Optogenetiikka valoa muistitutkimukseen

TIETEELLISET ARTIKKELIT Jari L. O. Kurkela, Arto Lipponen, Elisa M. Ruohonen & Piia Astikainen Optogenetiikka valoa muistitutkimukseen Miten kykenemme luomaan muistijälkiä kokemustemme pohjalta ja mitkä aivoalueet osallistuvat tähän tapahtumaan? Pitkään on tiedetty, että hippokampus on oleellinen tapahtumamuistin toiminnassa. Saatu tieto on pohjautunut ihmisen käyttäytymisen ja aivotoiminnan kokeelliseen tutkimukseen, neuropsykologisiin tapaustutkimuksiin sekä tutkimuksiin, joissa eläinten aivotoimintaa on kokeellisesti manipuloitu. Optogenetiikka on suhteellisen uusi tutkimusmenetelmä, joka mahdollistaa tietyn hermosolujoukon toiminnan säätelyn tarkasti määritellyllä ajanhetkellä. Tässä kirjallisuuskatsauksessa kuvataan, kuinka optogenetiikkaa hyödyntävän eläintutkimuksen avulla on kyetty tarkentamaan tietoa hippokampuksen eri alueiden ja aivokuoren merkityksestä muistijälkien muodostumisessa ja muistojen mieleenpalautuksessa. Tutkimuksissa on tarkasteltu eläimillä kontekstuaalista muistia, jonka voidaan ajatella vastaavan ihmisen tapahtumamuistia. Nämä tutkimustulokset viittaavat siihen, että vallalla oleva muistijälkien vahvistumisteoria ei nykymuodossaan kuvaa täysin oikein tapahtumamuistin toimintaa. Avainsanat: oppiminen, tapahtumamuisti, optogenetiikka Johdanto Kontekstuaalisella muistilla tarkoitetaan tiettyyn tapahtumaan tai ympäristöön liittyvää usean aistijärjestelmän luomaa muistijälkeä. Se voi pitää sisällään esimerkiksi ympäristön sensoriset piirteet sekä ajallisen, kognitiivisen ja sosiaalisen kontekstin (Maren, Phan & Liberzon, 2013). Ihmisellä kontekstuaalinen muisti on osa episodista muistia eli tapahtumamuistia. Esimerkiksi voimme muistaa tutun lääkärin vastaanoton huonekalut, huoneen tuoksun sekä sen, miltä tuoli tuntui ihoamme vasten, kun istuimme sille. Jos vastaanotolla tehdään jokin kivulias toimenpide, opimme yhdistämään ympäristön ja kivuliaan toimenpiteen siten, että myöhemmin pelkkä vastaanottohuone aiheuttaa meissä pelkoreaktion. Pahimmillaan tämänkaltaisista asiayhteyksien oppimisista voi syntyä traumaperäinen stressihäiriö tai ahdistuneisuushäiriö (Alvarez, Biggs, Chen, Pine & Grillon, 2008; Maren ym., 2013). Kontekstuaalisen tai tapahtumamuistin hermostollisen perustan tutkimus on pohjautunut pääosin neuropsykologisiin potilastutkimuksiin (Scoville & Milner, 1957; Squire & Alvarez, 1995), aivokuvantamiseen terveillä koehenkilöillä (ks. esim. Rugg & Vilberg, 2013) ja kokeellisiin aivojen manipulointeihin eläimillä (ks. esim. Frankland & Bontempi, 2005; Kim & Fanselow, 1992). Nämä tutkimukset ovat viitanneet siihen, että sisemmät ohimolohkot, erityisesti hippokampuksen alue, ovat oleellisia tapahtumamuistin toiminnassa. Hippokampuksen ja aivokuoren vuorovaikutusta muistin toiminnoissa selvittäneet tutkimukset ovat osoittaneet, että hippokampukseen juuri oppimisen jälkeen tehdyt vauriot saavat aikaan muistinmenetyksen, kun taas myöhemmin tehdyt vauriot eivät vaikuta samalla tavalla (Kim & Fanselow, 1992; Kitamura ym., 2009). 84

Edellä mainitut tulokset ovat tukeneet muistijäljen vahvistumisteoriaa, jonka mukaan hippokampuksen ja aivokuoren väliset yhteydet ovat välttämättömiä oppimisessa ja vastikään opitun asian mieleenpalautuksessa. Ajan kuluessa hippokampuksen merkitys kuitenkin vähenee ja muistijälki vahvistuu ja varastoituu aivokuoren alueille. Tällaisen vahvistuneen pitkäaikaisen muistijäljen mieleenpalautuksessa ei enää tarvita hippokampusta, vaan mieleenpalautus tapahtuu suoraan aivokuoren alueilta (Kuvio 1) (ks. esim. Frankland & Bontempi, 2005; Squire & Zola- Morgan, 1991). KUVIO 1. Muistiteoriat liittyen hippokampuksesta riippuvaiseen oppimiseen. Vallalla oleva muistijäljen vahvistumisteoria ja esimerkki vaihtoehtoisesta teoriasta (monimuistijälkiteoria) kontekstuaaliseen muistiin liittyen. Muistiteorioissa oletetaan muistijäljen vahvistuvan ajan kuluessa. Muistijäljen vahvistumisteoriassa oletetaan, että kun muistijäljet ovat vahvistuneet, ainoastaan aivokuori on riittävä mieleenpalautuksessa. Vaihtoehtoisissa teorioissa erona on se, että hippokampuksen ajatellaan osallistuvan myös vahvistuneiden muistijälkien mieleenpalautukseen aivokuoren alueiden kanssa. 85

