on selitetty. Käytettyihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin kuuluivat 3A5 (1), 5 2006 (2), 7D1 (3), 13A6 (4), 6A5 (5) ja kontrollivastaaine, joka oli Eimerian proteiinien kanssa reagoimaton. Käytettyihin seerumeihin kuuluivat hiiren no. 107-2 immuuniseerumi (7) ja kontrolliseerumi (8). Kuvio 4 esittää vasemmassa osakuvassa tulokset im- 10 munopresipitaatiomäärityksestä E. tenellan sporotsoiittien 125 1-leimattujen pintaproteiinien kanssa. Sporotsoiittien pintaproteiinit leimattiin joko IODOGEN- tai IODOBEADSmenetelmällä, saatettiin liukoisiksi ja tehtiin näkyviksi autoradiografialla SDS-polyakryyliamidigeelielektroforee- 15 sin 12,5 %:n geeleissä jälkeen. Oikea osakuva esittää tulokset sporotsoiittien 125I-leimattujenpintaproteiinien immunopresipitaatiosta seerumilla hiiristä, joita on immunisoitu elävillä sporotsoiiteilla. Hiirten immuuniseerumeja (105-1, 105-2, 105-3, 107-1, 107-2 ja 107-3) ja hii- 20 ren kontrolliseerumia (Kontrolli) inkuboitiin sporotsoiittien 125I-leimattujen pintaproteiinien kanssa, ja immuunikompleksit eristettiin agaroosiin liitetyllä hiiren IgG:n vastaisella vasta-aineella. Immuunikompleksit tehtiin liukoisiksi Laemmlin näytepuskurilla, erotettiin SDS-polyak- 25 ryyliamidigeelielektroforeesilla 12,5 %:n geeleissä ja tehtiin näkyviksi autoradiografialla. M edustaa standardimarkkeriproteiinien molekyylipainoja kilodaltoneina. Kuvio 5 esittää tulokset sporotsoiittien 125I-leimattujen pintaproteiinien immunopresipitaatiosta monokio- 30 naalisilla vasta-aineilla. Menettely kunkin vasta-aineen sitomien 125I-leimattujen proteiinien tunnistamiseksi on selitetty kuvion 4 kuvauksessa. Käytetyt spesifiset sporotsoiittivasta-aineet ja kontrollivasta-aine (Kontrolli) on ilmoitettu kunkin geelikaistan yläpuolella. Standardimark- 35 keriproteiinien molekyylipainot on esitetty kilodaltoneina.
10 101453 Kuvio 6 esittää faasikontrastimikroskooppivalokuvia ja mikroskooppivalokuvia immunofluoresenssivärjäytymiskuvioista eri monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen, ilmakuivatuista E. tenellan sporotsoiittipreparaateista objek- 5 tilaseilla. Osakuvien A, B, C ja D vasemmat puolet ovat faasikontrastimikroskooppivalokuvia, joissa näkyy ehjiä, pitkänomaisia sporotsoiitteja, joissa on suuri takaosan refraktiilikappale (PRB), pieni etuosan refraktiilikappale (ARB) ja apikaalinen pää vastapäätä takaosan refraktiili- 10 kappaletta. Osakuvien A, B, C ja D oikeat puolet esittävät objektilaseja, jotka on käsitelty vastaavasti monoklonaalisilla vasta-aineilla 14C3 (spesifinen pinta-antigeeneille), 6A5 (spesifinen pinnalle ja refraktiilikappaleen proteiinille), 11D2 (spesifinen sporotsoiitin apikaalikär- 15 jelle) ja kontrollivasta-aineella. Preparaatteihin sitoutuneet vasta-aineet paikallistettiin rodamiinikonjugoiduilla hiiren immunoglobuliinin vastaisilla vasta-aineilla ja tehtiin näkyviksi epifluoresenssilla käyttäen Leitzin Dialux 22 -mikroskooppia. Kaikki mikroskooppivalokuvat on 20 otettu suurennoksella 630X. Kuvio 7 esittää solunsisäisten sporotsoiittien ja kehittyvän loiseläimen vasta-ainevärjäystä kanan munuaissoluissa. Kanan munuaissoluja infektoitiin sporotsoiiteilla, ja ilmoitettuina aikoina infektion jälkeen solut käsi- 25 teltiin vasta-ainevärjäystä varten. Viljelmät pestiin ennen kestävöintiä mandollisten solunulkoisten sporotsoiittien poistamiseksi. Faasikontrasti- ja vastaavat immunofluoresenssimikroskooppivalokuvat otettiin käyttäen vastaaineita 7D4, 8A2, 7B2 ja 15A3 ilmoitetun mukaisesti. Pre- 30 paraatteihin sitoutuneet vasta-aineet paikallistettiin rodamiinikonjugoiduilla hiiren immunoglobuliinin vastaisilla vasta-aineilla ja tehtiin näkyviksi epifluoresenssilla. Kaikki mikroskooppivalokuvat on otettu suurennoksella 630X. 35 Kuvio 8 esittää solunsisäisten sporotsoiittien ja kehittyvän loiseläimen vasta-ainevärjäystä kanan munuais-
