1111111 111111111 11,111,111,,1111111L1111.111111 1

1111111 111111111 11,111,111,,1111111L1111.111111 1 1111111111111 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 112438 B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.12.2003 SUOMI - FINLAND (FI) (51) Kv.lk.7 - Int.k1.7 A61K 39/12, 39/395, CO7K 14/08, C12Q 1/70, C12N 15/51 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 941199 PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 14.03.1994 (24) Alkupäivä - Löpdag 11.09.1992 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 27.04.1994 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US92/07683 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 13.09.1991 US 759575 P (73) Haltija - Innehavare 1 Chiron Corporation, 4560 Horton Street, Emeryville, CA 94608, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Weiner,Amy J., 433 Greenbrier Court, Benicia, CA 94510, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Houghton,Michael, 53 Rosemead Court, Danville, CA 94526, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab Iso Roobertinkatu 4-6 A, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning DNA-molekyyli ja menetelmä hepatiitti C-viruksen vastaisten vasta-aineiden ilmaisemiseksi DNA-molekyl och förfarande för detektering av antikroppar mot hepatit typ C virus (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer EP 318216 A, EP 419182 A, EP 388232 A, WO 9014436 A, Virology, vol. 180, 1991, Weiner et al., "Variable and Hypervariable Domains Are Found in the Regions of HCV Corresponding to the Flavivirus Envelope and NS1 Proteins and the Pestivirus Envelope Glycoproteins". p. 842-848, Journal of Virology, vol. 65, nro 3, Mar 1991, Takamizawa et al., "Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated from Human Carriers". p. 1105-1113, Hepatology, vol. 14, nro 2, 1991, Houghton et al., "Molecular Biology of the Hepatitis C Viruses: Implications for Diagnosis, Development and Control of Viral Disease", p. 381-388, Journal of General Virology, vol. 71, 1990, Takeuchi et al., "The putative nucleocapsid and envelope protein genes of hepatitis C virus determined by comparison of the nucleotide sequences of two isolates derived from an experimentally infected chimpanzee and healthy human carriers", p. 3027-3033, Nucleic Acids Research, vol. 18, nro 15, 1990, Takeuchi et al., "Nucleotide sequence of core and envelope genes of the hepatitis C virus genome derived directly from human healthy carriers", p. 4626, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, vol. 88, March 1991, Choo et al., "Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus", p. 2451-2455, Molecular Immunology, vol. 27, nro 6, 1990, Neurath ja Strick, "Confronting the Hypervariability of an Immunodominant Epitope Eliciting Virus Neutralizing Antibodies from the Envelope Glycoprotein of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1)", p. 539-549 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Tämä keksintö koskee yleisesti immunoreaktiivisia polypeptidikoostumuksia, jotka sisältävät hepatiitti C -tyypin virusepitooppeja, menetelmiä koostumuksien käyttämiseksi immunologisissa sovellutuksissa, ja aineita ja menetelmiä koostumuksien valmistamiseksi. Uppfinningen avser i allmänhet immunoreaktiva polypeptidkompositioner, som innefattar hepatit typ C virusantigener, metoder för användning av kompositionerna i immunologiska tillämpningarna, och material och metoder för framställning av kompositionerna.

1 DNA-molekyyli ja menetelmä hepatiitti C -viruksen vastaisten vasta-aineiden ilmaisemiseksi Tämä keksintö koskee yleisesti menetelmää hepatiitti C- 5 viruksen vastaisten vasta-aineiden ilmaisemiseksi, jossa menetelmässä käytetään immunoreaktiivisia polypeptidikoostumuksia. Lisäksi keksintö koskee DNA-polynukleotidimolekyyliä, DNA-molekyyliä sisältävää isäntäsolua ja menetelmää yhdistelmäproteiinin tuottamiseksi, sekä pakkausta vasta- 10 aineiden ilmaisemiseksi useille HCV-kannoille. Hepatiitti C -virus on äskettäin identifioitu verensiirron jälkeen saadun ei-a, ei-b -hepatiitin (NANBH) tärkeimmäksi aiheuttajaksi samoin kuin yhteisöstä välittyvän NANBH:n mer- 15 kittäväksi aiheuttajaksi. Aineet ja menetelmät viruksen genomisten sekvenssien saamiseksi ovat tunnettuja. Lähemmin esim. PCT-julkaisut W089/04669, W090/11089 & W090/14436. HCV-genomin molekulaarinen karakterisointi osoittaa, että se 20 on positiivisesti polarisoitunut RNA-molekyyli, joka sisältää suunnilleen 10 000 nukleotidiä, joka koodittaa noin 3011 aminohappoa sisältävää polyproteiinia. Useat tekijät osoittavat, että HCV:llä on samanlainen geneettinen rakenne kuin Flaviviridae-ryhmän viruksilla, joita ovat flavi- ja pestivirukset. 25 Flavi- ja pestivirussukulaistensa tavoin HCV näyttää koodittavan suuren polyproteiinin esiastetta, josta yksittäiset virusproteiinit (sekä rakenteelliset että ei-rakenteelliset) prosessoidaan. 30 RNA-sisältöisillä viruksilla voi olla verrattain korkea spontaanimutaatioiden esiintymistiheys, so., tunnetusti suuruusluokkaa 10 3-10 4 sisällytettyä nukleotidiä kohti. Koska genotyypin heterogeenisyys ja mukautuvuus ovat tyypillisiä RNAviruksille, monenlaisia virusisolaatteja voi sen vuoksi olla 35 olemassa, jotka voivat olla virulentteja tai avirulentteja HCV-lajin sisällä.

2 Tällä hetkellä on identifioituna muutamia erilaisia HCV-isolaatteja. Näiden isolaattien sekvenssit osoittavat RNA-viruksille ominaisen heterogeenisyyden rajoittuneisuuden. 5 HCV J1.1 -isolaattia kuvaillaan julkaisuissa Kubo, Y. et al. (1989), Japan. Nucl. Acids Res. 17:10367-10372; Takeuchi, K. et al. (1990), Gene 91:287-291; Takeuchi et al. (1990), J. Gen. Virol. 71:3027-3033; Takeuchi et al. (1990), Nucl. Acids Res. 18:4626. 10 Kanden itsenäisen isolaatin, "HCV-J":n ja "BK":n, täydellisiä kooditussekvenssejä sekä 5'- ja 3'-terminaalisia sekvenssejä kuvailevat Kato et al. ja vastaavasti Takamizawa et al. (Kato et al. (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:9524-9528; Taka- 15 mizawa et al. (1991), J. Virol. 65:1105-1113). Muita HCV-eristyksiä kuvailevia julkaisuja ovat seuraavat; "HCV-1": Choo et al. (1990), Brit. Med. Bull. 46:423-441; 20 Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455; Han et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1711-1715; EP-patenttijulkaisu 318 216. "HC-Jl" ja "HC-J4": Okamoto et al. (1991), Japan J. Exp. Med. 25 60:167-177. "HCT 18", "HCT 23", "Th", "HCT 27", "EC1" ja "EC10": Weiner et al. (1991), Virol. 180:842-848. 30 "Pt-1", "HCV-K1" ja "HCV-K2": Enomoto et al., There are two major types of hepatitis C virus in Japan. Division of Gastroenterology, Department of Internal Medicine, Kanazawa Medical University, Japani. 35 Kloonit "A", "C", "D" & "E": Tsukiyama-Kohara et al., A second group of hepatitis virus, julkaisussa Virus Genes.