Jari L. O. Kurkela, Arto Lipponen, Elisa M. Ruohonen & Piia Astikainen Toisaalta uudemmissa tutkimuksissa on havaittu, että hippokampukseen tehdyt vauriot juuri oppimisen jälkeen tai jopa myöhemmin, kun oppimisesta on kulunut jo aikaa, aiheuttavat muistinmenetyksen (Sutherland, O Brien & Lehmann, 2008; Winocur, Moscovitch & Sekeres, 2007). Vaihtoehtoisissa teorioissa esitetäänkin, että hippokampus olisi välttämätön myös vahvistuneiden kontekstuaalisten muistojen mieleenpalautuksessa. Esimerkiksi monimuistijälkiteorian mukaan kontekstuaalisen muistijäljen mieleenpalautus on aina riippuvainen hippokampuksesta. Sen sijaan faktoihin ja taitoihin liittyvät jo vahvistuneet muistot pystytään palauttamaan mieleen ilman hippokampusta (ks. esim. Frankland & Bontempi, 2005; Nadel & Moscovitch, 1997). Muistojen muuntumisteoriassa taas esitetään, että ajan myötä osa tapahtumiin liittyvistä muistoista muuntuu tietomuistoiksi. Tietomuiston mieleenpalauttaminen ei olisi enää riippuvainen hippokampuksesta, vaan tietomuistot ilmenisivät itsenäisesti aivokuoren alueilla. Tapahtumamuistot kuitenkin olisivat vielä riippuvaisia hippokampuksesta (Kuvio 1) (ks. esim. Winocur & Moscovitch, 2011). Teorioiden väliset ristiriidat saattavat johtua osin käytössä olleiden tutkimusmenetelmien rajallisuudesta. Aivovauriopotilaista saatavaa tutkimustiedon tulkintaa rajoittaa se, että vauriot eivät ole kovin tarkkarajaisia (Annese ym., 2014). Esimerkiksi lääkeaineita käyttämällä on kyetty estämään hippokampuksen toiminta, mutta manipuloinnin rajaaminen tarkasti vain hippokampukseen tai sen tiettyihin alueisiin on mahdotonta. Lisäksi lääkeainemanipulaatioiden vaikutusajan säätely on epätarkkaa (Morris, Anderson, Lynch & Baudry, 1986). Optogenetiikka on suhteellisen uusi menetelmä, joka antaa uudenlaisia mahdollisuuksia testata eri muistiteorioita eri eläinmal- KUVIO 2. Solun toiminnan säätely optogenetiikalla. Opsiinia ilmentävät geenit siirretään viruskuljettimeen (1), joka injektoidaan aivokudokseen (2). Opsiinien geenit liittyvät hermosolujen perimään, ja opsiinit alkavat ilmentyä hermosolujen solukalvolla (2). Kun aivokudokseen ohjataan valoa valokuidun avulla, opsiini aktivoituu ja varautuneet ionit pääsevät hermosolun sisälle (3). Näin hermosolun toimintaa voidaan säädellä valon avulla. 86 PSYKOLOGIA

Optogenetiikka valoa muistitutkimukseen leilla säädellen tiettyjen solujen toimintaa tarkasti määritellyllä ajanhetkellä. Tässä katsauksessa selvitämme optogenetiikan perusperiaatteita ja kuvaamme, millaista uutta tietoa sen avulla on saavutettu hippokampuksen ja aivokuoren alueiden vuorovaikutuksesta kontekstuaaliseen muistiin liittyen. Optogenetiikka menetelmänä Optogenetiikka mahdollistaa solujen toiminnan edistämisen tai estämisen valostimulaation avulla jopa millisekuntien tarkkuudella (Deisseroth, 2010). Vaikutus voidaan lisäksi rajata tietyn aivoalueen tiettyyn solutyyppiin. Optogenetiikka perustuu valolle herkkien proteiinien, opsiinien, käyttöön. Opsiineja löytyy luonnossa levistä ja kasveista, mutta niitä on myös esimerkiksi nisäkkäiden silmissä. Kokeissa opsiinit viedään hermosoluihin geenisiirrolla. Opsiinit ovat valoherkkiä ionikanavia. Valon osuessa opsiiniin ionikanavan muoto muuttuu, jolloin aikaisemmin kiinni ollut kanava avautuu ja varautuneet ionit, kuten natrium, kalium ja kloridi, pääsevät kulkeutumaan ionikanavan läpi. Opsiinityyppejä on useita, ja tietyn opsiinin läpi pystyy kulkeutumaan vain tiettyjä ioneja. Riippuen mitä opsiinia käytetään, seurauksena on joko hermosolun toiminnan edistäminen tai estäminen. Esimerkiksi kun valo osuu halorodopsiiniin, kloridi-ionit pääsevät kulkeutumaan solun sisälle, mikä estää solun aktivoitumista eli solu ei pysty lähettämään tietoa eteenpäin (Kuvio 2). Geenitekniikan avulla voidaan opsiinien ilmentyminen kohdistaa tarkasti tiettyihin soluihin, esimerkiksi pelkästään hippokampuksen tiettyjen osien alueelle. Tämä mahdollistaa muistintoimintoihin liittyvien