Teijo Kuopio NESTEBIOPSIA

18.11.2016 Teijo Kuopio NESTEBIOPSIA

TERMINOLOGIAA

Nestebiopsia (liquid biopsy)

Nestebiopsia Veren tai muiden kehon nesteiden erilaiset diagnostiset testit, jotka voi rinnastaa kiinteiden kudosten koepaloista tai solunäytteistä tehtäviin kasvainta kuvaaviin molekyylipatologisiin tutkimuksiin

Nestebiopsia (verinäyte) Veren tai muiden kehon nesteiden erilaiset diagnostiset testit, jotka voi rinnastaa kiinteiden kudosten koepaloista tai solunäytteistä tehtäviin kasvainta kuvaaviin molekyylipatologisiin tutkimuksiin KUDOSPALA Testi VERINÄYTE Testi

Nestebiopsia (verinäyte) Veren tai muiden kehon nesteiden erilaiset diagnostiset testit, jotka voi rinnastaa kiinteiden kudosten koepaloista tai solunäytteistä tehtäviin kasvainta kuvaaviin molekyylipatologisiin tutkimuksiin KUDOSPALA Testi VERINÄYTE Testi Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood

Nestebiopsia (verinäyte) Verinäytteestä analysoitavat kohteet: 1. Verenkierron kasvainsolut 2. Ekstrasellullaariset vesikkelit 3. Solunulkoinen DNA (cell free DNA)

Nestebiopsia (verinäyte) CTCs Verenkierron kasvainsolut circulating tumors cells cfdna Solunulkoinen DNA (cell-free DNA) Kaikki elimistössä solujen ulkopuolella esiintyvä DNA, usein plasman DNA ctdna Verenkierron kasvain-dna (circulating tumor DNA) cfdna:n alakäsite; solujen ulkopuolella esiintyvä, syöpäsoluista peräisin oleva DNA

VERENKIERRON KASVAINSOLUT, EKSTRASELLULAARISET VESIKKELIT, SOLUNULKOINEN DNA JA KASVAIN-DNA

Apoptoosi Nekroosi, nekroptoosi Aktiivinen eritys

CTCs Verenkierron kasvainsolut Apoptoosi Nekroosi, nekroptoosi Aktiivinen eritys

EV Verenkierron ekstrasellulaariset vesikkelit Apoptoosi Nekroosi, nekroptoosi Aktiivinen eritys

cfdna Solunulkoinen DNA (cell-free DNA)

cfdna Solunulkoinen DNA (cell-free DNA) Pool of normal Cell-free DNA

cfdna Solunulkoinen DNA (cell-free DNA) Syöpä Raskaus

cfdna Solunulkoinen DNA (cell-free DNA) Autoimmuuni sairaudet Liikunta Trauma Syöpä Raskaus Aivohalvaus

ctdna Verenkierron kasvain-dna Syöpä

ctdna Verenkierron kasvain-dna Kasvainsoluista

ctdna Verenkierron kasvain-dna ctdna:ssa patogeenisiä mutaatiota Syöpä

ctdna Verenkierron kasvain-dna ctdna:ssa patogeenisiä mutaatiota ctdna:n määrä heijastaa tuumoritaakkaa, mutta siihen vaikuttavat myös metastaasien sijainti Syöpä

ctdna Verenkierron kasvain-dna ctdna:ssa patogeenisiä mutaatiota ctdna:n määrä heijastaa tuumoritaakkaa, mutta siihen vaikuttavat myös metastaasien sijainti Syöpä Puoliintumisaika n. 2 h

ctdna Verenkierron kasvain-dna ctdna:ssa patogeenisiä mutaatiota ctdna:n määrä heijastaa tuumoritaakkaa, mutta siihen vaikuttavat myös metastaasien sijainti Syöpä Puoliintumisaika n. 2 h Mahdollistaa (metastaattisen) syövän molekylaarisen tilan jatkuvan monitoroinnin

ctdna Verenkierron kasvain-dna ctdna:ssa patogeenisiä mutaatiota ctdna:n määrä heijastaa tuumoritaakkaa, mutta siihen vaikuttavat myös metastaasien sijainti Syöpä Puoliintumisaika n. 2 h Mahdollistaa (metastaattisen) syövän molekylaarisen tilan jatkuvan monitoroinnin Määrä voi olla hyvin pieni (esim. 0,4 % cfdna:sta)