3 Tyypillinen lähestymistapa diagnostiikka- ja rokotustoimintamalliin keskittyy säilyneisiin virusdomeeneihin. Tälle lähestymistavalle on kuitenkin epäedullista variaabelidomeeneissa mandollisesti esiintyvien tärkeiden epitooppien huomiotta 5 jättäminen. Tässä keksinnössä hyödynnetään polypeptidikoostumuksia, jotka ovat immunologisesti ristireaktiivisia multippelien HCV-isolaattien kanssa, erityisesti viruksen heterogeenisten domee- 10 nien suhteen. On havaittu, että muutamat tärkeät HCV-epitoopit vaihtelevat virusisolaateilla, ja että nämä epitoopit voidaan kartoittaa tiettyihin domeeneihin. Tämä keksintö mandollistaa toiminta- 15 mallin immunologisesti ristireaktiivisten polypeptidikoostumuksien tuottamiseksi, joka keskittyy variaabeleihin (ennemmin kuin säilyneisiin) domeeneihin. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään immunoreaktiivis- 20 ta koostumusta, joka sisältää polypeptidejä, joille polypeptideille on tunnusomaista, että ne sisältävät epitoopin aminohapposekvenssin HCV:n ensimmäisen variaabelidomeenin alueella, ja koostumuksessa on läsnä vähintään kaksi heterogeenistä aminohapposekvenssiä erillisten HCV-isolaattien en- 25 simmäisestä variaabelidomeenista. Immunoreaktiivinen koostumus voi sisältää useita antigeenikoosteita, jolloin (a) kukin antigeenikooste käsittää useita olennaisesti identtisiä polypeptidejä, jotka sisältävät epi- 30 toopin aminohapposekvenssin HCV-isolaatin ensimmäisen variaabelidomeenin alueella, ja (b) yhden ryhmän sisältämän epitoopin aminohapposekvenssi on heterogeeninen suhteessa vähintään yhden toisen ryhmän analogisen sekvenssin aminohapposekvenssiin. 35 Immunoreaktiivinen koostumus voi sisältää useita polypeptidejä, kunkin polypeptidin ollessa oheisen kaavan mukaisia

4 L. Rr - (SVn)x-RI r' jossa kaavassa 5 R ja R' ovat noin 1-2000 aminohappoa sisältäviä aminohapposekvenssejä ja ovat samoja tai erilaisia; ja r'ovat 0 tai 1 ja ovat samoja tai erilaisia; 10 V on aminohapposekvenssi, jolla on HCV:n variaabelidomeenin sekvenssi, jolloin variaabelidomeeni sisältää vähintään yhden epitoopin; S on kokonaisluku > 1, tarkoittaen valikoitua variaabelido- 15 meenia; ja n on kokonaisluku > 1, tarkoittaen valikoitua HCV-isolaattia, joka on kyseisen SV:n osalta heterogeeninen suhteessa vähintään yhteen toiseen isolaattiin, jolla on eri arvo n:lle, n:n 20 ollessa itsenäisesti valittu kullekin x:lle; 25 2V 1. x on kokonaisluku > 1; ja sillä ehdolla, että aminohapposekvenssit ovat läsnä koostumuksessa yhdistelmänä, joka käsittää aminohapot (i) 1V1 ja 1V2, (ii) 1V1 ja 2V 2, ja (iii) 1V 1 ja 30 Keksintö koskee menetelmää biologisen näytteen sisältämien vasta-aineiden ilmaisemiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että: (a) aikaansaadaan biologinen näyte, jonka epäillään sisältävän HCV-vasta-aineita; 35 (b) tuotetaan edellä määritelty immunoreaktiivinen koostumus; (c) annetaan (a)-kohdan biologisen näytteen reagoida (b)-kohdassa mainitun immunoreaktiivisen koostumuksen kanssa olosuh-

5 1 1. - 5 "7 t - teissa, jotka mandollistavat antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostumisen; ja (d) ilmaistaan antigeeni-vasta-ainekompleksien muodostuminen, 5 jotka ovat muodostuneet kohdan (a) immunoreaktiivisen koostumuksen ja (b)-kohdan biologisen näytteen mandollisesti sisältävien vasta-aineiden välillä. Keksintö koskee toisessa suoritusmuodossaan määrityspakkausta 10 biologisen näytteen sisältämien HCV-vasta-aineiden ilmaisemiseksi, joka pakkaus sisältää edellä määritellyn immunoreaktiivisen koostumuksen pakattuna sopivaan astiaan. Kuviossa 1 esitetään kaavamaisesti HCV-genomin geneettinen 15 rakenne. Kuviossa 2 vertaillaan I-ryhmän ja II-ryhmän HCV-isolaattien koodittaman El-proteiinin johdetut aminohapposekvenssit. 20 Kuviossa 3 vertaillaan aminohapposekvenssejä HCV-isolaattien oletetusta E2/NS1-alueesta. Kuvio 4 esittää graafisesti antigeenisyysprofiilit oletetun HCV E2/NS1-proteiinin (aminohapot 384-420) aminoterminaali- 25 selle alueelle ja HIV-1:n gp120 V3 hypervariaabelille alueelle. Kuvio 5 esittää graafisesti sarjan, jossa esitetään todennäköisyysprosentit, joissa esitetty tähde HCV E2/NS1-proteiinin 30 (aminohapot 384-420) aminoterminaaliselta alueelta esiintyy sekundäärirakennemotiivissa joko alfa-heliksi-, beeta-levytai beeta-kierremuodossa. Kuvio 6 käsittää pylväsdiagrammeja, jotka esittävät vasta- 35 aineiden reaktiivisuuksia HCV-18-plasmassa (paneelit A-C) ja Th-plasmassa (paneelit D-F) toisiaan peittävien biotinyloitujen 8-meeristen peptidien ollessa peräisin aminohapoista 384-

6,~) ""->r 415 tai 416 HCV-isolaateista HCT-18 (A,D), Th (B,E) ja vastaavasti HCV-J1 (C,F). Kuvio 7 esittää johdetut aminohapposekvenssit E2/NS1-polypep- 5 tidin kandelta alueelta, aminohapot 384-414 ja 547-647, esitettynä Ql- ja Q3-isolaateille. Kuvio 8A esittää HCV-J1.1 ja HCV-J1.2-isolaattien johdetut aminohapposekvenssit aminohapoista 384-647. Kuvio 8B esittää 10 HCT27- ja HCVE1-isolaattien johdetut aminohapposekvenssit aminohapoista 384-651. Kuvio 9 esittää HCV-1-isolaatin koko polyproteiinisekvenssin. 15 Tämän keksinnön mukaisesti käytetään, ellei toisin ole ilmoitettu, tavanomaisia molekyylibiologian, mikrobiologian, yhdistelmä-dna-tekniikan ja immunologian menetelmiä, jotka ovat tekniikan tason mukaisia. Kyseiset menetelmät on täysin selvitetty kirjallisuudessa. Lähemmin esim., Maniatis, Fitsch & 20 Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2. painos 1989); DNA Cloning, volyymit I ja II (D.N. Glover edit. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait edit., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins edit. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Hig- 25 gins edit. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney edit. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); sarja, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos edit. 30 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology vol. 154 ja 155 (Wu ja Grossman, ja vastaavasti Wu, edit.), Mayer ja Walker, edit. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, toinen 35 painos (Springer-Verlag, N.Y.), ja Handbook of Experimental Immunology, volyymit I-IV (D.M. Weir ja C.C. Blackwell edit. 1986); Immunoassay: A Practical Guide (D.W. Chan edit. 1987). Kaikki tässä yhteydessä sekä edellä että jäljempänä mainitut

7, patentit, patenttihakemukset ja julkaisut ovat tässä sisällytettyinä viitteenä. HCV on uusi jäsen Flaviviridae-heimossa, joka sisältää pesti- 5 virukset (sian koleravirus ja naudan virusperäinen ripulivirus) ja flavivirukset, joista esimerkkejä ovat dengue- ja keltakuumevirukset. Kaavio HCV:n geneettisestä rakenteesta esitetään kuviossa 1. Flavi- ja pestivirusten tavoin HCV näyttää koodittavan emäksistä polypeptididomeenia ("C") vi- 10 ruksen polyproteiinin N-päässä, jota seuraavat kaksi glykoproteiinidomeenia ("El", "E2/NS1"), ei-rakenteellisten geenien NS2-NS5 yläpuolella. Taulukossa 1 on esitetty oletettujen proteiinidomeenien aminohappopaikat. 15 Taulukko 1. Oletetut proteiinidomeenit HCV:ssä ah.-koordinaatit (likim.) Proteiini 1-191 192-383 El 384-750 E2/NS1 20 751-1006 NS2 1007-1488 NS3 1489-1959 NS4 1960-3011 NS5 25 Kuten edellä on käsitelty, joitakin HCV-isolaatteja on identifioitu. Kokonaisten ja osittaisten HCV-sekvenssien vertaileva sekvenssianalyysi osoittaa, että homologian perusteella nukleotidi- ja aminohappotasoilla HCV-isolaatit voidaan laajalti jakaa vähintään kolmeen pääryhmään (taulukko 2). Hough- 30 ton et al., (1991) Hepatology 14:381-388. Vain osasekvenssi kuitenkin on saatavissa III-ryhmän isolaateille. Sen vuoksi, koska näiden isolaattien sekvenssit ovat enemmän määriteltyjä, yksi tai useampi näistä isolaateista saatetaan erottaa eri ryhmään, sisältäen mandollisen neljännen ryhmän. Taulu- 35 kossa 3 esitetään sekvenssihomologiat eri HCV-isolaattien yksittäisten virusproteiinien välillä johdettuna niiden nukleotidisekvensseistä. Voidaan havaita, että saman virusryhmän proteiineilla on suurempi sekvenssiyhtäläisyys kuin eri vi-