11 101453 soluissa. Faasikontrasti- ja vastaavat immunofluoresenssimikroskooppivalokuvat otettiin ilmoitettuina ajankohtina käyttäen vasta-aineita 14B1 ja 19D6, kanan immuuniseerumia ja fluoresoivia sekundaarivasta-aineita. 5 Kuvio 9 esittää solunsisäisten sporotsoiittien kehittymisen neutralisointia sporotsoiittien vastaisilla vasta-aineilla. Puhdistettuja E. tenellan sporotsoiitteja esi-inkuboitiin 1 tunti 40 C:ssa joko kontrollivasta-aineen (X) tai sporotsoiittien vastaisen vasta-aineen 7D4 10 (0), 8A2 (0), 14B1 (1 ) tai 6A5 ( ) kanssa, ja sitten niiden annettiin infektoida MDBK-soluviljelmiä. Sporotsoiitteja esi-inkuboitiin myös elatusaineen kanssa (avoin kolmio) tai kokkidilääkkeen lasalosidin kanssa (*). Infektion jälkeen solunsisäisen sporotsoiitin ke- 15 hittymistä mitattiin soluviljelmiin inkorporoituvan 3Hurasiilin mukaan. Koska lasalosidi estää sporotsoiitin solunsisäisen kehittymisen, tällä lääkeaineella esikäsitellyissä viljelmissä havaittu 3H-urasiilin inkorporaatio oli minimaalinen. 20 Kuvio 10 esittää tulokset 65 kda-8-galaktosidaasi -fuusioproteiininäytteiden ja muiden, merkintöjen mukaisten näytteiden SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi/ "Western blot" -analyysista. "Western blot" -analyysi suoritettiin käyttäen 8-galaktosidaasia vastaan hiiressä tuo- 25 tettua vasta-ainetta (osakuva A) tai yhdistettyjä monoklonaalisia vasta-aineita 7D1, 7D4 ja 2006 (osakuva B) yhteydessä vuohessa tuotetun hiiren IgG:n vastaisen vastaaineen HPOD-konjugaattiin. Kaistat molemmissa osakuvissa esittävät (1) 8-galaktosidaasia, (m) esivärjättyjä mole- 30 kyylipainostandardeja, joiden koot on ilmoitettu osakuvan A vasemmalla puolella kilodaltoneina, (2) kokonaisproteiinia sentrifugoidusta solunapista, (3) sentrifugoidusta solunapista sonikoimalla vapautuvaa proteiinia, (4) sentrifugoidusta solunapista sonikaation jälkeen guanidiini- 35 HC1:lla liukoiseksi saatettua proteiinia.
12 101453 Kuvio 11 on kaavamainen esitys plasmidista pev/2-4, 65 kda proteiinin ekspressioplasmidista, joka sisältää 1,7 kb:n EcoRI-DNA-insertin faagista lambda-m2-4. Eri restriktioentsyymikohtien sijainnit insertissä esitetään suhtees- 5 sa EcoRI-kohtaan, mukaanluettuna PstI (P, emäsparien 53 ja 776 kohdalla), KpnI (K, emäsparin 202 kohdalla), BstNI (B, emäsparien 584, 1303 ja 1412 kohdalla) ja Sau3A (S, emäsparien 1017 ja 1439 kohdalla). Kuvio 12 on kartta pev3-seq:sta, joka sisältää po- 10 lylinkkerin, jossa on ilmoitetut kohdat, sijoitettuna pevvrf3:n EcoRI- ja SalI-kohtien väliin. Synteettistä oligonukleotidia CGGTCGACTCGAGCCA, katkoviivanuolen osoittama, käytettiin alukkeena DNA:n sekvenssianalyysiin ketjunterminaatiomenetelmällä. 15 Kuvio 13 on restriktiokartta cdna-klooneista, jotka koodaavat monoklonaalisen vasta-aineen 6A5 tunnistamia proteiineja. Restriktioendonukleaasikohdat, joita käytettiin Maxamin-Gilbertin DNA-sekvenssianalyysiin, näytetään. Suluissa oleva EcoRI-kohta on 0,9 kb cdna:n päässä. Suora- 20 kaide kartan yläpuolella osoittaa DNA-sekvenssistä ennustetun avoimen lukukehyksen, jossa potentiaalinen signaalipeptidi on väritetty. Viivat kartan alapuolella osoittavat exoiii-deleetioita, joita käytettiin ketjunterminaatiosekvenssianalyysiin. 25 Kuvio 14 on monoklonaalisen vasta-aineen 6A5 tunnistamaa 20 kda proteiinia koodaavan 1,1 kb:n cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi. Kuvio 15 on kuvion 14 proteiinin aminohapposekvenssi, ennustettu mainitun kuvion nukleotidisekvenssistä. 30 Kuvio 16 on monoklonaalisten vasta-aineiden 7D1, 7D4 ja 2006 tunnistamaa 65 kda proteiinia koodaavan 1,7 kb:n cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi. Kuvio 17 on kuvion 16 proteiinin aminohapposekvenssi, ennustettu mainitun kuvion nukleotidisekvenssistä ja 35 varmistettu ekspressoidusta 65 kda proteiinista tuotettujen tryptisten peptidien sekvenssianalyysillä. Joitakin
13 101453 näitä peptidejä vastaavat alueet koko aminohapposekvenssissä näytetään alleviivattuina. Näiden peptidien määritetyissä sekvensseissä on viiva yläpuolella. Kuvio 18 on monoklonaalisen vasta-aineen 8A2 tun- 5 nistamaa 28 kda proteiinia koodaavan 1,1 kb:n cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi. Kuvio 19 on kuvion 18 proteiinin aminohapposekvenssi, ennustettu mainitun kuvion nukleotidisekvenssistä. Kuvio 20 on monoklonaalisen vasta-aineen 7B2 tun- 10 nistamaa proteiinia koodaavan 3,2 kb:n cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi. Kuvio 21 on kuvion 20 proteiinin aminohapposekvenssi, ennustettu mainitun kuvion nukleotidisekvenssistä. Kuvio 22 on immunoaffiniteettipuhdistetun 65 kda 15 proteiinin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesianalyysi. Geeli visualisoitiin Coomassie blue -värjäyksellä