1111111 11111 1111 111111111111111111111111111111111111 F 10000B (B) (11)KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT C (45) Patentti myönnetty Patznt me1de1at 27 01 1997 (51) Kv.lk.6 - Int.c1.6 A 61K 39/09, C 12N 1/21 SUOIVII FINLAND (21) Patenttihakemus Patentansökning 883876 (F0 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 22.08.88 (24) Alkupäivä - Löpdag 22.08.88 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 25.02.89 Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Patent- och registerstyrelsen Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 15.10.96 24.08.87 US 088626 P (71+72) Hakijat ja keksijät - Sökande och uppfinnare 1. Beachey, Edwin H., 2909 Central Avenue, Memphis, TN 38111, USA, (US) 2. Poirier, Thomas P., 1542 Tutwiler Avenue, Memphis, TN 38107, USA, (US) 3. Kehoe, Michael A., 14 Springhouse Lane, Ebchester Co., Durham DH8 CQF, United Kingdom, (GB) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet Menetelmä rokotteen valmistamiseksi streptokokki-infektioita vastaan Förfarande för framställning av ett vaccin mot streptokock-infektioner (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer US A 4597967 (A 61K 39/00), WO A 85/00832 (C 12P 21/00), Nature vol. 292 (1981) nro 5822 p. 457-459 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee ei-virulentteja bakteereja, joihin on kloonattu heterologisia nukleotidisekvenssejä, joiden koodi muodostaa streptokokki M proteiinin antigeeneja, jotka aiheuttavat opsonisia vasta-aineita streptokokki-infektioita vastaan. Nämä bakteerit ovat hyödyllisiä rokotteina Streptococcus pyogenes-bakteereita vastaan. Keksintö koskee edelleen bakteereja sisältäviä terapeuttisia valmisteita, jotka tuottavat immuniteetin streptokokki-injektioita vastaan, immunisointimenetelmää, sekä streptokokki-mproteiiniantigeenin aminohapposekvenssiä ja sitä koodaavaa DNA sekvenssiä, joka sisältää virulentin bakteerin heterologisen DNA-sekvenssin. Uppfinningen avser icke-virulenta bakterier, in i vilka klonats heterologa nukleotidsekvenser, vilka kodar för experimering av streptokockiska m-proteinantigener, vilka förmår framkalla opsoniska antikroppar mot streptokockiska infektioner. Dessa bakterier är användbara som vaccin mot Streptococcus pyogenesbakterier. Uppfinningen avser vidare bakteriehaltiga, terapeutiska preparat, vilka ger immunitet mot streptokockiska infektioner, ett immuniseringsförfarande, och aminosyrasekvensen hos den streptokockiska M-proteinantigenen och en denna sekvens kodande DNA-sekvens, vilken innehåller den heterologa DNA-sekvensen hos den virulenta bakterien.
1 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi streptokokki-infektioita vastaan Tämä keksintö liittyy immunisaatioon streptokokki- 5 infektioita vastaan, tarkemmin A-ryhmän streptokokki-infektioita vastaan. Keksinnön kohteena on menetelmä rokotteen valmistamiseksi nisäkkään immunisoimiseksi streptokokki-infektioita vastaan aikaansaamalla opsonisten vastaaineiden muodostuksen streptokokki M-proteiiniantigeenia 10 vastaan saamatta aikaan vasta-aineita, jotka ovat ristiin reagoivia sydänkudoksen antigeenien kanssa. Keksinnöllä on laajoja tärkeitä vaikutuksia. Keksijän tietämän mukaan nyt tarjotaan ensimmäisen kerran biologinen elävä kantaja, joka sisältää virulentin baktee- 15 rin suojaavan antigeenin, joka pystyy immunisoimaan virulentin bakteerin aiheuttamia injektioita vastaan. Käsityksenä on, että tässä kuvattuja toteutustapoja voidaan soveltaa laajempaan käyttöön ja menetelmiin. Yli kuusikymmentä vuotta on etsitty turvallista ja 20 tehokasta rokotetta niitä A-ryhmän streptokokkeja vastaan, jotka aiheuttavat reumaattista sydänvikaa. Lancefield, "Current Knowledge of Type-Specific M Protein Antigens to Group A Streptococci", J. Immunol, Vol. 89, pp 307-313 (1962). Tiedetään, että harvoja bakteerilajeja on tutkittu 25 intensiivisemmin tällä vuosisadalla kuin Streptococcus pyogenes tai A-ryhmän streptokokkia. Kun varmuus kasvoi, että tämä organismi oli pääasiallinen ja sittemmin ainoa akuutin reumakuumeen aiheuttaja, tutkijat yrittivät määrätietoisesti selvittää bakteerin tuotetta, jonka myrkylli- 30 set tai antigeeniset komponentit aiheuttaisivat reumaprosessin. Kattava tutkimus reumakuumeesta ja streptokokkiinfektioista on julkaisussa Stollerman, Rheumatic Fever and Streptococcal Infektion (New York Clinical Cardiological Monographs, Grune and Stratton, 1975). Stollerman ku- 35 vaa M-proteiinin keskeistä roolia immuniteetissä A-ryhmän
