Plasmidi-DNA:n eristys bakteerisoluista DNA:n geelielektroforeesi (Proteiinien geelielektroforeesi) CHEM-A1310 Biotieteen perusteet Heli Viskari 2017 DNA-harjoitustöiden aikataulu, valitse yksi näistä (avautuvat Oodissa tämän päivän aikana): Ke 25.1. klo 13-16 To 26.1. klo 13-16 Ke 1.2. klo 13-16 To 2.2. klo 13-16 Pe 3.2. klo 13-16 Ke 8.2. klo 13-16 To 9.2. klo 13-16 Pe 10.2. klo 13-16 + yksi rästikerta, ilmoitetaan myöhemmin 1
DNA eliöissä DNA-sekvenssi ja geenit muodostavat eliöiden genotyypin ja määräävät täten myös fenotyypin eli ilmiasun, jonka me voimme havaita. DNA on luonnon keskeinen rakennusosanen ja se toimii myös pohjana biotekniikan ja synteettisen biologian sovelluksissa. DNA sisältää solun geneettisen informaation (käydään läpi prof. Linderin luennolla) http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/dna http://www-app.igb.illinois.edu/games2012/ 2
Geelielektroforeesi DNA-tutkimuksen perustyökaluna Kun DNA on eristetty esim. eläinsolusta tai bakteerista, sitä voidaan esim. Kopioida PCR:n (polymerase chain reaktion, polymeraasiketjureaktio) avulla Pilkkoa paloihin entsyymien avulla DNA:ta voidaan pilkkoa restriktioentsyymeillä, jotka tunnistavat esim. kuuden tai kahdeksan nukleotidin jakson Perustyökalu esim. rekombinantti-dna-tekniikassa DNA-palojen pituus voidaan määrittää geelielektroforeesilla Restriktioentsyymi katkaisee DNA:n http://science.nayland.school.nz/graemeb/yr13%20work/biotech/biotech nology.htm 3
Restriktioentsyymejä on erilaisia http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/r/restrictionenzymes.html Esimerkki DNA-digestion sovelluskohteesta: Geenin kloonaus plasmidiin, jonka avulla haluttua proteiinia voidaan tuottaa esim. E. coli soluissa -haluttu proteiini voi olla esim. lääkeaine tai vaikkapa entsyymi, jota bakteeri ei luonnostaan tuota 4
Harjoitustyö: plasmidi-dna:n eristys bakteerisoluista DNA-geelielektroforeesi Plasmidi-DNA:n eristys Bakteerissa kasvatettu plasmidi voidaan puhdistaa pienillä kolonneilla, joihin hajotettujen solujen plasmidi tarttuu. Tarttumisen jälkeen kolonni pestään ja sen jälkeen plasmidi eluoidaan eli irrotetaan ulos kolonnista. http://www.gibthai.com/pro/product_list_detail.php?companyid=44&cms_id=457 5
DNA-geelielektroforeesi Plasmidissa olevan geeni-insertin olemassaolo voidaan tarkistaa restriktioentsyymi-digestion ja DNA-geelielektroforeesin avulla. Elektroforeesin tuloksena voidaan määrittää DNA-palojen määrä ja koko. 6200 bp 6200 bp http://www.addgene.org/plasmid_protocols/diagnostic_digest/ 6
Mikä on DNA:n varaus: negatiivinen, neutraali vai positiivinen? Mihin suuntaan DNA-palat liikkuvat sähkövirrassa? http://www.biochem.arizona.edu/miesfeld/teaching/bioc471-2/pages/lecture2/lecture2.html http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lab12%20-%20biol210.htm 7
SybrSafe: SYBR Safe is a safer alternative to the known mutagen ethidium bromide. - A cyanine dye used as a nucleic acid stain in molecular biology - Binds to DNA - The resulting DNA-dyecomplex absorbs blue light (λ max = 509 nm) and emits green light (λ max = 524 nm) http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lab12%20-%20biol210.htm EtBr:lla värjätty DNA näkyy UV-valossa - Suojamaskia ja suojakäsineitä käytettävä! http://science.nayland.school.nz/graemeb/yr13%20work/biotech/biotechnology.htm 8
Työn suoritus Pienryhmissä laboratoriossa C305 Työohje tulee myöhemmin MyCoursesiin, jaetaan myös työn alussa Tule ajoissa paikalle, työ alkaa heti ilmoitettuna ajankohtana (lyhyt teoriaosuus + geeliajo + plasmidi-dna:n eristys) Mukaan laboratoriotakki ja suojalasit sekä kirjoitusvälineet REPPUJA ja TAKKEJA ym. EI LABORATORIOTILOIHIN! Videot 1) Video agaroosigeelin valmistuksesta (BioRad) https://www.youtube.com/watch?v=kkmikkmddhy 2) Video DNA-agaroosigeeliajosta (BioRad) https://www.youtube.com/watch?v=vq759wkccuq 9
