27.01.2005 1 (6) Näytteiden tutkiminen elintarvike- ja talousvesivälitteisessä epidemiassa Kun kunnallinen viranomainen saa tiedon epäillystä elintarvike- tai talousvesiepidemiasta, kunnan ruokamyrkytysten selvitystyöryhmän tulee viivyttelemättä hankkia kaikki saatavilla olevat esitiedot, joiden perusteella arvioidaan tilanteen vakavuus ja päätetään tarvittavista toimenpiteistä. Kun näytteenotto käynnistetään välittömästi, ei menetetä arvokasta näytemateriaalia, eikä epidemian selvittely suotta hankaloidu. Tämä koskee niin sairastuneista ihmisistä kuin elintarvikkeista, vedestä ja ympäristöstä otettuja näytteitä. Myös elintarviketyöntekijöiden - sekä oireellisten että oireettomien - mahdollinen osuus epidemian lähteenä on selvitettävä. Koska alkuvaiheessa ei yleensä tiedetä epidemian laajuutta tai vakavuutta, tulee näytteenotto mieluummin ylimitoittaa kuin päinvastoin. Ripeys näytteenotossa on tärkeää; esimerkiksi verkostovesiepidemiassa usein käytetyn verkoston sokkikloorauksen jälkeen näytteiden otto on auttamattomasti myöhässä. Myös elintarvikkeista on näytteet otettava mahdollisimman nopeasti, ettei niitä ehditä heittää pois. Selvitystyön edistyessä pystytään arvioimaan, miten laajasti otettuja näytteitä tulee tutkia. Selvitystyöryhmän tulee etukäteen varmistua, että näytteet tutkivilla laboratorioilla on ruokamyrkytystutkimuksiin vaadittava valmius ja pätevyys. Kliinisiä näytteitä tutkivalla laboratoriolla tulee olla lääninhallituksen myöntämä toimilupa kyseisten tutkimusten suorittamiseen. Elintarvikelaboratorion on oltava elintarvikelain mukainen virallinen elintarviketutkimuslaitos. Tiedot elintarvikeviraston hyväksymistä virallisista elintarviketutkimuslaitoksista löytyvät osoitteesta www.finas.fi tai www.elintarvikevirasto.fi/valvonta. Kliinisten sekä elintarvike- ja talousvesivesitutkimuksia tekevien laboratorioiden kesken tulee olla toimiva yhteistyö tietojen ja tarvittaessa myös materiaalin vaihtoon. Yhteistyö on tärkeää koko epidemian selvitystyön ajan, jotta tarvittavat jatkotutkimukset voidaan käynnistää ajoissa. Genotyypitysmenetelmien, kuten PFGE (pulssikenttägeelielektroforeesi), avulla pystytään aikaisempaa varmemmin osoittamaan ruokamyrkytyksen aiheuttaja. EELAn bakteriologian tutkimusyksikkö ja KTLn suolistobakteriologian laboratorio ovat yhteistyössä luoneet tietyille patogeeneille, kuten Listeria monocytogenes ja Escherichia coli O157, tietokonepohjaisen genomikirjaston. Kirjaston avulla voidaan verrata epäillystä välittäjästä ja sairastuneista eristettyjen kantojen PFGEprofiileja tietokonevälitteisesti epidemioiden selvittämiseksi. Potilasnäytteiden tutkimukset vatsatautiepidemian selvittämiseksi - toimenpideohje Kansanterveyslaitos on antanut ohjeen potilasnäytteiden tutkimiseksi http://www.ktl.fi/attachments/suomi/julkaisut/ohjeet_ja_suositukset/vatsatautiepidemia.pdf Elintarviketyöntekijöiden tutkimukset Elintarviketyöntekijöiltä otettujen näytteiden (uloste-, käsi- ja/tai nenänäytteet) tutkimisella voidaan tarvittaessa selvittää työntekijöiden aiheuttamaa kontaminaatiota. Samoin tulee pitää mielessä, että elintarviketyöntekijä voi olla oireeton tai oireellinen tartunnankantaja. Työntekijöiden käsihygienia tutkimuksia voidaan tehdä esimerkiksi käyttämällä veriagaria tai erityisagaria kosketusagarina.