8» 7 rusryhmien koodittamilla samoilla proteiineilla (taulukko 3). Yksi poikkeus tähän on nukleokapsidiproteiini, joka on hyvin säilynyt kaikissa I- ja II-ryhmän virusisolaattisekvensseissä tähän mennessä. (Taulukossa 3 symboli N/A tarkoittaa, että 5 sekvenssit eivät olleet saatavissa vertailua varten). Siitä johtuen tämän keksinnön mukaisia tarkoituksia varten I-ryhmän isolaatit voidaan määritellä isolaateiksi, joiden virusproteiinit, erityisesti El- ja E2/NS1-proteiinit, ovat noin 90 96:isesti tai enemmän homologiset aminohappotasolla niiden 10 isolaattien suhteen, jotka tässä yhteydessä luokitellaan I- ryhmään. Ryhmä II määritellään vastaavalla tavalla. Tulevat ryhmät voidaan määritellä samalla tavalla virusproteiinihomologian avulla prototyyppi-isolaatin suhteen. Alaryhmät voidaan myös määritellä homologian avulla rajoitettuihin prote- 15 iineihin nähden kuten El-, E2/NS1- tai NS2-proteiineihin, tai yksinkertaisesti korkeampien homologiatasojen avulla. Taulukko 2. Hepatiitti C -virusgenomin RNA-sekvenssien luokittelu kolmeen pääryhmään. 20 HCV I HCV II HCV III HCV-1 HCV-J1.1 Kloonit A,C,D&E HC-Jl HC-J4 HCV-K2 (a&b) HCT 18 HCV-J HCT23 BK 25 Th HCV-K1 HCT 27 EC1 Pt-1

Taulukko 3. Aminohappohomologiat (%) eri HCV-isolaattien koodittamien virusproteiinien välillä HCV C El E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5 5 Ryhmä I verrattuna I 98-100 94-100 N/A N/A N/A N/A 99-100 II 97-98 77-79 78-81 75-77 91-92 90-93 84-88 III N/A N/A N/A N/A 86 76-80 71-74 10 II verrattuna II 98-100 92-100 89-100 93-100 94-100 97-100 95-100 III N/A N/A N/A N/A 84 76 74-75 15 III verrattuna III N/A N/A N/A N/A N/A 91-100 89-100

10 On merkille pantavaa, että oletetut virusvaippaproteiinit, joita El- ja E2/NS1-geenit koodittavat, vaihtelevat olennaisesti aminohapposekvenssien osalta ryhmien I ja II välillä. Vain NS2:n heterogeenisyysaste on korkeampi, kun taas C-, 5 NS3-, NS4 ja NS5-proteiineilla kaikilla sekvenssien ryhmienvälinen säilyminen on korkea. Ryhmien I ja II välillä havaittu, oletettujen virionivaippaproteiinien sekvenssivaihtelu kuvastaa kanden ryhmän välistä tunnusomaista aminohappojen jakautumista. Esimerkki tästä on esitetty kuviossa 2, jossa 10 El-geenituotteen sekvenssiä verrataan ryhmien I ja II virusten välillä. HCV-ryhmien I ja II nukleotidisekvensseistä johdetut E1-aminohapposekvenssit on esitetty. Kuviossa vaakasuorat viivat osoittavat sekvenssien identtisyyden HCV-1:n suhteen. Tähdet osoittavat aminohappojen ryhmäspesifisen ja- 15 kautumisen; ryhmäspesifiset tähteet voidaan selvästi tunnistaa. Ryhmä I:n sekvenssit ovat HCV-1, HCT18, HCT23, HCT27 ja HC-Jl. Ryhmä II:n sekvenssit ovat HC-J4, HCV-J, HCV J1.1 ja BK. Sellaista aminohappojen ryhmäspesifistä jakautumista esiintyy myös muissa geenituotteissa mukaanlukien E2/NS1-20 geenin koodittama gp72. Kuvio 3 esittää HCV-isolaattien oletetun E2/NS1-alueen vertailuaminohapposekvenssin, jotka aminohapot jakautuvat kuten ryhmät I ja II. Viimeksi mainittu proteiini sisältää myös N-terminaalisen, noin 30 aminohappoa sisältävän hypervariaabelin alueen ("HV"), jossa esiintyy 25 suurta vaihtelua lähes kaikkien isolaattien välillä. Weiner et al. (1991), edellä. Tämä alue sijaitsee aminohappovälillä 384-414, kun käytetään HCV-1:n aminohapponumerosysteemiä. HCV:n oletettu vaippaglykoproteiini E2/NS1 saattaa vastata 30 pestivirusten gp53(bvdv)/gp55 (sian koleravirus)-vaippapolypeptidiä ja flavivirusten NS1:tä, joista kumpikin antaa suojaavan immuniteetin näillä polypeptideillä rokotetuissa isännissä. 35 Huomiota herättävät yhtäläisyydet hypervariaabelialueen ("HV") ja HIV-1 gp120 V3-domeenien välillä, mitä tulee sekvenssivaihtelutasoon, aminohappomuutosten ennustavaan vaikutukseen oletettuun vasta-ainesitoutumiseen, määrätyn sekun-

1 1 däärirakenteen puuttumisen lisäksi, viittaavat siihen, että HV-domeeni koodittaa neutraloivia vasta-aineita. Domeenin immunogeenisyys on osoitettu vasta-aineen epitooppi- 5 kartoituskokeilla, joita on kuvailtu esimerkeissä. Tulokset näistä kokeista osoittavat, että kolmen HCV-pääryhmän lisäksi on olemassa myös HV-spesifisiä alaryhmiä. Biologisten näytteiden analysointi yksilöistä, joilla on 10 HCV:n aiheuttama NANBH, osoittaa, että yksilöt voivat kantaa kahta tai useampaa HCV-muunnosta samanaikaisesti. Kaksi samaan aikaan esiintyvää HV-muunnosta löydettiin yhden yksilön, J1, plasmasta. Sen lisäksi, kroonisen NANBH-potilaan geenin osittainen sekvensointi, jolla oli ajoittaisia hepatiittipuh- 15 keamia, osoitti, että henkilö Q oli infektoitunut kandella HCV-muunnoksella (Q1 tai Q3). Kumpikin muunnoksista liittyi vain yhteen tautijaksoon. ELISA-määritys, käytettäessä Q1- tai Q3-spesifistä peptidiä (aminohapot 396-407), osoitti, että Q sai aikaan vasta-ainevasteen Ql-peptidille mutta ei vas- 20 taavalle Q3-peptidille, mikä osoitti, että Q:n taudinuusiutuminen johtui HV-muunnoksen ilmaantumisesta. Vastaaineiden läsnäolo Ql-peptidille, mutta humoraalisen immuunivasteen puuttuminen Q3-peptidille toisen tautijakson aikana osoittaa, että muunnos HV-domeenissa voi johtua immuuniselek- 25 tiopaineesta. Aminohapot 396-407 näyttävät olevan alttiina suurimmalle selektiopaineelle HV-domeenissa. Nämä havainnot tukevat olettamusta, että tautiin liittyvät korkeat kroonisuustasot voisivat johtua riittämättömästä immunologisesta isäntävasteesta HCV-infektiolle ja/tai virusmekanismien im- 30 munologisesta muuntautumiskyvystä. Havainnot kohdistuvat lisäksi E2/NS1 HV -alueeseen geneettisenä alueena, joka liittyy viruksen välttömekanismiin (pakomekanismiin) ja/tai riittämättömään immuunivastemekanismiin (-mekanismeihin). 35 Kuten edellä on käsitelty, HCV-genomissa on useita muunnelmaalueita. Yksi tai useampi näistä alueista liittyy todennäköisimmin viruksen välttömekanismiin ja/tai riittämättömään immuunivastemekanismiin. Sen vuoksi on edullista sisällyttää