ja "Western blot" -analyysillä. Kaistat 2 ja 4 sekä 3 ja 5 sisältävät puhdistetun proteiinin kandesta preparaatista. Kaistat 1 ja 6 sisältävät seoksen molekyylipainomarkkeri- 20 proteiineja, joilla on kuvion vasemmalla ja oikealla puolella näytetyt molekyylipainot. Kuvio 23 on 65 kda proteiinin B-merkaptoetanolilla pelkistetyn (osakuva A) ja ei-pelkistetyn (osakuva B) trypsiinidigestin HPLC-eluutioprofiili, jossa nähdään ab- 25 sorbanssi 215 nm:ssä pylvään retentioajan funktiona. Kuvio 24 esittää kokkidiantigeenejä koodaavien geenien lehmärokkovirukseen rekombinoimiseksi käytetyn perusvektorin neljän elementin restriktiokarttoja. Näihin elementteihin kuuluvat 7.5K-promoottorielementti, (a ja b, 30 vasemmalla), TK-lokus (a ja b, oikealla), osa plasmidia puc8 (c) ja polykloonauskohta M13tg131:stä (d). Transkriptiosuunta viruksen 7.5K- ja TK-promoottoreille on vasemmalta oikealle (siis BglII-restriktiokohdasta EcoRI-restriktiokohtaan polylinkkerissä). 35 Kuvio 25 esittää monoklonaalisen vasta-aineen 8A2 tunnistaman Eimerian antigeenin N-terminaalin aminohappo-
14 101. 453 sekvenssiä (A) ekspressoituna konstruktista, joka sisältää translaation alkukodonin AUG kuvan 24 vektorin polylinkkerielementissä, ja (B) fuusioituna malarian 190 kda signaalisegmenttiin (ensimmäiset 34 aminohappoa) ja kuvan 24 5 kloonausvektorin polylinkkeriin (seuraavat 13 aminohappoa). Proteiinin kypsymisprosessin aikana ensimmäiset 19 aminohappoa N-terminaalissa voidaan lohkaista irti kaksoispisteen osoittamasta kohdasta. Kuvioissa käytetään normaaleja yhden kirjaimen ly- 10 henteitä esittämään nukleotideja ja normaaleja yhden tai 15 798. kolmen kirjaimen lyhennyksiä esittämään aminohappoja. Näiden lyhennysten merkitykset voi löytää biokemian standardioppikirjoista, kuten Lehninger, Principles in Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, s. 96 ja Kuten niitä tässä käytetään, seuraavilla termeillä on seuraavat merkitykset: "20 kda proteiini" tarkoittaa synteettistä tai rekombinanttiproteiinia, jolla on näennäinen molekyylipaino 20 noin 20 kilodaltonia SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa, ja joka sitoutuu spesifisesti monoklonaaliseen vasta-aineeseen 6A5. Tämä vasta-aine reagoi myös spesifisesti Eimerian pinta-antigeenin kanssa (Eimerian kokonaisproteiiniekstraktista), jolla on näennäinen molekyylipaino 25 noin 28 kilodaltonia SDS-geeleissä. Tämä antigeeni on läsnä sporotsoiittikehitysvaiheessa. Tätä proteiinia koodaavan cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi ja siitä ennustettu aminohapposekvenssi näkyvät vastaavasti kuvioissa 14 ja 15. 30 "65 kda proteiini" tarkoittaa synteettistä tai re- kombinanttiproteiinia, jolla on näennäinen molekyylipaino noin 65 kilodaltonia SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa, ja joka sitoutuu spesifisesti monoklonaalisiin vasta-aineisiin 7D1, 7D4 ja 2006. Nämä vasta-aineet rea- 35 goivat myös spesifisesti sellaisen pinta-antigeenin kanssa Eimerian ekstrakteista, jolla on näennäinen molekyylipaino
15 101453 noin 120 kilodaltonia SDS-geeleissä. Tämä antigeeni on läsnä sporotsoiitti-, skitsontti- ja merotsoiittikehitysvaiheissa. Tätä proteiinia koodaavan cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi ja siitä ennustettu aminohapposekvenssi 5 näkyvät vastaavasti kuvioissa 16 ja 17. "28 kda proteiini" tarkoittaa synteettistä tai rekombinanttiproteiinia, jolla on näennäinen molekyylipaino noin 28 kilodaltonia SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa, ja joka sitoutuu spesifisesti monoklonaaliseen 10 vasta-aineeseen 8A2. Tämä vasta-aine reagoi myös spesifisesti Eimerian pinta-antigeenin kanssa, jolla on näennäinen molekyylipaino noin 37 kda SDS-geeleissä. Tämä antigeeni on läsnä sporotsoiitti-, skitsontti- ja merotsoiittikehitysvaiheissa. Tätä proteiinia koodaavan cdna-mole- 15 kyylin nukleotidisekvenssi ja siitä ennustettu aminohap- posekvenssi näkyvät vastaavasti kuvioissa 18 ja 19. "45 kda proteiini" tarkoittaa synteettistä tai rekombinanttiproteiinia, jolla on näennäinen molekyylipaino noin 45 kilodaltonia SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo- 20 reesissa, ja joka sitoutuu spesifisesti monoklonaaliseen vasta-aineeseen 7B2. Tämä vasta-aine reagoi myös spesifisesti Eimerian pinta-antigeenin kanssa, jolla on näennäinen molekyylipaino yli 200 kda SDS-geeleissä. Tämä antigeeni on läsnä sporotsoiittikehitysvaiheessa. Tätä prote- 25 iinia koodaavan cdna-molekyylin nukleotidisekvenssi ja siitä ennustettu aminohapposekvenssi näkyvät vastaavasti kuvioissa 20 ja 21. Termi "proteiini, jolla on yksi tai useampi Eimerian pinta-antigeenin immunoreaktiivinen ja/tai antigee-. 