27.01.2005 2 (6) Elintarvikenäytteiden tutkimukset Yleistä Elintarvikenäytteet otetaan mahdollisimman pian sen jälkeen, kun paikallinen viranomainen on saanut tiedon epäillystä ruokamyrkytyksestä. Ruokamyrkytysepäilystä ilmoitetaan heti tutkivalle laboratoriolle, jotta siellä voidaan tehdä tarvittavat esivalmistelut. Jos laboratorio ei pysty tekemään kaikkia tarvittavia tutkimuksia, on sillä oltava valmius lähettää näytteitä viivytyksettä sellaiseen laboratorioon, jolla on niihin valmiudet. Elintarvikelaboratorioiden tutkimukset ovat maksullisia. Tutkimusten suunnittelussa on otettava huomioon epidemian laajuus ja vakavuus, potilaiden oireet, onko epäillyn elintarvikkeen laadulla valvonnallista merkitystä vai onko virhe tapahtunut kotitaloudessa. Epidemian selvittämisen kannalta on kuitenkin tärkeää, että näytteitä otetaan riittävän laajasti. Jos epidemian alussa epäillään esimerkiksi potilasnäytteen tuloksen perusteella tiettyä aiheuttajamikrobia, voidaan tutkimukset kohdistaa nimenomaan tähän mikrobiin. Elintarvikevälitteisten epidemioiden tutkimuksissa tuki- ja referenssilaboratoriona toimii Eläinlääkintä- ja elintarviketutkimuslaitos EELAn Bakteriologian tutkimusyksikkö/elintarvikemikrobiologia, merellisten biotoksiinien osalta Tullilaboratorio. Näytteenotto Elintarvikenäytteiksi otetaan valmiita, tarjoiltuja ruokia ja niiden raaka-aineita. Näytemäärän tulee olla vähintään 300 g. Ellei elintarviketta ole riittävästi jäljellä, otetaan niin suuri näytemäärä kuin mahdollista. Näytteet otetaan aseptisesti steriileihin näytteenottoastioihin. Näytetiedot kirjataan näytteenottotodistukseen. Jos näyte ei ole samaa valmistuserää kuin ruokamyrkytyksen aiheuttajaksi epäilty elintarvike, tieto kirjataan ylös. Jos näytettä on riittävästi, on suositeltavaa jakaa se kahteen osaan, joista toinen säilytetään mahdollista uusintatutkimusta varten. Raaka-ainenäytteitä voidaan käyttää epäillyn ruuan valmistuksen simulointiin. Kuljetuksen aikana näytteet on säilytettävä alhaisessa lämpötilassa (+4 - +8 o C), esimerkiksi kylmävaraajilla varustetuissa kylmälaukuissa. Pakasteet eivät saa sulaa kuljetuksen aikana. Tarvittaessa otetaan puhtausnäytteitä elintarvikehuoneiston hygieenisen tason ja mahdollisen ristikontaminaation toteamiseksi. Näytteitä voidaan ottaa pinnoista, välineistä, laitteista ja sisäilmasta. Tarpeen vaatiessa näistä näytteistä voidaan tutkia myös patogeenisia bakteereita. Useimmiten on syytä ottaa myös talousvesinäyte. Ruokamyrkytyksen perustutkimus Perustutkimus sisältää sekä patogeenisten, tautia aiheuttavien bakteerien että hygieniaindikaattorien tutkimuksen. Näytteestä pyritään arvioimaan sen hygieeninen laatu. Lisäksi arvioidaan, onko patogeenisilla bakteereilla mahdollisuus lisääntyä tutkittavana olevassa elintarvikkeessa. 1. Hygieniaindikaattoritutkimus aerobiset mikrobit Escherichia coli tai Enterobacteriaceae / koliformiset bakteerit
27.01.2005 3 (6) ph vesiaktiivisuus (a w ) tarpeen mukaan Näytteen viljely pesäkelaskenta-agarin lisäksi veriagarille (aerobinen ja anaerobinen inkubointi 37 C) on suositeltavaa. 