12 hoitokoostumuksiin HCV-polypeptidejä, jotka aiheuttaisivat immunogeenisen vasteen näille muunnelmille. Johtuen siitä, että genomin E1- ja E2/NS1-alueet koodittavat 5 oletettuja vaippatyypin polypeptidejä, nämä alueet olisivat erityisen kiinnostavia immunogeenisyyden kannalta. Nämä alueet ovat näin ollen niitä, joihin olisi erityisen edullista saada aikaan ja/tai lisätä immuunivastetta henkilön suojaamiseksi HCV-infektiota vastaan ja taudin kroonisen uusiu- 10 tumisen estämisen helpottamiseksi infektoituneilla henkilöillä. Nämä alueet olisivat lisäksi niitä, joista olisi edullista ilmaista HCV-muunnokset, jotka syntyvät infektion kuluessa samoin kuin super- tai yhteisinfektion kuluessa kandella tai useammalla muunnoksella. 15 Tässä keksinnössä kuvaillaan koostumuksia ja menetelmiä anti- HCV-vasta-aineiden läsnäolon ilmaisemiseksi biologisista näytteistä. Tämä viimeksi mainittu menetelmä on erityisen käyttökelpoinen identifioitaessa anti-hcv-vasta-aineita, joi- 20 ta on muodostunut vasteena immunologisesti erillisille HCVepitoopeille. Tätä menetelmää voidaan käyttää myös tutkittaessa useanlaisten HCV-muunnosten kehitystä infektoituneessa yksilössä. Keksintöä koskevassa pohdinnassa seuraavat määritelmät ovat käyttökelpoisia. 25 Ilmaus "polypeptidi" tarkoittaa aminohappopolymeeriä eikä viittaa tuotteen määrättyyn pituuteen; polypeptidimääritelmän piiriin luetaan siten peptidit, oligopeptidit ja proteiinit. Tämä ilmaus ei myöskään tarkoita polypeptidin ilmentymisen 30 jälkeisiä modifikaatioita eikä sulje niitä pois, esimerkiksi glykosylaatiot, asetylaatiot, fosforylaatiot ja vastaavat modifikaatiot. Määritelmä sisältää esimerkiksi polypeptidit, jotka sisältävät yhden tai useamman aminohappoanalogin (mukaan lukien esimerkiksi luonnossa esiintymättömät aminohapot 35 jne.), polypeptidit, joiden sidokset on korvattu, samoin kuin muut alalla tunnetut modifikaatiot, sekä luonnollisina esiintyvät että ei-luonnollisina esiintyvät.

13 i `- Tässä yhteydessä käytettynä A on "olennaisesti eristetty" B:stä, kun A:n paino on vähintään noin 70 %, edullisemmin vähintään noin 80 % ja edullisimmin vähintään noin 90 % A:n ja B:n yhteispainosta. Tässä keksinnössä käytetyt polypeptidi- 5 koostumukset ovat edullisesti olennaisesti vapaita ihmisen tai muun kädellisen kudoksesta (mukaan lukien veri, seerumi, soluhajote, soluorganellit, soluproteiinit jne) ja soluviljelyalustasta. 10 Tässä yhteydessä käytettynä ilmaus "yhdistelmäpolynukleotidi" tarkoittaa alkuperältään genomista, cdna:sta saatua, puolisynteettistä tai synteettistä polynukleotidiä, joka alkuperänsä tai manipuloinnin nojalla: (1) ei liity kokonaan tai osaksi polynukleotidiä, jonka kanssa se on liittynyt yhteen 15 luonnossa, (2) on liittynyt polynukleotidiin, joka on eri kuin mihin se on liittynyt luonnossa tai (3) ei esiinny luonnossa. "Polynukleotidillä" tarkoitetaan minkä tahansa pituista po- 20 lymeeristä nukleotidimuotoa, joko ribonukleotidejä tai deoksiribonukleotidejä. Tämä ilmaus tarkoittaa vain molekyylin primäärirakennetta. Tämä ilmaus sisältää siten kaksi- ja yksijuosteisen DNA:n ja RNA:n. Se sisältää myös tunnetut modifikaatiot, esimerkiksi alalla tunnetut leimat, metylaation, 25 "cap"-alueet, yhden tai useamman luonnossa esiintyvän nukleotidin korvaamisen analogilla, nukleotidien väliset modifikaatiot, kuten esimerkiksi modifikaatiot varauksettomien liitosten kanssa (esim., metyylifosfonaatit, fosfotriesterit, fosfoamidaatit, karbamaatit jne.) ja varauksellisten liitos- 30 ten kanssa (esim., fosforitioaatit, fosforiditioaatit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät sivuryhmäosia, kuten esimerkiksi proteiineja (mukaan lukien esim., nukleaasit, toksiinit, vasta-aineet, signaalipeptidit, poly-l-lysiini jne.), modifikaatiot väliin sijoitettujen aineiden kanssa (esim., 35 akridiini, psoraleeni jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät kelaatinmuodostajia (esim., metallit, radioaktiiviset metallit jne.), modifikaatiot, jotka sisältävät alkylaattoreita, modifikaatiot modifioitujen liitosten kanssa (esim., alfa-

14 anomeeriset nukleiinihapot jne.) samoin kuin polynukleotidin modifioimattomat muodot. "Yhdistelmäisäntäsolut", "isäntäsolut", "solut", "solulin- 5 jat", "soluviljelmät" ja muut sellaiset ilmaukset, jotka merkitsevät mikro-organismeja tai korkeampia eukaryoottisia solulinjoja viljeltyinä yksisolukokonaisuuksina, tarkoittavat soluja, joita voidaan tai joita on käytetty vastaanottajina yhdistelmävektorille tai muulle siirtopolynukleotidille, ja 10 käsittävät alkuperäisen transfektoidun solun jälkeläisiä. On ymmärrettävä, että yksittäisen lähtösolun jälkeläiset eivät välttämättä ole täysin identtiset morfologian ja genomisen DNA:n tai kokonais-dna:n osalta kuin alkuperäinen lähtösolu johtuen luonnollisesta, satunnaisesta tai tarkoituksellisesta 15 mutaatiosta. "Replikoni" on mikä tahansa geneettinen elementti, esim., plasmidi, kromosomi, virus, kosmidi yms., joka käyttäytyy itsenäisen yksikön tavoin polynukleotidireplikaatiossa solussa; 20 so., kykenee itseohjattuun repiikaatioon. "Vektori" on replikoni, joka sisältää lisäksi sekvenssejä, jotka saavat aikaan replikaation ja/tai avoimen lukukehyksen ilmentymisen. 25 "Säätelysekvenssi" tarkoittaa polynukleotidisekvenssejä, jotka ovat välttämättömiä kooditussekvenssien ilmentymisen toteuttamiselle, joihin ne on liitetty. Sellaisten säätelysekvenssien luonne on erilainen isäntäorganismista riip- 30 puen; prokaryooteilla sellaiset säätelysekvenssit käsittävät yleensä promoottorin, ribosomin sitoutumiskohdan ja terminaattorit; eukaryooteilla sellaiset säätelysekvenssit käsittävät yleensä promoottorit, terminaattorit ja joissakin tapauksissa tehostinsekvenssit. Ilmauksen "säätelysekvenssit" 35 on tarkoitettu sisältävän ainakin kaikki komponentit, joiden läsnäolo on välttämätön ilmentymiselle, ja siihen voi sisältyä myös lisäkomponentteja, joiden läsnäolo on edullista, esimerkiksi ohjaussekvenssejä, jotka huolehtivat erityksestä.