TARVITAAN HERKKIÄ MÄÄRITYSMENETELMIÄ

NGS ddpcr

Technology to asses circulating tumor DNA NGS Has been used for point mutations, rearrangents, genomic amplification, aneuploidy, whole exome and whole genomes equencing False discovery rate requires presequencing barcoding and postsequencing bioinformatics for error supression More exprensive Panels, bioinformatics dpcr Best for individual mutations but can be used for crude copy number analysis Mutations needs to be known ahead of time (e.g. BRAF v600e) Sensitivity* is dependent on specific mutation and assay optimization Multiplexing assays is possible Fast and highly reproducible results in hours Minimal bioinformatics needs Inexpensive *0.01% or less (ie, 1 mutated allele in presence of 10,000 wild-type alleles)

Droplet digital PCT (ddpcr) Normaali DNA Mutatoitunut DNA PCR -reaktioseos Osionti ~20 000 erillistä reaktiota PCR Alleelispesifinen PCR WT koetin HEX-leimattu Mutaatiospesifiset koettimet FAMleimattu

Droplet digital PCT (ddpcr) Pisaratekniikassa PCR seoksen osionti toteutettu luomalla öljyn avulla emulsio 1nl pisaroita ~ 20 000 kpl pisarat PCR reaktion jälkeen Fluoresenssidetektio ja droplettien laskenta Data analyysi

Pisarat joissa EGFR mutaatio 45 % Pisarat joissa normaalia ja Digitaalinen PCR mutatoitunutta EGFR DNA:ta FFPE näyte, jossa ~90% tuumorisoluja Pisarat joissa WT EGFR 1,4 % Plasman cfdna näyte potilaasta, jonka primäärituumorista on aikaisemmin osoitettu EGFR L858R mutaatio

NESTEBIOPSIA vs. KUDOSBIOPSIA

Nestebiopsia vs. kudosbiopsia cfdna + Verinäyte helppo ottaa + Edustaa taudin (koko) profiilia + Voidaan kerätä taudin/hoidon eri vaiheissa + Taudin aikainen toteaminen - Edustavuuden arviointi Kudosnäyte + Diagnoosi, rakenne + Yleensä valmiina jo olemassa + Näytteen edustavuus voidaan arvioida - Kajoava/komplikaatiot - Ei aina mahdollista saada - Ei välttämättä edusta koko taudin geneettistä profiilia/ nykytilannetta

ASCO 2016: Plasma Detection Is Sensitive and Can Complement Tissue T790M Testing Plasma sensitivity = 80,9 % (313/387) with tissues as reference Plasma identifies almost as many T790M-positive patients (n=374) as tissue (n=387) when inadequate biopsies (n=55) are included Wakelee et al., J Clin Oncol 34, 2016 (suppl; abstr 9001)

ASCO 2016: Plasma, Tissue, and Urine Identify Unique and Overlapping Subsets of T790M- Positive Patients 181 samples and matched pretreatment T790M results in plasma tissue urine Wakelee et al., J Clin Oncol 34, 2016 (suppl; abstr 9001)

ASCO 2016: Plasma, Tissue, and Urine Identify Unique and Overlapping Subsets of T790M- Positive Patients 181 samples and matched pretreatment T790M results in plasma, tissue and urine 7 were T790M-negative or inadequate by all sample types (4 %) 174 were T790M-positive by at least 1 sample type (96 %) Tissue Urine 8 16 18 104 19 5 4 Plasma Wakelee et al., J Clin Oncol 34, 2016 (suppl; abstr 9001)

ASCO 2016: Plasma, Tissue, and Urine Identify Unique and Overlapping Subsets of T790M- Positive Patients 181 samples and matched pretreatment T790M results in plasma, tissue and urine 7 were T790M-negative or inadequate by all sample types (4 %) 174 were T790M-positive by at least 1 sample type (96 %) Tissue Urine 8 16 18 104 19 5 Positive Tissue 146/181 Positive Plasma 145/181 Positive Urine 144/181 4 Plasma Wakelee et al., J Clin Oncol 34, 2016 (suppl; abstr 9001)

ASCO 2016: Plasma, Tissue, and Urine Identify Unique and Overlapping Subsets of T790M- Positive Patients Plasma sensitivity = 80,9 % with tissue as reference Regardless of assay methodology (plasma, urine, tissue), presence of T790M mutation is predictive of response and improved outcome to TKI EGFR mutation detection from plasma and urine should be considered viable approacches, particularly when tumor tissue is not available Wakelee et al., J Clin Oncol 34, 2016 (suppl; abstr 9001)

EGFR-Plasma vs. EGFR-Tissue Sensitivity 70-86 % 31 % patients negative for T790M in tumour genotyping were positive for T790M in plasma.