2. Patogeeniset bakteerit Bacillus cereus ja muut basillukset Campylobacter jejuni/coli Clostridium perfringens Listeria monocytogenes, kvalitatiivinen (ja kvantitatiivinen tarvittaessa) salmonellat Staphylococcus aureus Yersinia enterocolitica Muista basilluksista esim. Bacillus licheniformiksen, Bacillus subtiliksen ja Bacillus pumiluksen on raportoitu aiheuttaneen ruokamyrkytyksiä. Siksi yleismaljoja (pesäkelaskenta-agar ja veriagar aerobisesti/anaerobisesti 37 C) tulee tarkastella ottaen huomioon myös muiden basillusten mahdollinen esiintyminen. Monet toksiset basilluslajit kasvavat 55 C lämpötilassa eli ovat termofiilisiä. Siksi erityisesti ruokamyrkytysepäilyssä suositellaan viljeltäväksi lisäksi veriagarmaljat, jotka kasvatetaan aerobisesti 55 C lämpötilassa. Kun ruokamyrkytyksen aiheuttajaksi epäillään B. cereus -bakteeria ja oireina esiintyy sekä oksentelua että ripulointia ja oireet alkavat 0,5-5 h kuluttua ruokailusta, ruoka saattaa sisältää sekä oksennus- että ripulityypin B. cereusta. Varsinkin tällöin on syytä eristää kumpaakin tyyppiä jatkotutkimuksia varten. Nämä kaksi tyyppiä voidaan erottaa naudanveriagarilla β-hemolyysin perusteella: oksennustyypin kantojen pesäkkeitä ympäröivä hemolyysivyöhyke on kapea (< 2 mm), ripulityypin leveä (4-5 mm). Ero on parhaiten nähtävissä, kun maljat luetaan 20 h kuluttua inkuboinnista. Polymyksiin-B-sulfaatin(8,0 mg/l) ja litiumkloridin (5,0 g/l) lisääminen naudanverialustaan estää oksennustyypin pesäkkeitä ympäröivän kapean hemolyysivyöhykkeen kasvamisen jatkettaessa inkubointia yli 20 h. Ripulityypin pesäkkeiden hemolyysivyöhyke sen sijaan kasvaa ja muuttuu kaksoishemolyysiksi. Tutkimuksen laajentaminen Kunnana ruokamyrkytysten selvitystyöryhmä voi laajentaa tutkimusvalikkoa oireiden, potilasnäytteistä saatujen tulosten, elintarvikkeen luonteen tai muun erityisen syyn perusteella seuraavasti: enterohemorraginen E. coli O157 (EHEC) shigellat Yersinia pseudotuberculosis patogeeniset vibriot Clostridium botulinum, toksiinimääritys Aeromonas, Plesiomonas Streptococcus zooepidemicus biogeeniset amiinit, mm. histamiini ja tyramiini simpukkamyrkyt (DSP, PSP, ASP), muut kemikaalit ja toksiinit
27.01.2005 4 (6) virus (norovirus eli entinen NLV ja hepatiitti A) alkueläin: Giardia, Cyclospora, Cryptosporidium, ameba Norovirusten toteaminen on mahdollista simpukoista ja pakastemarjoista. Hepatiitti A pystytään toteamaan ostereista. Epäiltäessä noroviruksen aiheuttaneen epidemian tulee simpukkanäytteet lähettää tutkittavaksi EELAn bakteriologian tutkimusyksikköön. Pakastemarjoista noroviruksia tutkitaan Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan elintarvike- ja ympäristöhygienian laitoksella (puh. 09-1915 7143). Mikäli taudinaiheuttajan epäillään olevan jokin muu kuin edellä mainittu, tutkitaan elintarvikkeesta epäilty aiheuttaja, jos sen tutkimiseksi on olemassa analyysimenetelmä. Näytteiden ja eristettyjen bakteerikantojen säilytys Jäljelle jäänyt näyte on säilytettävä laboratoriossa mahdollisia lisä- ja jatkotutkimuksia varten. Kylmäsäilytystä vaativat elintarvikenäytteet jaetaan kahteen osaan, joista toinen pakastetaan ja toinen säilytetään 4-6 o C:ssa. Mikäli näytemäärä on liian pieni jaettavaksi, näyte säilytetään pilaantumisen estämiseksi pakastettuna (n. -20 o C). Myös elintarvikenäytteistä eristetyt, merkitseviksi löydöksiksi arvioidut bakteerikannat tulee tallettaa jatkotutkimuksia varten. Kannat tulee säilyttää pakastettuina tai lähettää mahdollisimman nopeasti jatkotutkimuksiin (katso 6.3 Ohje elintarvikkeista eristettyjen patogeenisten bakteerikantojen lähettämisestä EELAan). Stafylokokkienterotoksiinitutkimukseen lähetettävä ruokanäyte voidaan yleensä pakastaa. EELAn viimeaikaisissa tutkimuksissa on kuitenkin ilmennyt, että