15 1 -I "Promoottorin on nukleotidisekvenssi, joka koostuu konsensussekvensseistä, jotka mandollistavat RNA-polymeraasin sitoutumisen DNA-templaattiin sellaisella tavalla, että mrna-syntee- 5 si alkaa normaalissa transkription aloituskohdassa viereisen rakennegeenin suhteen. "Toimivasti kytketty" viittaa vierekkäisyyteen, jolloin siten kuvaillut komponentit ovat yhteydessä toisiinsa, mikä mandol- 10 listaa niiden toiminnan tarkoituksenmukaisella tavalla. Kooditussekvenssiin "toimivasti kytketty" säätelysekvenssi liitetään siten, että kooditussekvenssin ilmentyminen saadaan aikaan olosuhteissa, jotka sopivat säätelysekvensseille. 15 "Avoin lukukehys" (ORF) on polynukleotidin alue, joka koodittaa polypeptidiä; tämä alue voi käsittää osan kooditussekvenssistä tai kokonaisen kooditussekvenssin. "Kooditussekvenssi" on polynukleotidisekvenssi, joka kopioi- 20 daan mrna:ksi ja/tai luetaan polypeptidiksi asetettaessa sopivien säätelysekvenssien ohjaukseen. Translaation aloituskodoni 5'-päässä ja translaation lopetuskodoni 3'-päässä määräävät kooditussekvenssin rajat. Kooditussekvenssi voi sisältää niihin rajoittumatta mrna-, DNA (mukaan lukien cdna-) ja 25 yhdistelmäpolynukleotidisekvenssit. Tässä yhteydessä "epitooppi" tai "antigeeninen determinantti" tarkoittavat immunoreaktiivista aminohapposekvenssiä. Epitooppi sisältää yleensä vähintään 3-5 aminohappoa ja tavalli- 30 simmin vähintään noin 8 tai jopa noin 10 aminohappoa. Tässä yhteydessä käytettynä määrätyn polypeptidin epitooppi tarkoittaa epitooppeja, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin määrätyllä polypeptidillä ja sen immunologisilla vastineilla. 35 "Antigeeni" on polypeptidi, joka sisältää yhden tai useamman epitoopin. "Immunogeeninen" tarkoittaa kykyä synnyttää solutason ja/tai

16 5 humoraalinen immuunivaste. Immuunivaste voidaan saada esille pelkästään immunoreaktiivisten polypeptidien avulla tai se saattaa edellyttää kantajan läsnäoloa adjuvanssin kanssa tai ilman. "Immunoreaktiivinen" tarkoittaa (1) kykyä sitoutua immunologisesti vasta-aineeseen ja/tai lymfosyytin antigeenireseptoriin tai (2) kykyä olla immunogeeninen. 10 "Vasta-aine" on mikä tahansa immunoglobuliini, mukaan lukien vasta-aineet ja niiden fragmentit, joka sitoo spesifisen epitoopin. Ilmaus käsittää muiden muassa polyklonaaliset, monoklonaaliset ja kimeeriset vasta-aineet. Esimerkkejä kimeerisistä vasta-aineista esitetään US-patenteissa 4 816 397 ja 4 15 816 567. "Antigeenikooste" määritellään koostumukseksi, joka sisältää useita olennaisesti identtisiä polypeptidejä, jolloin polypeptidit käsittävät yhden määrätyn epitoopin aminohapposek- 20 venssin. "Olennaisesti identtiset polypeptidit" tarkoittavat polypeptidejä, jotka ovat identtisiä lukuun ottamatta vaihtelua, joka rajoittuu tyypilliseen sekvenssialueeseen tai kokovaih- 25 teluun, johtuen polypeptidin tuotantomenetelmästä; esim., yhdistelmäilmentäminen, kemiallinen synteesi, kudosviljely jne. Tämä vaihtelu ei muuta olennaisesti identtisiä polypeptidejä sisältävän koostumuksen haluttua toiminnallista ominaisuutta; esim., koostumus käyttäytyy immunologisesti kuten identtisiä 30 polypeptidejä sisältävä koostumus. Vaihtelut voivat johtua esimerkiksi muutoksista, jotka johtuvat eritysprosessista polypeptidin kuljetuksen aikana, alle 100 %:n hyötysuhteesta kemiallisessa synteesissä jne. 35 Tässä yhteydessä käytettynä virusproteiinin "variaabelidomeeni" eli "VD" on domeeni, jossa esiintyy yhdenmukainen aminohappovaihtelu vähintään kanden HCV-isolaatin tai -alapopulaation välillä. Domeeni sisältää edullisesti vähintään yhden

17 epitoopin. Variaabelidomeenit voivat vaihdella isolaatista toiseen jopa vain yhden aminohappomuutoksen verran. Nämä isolaatit voivat olla samasta tai eri HCV-ryhmästä (-ryhmistä) tai -alaryhmästä (-alaryhmistä). Variaabelidomeeneja voidaan 5 helposti identifioida sekvenssikoostumuksen perusteella eri isolaattien kesken ja esimerkkejä näistä menetelmistä kuvaillaan jäljempänä. Tämän keksinnön kuvaamista varten variaabelidomeenit määritellään HCV-genomin koodittaman polyproteiinin aminohappojärjestysnumeron suhteen kuten kuviossa 9 on 10 esitetty, aloitusmetioniinin ollessa merkitty paikkanumerolla 1. Vastaava variaabelidomeeni toisessa HCV-isolaatissa määritetään asettamalla kanden isolaatin sekvenssit rinnakkain tavalla, joka saattaa säilyneet domeenit jonkin variaabelidomeenin ulkopuolelle maksimiasetuksessa. Tämä voidaan suorit- 15 taa millä tahansa muutamista tietokoneohjelmapaketeista kuten esim. ALIGN 1.0, jota on saatavissa the University of Virginia'lta, Biokemian osasto (Dr. William R. Pearson). Lähemmin Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448. Tulisi ymmärtää, että tietylle variaabelidomeenille 20 esitetyt aminohapponumerot ovat jonkin verran yksilöllisiä ja valinnaisia. Variaabelidomeenien alku ja loppu tulisi ymmärtää likimääräisiksi ja sisältämään toisiaan peittäviä domeeneja tai aladomeeneja, ellei toisin ole osoitettu. 25 Epitooppi on toisen epitoopin "immunologinen vastine" määrätyssä polypeptidissä, jos se ristireagoi vasta-aineiden kanssa, jotka sitoutuvat immunologisesti epitooppiin määrätyssä polypeptidissä. 30 Epitoopit on kartoitettu tyypillisesti sisältämään vähintään noin viisi aminohappoa, joskus vähintään noin 8 aminohappoa ja jopa noin 10 tai useampia aminohappoja. HCV-epitoopin sisältävä aminohapposekvenssi voidaan kytkeä 35 toiseen polypeptidiin (esim., kantajaproteiiniin) joko kovalenttisella kiinnityksellä tai ilmentämällä yhdistetty polynukleotidi, jolloin muodostuu fuusioproteiini. Haluttaessa voidaan liittää tai kiinnittää useita epitooppitoisintoja

18 ja/tai sisällyttää useita erilaisia epitooppeja. Kantajaproteiini voi olla peräisin mistä tahansa lähteestä mutta se on yleensä verrattain suurikokoinen immunogeeninen proteiini kuten BSA, KLH tai vastaava. Haluttaessa voidaan käyttää olen- 5 naisesti täyspitkää HCV-proteiinia kantajana, mikä lisää immunogeenisten epitooppien määrää. HCV-epitoopin aminohapposekvenssi voidaan vaihtoehtoisesti liittää aminopäästä ja/tai karboksipäästä ei-hcv-aminohapposekvenssiin, jolloin polypeptidi olisi siis "fuusiopolypeptidi". Vastaavantyyppisiä poly- 10 peptidejä voidaan konstruoida käyttämällä epitooppeja muista määrätyistä virusproteiineista. Määrätyn polypeptidin muunnos tarkoittaa polypeptidiä, jossa määrätyn polypeptidin aminohapposekvenssiä on muutettu yhden 15 tai useamman, sekvenssin sisältämän aminohapon deleetion, substituution, addition tai uudelleenjärjestelyn kautta. Alalla tunnetaan menetelmät, joilla muunnokset ilmaantuvat (esimerkiksi rekombinaation avulla) tai valmistetaan (esimerkiksi paikkakohdennetun mutatoinnin avulla). 20 "Transformaatiolla" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä ulkopuolisen polynukleotidin liittämistä isäntäsoluun, riippumatta liittämiseen käytetystä menetelmästä, esimerkiksi suora sisäänotto, transduktio (mukaan lukien virusinfektio), 25 f-pariutus tai elektroporaatio. Ulkopuolinen polynukleotidi voidaan säilyttää ei-integroituvana vektorina, esimerkiksi plasmidina, tai se voidaan vaihtoehtoisesti integroida isännän genomiin. 30 "Yksilö" tarkoittaa selkärankaista, erityisesti nisäkäsryhmän jäsentä, ja käsittää niihin rajoittumatta jyrsijät (esim., hiiret, rotat, hamsterit, marsut), kanit, vuohet, siat, nautakarjan, lampaat ja kädelliset (esim., simpanssit, Afrikan viherapinat, paviaanit, orangit ja ihmiset). 35 "Biologisella näytteellä" tarkoitetaan tässä yhteydessä käytettynä yksilöstä eristettyä kudos- tai nestenäytettä, mukaan lukien niihin rajoittumatta esimerkiksi plasma, seerumi, sel-