30 ninen determinantti" tarkoittaa proteiinia, jolla on yksi tai useampi alue tai epitooppi, joka pystyy aiheuttamaan immuunivasteen immunologisesti kompetentissa isäntäeliössä ja/tai kykenee sitoutumaan spesifisesti komplementaariseen vasta-aineeseen. 35 Geneettisen koodin degeneraation takia on ymmärret- tävä, että on olemassa useita potentiaalisia nukleotidi-
16 101453 sekvenssejä (funktionaalisia ekvivalentteja), jotka voisivat koodata kuvioissa 15, 17, 19 ja 21 esitettyjä aminohapposekvenssejä. Olisi myös ymmärrettävä, että keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien, kun ne on sijoitettu vektorei- 5 hin, nukleotidisekvensseihin voi kuulua nukleotideja, jotka eivät ole osa varsinaisia rakennegeenejä, kunhan vain yhdistelmävektorit, jotka sisältävät tällaisia sekvenssejä ja fragmentteja kykenevät ohjaamaan sopivassa isäntäeliössä sellaisen proteiinin tai proteiinifragmentin tuotantoa, 10 jolla on yksi tai useampi Eimerian pinta-antigeenin immunoreaktiivinen ja/tai antigeeninen determinantti. Tässä kuvattuja proteiineja voidaan tehdä sinänsä tunnetuilla tavoilla, kuten yhdistelmä-dna-tekniikoilla, kemiallisella synteesillä tai eristyksellä Eimeria-prepa- 15 raateista. Mainittavien proteiinien tekemiseen tarvittava DNA voitaisiin syntetisoida kemiallisesti käyttäen kuvioissa 14, 16, 18 ja 20 käytettäväksi tuotua nukleotidisekvenssitietoa. Tällainen kemiallinen synteesi voitaisiin suorit- 20 taa käyttäen mitä vain tunnettua menetelmää, vaikka Matteuccin ym. [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] fosforamidiittimenetelmä, jossa käytetään kiinteää kantajaa, on edullinen. Vaihtoehtoisesti cdna voidaan tehdä Eimerian 25 mrna:sta. Lähetti-RNA:ta voidaan eristää Eimerian sporuloivista ookystista tai merotsoiiteista standarditekniikoita käyttäen. Näitä mrna-näytteitä voidaan sitten käyttää kaksijuosteisen DNA:n tuottamiseksi, kuten ovat kuvanneet Maniatis ym., aiemmin mainittu teos. Tämä cdna voi- 30 daan sitten sijoittaa sopivaan kloonausvektoriin, jota voidaan käyttää E. colin transformointiin cdna-kirjaston tuottamiseksi. cdna-kirjasto voidaan sitten seuloa käyttäen mukaisia kloonattuja geenejä tai niiden fragmentteja koettimi- 35 na. Tällaiset geenit tai fragmentit voidaan radioleimata, esim. nick-translaatiolla käyttäen Pol I DNA-polymeraasia
17 101453 4 neljän deoksiribonukleotidin läsnäollessa, joista yksi sisältää 3212 :a ft-asemassa (Maniatis ym., mts. 109), koettimina käytettäviksi. Vaikka Eimeria tenellaa käytettiin mrna:n lähteenä 5 tuonnempana seuraavissa esimerkeissä, tästä lajista kloonattuja geenejä voidaan käyttää koettimina geenien eristämiseksi toisista Eimeria-lajeista johtuen DNA-sekvenssihomologiasta eri lajien välillä. Tultuaan tunnistetuiksi ja eristetyiksi Eimerian 10 geenit sijoitetaan sopivaan ekspressiovehikkeliin, joka sisältää tarvittavat elementit sijoitettujen geenisekvenssien transkriptiota ja translaatiota varten. Käyttökelpoiset kloonausvehikkelit voivat koostua osista kromosomaalisia, kromosominulkoisia ja synteettisiä DNA-sekvenssejä, 15 kuten erilaiset tunnetut bakteeriplasmidit, faagi-dna, plasmidien ja faagi-dna:n yhdistelmät, kuten plasmidit, joita on muunnettu käyttämään faagi-dna:ta tai muita ekspression säätelysekvenssejä, tai hiivan plasmidit. Spesifisiin kloonausvehikkeleihin, joita voitaisiin käyttää ja 20 jotka ovat ammattimiehelle tunnettuja, kuuluvat, näihin rajoittumatta, pev-vrf-plasmidit (pev-vrfl, -2 ja -3); SV40; adenovirus; hiiva; lambda-gt-wes-lambda B; Charon 4A ja 28; lambda-gt-11-lambda B; M13-peräiset vektorit, kuten puc8, 9, 18 ja 19 sekä pbr313, 322 ja 325; pac105; pva51; 25 pacy177; pkh47; pacy184; pub110; pmb9; colel; psc101; pm121; RSF2124; pcr1 tai RP4. Eimerian geenien sijoittaminen vektoriin toteutetaan helposti, kun sekä geenit että haluttu kloonausvehikkeli on katkaistu samalla restriktioentsyymillä tai -ent- 30 syymeillä, koska siten muodostuu komplementaarisia DNA:n päitä. Jos tätä ei voida toteuttaa, voi olla tarpeen muun- taa tuotettuja katkaistuja päitä digestoimalla pois yksijuosteinen DNA tasaisten päiden tuottamiseksi, tai saavuttamalla sama tulos täyttämällä yksijuosteiset päät sopi- 35 valla DNA-polymeraasilla. Tällä tavoin tasaiset päät voidaan ligatoida sellaisella entsyymillä kuten T4:n DNA-li-