kalanäytteitä (raaka tai savustettu) ei tule pakastaa. Virustutkimukset voidaan tehdä tuoreesta tai pakastetusta elintarvikenäytteestä. Sulanutta, pakastettua tuotetta ei saa kuitenkaan pakastaa uudelleen virustutkimuksia varten. Jääkaapissa säilytetyt elintarvikkeet lähetetään virustutkimuksiin mieluiten jäähdytettyinä (4 o C). Näytteet, eristetyt bakteerikannat ja tarvittaessa primaarimaljat hävitetään vasta, kun kaikki epidemiaan liittyvät tutkimukset on saatu päätökseen ja on varmaa, että lisätutkimustarpeita ei enää ole. Kunnan ruokamyrkytysten selvitystyöryhmän tehtävä on päättää, milloin tutkimusmateriaalin saa hävittää, ja ilmoittaa tästä laboratoriolle. Jatkotutkimukset EELAssa EELA vastaanottaa keskeisiä ruokamyrkytysbakteereja ja tekee niille tarkempia jatkotutkimuksia kuten biokemiallisia tunnistuksia, toksiinitutkimuksia sekä sero- ja genotyypityksiä. Elintarvikelaboratorioita pyydetään lähettämään ruokamyrkytyksen aiheuttajaksi epäilemänsä bakteerit ja ruokanäytteet jatkotutkimuksiin EELAn bakteriologian tutkimusyksikköön/elintarvikemikrobiologia taulukon 1 mukaisesti. Laboratorion tulee neuvotella jatkotutkimustarpeesta kunnan ruokamyrkytysten selvitystyöryhmän kanssa.
27.01.2005 5 (6) Taulukko 1. Ruokamyrkytyksen aiheuttajaksi epäiltyjen bakteerien ja/tai ruokanäytteiden lähettäminen EELAan jatkotutkimuksiin. Bakteeri Puhdasviljelmä Epäilty ruoka 5 kpl Toksiinitutkimus /30-100g Kvantitatiivinen määritys /n.200g Bacillus cereus x x x (n. 50g) Termofiiliset basillukset x x x (n. 50g) C. perfringens x - - S. aureus x x - Termofiiliset kampylobakteerit x - x L. monocytogenes x - x EHEC x - x Patogeeniset vibriolajit x - x Y. enterocolitica ja x - x Y. pseudotuberculosis Shigellat x - x Salmonellat 1 - x 1 Tyypitys EELAn Kuopion tutkimusyksikössä salmonellaohjeistuksen mukaisesti. On tärkeää, että aiheuttajaksi epäillystä bakteerista eristetään primäärimaljalta jatkotutkimuksia varten useita puhdasviljelmiä, koska: kaikki selektiivisillä maljoilla tyypillisinä kasvavat, lasketut C. perfringens-, S. aureus- tai B. cereus- bakteerien tai termofiilisten basillusten pesäkkeet eivät välttämättä tuota enterotoksiineja, rikastamalla eristetyn bakteerilajin primäärimaljalla kasvavista pesäkkeistä vain osa saattaa olla patogeenisia, vaikka rikastamalla eristetyn bakteerilajin kaikki kannat olisivatkin patogeenisia, niin primäärimaljalla voi kasvaa tyypitysmenetelmillä toisistaan erotettavia kantoja, joista vain joku on epidemiatyyppiä. Kun ruokamyrkytyksen aiheuttajaksi epäillään S. aureus - tai B. cereus -bakteeria tai termofiilisiä basilluksia, on enterotoksiinitutkimuksiin lähetettävä bakteeriviljelmien lisäksi myös epäilty ruoka. Mikäli ruoan prosessointi tai käsittely on tuhonnut bakteerit, lähetetään vain ruokanäyte: enterotoksiinit ovat kestäviä ja voivat säilyä, vaikka bakteerit tuhoutuisivatkin. Jos potilasnäytteestä on eristetty non-o157 EHEC, lähetetään epäillystä ruoasta viljellystä E. coli O157 -rikastusliemestä viljelty primäärimalja EELAan toksiinigeenitutkimusta varten. Laboratorioiden toivotaan lähettävän EELAan kvantitatiivista tutkimusta varten ruokanäytteet, joista on eristetty aiheuttajaksi epäilty patogeeni rikastamalla. Tällöin on mahdollista hankkia tietoa annos-vasteesta eli siitä, mistä bakteerimäärästä syöjä on sairastunut. Bakteerilukumäärän määrittämisen lisäksi pitäisi tällöin selvittää myös nautittu elintarvikemäärä.