19 käydinneste, imuneste, ihon ulkopuoliset osat, hengitys-, suolisto- ja virtsa- ja sukupuolielinkanavat, kyyneleet, sylki, maito, verisolut, tuumorit, elimet, kudosleikkeet ja myös näytteet in vitro soluviljelyaineosista (mukaan lukien niihin 5 rajoittumatta solujen osittain käyttämä alusta, joka on tuloksena solujen kasvusta soluviljelyalustassa esim., Mab:tä tuottavat myeloomasolut, yhdistelmäsolut ja solukomponentit). Tässä keksinnössä käytettävät immunoreaktiiviset polypeptidi- 10 koostumukset sisältävät seoksen, joka sisältää isolaatti- tai ryhmäspesifisiä epitooppeja vähintään yhdestä HCV VD:stä. Läsnä on siten vähintään kaksi heterogeenistä aminohapposekvenssiä, joista kumpikin määrää erillisistä HCV-isolaateista löydetyn epitoopin samassa tai olennaisesti samassa fyysises- 15 sä paikassa HCV-proteiinissa; so. kumpikin sekvenssi kartoittuu samaan paikkaan HCV:n genomissa/polypeptidissä. Koska sekvenssit ovat heterogeenisiä, sijaintia nimitetään variaabelidomeeniksi (VD). 20 Keksinnön ymmärtämiseksi paremmin, ensin selvitetään yksittäiset aminohapposekvenssit, jotka muodostavat koostumukset. Sen jälkeen käsitellään useita sellaisia sekvenssejä, jotka tavataan tässä keksinnössä käytetyissä koostumuksissa. 25 Aminohapposekvenssi, joka on tunnusomainen tässä keksinnössä käytetyille polypeptideille on perusrakenteeltaan oheisen kaavan mukainen: (I) 30 jossa kaavassa Z tarkoittaa aminohapposekvenssiä valikoidun HCV-isolaatin proteiinialueelta, joka alue käsittää vähintään yhden variaabelidomeenin, ja variaabelidomeeni sisältää vähintään yhden epitoopin. L ja L' ovat ei-hcv-aminohapposek- 35 venssejä tai HCV:n aminohapposekvenssejä, jotka eivät sisällä variaabelidomeenia, ja jotka voivat olla samoja tai erilaisia. y ja y' ovat 0 tai 1 ja voivat olla samoja tai erilai-

20 1 sia. Kaava I edustaa aminohapposekvenssiä, joka sisältää HCV VD:n sekvenssin, jossa VD sisältää epitoopin. Kuten edellä on mainittu, epitooppi (epitoopit) Z:ssa sisäl- 5 tää tavallisesti vähintään noin 5 aminohappoa, tyypillisemmin vähintään noin 8 aminohappoa ja vielä tyypillisemmin vähintään noin 10 aminohappoa. Variaabelidomeeni Z voi sisältää enemmän kuin yhden epitoo- 10 pin. Variaabelidomeeni Z on vähintään yhtä suuri kuin läsnä olevien epitooppien yhdistetyt sekvenssit, mikä tekee siitä tyypillisesti vähintään noin 5 aminohappoisen, kun yksi epitooppi on läsnä. Koska epitoopit voivat peittää toisiaan, minimiaminohapposekvenssi yhdistetyille epitoopeille variaa- 15 belidomeenissa voi olla pienempi kuin yksittäisten epitooppisekvenssien summa. Z on HCV-isolaatin aminohapposekvenssi, joka sisältää edellä kuvaillun VD:n. Z:n minimikoko on siten VD:n minimikoko. Z 20 voi sisältää useamman aminohapposekvenssin kuin vain VD:n ja voi sisältää lisäksi enemmän kuin yhden VD:n. Z:n maksimikoko ei ole ratkaiseva mutta ilmeisesti se ei voi olla suurempi kuin koko HCV-polyproteiinin pituus. Z on kuitenkin tyypillisesti koko HCV-proteiinin sekvenssi (erityisesti Ei, E2/NS1, 25 NS2, NS3, NS4 ja NS5) tai jopa tyypillisemmin sellaisen HCVproteiinin fragmentti. Z:n koko on siten edullisesti alueella, joka käsittää vähintään noin 5 aminohappoa (edullisemmin noin 8 tai noin 10 aminohappoa vähintään) - enintään noin 1100 aminohappoa (edullisemmin enintään noin 500, edullisem- 30 min enintään noin 400 tai vielä edullisemmin enintään noin 200 aminohappoa). Kaavan I mukainen polypeptidi ja/tai Z, valmistettuna esim. kemiallisen synteesin avulla, käsittää tavallisemmin enintään noin 50 aminohappoa, tyypillisemmin enintään noin 40 aminohappoa ja vielä tyypillisemmin enintään 35 noin 30 aminohappoa. Ei-HCV-aminohapposekvenssit L ja L' voivat läsnäollessaan kä- sittää minkä tahansa joistakin sellaisista sekvenssityy-

21 11' peistä. L ja L' voivat olla esimerkiksi ei-hcv-sekvenssejä, joihin Z on sulautettu yhdistelmäilmentymisen helpottamiseksi (esim., beeta-galaktosidaasi, alfa-tekijä, TPA-ohjain jne.) kuten jäljempänä on esitetty. L ja L' voivat vaihtoehtoisesti 5 edustaa muiden patogeenien epitooppeja, kuten hepatiitti B - viruksen, Bordetella pertussiksen, tetanustoksoidin, difterian jne., jotta saadaan aikaan koostumuksia, jotka ovat immunoreaktiivisia joidenkin näiden muiden patogeenien suhteen. L ja L' voivat olla aminohapposekvenssejä, jotka helpottavat 10 kiinnittymistä kiinteisiin kantajiin peptidisynteesin aikana, immunomäärityskantajiin, rokotekantajaproteiineihin jne. L ja L' voivat itse asiassa sisältää jopa yhden tai useamman tarpeettoman aminohapon ilman toiminnallista hyötyä. L:lle ja L':11e ei ole olemassa ratkaisevaa maksimikokoa, pituuden 15 määräytyessä yleensä halutun toiminnon mukaan. L ja L' sisältävät kumpikin tyypillisesti enintään noin 2000 aminohappoa, tyypillisemmin enintään noin 1000 aminohappoa. Enemmistö L- ja L'-sekvensseistä, joissa on käyttökelpoisia ominaisuuksia, käsittää enintään noin 500 aminohappoa. On tietenkin edullis- 20 ta valita L ja L' niin, ettei Z:n immunoreaktiivisuus esty. Polypeptidikoostumukset sisältävät tyypillisesti (immunoreaktiivisuuteen riittävänä määränä) koostumuksessa vähintään kaksi seuraavissa kaavoissa II ja vastaavasti III määriteltä- 25 vää aminohapposekvenssiä: Ly - Z1-1J l y. (II) Ly-Z 2 -L y. 30 (III) joissa kaavoissa L, L', y ja y' ovat kuten edellä on määritelty sekä itsenäisesti määritellyt kummallekin kaavoista II ja III. ZI ja Z2 ovat kumpikin HCV-aminohapposekvenssejä kuten Z:lle on edellä määritelty ja sisältävät saman variaabe- 35 lidomeenin (so., fyysinen sijainti) mutta ovat peräisin eri HCV-isolaateista, joilla on yhteisessä Zi:n ja Z2:n variaabelidomeenissa vähintään yksi heterogeeninen epitooppi. Valaisevana esimerkkinä kaavan II mukainen aminohapposekvenssi