18 101453 gaasilla. Vaihtoehtoisesti mikä tahansa haluttu kohta voidaan tuottaa ligatoimalla nukleotidisekvenssejä (linkkereitä) DNA:n päihin. Tällaiset linkkerit voivat koostua spesifisistä oligonukleotidisekvensseistä, jotka vastaavat 5 restriktiokohtien tunnistussekvenssejä. Katkaistua vektoria ja Eimerian geenejä voidaan myös muuntaa homopolymeerihännillä varustamalla, kuten on kuvannut Morrow [Methods in Enzymology fia:3 (1979)]. Monet kloonausvehikkelit, joita voidaan käyttää 10 tässä keksinnössä, sisältävät yhden tai useamman merkkiaktiivisuuden, joita voidaan käyttää haluttujen transformanttien selektioon, kuten ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenssin pbr322:ssa, ampisilliiniresistenssin ja 8- galaktosidaasiaktiivisuuden puc8:ssa ja ampisilliiniresis- 15 tenssin pev-vrf2:ssa. Sellaisten isäntäsolujen selektio, joihin tällaisia vektoreita on sijoitettu, tulee huomattavasti yksinkertaisemmaksi, kun isäntäsoluilta muuten puuttuvat vektorien tuomat aktiivisuudet. Olisi ymmärrettävä, että valittuun kohtaan kloo- 20 nausvehikkelissä sijoitettujen Eimerian geenien nukleotidisekvenssit voivat sisältää mukleotideja, jotka eivät kuulu varsinaisiin rakennegeeneihin. Vaihtoehtoisesti geeni voi sisältää vain osan täydellisestä villityypin geenistä. Ainoa, mitä vaaditaan, on, että kloonausvehikkeliin 25 sijoitetut geenifragmentit kykenevät ohjaamaan sopivassa isäntäeliössä sellaisen polypeptidin tai proteiinin tuotantoa, jolla on ainakin yksi Eimerian pinta-antigeenin immunoreaktiivinen ja/tai antigeeninen determinantti. Sopivan isäntäeliön valintaan vaikuttaa joukko 30 alalla tunnettuja tekijöitä. Näihin tekijöihin kuuluvat esimerkiksi yhteensopivuus valitun vektorin kanssa, hybridiplasmidin koodaamien proteiinien toksisuus, halutun proteiinin kerätyksi saamisen helppous, ekspressio-ominaisuudet, biologinen turvallisuus ja kustannukset. Näiden 35 tekijöiden suhteen täytyy löytää tasapaino, ja on ymmär-
19 101453 rettävä, etteivät kaikki isännät ole yhtä tehokkaita ekspressoimaan tiettyä yhdistelmä-dna-molekyyliä. Sopiviin yksisoluisiin isäntäeliöihin, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, kuuluvat bakteerit, kuten 5 Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus ja Actinomyces. Erityisen edullinen on Escherichia coli -kanta MC1061, jonka ovat kuvanneet Casadaban ym. [J. Mol. Biol. 131:179 (1980)]. Tätä kantaa voidaan käyttää, tai mitä vain muuta E. coli K-12:n kantaa, jossa 10 on plasmidi prk248cits. Plasmidi prk248cits on saatavissa käytettäväksi muissa E. coli K12 -kannoissa American Type Culture Collectionista, ja sillä on hakunumero ATCC 53338. Rekombinantti kloonausvektori voidaan siirtää isäntäsoluun transformaatiolla. Kun tällainen muunnettu isän- 15 täsolu on tuotettu, solua voidaan viljellä, ja proteiiniekspressiotuote voidaan eristää viljelmästä. Keksinnön mukaisesti valmistettuja Eimerian proteiineja tuottavat kloonit voidaan tunnistaa käyttäen sopivasti leimattuja proteiineille spesifisiä vasta-aineita. 20 Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat edullisia, voidaan valmistaa standardimenetelmillä seuraavan mukaisesti. Antigeenisiä proteiineja Eimeria tenellasta käytetään immunisoimaan eläimiä, kuten hiiriä, rottia, hevosia, lampaita, sikoja, kaneja jne., jotta saataisiin vasta-ai- 25 netta tuottavia somaattisia soluja fuusioitaviksi myeloomasoluihin. Somaattiset solut, joilla on potentiaali tuottaa vasta-ainetta, erityisesti B-solut, ovat sopivia fuusioitaviksi myeloomasolulinjaan. Nämä somaattiset solut voivat 30 olla peräisin esiherkistettyjen eläinten imusolmukkeista, pernoista ja perifeerisestä verestä. Edullisesti tässä käytetään hiiren pernasoluja, osaksi siksi, että nämä solut tuottavat suhteellisen korkean prosentin stabiileja fuusioita hiiren myeloomasolulinjojen kanssa. Olisi kui- 35 tenkin mandollista käyttää rotan, kanin, sammakon tai muita soluja niiden sijasta.