Proteiinien elektroforeesi (ei kuulu harjoitustöihin) Miten erottaa erilaiset proteiinit toisistaan? www.ironmanmagazine.com http://www.ucl.ac.uk/~sjjgsca/proteinstructure.html http://apbrwww5.apsu.edu/thompsonj/anatomy%20&%20physiology/2010/2010%20exam%20reviews/ Exam%201%20Review/Ch03%20Cell%20Organelles%20&%20Cytoskeleton.htm http://www.mcw.edu/pharmacology/people/faculty/leesang.htm 10
Miten voidaan havaita onko haluamaamme proteiinia syntynyt esim. bakteerissa tuotettaessa? http://en.wikipedia.org/wiki/bioreactor http://www.gene-vinate.com/#!bacterial-expression-systems/c1e2q Proteiinien elektroforeesin periaate Proteiinit liikkuvat sähkökentässä Hyödynnetään proteiinien erottamiseksi toisistaan tunnistamista varten Proteiinit liikkuvat kokonsa perusteella eri nopeuksilla ja siten erottuvat toisistaan http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/bulletin_6040a.pdf 11
SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulphate (negatiivisesti varautunut detergentti) PAGE = polyakryyliamidi-geelielektroforeesi SDS-PAGE = natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi SDS denaturoi ja linearisoi proteiinit niiden primaarirakenteiksi eli aminohapposekvenssimuotoon sekä päällystää linearisoidut proteiinit -> kompleksilla negatiivinen varaus Miksi juuri polyakryyliamidi? Kemiallisesti inertti Sähköisesti neutraali Hydrofiilinen Läpinäkyvä koostumus hyvä havainnointitarkoituksiin Proteiinien erottuminen http://www.slideshare.net/ouopened/sds-page-lecture 12
Proteiinien erottuminen http://www.bio-rad.com/en-fi/applications-technologies/protein-electrophoresis-methods Proteiinin koon määritys FDH: 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase 2,3-BDH: 2,3-butanediol dehydrogenase GDH: glutamate dehydrogenase www.nature.com 13
Elektroforeesin työjärjestys Ajopuskurien valmistus Geelin valmistus Näytteiden valmistelu ajoa varten Näytteiden ja standardien lataus ja ajo Geelin värjäys ja/tai immunoblottaus Kuvantaminen ja tulosten analysointi Näyte-cocktail Tris-HCl-puskuri SDS 10% glyseroli 0.01% bromophenol blue 5% 2-merkaptoetanoli (rikkisillat poikki) näy eiden denaturoin kuumentamalla Geelin värjäys - Esim. Coomassie blue värillä Huom! Muista työturvallisuus ja suojavarusteet - Esim. akryyliamidi on neurotoksiini Laitteisto 200 V Tärkeää, että johdot kytketään oikein päin! Ajolaitteen kansi päälle/pois vasta, kun virtalähde on sammutettu ja johdot on irrotettu virtalähteestä! 14
http://bitesizebio.com/articles/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ http://bitesizebio.com/articles/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ 15
http://bitesizebio.com/articles/sds-page-the-easy-way-to-find-the-wells/ Proteiinien identifiointi geeliajon jälkeen Yhtenä vaihtoehtona proteiinien immunoblottaus eli Western blot Geeliajossa koon mukaan erotellut proteiinit siirretään sähkövirran avulla membraanille, josta haluttu proteiini voidaan tunnistaa sille spesifisen vastaaineen avulla Miksi proteiinit siirretään membraanille tarkastelua varten? http://technologyinscience.blogspot.fi/2011/12/ western-blot-protein-immunoblot.html#.vqqjewo6h8e http://www.genoprice.com/onestep.htm 16
Western blot -menetelmän tuloksena vain tutkittava proteiini havaitaan membraanilla, jos alkuperäinen näyte sisältää ko. proteiinia Kemiluminesenssiin tai kolorimetriseen reaktioon perustuva detektio http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/techniques/techelectrophoresis.htm Video Video vertikaalisesta SDS-PAGE-ajosta (ThermoFisher) http://www.piercenet.com/method/overviewelectrophoresis 17