22 I L. voisi sisältää Z i :nä hypervariaabelidomeenifragmentin, joka kattaa aminohapot 384-414 HCV-1-isolaatista (tai erityisemmin 396-407 tai 396-408), kun taas Z2 on analoginen fragmentti HCV-J1.1.:stä. Nämä kaksi isolaattia ovat heterogeenisiä tä- 5 män domeenin suhteen, epitooppien aminohapposekvenssien vaihdellessa merkittävästi. Tulisi ymmärtää, että nämä koostumukset voivat sisältää enemmän kuin vain kaksi erillistä kaavan I mukaista aminohappose- 10 kvenssiä, ja että Z-sekvenssit voidaan jakaa ryhmiin, jotka käsittävät erilaisia variaabelidomeeneja. Tällainen koostumus voisi esimerkiksi sisältää HCV-sekvenssiryhmän (kaavan I mukaisilla aminohapposekvensseillä), joka sisältää hypervariaabelidomeenin aminohappojen 384-411 kohdalla isolaa- 15 teista HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HC-J4 jne. Koostumus voisi sisältää myös HCV-sekvenssilisäryhmän (kaavan I mukaisilla aminohapposekvensseillä), joka sisältää variaabelidomeenin aminohappojen 215-255 kohdalla, myös isolaateista HCV-1, HCV- J.1, HC-J1, HC-J4 jne. Koostumusten yhteydessä kaavan I mu- 20 kainen sekvenssi voidaan edelleen määritellä seuraavasti: SVn (IV) jossa kaavassa V tarkoittaa aminohapposekvenssiä, joka sisäl- 25 tää HCV:n variaabelidomeenin sekvenssin, jossa sekvenssissä variaabelidomeeni sisältää vähintään yhden epitoopin; so., kaavan I mukaisen. S ja n ovat kokonaislukuja 1 tai enemmän. S tarkoittaa erityistä variaabelidomeenia ja n tarkoittaa erityistä isolaattia. Esimerkiksi, S=1 voisi tarkoittaa va- 30 riaabelidomeenia aminohappojen 384-411 kohdalla; S=2 voisi tarkoittaa variaabelidomeenia aminohappojen 215-255 kohdalla; ja n=1, 2, 3 ja 4 voisi tarkoittaa isolaatteja HCV-1, HCV- J1.1, HC-Jl ja vastaavasti HC-J4. Kaksi edellä käsiteltyä ryhmää voisivat siten tarkoittaa: 35 Ryhmä 1: 1V1, 1V2, 1V3 Sc 1V 4 Ryhmä 2: 2V 1, 2V2, 2V3 & 2V 4

23 Koostumuksissa on vähintään kaksi kaavan IV mukaista erillistä sekvenssiä; so., koostumus sisältää kaksi erilaista kaavan IV mukaista sekvenssiä, joissa S:n ja n:n arvot ovat erilaiset. Esimerkiksi, ainakin 1\71 ja 1V 2 ovat läsnä tai ainakin 5 1\7 1 ja 2V2 ovat läsnä tai ainakin 1V 1 ja 2V1 ovat läsnä. Kaavan IV mukaiset erilliset sekvenssit ovat läsnä koostumuksessa joko samassa tai eri polypeptidimolekyyleissä. Käyttämällä minimiyhdistelmää 1V1 ja 1V2 valaisun vuoksi, nämä kaksi 10 sekvenssiä voisivat olla läsnä samassa polypeptidimolekyylissä (esim., 1V1-1V2) tai erillisissä molekyyleissä. Tätä koostumuspiirrettä voidaan kuvailla seuraavanlaisilla polypeptidikoostumuksilla: 15 (SVn)x - R I r' (V) jossa kaavassa S, V ja n ovat kuten edellä on määritelty; R ja R' ovat noin 1-2000 aminohappoa sisältäviä aminohapposekvenssejä ja ovat 20 samoja tai erilaisia; r ja r' ovat 0 tai 1 ja ovat samoja tai erilaisia; x on kokonaisluku > 1; n on itsenäisesti valittu kutakin x:ää varten; ja sillä ehdolla, että aminohapposekvenssit ovat läsnä koostumuksessa yhdistelmänä, joka käsittää aminohapot (i) 1\1 1 ja 1V2, (ii) 1V1 ja 2\72, ja (iii) 1V 1 ja 25 2v1. Suoritusmuodoissa, joissa kaavan IV mukaiset erilliset sekvenssit ovat eri polypeptideissä, x voi olla 1, vaikka se voi silti olla > 1 haluttaessa; esim., polypeptidiseos 1V1-1V2 ja 1V1-2V2. Kun x on 1, r ja r' ovat edullisesti kumpikin 0, jotta vältetään L y -ylimäärä ja L' y ylimäärä, koska V voidaan 30 kuvailla edullisessa kaavan I mukaisessa suoritusmuodossa. Kun x on > 1, R:n ja viereisen L:n, ja R':n ja viereisen L':n yhdistetyt pituudet eivät edullisesti ole suurempia kuin edellä L:lle ja L':lle kuvaillut maksimipituudet. 35 Koostumuksien sisältämiin erillisiin V-sekvensseihin sisältyvien HCV-aminohapposekvenssien valinta riippuu sekvenssien aiotusta käytöstä ja on tämän julkaisun valossa tekniikan tason mukaista. Ensiksi, tulee käsittää, että tämän keksinnön

24 1 kannalta merkitykselliset HCV-epitoopit voidaan jakaa kandeksi tyypiksi. Ensimmäinen epitooppityyppi käsittää ne, jotka ovat "ryhmäspesifisiä"; so., vastaavat epitoopit kaikissa tai olennaisesti kaikissa isolaateissa HCV-isolaattiryhmän sisäl- 5 lä ovat immunologisesti ristireaktiivisia toistensa kanssa, mutta eivät toisen ryhmän olennaisesti kaikkien isolaattien vastaavien epitooppien kanssa. Ryhmäspesifisen ryhmän epitoopit ovat edullisesti olennaisesti säilyneitä ryhmän sisällä mutta eivät ryhmien välillä tai joukossa. Toinen epitoop- 10 pityyppi käsittää ne, jotka "isolaattispesifisiä"; so., epitooppi on immunologisesti ristireaktiivinen olennaisesti identtisten isolaattien kanssa eikä ole ristireaktiivinen kaikkien tai olennaisesti kaikkien erillisten isolaattien kanssa. 15 Nämä ryhmä- ja isolaattispesifiset epitoopit voidaan helposti identifioida huomioon ottaen tämä julkaisu. Ensiksi, useiden HCV-isolaattien sekvenssejä verrataan kuten tässä yhteydessä on kuvailtu, ja sekvenssiheterogeenisyysalueet identifioi- 20 daan. Heterogeenisyysmalli tavallisesti osoittaa ryhmä- tai isolaattispesifisyyden. Jos identifioidun alueen tiedetään sisältävän yhden tai useamman epitoopin, sen jälkeen valitaan riittävänkokoinen sekvenssi sisältääkseen halutun epitoopin (epitoopit) variaabelidomeeniksi, joka voidaan sisällyttää 25 tässä keksinnössä käytettyihin koostumuksiin. Jos tietyn heterogeenisen alueen immunoreaktiivisuutta ei tunneta, eri HCV-isolaattien kyseiseltä alueelta tavattavia sekvenssejä vastaavia peptidejä voidaan valmistaa ja seuloa. Seulonta voi käsittää niihin rajoittumatta immunomääritykset erilaisilla 30 anti-hcv-vasta-ainelähteillä (esim., potilasseerumi, neutraloivat Mab:t jne.) tai vasta-aineen muodostamisen ja sellaisen vasta-aineen kyvyn testauksen neutraloida virus in vitro. Seulontatoiminnassa identifioidut epitooppilokukset, kuten jäljempänä on kuvailtu, voidaan vaihtoehtoisesti tutkia 35 heterogeenisyyden suhteen eri isolaateilla ja vastaavien heterogeenisten sekvenssien immunologiset ominaisuudet seuloa.