20 101453 Erikoistuneita myeloomasolulinjoja on kehitetty lymfosyyttiperäisistä kasvaimista käytettäväksi hybridoomia tuottavissa fuusiomenettelyissä [Köhler ja Milstein, Eur. J. Immunol. 52:511 (1976); Shulman ym. Nature 276:269 5 (1978); Volk ym., J. Virol. 42:220 (1982)]. Näitä solulinjoja on kehitetty ainakin kolmesta syystä. Ensimmäinen on helpottaa fuusioitujen hybridoomien selektiota fuusioitumattomien ja samalla tavalla loputtomasti jakautuvien myeloomasolujen joukosta. Yleensä tässä onnistutaan käyttö- 10 mällä myeloomia, joilla on entsyymipuutoksia, jotka tekevät niistä kyvyttömiä kasvamaan tietyissä selektiivisissä elatusaineissa, jotka tukevat hybridoomien kasvua. Toinen syy tulee lymfosyyttiperäisiin kasvainsoluihin luonnostaan kuuluvasta kyvystä tuottaa omia vasta-aineitaan. Monokio- 15 naalisten tekniikoiden käytön tarkoituksena on saada rajoittamattoman eliniän omaavia fuusioituja hybridisolulinjoja, jotka tuottavat haluttua yhtä vasta-ainetta hybridooman somaattisesta solusta tulevan osan geneettisen säätelyn alaisena. Hybridoomien kasvainsoluperäisten vasta- 20 aineiden tuottamisen eliminoimiseksi käytetään myeloomasolulinjoja, jotka eivät kykene tuottamaan immunoglobuliinin kevyt- tai raskasketjuja, tai joilla on vikaa vasta-aineen eritysmekanismeissa. Kolmas syy näiden solulinjojen selektioon on niiden fuusiosopivuus ja -tehokkuus. 25 Useita myeloomasolulinjoja voidaan käyttää fuusioitujen soluhybridien tuottoon, mukaanluettuina esim. P3/X63-Ag 8, P3/NSI/1-Ag 4-1, SP2/0-Ag-14 ja S194/5.XX0.- BU.1. P3/X63-Ag 8 ja P3/NSI/1-Ag 4-1 solulinjat ovat kuvanneet Köhler ja Milstein [Eur. J. Immunol. 52;511 30 (1976)]. Shulman ym. [Nature 22.:269 (1978)] kehittivät Sp2/0-Ag-14 -myeloomasolulinjan. S194/5.XXO.BU.1 -solulinjan raportoi Trowbridge [J. Exp. Med. 14a:313 (1979)]. Tämän keksinnön esimerkissä käytettiin hiiren solulinjaa PAI-O (Ig:tä tuottamaton P3/X63-Ag 8:n aliklooni). 35 Menetelmiin vasta-ainetta tuottavan perna- tai imusolmukesolun ja myeloomasolun fuusioimiseksi kuuluu yleen-
21 101453 sä somaattisten solujen sekoittaminen myeloomasoluihin vastaavasti suhteessa 10:1 (joskin suhde voi vaihdella välillä noin 20:1-1:1), sellaisen tekijän tai tekijöiden (kemiallinen, virus- tai sähköinen tekijä) läsnäollessa, 5 joka edistää solukalvojen fuusiota. On edullista, että fuusiomenettelyssä käytettävät somaattiset solut ja mye-, loomasolut ovat peräisin samasta eläinlajista. Fuusiomenetelmiä ovat kuvanneet Kohler ja Milstein [Nature 256 495 (1975) ja Eur. J. Immunol. fi:511 (1976)], Gefter ym. [So- 10 matic Cell Genet. a:231 (1977)] ja Volk ym. [J. Virol. 42:220 (1982)]. Näiden tutkijoiden fuusiota edistävät tekijät olivat Sendai-virus ja polyetyleeniglykoli (PEG). Tämän keksinnön esimerkin fuusiomenettelyssä käytetään PEG:a. 15 Koska fuusiomenettelyt tuottavat elinkykyisiä hybridejä hyvin alhaisella frekvenssillä (esim. käytettäessä pernoja somaattisten solujen lähteenä saadaan vain yksi hybridi karkeasti 1 x 10 5 pernasolua kohti), on olennaista, että käytettävissä on keino fuusioitujen soluhybridien 20 selektoimiseksi jäljellejäävien fuusioitumattomien solujen joukosta, erityisesti fuusioitumattomien myeloomasolujen joukosta. Tarvitaan myös keino haluttua vasta-ainetta tuottavien hybridoomien havaitsemiseksi muiden saatujen fuusioitujen soluhybridien joukosta.. 25 Yleensä fuusioidut soluhybridit selektoidaan viljelemällä soluja elatusaineessa, joka tukee hybridoomien kasvua, mutta estää kasvun myeloomasoluilta, jotka normaalisti jatkaisivat loputtomasti jakautumista. (Fuusiossa käytetyillä somaattisilla soluilla pitkäaikainen elinkyky 30 ei säily in vitro -viljelmässä, ja siksi ne eivät ole on- : gelma). Tämän keksinnön esimerkissä käytettiin myeloomasoluja, joilta puuttuu hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi (HPRT-negatiivisia). Selektio näitä soluja vastaan tehdään hypoksantiini/aminopteriini/tymidiini -elatusai- 35 neessa (HAT-elatusaineessa), jossa fuusioidut soluhybridit pysyvät hengissä johtuen pernasolujen HPRT-positiivisesta
