LC-MS JA MASSASPEKTROMETRIAN MONET KÄYTTÖTARKOITUKSET KLIINISESSÄ KEMIASSA Outi Itkonen Sairaalakemisti, dos. HUSLAB 11.2.2016 O. Itkonen 1
LC-MS LC: nestekromatografia näytteen komponenttien erottaminen toisistaan kemiallisten ominaisuuksiensa perusteella kvantitatiivinen MS: massaspektrometria näytteen komponenttien erottaminen toisistaan massa/varaus suhteen (m/z) perusteella kvantitatiivinen spesifisyys ja herkkyys 2
KROMATOGRAFIA molekyylien erottaminen toisistaan partition perusteella, eli miten ne jakautuvat kahden eri faasin välillä jakautuminen on tasapainotila, dynaaminen prosessi liikkuva faasi on nestettä nestekromatografia (LC) www.waters.com 3
MASSASPEKTROMETRI mittaa ionien massa/varaus (m/z) suhdetta kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen CoQ10 IS 4
IONILÄHDE ionisoi näytteen ESI, APCI, APPI, MALDI... 5
MASSA-ANALYSAATTORI kvadrupoli (Q), lentoaika-analysaattori (TOF), orbiloukku tandemmassaspektrometri (QQQ), hybridims (QTOF, ) Skimmer Q0 Q1 Q2 Q3 LIT Orifice LINAC TM Exit Lens Curtain Plate collision cell 6
DETEKTORI elektronimonistin fotodetektori 7
8
MRM, SRM Q1 q2 Q3 CEM 9
LC-MS SOVELLUTUKSIA KLIINISESSÄ KEMIASSA 10
MITÄ MITATAAN? steroidihormoneja lääkeaineita biogeenisiä amiineja vitamiineja peptidejä 11
MITEN MITATAAN? kaupallisia kittejä in-house menetelmiä 12
MITEN MAAILMALLA? 13
SIROLIMUUSI veren sekoitus ja annostelu + ISTD + saostus sentrifugointi supernatantin injisointi 12 s. välein C18 cartidge 96 kaivoa - 20 min vastaukset valmiina klo 13 500-1000 näytettä / pv 14
MONIAJO 4-plexing 15
4-PLEXING Printing Time: 10:11:09 PM Printing Date: Tuesday, May 18, 2010 XIC of +MRM (2 pairs): 698.0/354.0 Da ID: hepcidin from Sample 23 (31) o... Max. 2.7e4 cps. 3.8e4 3.5e4 3.0e4 6.15 2.5e4 Printing Time: 10:11:09 PM Printing Date: Tuesday, May 18, 2010 2.0e4 XIC of +MRM (2 pairs): 698.0/354.0 Da ID: hepcidin from Sample 23 (31) o... Max. 2.7e4 cps. 1.5e4 3.8e4 3.5e4 1.0e4 3.0e4 5000.0 6.15 2.5e4 Printing Time: 10:11:09 PM 0.0 Printing Date: Tuesday, May 18, 2010 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 2.0e4XIC of +MRM (2 pairs): 698.0/354.0 Da ID: hepcidin Time, minfrom Sample 23 (31) o... Max. 2.7e4 cps. 3.8e4 1.5e4 3.5e4 *Installation 1.0e4 3.0e4 5000.0 2.5e4 0.0 2.0e4 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Time, Printing min 10:11:09 Time: PM 6.15 Printing Date: Tuesday, May 18, 2010 3.8e4 1.0e4 3.5e4 5000.0 3.0e4 0.0 2.5e4 *Installation 1.5e4XIC of +MRM (2 pairs): 698.0/354.0 Da ID: hepcidin from Sample 23 (31) o... 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Time, min 6.15 Max. 2.7e4 cps. 10 min 2.0e4 *Installation 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Time, min esim. 10-15 levyä TESTO:ja per päivä *Installation 16 4 x 10 min
25-OH VITAMIN D2 JA D3 VIIDELLE KUOPPALEVYLLE: 16-kanavainen automaatilla 100 µl näytettä d6-25(oh)d3 ja d3-25(oh)d2 96-kanavainen automaatilla 100 µl asetonia 450 µl etyyliasetaatti orgaanisen faasin siirto uutto 4x TAD lisäys, 300 µl 20 min @ +37 ºC kuivatus N 2 (Turbovap) liuotus150 µl 50% MeOH-0.1% FA yhdistä eri TAD-johdokset = YKSI KUOPPALEVY 17
D-VITAMIN 20-PLEXING LOD <4.91 nmol/l for 25(OH)D 2 LOD <1.33 nmol/l for 25(OH)D 3 LOQ 10 nmol/l for 25(OH)D 2 LOQ 5 nmol/l for 25(OH)D 3 6-8 levyä päivässä yksi levy = 480 näytettä.siis >3500 näytettä päivässä! Netzel BC et al., Clin Chem 2011;57:431-440 18
MITEN MEILLÄ? 19
STEROIDIHORMONIT Näytteen esikäsittely Lisätään sisäistä standardia Neste-neste -uutto eetterillä tai dikloorimetaanilla Orgaanisen faasin haihdutus Jäännöksen liuotus LC-ajoliuokseen LC: käänteisfaasikromatografia ESI MRM 20
S -17HPROG 17HPROG ISTD Vakiosuora Potilasnäyte 21
STEROIDIHORMONIT du -Kors-V S -Estroni Sa -Korsol S -DHEA S -11-DOK S -Aldos S -17HProg du -Aldos S -17HPregnlo S Estdio du -THF/TFE S E1-sulfaatti S -Testo S -Adioni S -Pregnlo S -DHTesto S -Prog 22
BIOGEENISET AMIINIT Seeruminäyte ISTD kiintofaasiuutto LC-MS/MS S Metnor, Normet ja 3-MT S MOMA S Serotoniini S -5-HIAA 23
MUUTA B -syklosporiini A S hepsidiini S -D-25 S klotsapiini/norklotsapiini tuotekehityshankkeita moniajo 24
VARIANTTIEN TUNNISTUS S TATI wt, P55S, N34S näyte + ISTD immunocapture LC-MS mutation score = wttati/total TATI Mutation score 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 wt-tati N34S-TATI he N34S-TATI ho 25
- HERKKÄ, TARKKA, SPESIFINEN - SOPII MONILLE ANALYYTEILLE - PROSESSI PITKÄLLE AUTOMATISOITAVISSA - VAATII IN-HOUSE OSAAMISTA - MYÖS KAUPALLISIA SOVELLUTUKSIA 26
KIITOS! 27