Liver metastases easier to detect: 94 % vs. 79 % (sensitivity) positive plasma testing vs. in other locations Metastases present only in intrathoracic location more difficult to detect 75 % vs. 86 % (sensitivity) positivity in plasma testing

ESMO 2016 guideline recommendations for EGFR mut patients progressing after 1st line EGFR TKI therapy Novello et al., Annals of Oncology 27 (Supplement 5): v1 v27, 2016

Biopsianäyte voi olla Vaikea tai mahdoton ottaa (esim. keuhkot, aivot, luu) Niukka ja loppunut Vanha eikä edusta nykytilannetta Häviävän pieni osa koko tuumorimassasta A tumor reaching the size of 1 cm 3 (approximately 1 g wet weight) is commonly assumed to contain 1 x 10 9 cells

Syöpä on heterogeeninen

Syöpä on heterogeeninen 10 9 solua /g 3 cm tuumorista 200 solua =tavattoman pieni osa

Syöpä muuntuu ajan myötä Primary and metastasis clonal heterogeneity Molecular heterogeneity and clonal evolution is an ongoing process

Metastaasit ovat erilaisia Independent somatic evolution, cell competition and various systemic and site-specific selection pressures (such as the extracellular matrix, hypoxia and immunosurveillance) generate metastatic diversity Klein, C. Nature 501, 365 372 (19 September 2013)

Metastaasit ovat erilaisia Pool Nestebiopsia saattaa kertoa enemmän kokonaistilanteesta kuin kudosnäyte Modified from Klein, C. Nature 501, 365 372 (19 September 2013)

NESTEBIOPSIA JA HOITOPOLKU

Nestebiopsia hoitopolun eri kohdissa Määrä Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio Aika

Nestebiopsia hoitopolun eri kohdissa Määrä Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio Aika Hoitovastetta ennakoiva mutaatiotestaus

Nestebiopsia hoitopolun eri kohdissa Määrä Leikkaus Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio Aika Jäännöstaudin seuraaminen

Nestebiopsia hoitopolun eri kohdissa Määrä Leikkaus Biologinen lääkitys Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio Aika Hoitovasteen seuranta Hoitovastetta ennakoiva mutaatiotestaus

Nestebiopsia hoitopolun eri kohdissa Määrä Leikkaus Biologinen lääkitys Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio resistenssimutaatio Aika Hoitovasteen seuranta Resistenssimutaatioiden havaitseminen Hoitovastetta ennakoiva mutaatiotestaus

Nestebiopsia hoitopolun eri kohdissa Määrä Leikkaus Biologinen lääkitys Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio Aika Taudin varhainen toteaminen

Luis Diaz Jr., MD, from Johns Hopkins University "I think early detection is the Holy Grail of cancer research," Liquid biopsies will likely offer a screening method for most cancers one day

Nestebiopsia voi olla dynaaminen biomarkkeri Määrä Leikkaus Biologinen lääkitys Kasvaintaakka Alkuvaiheen mutaatio resistenssimutaatio Aika Taudin varhainen toteaminen Jäännöstaudin seuraaminen Hoitovasteen seuranta Hoitovastetta ennakoiva mutaatiotestaus Resistenssimutaatioiden havaitseminen

Mies syntynyt 1955 2015 inoperaabeli rektumim karsinooma, maksametastaasi Ei RAS-mutaatiota tuumorissa Sädehoitoa, panitumumabi

Mies syntynyt 1955 2015 inoperaabeli rektumim karsinooma, maksametastaasi Ei RAS-mutaatiota tuumorissa Sädehoitoa, panitumumabi 8/2016 maksassa progressio, nestebiopsianäyte

Mies syntynyt 1955 2015 inoperaabeli rektumim karsinooma, maksametastaasi Ei RAS-mutaatiota tuumorissa Sädehoitoa, panitumumabi 8/2016 maksassa progressio, nestebiopsianäyte Plasmassa KRAS-mutaatio