solujoukkojen tai aivoalueiden tarkan tutkimuksen. Pelkoehdollistuminen kontekstuaalisen muistin tutkimuksen työkaluna Optogenetiikkaa on käytetty pääasiassa pelkoehdollistumisasetelmassa tutkimaan kontekstuaalisen muistijäljen muodostumista ja mieleenpalautusta (ks. esim. Goshen, 2014). Eläimet oppivat tunnistamaan tietyn ympäristön, kun ne viettävät siellä aikaa. Kun tässä tutussa ympäristössä eläimelle annetaan lievä sähköisku, eläin oppii pelkäämään tätä kyseistä ympäristöä. Tällaisessa pelkoehdollistumiskokeessa ympäristö toimii neutraalina ehdollisena ärsykkeenä ja lievä sähköisku ehdottomana ärsykkeenä. Neutraalina ehdollisena ärsykkeenä voidaan käyttää myös ääntä, joka esitetään yhtä aikaa sähköiskun kanssa. Tällöin voidaan pelon oppimista testata erikseen kontekstuaaliseen ja ei-kontekstuaaliseen vihjeeseen (Kuvio 3). Kontekstuaalinen vihje muodostuu usean aistijärjestelmän tuottamista tiedoista, kuten häkkiin liittyvät tunto, haju ja visuaaliset aistimukset. Ääni taas edustaa yhteen aistijärjestelmään perustuvaa vihjettä. Pelkoehdollistumisen hermostollisesta perustasta tiedetään jo aiemmista leesiokokeista, että mantelitumakkeen (amygdala) toiminta on välttämätöntä sekä ääneen että ympäristöön ehdollistumiselle (Phillips & LeDoux, 1992). Sen sijaan hippokampuksen vaurioittaminen heikentää vain ympäristöön liittyvää ehdollistumista (Kim & Fanselow, 1992; Phillips & LeDoux, 1992). Hippokampus kuitenkin koostuu monesta eri anatomisesta alueesta, joiden itsenäinen merkitys ja keskinäinen yhteistyö oppimisen ja mieleenpalautuksen aikana ovat vielä epäselviä (Kuvio 4). Hippokampuksen CA1-alue osallistuu oppimiseen ja mieleenpalautukseen Goshen ja työryhmä (2011) tekivät koesarjan, jossa he testasivat muistijäljen vahvistumisteoriaa. Optogenetiikan avulla he pystyivät estämään pelkoehdollistumiskokeessa hippokampuksen CA1-alueen toiminnan ajallisesti tarkasti oppimisen aikana, vuorokausi oppimisen jälkeen tai jo vahvistuneiden muistojen mieleenpalautuksen aikana. Kokeilla pyrittiin selvittämään, missä prosessin vaiheessa CA1-alue on välttämätön. Ensimmäisessä kokeessa hiiriä ehdollistettiin yhdistämään sähköisku tiettyyn ympäristöön ja ääneen samalla kun CA1-alueen toimintaa häirittiin. Seuraavana päivänä tarkasteltiin eläinten mieleenpalautusta. Tutkijat havaitsivat, että eläimet eivät pelänneet ympäristöä, jossa ne edellise- 87

Jari L. O. Kurkela, Arto Lipponen, Elisa M. Ruohonen & Piia Astikainen KUVIO 3. Pelkoehdollistumisasetelma. Pelkoehdollistumisessa voidaan neutraalina ehdollisena ärsykkeenä käyttää ympäristöä ja ääntä. Kun näiden ehdollisten ärsykkeiden aikana esitetään ehdottomana ärsykkeenä lievä sähköisku, eläin oppii pelkäämään sekä ympäristöä, jossa sähköisku esitettiin, että ääntä, jonka se kuuli sähköiskun aikana. Asiayhteyden oppimista voidaan testata asettamalla eläin alkuperäiseen ympäristöön ja tarkkailemalla, osoittaako se pelkoa kyseisessä ympäristössä (ilman sähköiskua). Asiayhteyden mieleenpalautus vaatii sekä hippokampuksen että amygdalan toimintaa. Sen sijaan ääntä eläin pelkää missä tahansa ympäristössä, eikä tämän asiayhteyden mieleenpalautukseen tarvita hippokampusta. 88 PSYKOLOGIA

Optogenetiikka valoa muistitutkimukseen nä päivänä olivat saaneet sähköiskuja. Tästä voidaan päätellä, että CA1-alueen solujen toiminnan häiritseminen esti muistijäljen muodostumisen oppimistilanteessa. Toisessa kokeessa hiiret ehdollistettiin ilman oppimisen aikaista häirintää, mutta CA1-alueen toimintaa estettiin ehdollistumisen jälkeisenä päivänä tapahtuvan mieleenpalautuksen aikana. Havaittiin, että hiiret eivät osoittaneet pelkoa ympäristössä, jota ne olivat aiemmin oppineet pelkäämään. Sen sijaan ääni ehdollisena ärsykkeenä laukaisi eläimissä edelleen pelkoreaktion. Optogeneettinen estäminen näytti siis vaikuttavan pelkästään kontekstuaalisen muiston mieleenpalautukseen. Koesarjassa osoitettiin myös, että mantelitumakkeen optogeneettinen estäminen aiheutti sekä ympäristöön että ääneen liittyvän oppimisen ja mieleenpalautuksen epäonnistumisen. Seuraavassa vaiheessa selvitettiin CA1-alueen