25 1 Rokotetarkoituksia varten otaksutaan, että variaabelidomeenit El- ja/tai E2/NS1-domeeneista ovat erityisen kiinnostavia. Varsinkin El-variaabelidomeeni aminohappovälillä 215-255 (kuvio 2) ja E2/NS1-variaabelidomeeni aminohappovälillä 384-414 5 (kuvio 3) on identifioitu tärkeiksi immunoreaktiivisiksi domeeneiksi. Alustavat tulokset viittaavat siihen, että toinen tai molemmat näistä domeeneista saattavat olla heterogeenisyyslokuksia, jotka vastaavat välttömutanteista, mikä johtaa kroonisiin HCV-infektioihin. Polypeptidikoostumukset, 10 joita edellä on kuvailtu, joissa variaabelidomeeni(t) V:ssä ovat toinen tai kumpikin näistä variaabelidomeeneista, ovat siten erityisen edullisia. Sen lisäksi, tässä kuvaillut polypeptidikoostumukset, vaikkakin erityisesti käsittävätkin yleensä lineaarisia epitooppeja variaabelidomeeneissa, voivat 15 sisältää myös konformationaalisia epitooppeja. Koostumus voi esimerkiksi sisältää seoksen, joka sisältää yhdistelmä-e1- ja/tai E2/NS1-proteiineja (joissa on eri isolaattien variaabelidomeenit), ilmennettynä yhdistelmäsysteemissä (esim., hyönteis- tai nisäkässolut), joka säilyttää kon- 20 formationaaliset epitoopit variaabelidomeenin joko sisäpuolella tai ulkopuolella. El- ja/tai E2/NS1-alayksikköantigeeni yhdestä isolaatista, joka säilyttää konformaationaaliset epitoopit, voidaan vaihtoehtoisesti yhdistää polypeptidikoostumukseen (esim., seos, joka sisältää synteettisiä 25 polypeptidejä tai denaturoituja yhdistelmäpolypeptidejä). Toisessa edullisessa rokotesovellutuksessa tässä kuvaillut polypeptidikoostumukset yhdistetään muiden HCV-alayksikköantigeenien kanssa kuten niiden kanssa, joita on kuvailtu yleisesti siirretyssä U.S.S.N. :ssä, otsikolla "Hepa- 30 titis C Virus Asialoglycoproteins" (toimeksiantonumero 0154.002), Robert 0. Ralston, Frank Marcus, Kent B. Thudium, Barbara Gervase ja John Hall, jätetty samana päivänä ja sisällytetty tässä viitteenä. 35 Diagnostista käyttöä varten voi olla käyttökelpoista käyttää tässä kuvailtuja koostumuksia antigeeneinä parantaen siten kykyä ilmaista vasta-aineet erillisille HCV-isolaateille. Polypeptidiseoksia voidaan tyypillisesti käyttää suoraan homo-

26 geenisessa tai heterogeenisessä immunomäärityskokoonpanossa, viimeksi mainitun käsittäessä edullisesti polypeptidin immobilisoinnin kiinteään substraattiin (esim., mikrotitrauslevyn kaivot, muovihelmet, nitroselluloosa jne.). Lähemmin esim., 5 PCT-julkaisu W090/11089; EPO-julkaisu 360 088; Immunoassay: A Practical Guide, edellä. Jokainen olennaisesti identtinen polypeptidi, joka muodostaa tällaisen polypeptidikoostumuksen voitaisiin vaihtoehtoisesti immobilisoida samaan kantajaan erillisissä lokuksissa, saaden siten informaatiota siitä, mi- 10 tä isolaattia tai ryhmää vastaan vasta-aine on muodostunut. Tämä voi olla erityisen tärkeää diagnostiikassa, jos useat erilaiset isolaatit aiheuttavat hepatiitin, syövän tai muita sairauksia, joilla on erilaiset kliiniset ennusteet. Edullinen kokoonpano on Chiron RIBA Tm -liuskaimmunomääritys- 15 kokoonpano, jota on kuvailtu yleisesti siirretyissä julkaisuissa U.S.S.N. 07/138 894 ja U.S.S.N. 07/456 637, jotka julkaisut ovat tässä sisällytettyinä viitteenä. Polypeptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia tässä kuvailtujen 20 koostumuksien valmistuksessa, voidaan valmistaa yhdistelmätekniikalla, synteettisesti tai kudosviljelmässä. Yhdistelmäpolypeptidit, jotka sisältävät typistettyjä HCV-sekvenssejä tai täyspitkiä HCV-proteiineja, voivat koostua kokonaan HCVsekvensseistä (yksi tai useampi epitooppi, joko vierekkäinen 25 tai ei-vierekkäinen) tai sekvensseistä fuusioproteiinissa. Fuusioproteiineissa käyttökelpoiset heterologiset sekvenssit sisältävät sekvenssejä, jotka huolehtivat erityksestä yhdistelmäisännästä, tehostavat HCV-epitoopin (-epitooppien) immunologista reaktiivisuutta tai helpottavat 30 polypeptidin kytkemistä kantajaan tai rokotekantajaan. Lähemmin esim., EPO-julkaisu 116 201; US-patentti 4 722 840; EPOjulkaisu 259 149; US-patentti 4 629 783, jotka julkaisut on tässä liitetty viitteinä. 35 Täyspitkiä polypeptidejä samoin kuin typistettyjä HCV-sekvenssejä sisältäviä polypeptidejä ja niiden mutantteja voidaan valmistaa kemiallisen synteesin avulla. Alalla tunnetaan menetelmät polypeptidien valmistamiseksi kemiallisella syn-

27 I,' -.7 (-1 ' teesillä. Niitä voidaan valmistaa myös yhdistelmätekniikan avulla. Tässä julkaisussa on kuvailtu ja/tai viitattu HCV- 1:tä koodittavaan DNA-sekvenssiin samoin kuin muista HCVisolaateista saatuihin variaabelialueiden DNA-sekvensseihin. 5 Näiden sekvenssien saatavuus mandollistaa polynukleotidien konstruoinnin, jotka koodittavat HCV-polypeptidien immunoreaktiivisia alueita. Polynukleotidejä, jotka koodittavat haluttua polypeptidiä, 10 joka käsittää yhden tai useamman immunoreaktiivisen HCVepitoopin HCV:n variaabelidomeenista, voidaan syntetisoida kemiallisesti tai eristää ja liittää ekspressiovektoriin. Vektorit voivat sisältää tai eivät ehkä sisällä fuusiosekvenssien osia kuten beeta-galaktosidaasin tai superoksididis- 15 mutaasin (SOD). Menetelmiä ja vektoreita, jotka ovat käyttökelpoisia tuotettaessa polypeptidejä, jotka sisältävät SOD:n fuusiosekvenssejä, kuvaillaan EP-patenttijulkaisussa 0196056, julkaistu 1. lokakuuta, 1986. 20 Haluttua polypeptidiä koodittava DNA, joko yhteensulautetussa muodossa tai valmiissa muodossa, ja joko sisältäen tai ei signaalisekvenssin erityksen mandollistamiseksi, voidaan liittää ekspressiovektoreihin, jotka sopivat mille tahansa sopivalle isännälle. Isännät transformoidaan sen jälkeen eks- 25 pressiovektorilla. Sekä eukaryoottisia että prokaryoottisia isäntäsysteemejä käytetään tällä hetkellä muodostettaessa yhdistelmäpolypeptidejä, ja tiivistelmä joistakin yleisemmistä säätelysysteemeistä ja isäntäsolulinjoista on esitetty jäljempänä. Isäntäsoluja inkuboidaan olosuhteissa, jotka mah- 30 dollistavat halutun polypeptidin ilmentymisen. Polypeptidi eristetään sen jälkeen hajotetuista soluista tai kasvualustasta ja puhdistetaan tasoon, joka tarvitaan sen aiottua käyttöä varten. 35 Alalla tunnetaan yleiset menetelmät, joita käytetään, kun uutetaan HCV-genomi viruksesta, valmistetaan ja tutkitaan DNAkirjastoja, sekvensoidaan klooneja, konstruoidaan ekspressiovektoreita, transformoidaan soluja, suoritetaan im-