22 101453 genotyypistä. On myös mandollista käyttää myeloomasoluja, joilla on muita geneettisiä puutteita (lääkeaineherkkyyksiä ym.), joita vastaan voidaan selektoida elatusaineessa, joka tukee kompetenttien hybridien kasvua. 5 Fuusioitujen soluhybridien selektiiviseen viljelyyn tarvitaan useita viikkoja. Varhain tämän ajan kuluessa täytyy tunnistaa ne hybridit, jotka tuottavat haluttua vasta-ainetta, jotta niitä voidaan sitten kloonata ja lisätä. Yleensä noin 10 % saaduista hybrideistä tuottaa ha- 10 luttua vasta-ainetta, joskaan vaihtelu välillä 1-30 % ei ole harvinaista. Vasta-ainetta tuottavien hybridien havaitseminen onnistuu millä vain useista standardimääritysmenetelmistä, joihin kuuluvat entsyymiin kytketty immunologinen määritys ja radioimmunologinen määritys, jotka on 15 kuvattu kirjallisuudessa [ks. esim. Kennet ym. (toim.), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, s. 376-384, Plenum Press, New York (1980)]. Useita havaitsemismenetelmiä käytettiin tämän keksinnön esimerkissä. 20 Kun halutut fuusioidut soluhybridit on selektoitu ja kloonattu yksittäisiksi vasta-ainetta tuottaviksi solulinjoiksi, kutakin solulinjaa voidaan lisätä kummalla tahansa kandesta standarditavasta. Hybridoomasolususpensio voidaan ruiskuttaa kudostyypiltään yhteensopivaan eläi- 25 meen. Sitten ruiskeen saaneeseen eläimeen kehittyy kasvaimia, jotka erittävät fuusioidun soluhybridin tuottamaa spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta. Eläimen ruumiinnesteitä, kuten seerumia tai ascites-nestettä, voidaan punktoida monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi suu- 30 ressa pitoisuudessa. Vaihtoehtoisesti yksittäisiä solulinjoja voidaan lisätä in vitro laboratorioviljelyastioissa. Yksittäistä spesifistä vasta-ainetta korkeina pitoisuuksina sisältävä elatusaine voidaan ottaa talteen dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla. 35 E. colissa tuotettuna Eimerian proteiinit pysyvät sytoplasmassa tai inkluusiokappaleissa. Proteiinien va-
23 101453 pauttamiseksi täytyy siksi rikkoa ulkomembraani. Tämä suoritetaan edullisesti sonikoimalla tai muulla mekaanisella hajotuskeinolla, kuten "French pressure cell" -homogenisaattorilla tai Gaulin-homogenisaattorilla. Solujen hajotus voidaan myös suorittaa kemiallisesti tai entsymaattisesti. Koska divalentteja kationeja usein tarvitaan solukalvon ehjänä pysymiseen, käsittely sopivilla kelatoivilla aineilla, kuten EDTA:lla tai EGTA:lla, saattaisi olla riittävän hajottava päästääkseen proteiinit vuotamaan soluista. Samankaltaisesti entsyymejä, kuten lysotsyymiä, voitaisiin käyttää samaan tulokseen pääsemiseksi. Tämä entsyymi hydrolysoi soluseinän peptidoglykaanitukirangan. Osmoottisen shokin antamista voidaan myös käyttää. Lyhyesti kuvattuna, tämä voitaisiin suorittaa sijoittamalla solut ensiksi hypertoniseen liuokseen, joka saisi ne menettämään vettä ja kutistumaan. Sen jälkeen siirto hypotoniseen "shokki"-liuokseen johtaisi veden nopeaan työntymiseen soluihin haluttujen proteiinien työntyessä ulos. Kun ne on vapautettu soluista, Eimerian proteiineja voidaan konsentroida saostuksella suoloilla, kuten natrium- ja ammoniumsulfaatilla, ultrasuodatuksella tai muilla ammattimiesten hyvin tuntemilla menetelmillä. Lisäpuhdistus voitaisiin suorittaa tavanomaisilla proteiininpuhdistusmenetelmillä, joihin kuuluvat, näihin rajoittumatta, geelisuodatus, ioninvaihtokromatografia, preparatiivinen disc-geeli- tai jatkuva elektroforeesi, isoelektrinen fokusointi, fraktiointi orgaanisilla liuottimilla matalassa lämpötilassa tai vastavirtadistribuutio. Kuitenkin puhdistus suoritetaan edullisesti immunoaffiniteettikromatografialla, kuten myöhemmin kuvataan. Tässä kuvattuja proteiineja voidaan myös syntetisoida kemiallisesti sopivalla menetelmällä, kuten pelkästään kiinteän faasin synteesillä, osittain kiinteän faasin menetelmillä, fragmenttien kondensaatiolla tai klassisella nestefaasisynteesillä. Kiinteän faasin syntee-