merkitystä vahvistuneiden muistijälkien mieleenpalautukselle (Goshen ym., 2011). Kokeessa havaittiin, että CA1-alueen toiminnan estäminen 12 viikkoa oppimisen jälkeen johti mieleenpalautuksen epäonnistumiseen. Voidaankin päätellä, että vahvistuneen muistijäljen mieleenpalautuksessa CA1-alue on välttämätön. Edellä kuvatut Goshenin ryhmän tulokset osoittivat, että CA1-alue ei osallistu ainoastaan tapahtumamuistoihin liittyvien muistijälkien muodostamiseen vaan myös mieleenpalautukseen muistijäljen muodostumisen ja vahvistumisen jälkeenkin. Dorsaalinen pykäläpoimu osallistuu oppimiseen muttei mieleenpalautukseen Mikä merkitys on sitten muilla hippokampuksen alueilla, kuten pykäläpoimulla? Kheirbekin työryhmä (2013) selvitti dorsaalisen ja ventraalisen pykäläpoimun toiminnan merkitystä oppimisen ja mieleenpalautuksen aikana vastaavanlaisilla pelkoehdollistumiskokeilla kuin edellä esitetyissä CA1-alueen tutkimuksissa. Kokeissa havaittiin, että dorsaalisen pykäläpoimun solujen toiminnan estäminen oppimisen aikana johti kontekstiin ehdollistumisen epäonnistumiseen. KUVIO 4. Hippokampuksen rakenne ja hermoyhteydet. Hippokampus koostuu useasta alueesta: pykäläpoimusta (dentate gyrus, DG), CA1- ja CA3- alueesta (cornu ammonis 1 ja 3). Aivokuorelta tuleva informaatio tulee ensin pykäläpoimuun, josta se kulkeutuu CA3- ja CA1-alueen kautta takaisin aivokuorelle. 89

Jari L. O. Kurkela, Arto Lipponen, Elisa M. Ruohonen & Piia Astikainen Kun dorsaalisen pykäläpoimun aluetta estettiin optogeneettisesti mieleenpalautuksen aikana (24 tuntia oppimisen jälkeen), sillä ei ollut vaikutusta, sillä eläin osoitti pelkoa ympäristöön. Ventraalisen pykäläpoimun alueen estämisellä ei havaittu vaikutusta oppimiseen eikä mieleenpalautukseen. Tulokset siis osoittivat, että dorsaalinen pykäläpoimu osallistuu oppimiseen samoin kuin CA1- aluekin, mutta mieleenpalautuksessa se ei ole enää välttämätön. Uudet hermosolut muistijälkien muodostamisessa Pykäläpoimulla on kyky tuottaa uusia hermosoluja (esim. Kempermann, Gast & Gage, 2002), ja tiedetään, että nämä uudet solut ovat osallisena uusien muistijälkien muodostumisessa (Aimone ym., 2014). Gu ja työryhmä (2012) pyrkivät tutkimuksessaan tarkentamaan, miten pykäläpoimun uudet hermosolut osallistuvat uusien muistojen tallentamiseen. Hiirillä tehdyssä kokeessa he käyttivät menetelmää, jolla kyettiin merkitsemään juuri syntyneet solut. Koska nämä solut myös ilmensivät opsiinia, niitä voitiin manipuloida merkitsemisen jälkeen optogeneettisesti. Näin he pystyivät tutkimaan, missä elinkaarensa vaiheessa uudet solut osallistuvat muistijälkien muodostumiseen. Kokeessa käytettiin uimasuunnistustehtävää, jossa hiirten piti oppia ympäristön maamerkkien perusteella löytämään piilotetun alustan paikka vesialtaassa. Tulokset osoittivat, että neljän viikon ikäisten uusien solujen toiminnan estäminen optogeneettisesti uimasuunnistustehtävän aikana ei vaikuttanut oppimiseen (Gu ym., 2012). Kuitenkin jos neljän viikon ikäisten solujen annettiin toimia normaalisti oppimisen aikana, ne liittyivät osaksi hermoverkkoa, jossa muistijälki sijaitsi. Kun näiden neljän viikon ikäisten solujen toiminta estettiin mieleenpalautuksen aikana, eläimet eivät enää muistaneet, missä piilotettu alusta sijaitsi, eivätkä siis enää kyenneet aktivoimaan jo muodostunutta muistijälkeä. Kontrollikokeissa kahden ja kahdeksan viikon ikäisten solujen vastaavalla manipulaatiolla ei havaittu olevan vaikutusta oppimiseen tai mieleenpalautukseen. Edellä kuvattujen tutkimusten perusteella on saatu selville, että uudet solut integroituvat osaksi toiminnallista hermoverkkoa ajallisesti hyvin kapeassa ikkunassa. Vain neljän viikon ikäisten, muttei kahden tai kahdeksan viikon ikäisten, solujen havaittiin integroituvan toiminnallisesti ympäröiviin soluihin. Vastaavanlaisia tutkimuksia on tehty toistaiseksi vain muutamia (ks. esim. Restivo, Niibori, Mercaldo, Josselyn & Frankland, 2015), joten johtopäätösten tekeminen niiden perusteella on vaikeaa. On mahdollista, että kahden viikon ikäisten solujen rakenteellinen kehitys on vielä kesken eivätkä ne pysty