Mies syntynyt 1955 4 8 2 N AT U R E VO L 4 8 6 2 8 J U N E 2 0 1 2

Nainen syntynyt 1960 21.7.2015 Lähete: Potilaalla todettu keuhkojen adenokarsinooma gr 2. Näytteessä on niukasti karsinoomasolukkoa. Esiin tulee yksi strooman kappale. Vastaus: EGFR-geenin Ex 19 deleetio 23.9.2016 Lähete: 26.9.2016 Lähete: EGFR-mutaatiotestissä aiemmin todettu deleetio eksonissa. Nyt lääkevaste hiipunut. Löytyykö T790M-mutaatiota plasmanäytteestä? Adenokarsinooman metastaasi mediastinumissa, T790M mutaatio?

Mediastinumin näyte

Mediastinumin näyte 0,45% Mediastinum: Ex 19 del Sama mutaatio kuin primaarikasvaimessa 2015

Mediastinumin ja Plasman näyte 0,45% Mediastinum: Ex 19 del 0,19% Plasma: T790M

Primaari Mediastinum Plasma Ex 19 del + + + T790M - - +

Metastaasit ovat erilaisia Pool Modified from Klein, C. Nature 501, 365 372 (19 September 2013)

dd PCR/NGS työn alla mm EGFR-geenin yleisimmät mutaatiot (p.l858r, p.t790m, p.l861q, ex.19 deleetio p.e740_a746del) BRAF-geenin mutaatiot (V600E ja -K), K-RAS (yleisimmät, kod 12 ja 13) HER2 monistuma, EGFR-kopioluku, custom assay TAYS-KSSHP tutkimus Rintasyöpäpotilaiden plasman ERS1-mutaatioiden tutkimus Verrataan ddpcr:ää ja NGS:ää TAYS-KSSHP tutkimus 80 stage III CRC tapauksia Nestebiopsiaseuranta 3 vuotta leikkauksen jälkeen Haimasyöpä vs. kr. pankreatiitti, plasma ja ERCP-näytteet Verrataan ddpcr ja NGS

ESP:n EGFR-laatukierros 2015 131 laboratoriota ilmoittautui 114 laboratoriota (26 maata) palautti vastaukset Onnistunut läpäiseminen vaati vähintään 90 % maksimipistemäärästä (eli käytännössä 1 väärä tulos sallittu) n. 48 %:lla kaksi tai enemmän väärää tulosta Vain 59/114 (52 %) laboratorioista läpäisi laatukierroksen onnistuneesti KSSHP tulos 17,5/18 pistettä (0,5 pisten vähennys lausuntoon liittyvän puutteen takia)

NESTEBIOPSIASTA SANOTTUA

Liquid biopsies are an area of intense study and commercial activity The field has really exploded But caution should be used until clinical trials are completed that confirm their therapeutic utility More research is needed before liquid biopsies are used routinely in cancer care Just because a test can be done, doesn t mean it should be done

PELKKÄ GENOMIDATA EI RIITÄ

Mutaatioanalytiikan lisäksi tarvitaan muuta Mutaatio lääkeresponssi topografia diagnoosi Tarvitaan dynaamisia erilaisten biomarkkereiden analyyseja ja funktionaalisia testejä Seuraavassa kuvassa on esitetty KSSHP:n (Jyväskylä) patologian nykytilanne, jossa nestebiopsia on osa käytössä olevaa dynaamista biomarkkerianalytiikkaa

P a t o l o g i a BIOMARKKEREIDEN DYNAAMINEN MONITOROINTI Molecular profiling Individual mutations, hot spot mutation panels, exsome analysis, immunohistochemistry, RT- PCR, Pyro, NGS, dd-pcr Analysis of immunoresponse TIL, CD3, CD8, immunoscore PD-L1 Mutation status Individualized testing of drug susceptibility Morphology macro, micro Diagnosis Liquid biopsy Ex vivo tumor cells Suspension 2D, 3D Tumour cells and tissue Primary, Metastatic fixed, fresh Plasma and other liquids Cell free DNA, circulating tumour cells, mirna, exosomes ect. BIOBANKING

Vaikka nesteestä puhuttiin, OLIKO KUIVA ESITYS?

K I I T O S