24 101453 si sellaisena, kuin Merrifield on sen kuvannut [J. Am. Chem. Soc. U:2149 (1963)], on edullinen. Tällainen synteesi suoritetaan aminohapoilla, jotka on suojattu alfa-aminopäästä. Trifunktionaaliset aminoha- 5 pot, joissa on labiili sivuketju, suojataan myös sopivilla ryhmillä, jotka estävät kemiallista reaktiota tapahtumasta tässä kohdassa peptidin kokoamisen aikana. Alfa-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, jotta seuraava reaktio pääsee tapahtumaan aminopäässä. Olosuhteet alfa- 10 aminoryhmän suojauksen poistamiseksi eivät johda sivuketjujen suojaryhmien irtoamiseen. Alfa-aminoryhmän suojaryhmät ovat niitä, joiden tiedetään olevan hyödyllisiä peptidien vaiheittaisen synteesin taidossa. Niihin kuuluvat asyylityyppiset suojaryh- 15 mät (esim. formyyli, trifluoriasetyyli, asetyyli), aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät (esim. bentsyylioksikarbonyyli (Cbz) ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli), alifaattiset uretaanisuojaryhmät (esim. t-butyylioksikarbonyyli (Boc), isopropyylioksikarbonyyli, syklo- 20 heksyylioksikarbonyyli) ja alkyylityyppiset suojaryhmät (esim. bentsyyli, trifenyylimetyyli). Edullinen suojaryhmä on Boc. Sivuketjusuojaryhmiin tyrosiinille kuuluvat tetrahydropyranyyli, tert-butyyli, trityyli, bentsyyli, Cbz, 4- Br-Cbz ja 2,6-diklooribentsyyli. Edullinen sivuketjusuoja-. 25 ryhmä tyrosiinille on 2,6-diklooribentsyyli. Sivuketjusuojaryhmiin asparagiinihapolle kuuluvat bentsyyli, 2,6- diklooribentsyyli, metyyli, etyyli ja sykloheksyyli. Edullinen sivuketjusuojaryhmä asparagiinihapolle on sykloheksyyli. Sivuketjusuojaryhmiin treoniinille ja seriinille 30 kuuluvat asetyyli, bentsoyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli ja Cbz. Edullinen sivuketjusuojaryhmä treoniinille ja seriinille on bentsyyli. Sivuketjusuojaryhmiin arginiinille kuuluvat nitro, Tos, Cbz, adamantyylioksikarbonyyli ja Boc. Edullinen si- 35 vuketjusuojaryhmä arginiinille on Tos. Lysiinin sivuketjun aminoryhmän suojana voi olla Cbz, 2-C1-Cbz, Tos tai Boc.
25 101453 2-C1-Cbz on edullinen suojaryhmä lysiinille. Sivuketjusuojaryhmän valinta perustuu seuraavaan: Sivuketjun suojaryhmä pysyy koskemattomana liittämisreaktion ajan eikä lohkea irti aminopään suojaryhmän poiston aikana tai liit- 5 tämisreaktion olosuhteissa. Sivuketjun suojaryhmän täytyy olla poistettavissa lopullisen peptidin synteesin valmistuttua käyttäen reaktio-olosuhteita, jotka eivät muuta kohdepeptidiä. Kiinteän faasin synteesi tapahtuu yleensä karbok- 10 syylipäästä lähtien liittämällä alfa-aminoryhmästä suojattu (sivuketjusuojattu) aminohappo sopivaan kiinteään kantajaan. Esterisidos muodostuu, kun liittäminen tehdään kloorimetyloituun tai hydroksimetyylihartsiin, ja saatavalla kohdepeptidillä on vapaa karboksyyliryhmä C-termi- 15 naalissa. Vaihtoehtoisesti käytetään bentshydryyliamiinitai p-metyylibentshydryyliamiinihartsia, jolloin muodostuu amidisidos, ja saatavalla kohdepeptidillä on karboksiamidiryhmä C-terminaalissa. Näitä hartseja on kaupallisesti saatavana, ja niiden valmistuksen ovat kuvanneet Stewart 20 ym., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. laitos, Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984). C-terminaalinen aminohappo, Arg, jonka sivuketju on suojattuna Tos-ryhmällä ja alfa-aminofunktio Boc-ryhmällä, liitetään bentshydryyliamiinihartsiin käyttäen eri akti- 25 voivia aineita, joihin kuuluu disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC), N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja karbonyylidiimidatsoli. Kantajahartsiin kiinnittämisen jälkeen alfaaminoryhmän suojaryhmä irrotetaan käyttäen trifluorietikkahappoa (TFA) tai HC1:a dioksaanissa lämpötilassa 0 C:en 30 ja 25 C:en välillä. Dimetyylisulfidia lisätään TFA:han metioniinin (Met) tultua mukaan estämään mandollista S- alkylaatiota. Alfa-aminoryhmän suojaryhmän poistamisen jälkeen, jäljellä olevat suojatut aminohapot liitetään vaiheittain vaaditussa järjestyksessä halutun peptidisek- 35 venssin saamiseksi.