integroitumaan osaksi ympäröiviä hermoverkkoja (Aimone ym., 2014). Toisaalta jos solut ovat liian vanhoja, ne saattavat olla jo kytkeytyneenä muihin toiminnallisiin hermoverkkoihin eivätkä kykene enää osallistumaan uusien muistojen muodostamiseen (Aimone ym., 2014). Muistijälki muodostuu aivokuorelle jo oppimisen aikana Muistijäljen vahvistumisteorian ja vaihtoehtoisten teorioiden mukaan hippokampus on välttämätön oppimisen aikana ja ajan kuluessa muistijäljet vahvistuvat myös aivokuoren alueille. Aivokuoren alueiden merkitys muistijäljen muodostumisessa itse oppimisen aikana on kuitenkin vielä epäselvä. Cowansage ja työryhmä (2014) testasivat, voiko oppimisen aikana aivokuorelle syntyä muistijälkeä ilman hippokampuksen toimintaa. He merkitsivät opsiinilla muistijäljen muodostumiseen osallistuvat solut retrospleniaalisella aivokuorella pelkoehdollistumisoppimisen aikana. Tämä aivokuoren alue otettiin tarkastelun kohteeksi, koska sillä on yhteyksiä hippokampukseen liittyviin alueisiin ja tiedetään, että siellä sijaitsee soluja, jotka liittyvät ympäristön hahmottamiseen (Wyss & van Groen, 1992). Kokeessa hiiret vietiin pian pelkoehdollistumisen jälkeen neutraaliin ympäristöön, joka oli niille entuudestaan vieras. Tässä neutraalissa ympäristössä aivokuorella sijaitseva muistijälki aktivoitiin optogenetiikan avulla. Havaittiin, että aktivoiminen sai aikaan pelkoreaktion eli muiston mieleenpalautumisen neutraalissakin ympäristössä. Tulokset viittasi- 90 PSYKOLOGIA

Optogenetiikka valoa muistitutkimukseen vat siihen, että opittu muistijälki sijaitsi ainakin osittain retrospleniaalisella aivokuorella ja että pelkästään sen aktivoiminen mahdollisti mieleenpalautuksen. Tulos oli yllättävä, koska aiemmin muistijäljen vahvistumisteoriaan pohjautuen oli ajateltu, että vastaopittujen (vielä vahvistumattomien) kontekstuaalisten muistojen palauttamiseen osallistuvat sekä hippokampus että aivokuori. Teorian mukaan hippokampuksen merkitys mieleenpalautuksessa vähenee vasta muistijälkien vahvistuttua aivokuorelle. Ollakseen täysin varmoja siitä, että hippokampus ei osallistunut mieleenpalautukseen, Cowansagen työryhmä (2014) esti seuraavassa kokeessa lääkeaineen avulla hiirten hippokampuksen toiminnan heti pelkoehdollistumisen jälkeen. Tulokset osoittivat, että silloinkin kun hippokampus oli lamautettu, aivokuorelle oppimisen aikana syntyneen muistijäljen uudelleen aktivoiminen optogeneettisesti mahdollisti mieleenpalautuksen. Edellä kuvatut tulokset viittaavat siihen, että jo oppimisen aikana aivokuoren alueille syntyy itsenäinen muistijälki, jonka mieleenpalautus onnistuu ainakin keinotekoisesti aivokuorta aktivoimalla ja myös ilman hippokampusta. Hippokampuksen ja aivokuoren muodostamalla hermoverkolla näyttäisi siis olevan myös kykyä sopeutua tilanteisiin, joissa jommankumman alueen toiminta on hetkellisesti häiriintynyttä. CA1-alue osallistuu myös vahvistuneiden muistijälkien mieleenpalautukseen Muistijäljen vahvistumisteoriassa oletetaan, että muistijäljet vahvistuvat ajan kuluessa aivokuorelle eikä niiden mieleenpalautukseen silloin enää tarvita hippokampusta. Tämä teoria on saanut aiemmin tukea kokeissa, joissa lääkeaineella estettiin aivokuoren pihtipoimun etuosan (anterior cingulate cortex, ACC) toiminta mieleenpalautuksen aikana (Frankland, Bontempi, Talton, Kaczmarek & Silva, 2004). Näissä kokeissa huomattiin, että 18 päivää oppimisen jälkeen tehty pihtipoimun lamaannuttaminen esti mieleenpalautuksen. Näin ollen voitiin päätellä muistijäljen sijaitsevan jo tässä vaiheessa aivokuorella. Goshen ryhmineen (2011) tutki tätä samaa asiaa käyttämällä optogenetiikkaa estämään vuorotellen aivokuoren pihtipoimun etuosan ja hippokampuksen alueiden toimintaa. Ensimmäisessä vaiheessa käytettiin pelkoehdollistumisasetelmaa, jossa hiiret oppivat pelkäämään tiettyä ympäristöä. Pihtipoimun toiminnan estäminen optogeneettisesti päivä oppimisen jälkeen ei estänyt mieleenpalautusta. Sen sijaan huomattiin, että mieleenpalautus epäonnistui, kun alueen toimintaa estettiin kuukauden päästä oppimisesta, jolloin voitiin olettaa muistijäljen jo