27.01.2005 6 (6) Talousvesinäytteiden tutkimukset Talousvesiepidemioissa koordinaatiovastuu kuuluu KTLn Kuopion yksikön ympäristöterveyden osastoryhmälle. Vettä tulee ottaa talteen heti epidemian alussa ennen epidemian hallitsemiseksi tarkoitettuja toimenpiteitä, kuten sokkikloorausta tai verkoston huuhtelua. Näytteenoton tulee heti alussa olla kattavaa siten, että näytteitä otetaan riittävästi raaka-, vesilaitos- ja verkostovedestä. Näytemäärän tulee olla myös niin riittävä, että siitä saadaan tehtyä tarvittavat analyysit. Näytteistä tutkitaan ulostesaastutusta osoittavat indikaattoribakteerit. Tosin indikaattoribakteereiden esiintymisen ei läheskään aina ole todettu korreloivan patogeenien esiintymisen kanssa. Tämä on käynyt ilmi mm. kampylobakteeri- ja norovirusepidemioissa. Patogeenisten bakteerien, kuten salmonella, kampylobakteeri, yersinia ja EHEC, tutkimiseen sovelletaan vastaavia elintarvikemenetelmiä. Kutakin analyysiä varten vettä suodatetaan useita litroja (mielellään vähintään 3 litraa). Mikäli vesi on vaikeasti suodatettavissa, voidaan suodatinkalvo vaihtaa useitakin kertoja suodatuksen aikana. Suodatinkalvo/kalvot siirretään vastaavassa elintarviketutkimusmenetelmässä käytettyyn esirikastus- tai rikastusliemeen. Tutkimusta jatketaan vastaavan elintarviketutkimusmenetelmän mukaisesti. Salmonellan osoittamiseen vedestä on olemassa oma standardimenetelmänsä (ISO 6340:1995). Vesinäytteet tutkitaan tarvittaessa myös virheellisen kemikaloinnin selvittämiseksi (esimerkiksi lipeän ylisyöttö). Vesinäytteistä saattaa myös olla tarvetta tutkia tiettyjä epäiltyjä kemikaaleja. Vesinäytteen säilyttämiseen soveltuu yleensä 4-6 o C. Kemiallista tutkimusta varten vesinäytteet voidaan kuitenkin pakastaa. Virustutkimusta varten vettä otetaan 2 litraa puhtaaseen astiaan. Näyte jäähdytetään heti (4 o C) ja toimitetaan jäähdytettynä FIRRST LIFE SCIENCE Oy:hyn Helsinkiin. Näytteen lähettämisestä on sovittava etukäteen puhelimitse (040-8384007). Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset Sekä elintarvikkeista, talousvedestä, ympäristöstä ja elintarviketyöntekijöistä, että potilaista otetuista näytteistä saatujen laboratoriotutkimusten tuloksia tulee verrata epidemiologisen tutkimuksen tuloksiin. Tulosten tarkastelua ja johtopäätöksiä tekevillä henkilöillä pitää olla riittävästi pätevyyttä sekä epidemiologisten että laboratoriotutkimusten osalta tulosten merkittävyyden ja tutkimusmenetelmien arvioimiseksi. Selvitysilmoituksen kohdassa johtopäätökset tulisi ottaa kantaa seuraaviin seikkoihin: oliko sairastumisten ja epäillyn/epäiltyjen elintarvikkeiden tai talousveden nauttimisen välillä osoitettavissa yhteys mikä oli välittäjä mikä oli aiheuttaja (mikro-organismi)