vahvistuneen aivokuorelle. Tulokset olivat siis yhteneviä lääkeaineella toteutetun tutkimuksen kanssa (Frankland ym., 2004) ja osoittivat, että muistijäljen vahvistuminen aivokuorelle vie vähintään päiviä ja ennen vahvistumista opittu asiayhteys voidaan palauttaa mieleen ilman pihtipoimun etuosaa. Seuraavaksi testattiin, voiko jo vahvistuneen muistijäljen palauttaa mieleen ilman CA1-aluetta (Goshen ym., 2011). Tutkijat estivät CA1-alueen toiminnan optogeneettisesti mieleenpalautuksen aikana. Mieleenpalautusta testattiin kahdessa aikapisteessä: neljä ja yhdeksän viikkoa oppimisen jälkeen. Mieleenpalautus epäonnistui molemmissa aikapisteissä. Tämä oli yllättävää, sillä aikaisemmissa tutkimuksissa hippokampuksen leesiolla, joka oli myös tehty neljä viikkoa oppimisen jälkeen, ei ollut vaikutusta vahvistuneen muistijäljen mieleenpalautukseen (esim. Kim & Fanselow, 1992). Tulosten ristiriitaisuus saattoi johtua siitä, että leesion vaikutuksia ei voida tarkastella ajallisesti tarkkarajaisesti. Toisessa koeosiossa Goshen ja työryhmä (2011) testasivat, miten CA1-alueen toiminnan pitkäaikainen estäminen optogeneettisesti vaikuttaa vahvistuneen muistijäljen mieleenpalautukseen. He aloittivat estämisen jo 30 minuuttia ennen mieleenpalautustilannetta ja jatkoivat estämistä sen aikana. Nyt eläimet osoittivatkin normaaliin tapaan pelkoreaktiota eli mieleenpalautus onnistui ilman CA1-aluetta. Tulosten perusteella voitiin olettaa jonkin aivoalueen kompensoivan CA1-alueen estettyä toimintaa. Selvittääkseen, minkä aivoalueen toimintaan onnistunut mieleenpalautus perustui, tutkijat tekivät jatkokokeen (Goshen ym., 2011). He käyttivät hyödykseen geeniä, joka ilmentää itseään vain hermosolujen toimiessa. Tällä menetelmäl- 91

Jari L. O. Kurkela, Arto Lipponen, Elisa M. Ruohonen & Piia Astikainen lä he pystyivät tarkastelemaan, mitkä aivoalueet aktivoituvat mieleenpalautuksen aikana. Tutkijat havaitsivat, että kun CA1-alueen toimintaa estettiin pitkäkestoisesti, pihtipoimun aktiivisuus kohosi merkittävästi mieleenpalautuksen aikana. Tästä voitiin päätellä nimenomaan pihtipoimun kompensoivan hippokampuksen puutteellista toimintaa mieleenpalautuksessa. Näiden tutkimusten valossa muistijäljen vahvistuminen aivokuorelle ei tapahdu heti oppimisen jälkeen. Ajan kuluessa muistijälki vahvistuu aivokuorelle eikä sen mieleenpalautus onnistu enää ilman aivokuoren normaalia toimintaa. Hermoverkkojen toimiessa normaalisti CA1-alue osallistuu myös jo vahvistuneiden muistijälkien mieleenpalautukseen yhdessä aivokuoren kanssa. Jos CA1-alueen toiminnassa on pitkäaikaisia puutteita, aivokuoren alueet voivat kompensoida CA1-alueen toimintaa ja mahdollistaa itsenäisesti mieleenpalautuksen. Yhteenveto ja johtopäätökset Hippokampuksen ja aivokuoren vuorovaikutus muistitoimintojen eri vaiheissa on ollut pitkään epäselvä. Optogenetiikkamenetelmä on mahdollistanut muistitoimintojen tutkimisen tarkasti rajatuissa aivoalueissa erikseen oppimisen ja mieleenpalautuksen yhteydessä. Optogenetiikkatutkimuksen avulla on pystytty tarkentamaan tietoa hippokampuksen CA1- alueen ja pykäläpoimun osalta ja osoitettu, että näillä alueilla on erilaiset tehtävät muistiprosessin eri vaiheissa. Tämän uuden tiedon valossa näyttää siltä, että hippokampuksen CA1-alue ei osallistu ainoastaan oppimiseen vaan myös vahvistuneiden muistojen mieleenpalautukseen. Hippokampuksessa sijaitsevan pykäläpoimun dorsaalinen alue puolestaan osallistuu vain muistijäljen muodostamiseen oppimisen aikana, mutta ei ole enää osallisena mieleenpalautuksen aikana. Toisaalta mieleenpalautukselle kriittisiä ovat pykäläpoimussa syntyvät uudet solut, jotka ovat neljän viikon ikäisiä. Hermoverkkojen toimiessa normaalisti CA1- alue ja aivokuoren pihtipoimun alue ovat yhdessä mukana mieleenpalautuksessa. Muistijäljen vahvistuminen aivokuoren alueille alkaa heti oppimistilanteen jälkeen. Optogenetiikkatutkimus on antanut viitteitä siitä, että aivokuoren pihtipoimun etuosaa ei tarvittaisi juuri opittujen asioiden mieleenpalautuksessa. Ajan kuluessa muistijälki vahvistuu hippokampuksen ja aivokuoren vuorovaikutuksessa myös aivokuorelle. Jos CA1-alueen toiminta on pitkään häiriintynyttä, aivokuorella on mahdollisuus kompensoida tätä ja palauttaa jo vahvistunut muisto itsenäisesti mieleen. Tarvitaan vielä tutkimusta selvittämään, onko tämä mekanismi käytössä esimerkiksi aivovaurioiden kohdalla. Yhteenvetona voidaan sanoa, että optogenetiikkakokeiden tulokset ovat kyseenalaistaneet vallalla olevan muistijäljen vahvistumisteorian. Erityisesti se tulos, että hippokampuksen CA1- aluetta tarvitaan aivokuoren ohella vahvistuneen muistijäljen mieleenpalautukseen, on vastakkainen muistijäljen vahvistumisteorian kanssa, mutta sopii yhteen vaihtoehtoisten teorioiden kanssa (monimuistijälkiteoria tai muistijälkien muuntumisteoria). Optogenetiikka tulevaisuudessa Optogenetiikka kehittyy tekniikkana jatkuvasti, ja tulevaisuudessa voidaan todennäköisesti hyödyntää laajempaa kirjoa erilaisia opsiineja, joita voidaan samassa hermokudoksessa kohdistaa useisiin erilaisiin soluryhmiin joko aktivoiden tai estäen niiden toimintaa. Lisäksi opsiinien valoherkkyyden kehittyessä hermosoluja voidaan ohjata valolla suoraan kalloluun ja kenties jopa päänahan päältä, jolloin vältyttäisiin neurokirurgisilta operaatioilta. On siis mahdollista, että optogenetiikkaa voitaisiin käyttää tulevaisuudessa ihmisten hermostollisten sairauksien hoitomuotona. Viime vuosina muistitutkimus, jossa on hyödynnetty optogenetiikkaa, on keskittynyt pitkälti kontekstuaaliseen oppimiseen ja käyttänyt menetelmänään erityisesti pelkoehdollistumista. On kuitenkin todennäköistä, että hermostolliset mekanismit pelkoehdollistumisoppimisen taustalla ovat erilaisia kuin muunlaisessa oppimisessa ja että muiden oppimisen lajien, kuten havainto-oppimisen, mekanismien tutkimukseen ei ole vielä juurikaan käytetty optogenetiikkaa. Havainto-oppimisella tarkoitetaan havaintojen 92 PSYKOLOGIA

Optogenetiikka valoa muistitutkimukseen tarkentumista oppimisen seurauksena. Tutkimusryhmämme selvittää parhaillaan auditiivisen havainto-oppimisen hermostollista perustaa käyttäen apuna myös optogenetiikkaa (tutkimusprojekti Puheäänten erottelun oppiminen vertaileva aivovastetutkimus ihmisillä ja rotilla, Suomen Akatemia, 2014 2016, vastuullinen tutkija Piia Astikainen). Tarkemmin sanottuna selvitämme aivokuoren ja hippokampuksen toimintaa ja vuorovaikutusta kuuloerotteluoppimisen aikana altistamalla jyrsijöitä erilaisille äänten piirteille. Hippokampuksen merkitystä selvitetään äänten piirteiden havaitsemisessa, muistiin tallentamisessa ja säilömuistista palauttamisessa. Tutkimuksessamme teemme elektrofysiologisia rekisteröintejä esimerkiksi hippokampuksen eri alueilta ja kuuloaivokuorelta samalla, kun ääniä esitetään ja optogeneettinen estäminen kohdistetaan hippokampuksen yksittäiseen rakenteeseen. Tutkimus tulee antamaan tietoa äänten erottelun hermostollisesta perustasta sekä hippokampuksen ja kuuloaivokuoren toiminnasta ja vuorovaikutuksesta pitkäkestoisten muistijälkien muodostumisen aikana. Artikkeli on saatu toimitukseen 26.6.2015 ja hyväksytty julkaistavaksi 1.3.2016. Kiitokset Suomen Akatemia on rahoittanut tutkimusta (projektinumero 273134 Piia Astikaiselle). Kiitämme professori Heikki Tanilaa artikkelikäsikirjoituksemme kommentoinnista ja akatemiatutkija Miriam Nokiaa hänen kommenteistaan edelliseen käsikirjoitusversioon. Lisäksi kiitämme Anniina Kuuselaa ja Greetta Heilalaa kuvien tuottamisesta. Lähteet Aimone, J. B., Li, Y., Lee, S. W., Clemenson, G. D., Deng, W. & Gage, F. H. (2014). Regulation and function of adult neurogenesis: From genes to cognition. Physiological Reviews, 94(4), 991 1026. Alvarez, R. P., Biggs, A., Chen, G., Pine, D. S. & Grillon, C. (2008). Contextual fear conditioning in humans: Corticalhippocampal and amygdala contributions. The Journal of Neuroscience, 28(24), 6211 6219. Annese, J., Schenker-Ahmed, N. M., Bartsch, H., Maechler, P., Sheh, C., Thomas, N.,... & Klaming, R. (2014). Postmortem examination of patient HM s brain based on histological sectioning and digital 3D reconstruction. Nature Communications, 5, 3122. Cowansage, K. K., Shuman, T., Dillingham, B. C., Chang, A., Golshani, P. & Mayford, M. (2014). Direct reactivation of a coherent neocortical memory of context. Neuron, 84(2), 432 441. Deisseroth, K. (2010). Controlling the brain with light. Scientific American, 303(5), 48 55. Frankland, P. W. & Bontempi, B. (2005). The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience, 6(2), 119 130. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L. & Silva, A. J. (2004). The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science, 304(5672), 881 883. Goshen, I. (2014). The optogenetic revolution in memory research. Trends in Neurosciences, 37(9), 511 522. Goshen, I., Brodsky, M., Prakash, R., Wallace, J., Gradinaru, V., Ramakrishnan, C. & Deisseroth, K. (2011). Dynamics of retrieval strategies for remote memories. Cell, 147(3), 678 689. Gu, Y., Arruda-Carvalho, M., Wang, J., Janoschka, S. R., Josselyn, S. A., Frankland, P. W. & Ge, S. (2012). Optical controlling reveals time-dependent roles for adult-born dentate granule cells. Nature Neuroscience, 15(12), 1700 1706. Kempermann, G., Gast, D. & Gage, F. H. (2002). Neuroplasticity in old age: Sustained fivefold induction of hippocampal neurogenesis by long-term environmental enrichment. Annals of Neurology, 52(2), 135 143. Kheirbek, M. A., Drew, L. J., Burghardt, N. S., Costantini, D. O., Tannenholz, L., Ahmari, S. E., & Hen, R. (2013). Differential control of learning and anxiety along the dorsoventral axis of the dentate gyrus. Neuron, 77(5), 955 968. Kim, J. J. & Fanselow, M. S. (1992). Modality-specific retrograde amnesia of fear. Science, 256(5057), 675 677. 93

Jari L. O. Kurkela, Arto Lipponen, Elisa M. Ruohonen & Piia Astikainen Kitamura, T., Saitoh, Y., Takashima, N., Murayama, A., Niibori, Y., Ageta, H.,... & Inokuchi, K. (2009). Adult neurogenesis modulates the hippocampus-dependent period of associative fear memory. Cell, 139(4), 814 827. Maren, S., Phan, K. L. & Liberzon, I. (2013). The contextual brain: Implications for fear conditioning, extinction and psychopathology. Nature Reviews Neuroscience, 14(6), 417 428. Morris, R. G. M., Anderson, E., Lynch, G. A. & Baudry, M. (1986). Selective impairment of learning and blockade of long-term potentiation by an N-methyl-D-aspartate receptor antagonist, AP5. Nature, 319(6056), 774 776. Nadel, L. & Moscovitch, M. (1997). Memory consolidation, retrograde amnesia and the hippocampal complex. Current Opinion in Neurobiology, 7(2), 217 227. Phillips, R. G. & LeDoux, J. E. (1992). Differential contribution of amygdala and hippocampus to cued and contextual fear conditioning. Behavioral Neuroscience, 106(2), 274 285. Restivo, L., Niibori, Y., Mercaldo, V., Josselyn, S. A. & Frankland, P. W. (2015). Development of adult-generated cell connectivity with excitatory and inhibitory cell populations in the hippocampus. The Journal of Neuroscience, 35(29), 10600 10612. Rugg, M. D. & Vilberg, K. L. (2013). Brain networks underlying episodic memory retrieval. Current Opinion in Neurobiology, 23(2), 255 260. Scoville, W. B. & Milner, B. (1957). Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 20(1), 11 21. Squire, L. R. & Alvarez, P. (1995). Retrograde amnesia and memory consolidation: A neurobiological perspective. Current Opinion in Neurobiology, 5(2), 169 177. Squire, L. R. & Zola-Morgan, S. (1991). The medial temporal lobe memory system. Science, 253(5026), 1380 1386. Sutherland, R. J., O Brien, J. & Lehmann, H. (2008). Absence of systems consolidation of fear memories after dorsal, ventral, or complete hippocampal damage. Hippocampus, 18(7), 710 718. Winocur, G. & Moscovitch, M. (2011). Memory transformation and systems consolidation. Journal of the International Neuropsychological Society, 17(5), 766 780. Winocur, G., Moscovitch, M. & Sekeres, M. (2007). Memory consolidation or transformation: Context manipulation and hippocampal representations of memory. Nature Neuroscience, 10(5), 555 557. Wyss, J. M. & van Groen, T. (1992). Connections between the retrosplenial cortex and the hippocampal formation in the rat: A review. Hippocampus, 2(1), 1 11. 94 PSYKOLOGIA