2 streptokokkeja vastaan. Viittaamme myös julkaisuun Beachey and Seyer, "Primary Structure and Immunochemistry of Group A Streptococcal M Proteins", Seminars in Infectious Disease, Vol 4 pp 401-410 (toim. J. B. Robbins, J. C. Hill ja 5 J. C. Sadoff, julk. Georg Thieme verlag, New York & Stutt- gart 1982). Suurin osa rokotteenkehitysyrityksistä johti vakaviin myrkyllisiin reaktioihin millä tahansa streptokokkituotteella, jota annettiin ihmiselle. Joidenkin näistä 10 tuotteista on osoitettu aiheuttavan vasta-aineita jotka reagoivat kantajan kudosten, erityisesti sydämen, kanssa. Kaplan ja Meyersian, "An Immunological Cross-Reaction Between Group A Streptococcal Cells and Human Heart Tissue", Lancet, Vol i, pp 706-710 (1962); Zabriskie ja Freimer, 15 "An Immunological Relationship Between the Group A Streptococcus and Mammlian Muscle", J. Exp. Med, Vol. 124, pp 661-678 (1966). Vaikka onkin kauan sitten todistettu, että M-proteiini A-ryhmän Streptococcuksen pinnalla sisältää näiden organismien suojaavat antigeenit, on pelätty, että 20 eristetty M-proteiini liittyisi potentiaalisesti haitallisiin kudosten ristiinreaktiivisiin antigeeneihin, jotka aiheuttavat eivätkä estä reumakuumetta. Tätä pelkoa on lisännyt havainto, että tietyt reumaa aiheuttavat streptokokit tuottavat M-proteiineja, jotka ovat läheisesti yh- 25 teydessä sydämen ristiinreaktiiviseen antigeeniin. Kaplan, "Immunologic Relation of Certain Strains of Group A Streptococci Exhibiting an Immunologic Cross-Reaktioneith Human Heart Tissue," J. Immunol. Vol. 90, p 595 (1963). On todellakin äskettäin todistettu, että yksi M-proteiinimole- 30 kyyleistä sisältää kovalenttirakenteessaan epitoopin, joka aiheuttaa suojaavan anti-streptokokkivasta-aineen esiintymistä, joka myöskin ristiinreagoi ihmisen sydänkudoksen sarkolemmaproteiinin kanssa. Dale ja Beachey, "Protective Antigenic Determinant of Streptococcal M Protein Sharded 35 with Sarcolemmal Membrane Protein of Human Heart", J. Exp. Med., Vol. 156, pp 1165-1176 (1982).
3 US-patentti nro 4 284 537, E. Beachey, myönnetty 18.8.1981, kuvasi kanden tyyppi 24 M-proteiinista saadun peptidifragmentin aminohapposekvenssin. Siinä todettiin myös, että kumpikin näistä luonnon fragmenteista pystyi 5 kovalenttisesti sitoutuneena kantajaan kuten polylysiiniin aiheuttamaan tyyppispesifisiä opsonisia vastaaineita, jotka vaikuttivat Streptococcus pyogenesta vastaan. Kumpikin näistä fragmenteista oli luonnonuute ja kumpikin sisälsi 35 aminohappoa. 10 US-patentti nro 4 454 121, E. Beachey, myönnetty 12.6.1984, kuvasi synteettisen peptidin (S-CB7) ja siinä todettiin, että yksi suojaavista vaikuttajista sijaitsee tietyssä tyyppi 24 M-proteiinin S-CB7:n fragmentissa, joka sisältää ainoastaan 12 aminohappotähdettä [S-CB7 (18-29)]. 15 S-CB7, kuten on kuvattu, eroaa alkuperäisestä CB-7-fragmentista siinä, että S-CB7:n COOH-terminaalinen tähde on metioniini homoseriinin sijasta. Patenttijulkaisussa kuvataan myöskin S-CB7:n kovalenttisesti kytkeytyneitä konjugaatteja ja sopivia hapteenikantajia, luonnollisia kuten 20 BSA tai OVA tai synteettisiä kuten polylysiini. Lisää tämän työn yksityiskohtia on julkaistu Naturessa 30.7.1981, Beachey et al., 292, sivut 457-459. US-patentti nro 4 521 334, "Synthetic Polypeptide Fragments", Edwin H. Beachey, myönnetty 4.6.1985 kuvaa 25 kolmen peptidifragmentin CB3, CB4 ja CB5 aminohapposekvenssin sekä 35 ja 37 tyyppi 24 M aminohapposekvenssit, jotka sisältävät antigeenisia determinantteja jotka vastaavat CB3-CB7 sisältyviä antigeenisia determinantteja. US-patentti nro 4 597 967, "Synthetic Polypeptide Frag- 30 ments", Edwin H. Beachey, myönnetty 1.7.1986 kertoo, että nämä fragmentit sopivasti kytkettyinä kantajaan kuten polylysiiniin pystyvät aiheuttamaan tyyppispesifisiä opsonisia antigeeneja, jotka vaikuttavat Streptococcus pyogenesta vastaan.
4 Yllämainitut patentit kuvaavat pieniä peptidifragmentteja, jotka ovat immunogeenisiä ja auttavat kehittämään turvallisen ja tehokkaan rokotteen niitä streptokokki-infektioita vastaan, jotka aiheuttavat kuumeita ja reu- 5 maattista sydänvikaa. Lähestymistapa oli se, että hyvin pienet peptidit sallisivat jättaä pois suuren osan M-proteiinimolekyylistä ja siksi vähentäisivät vaaraa aiheut taa immunologisia ristiinreaktioita kantajan kudoksia vastaan. Katso esim. yllämainittu US-patentti nro 4 454 121 kappa- 10 Teet 1 ja 2. Lisäinformaation saamiseksi synteettisten Streptococcus pyogenes M-proteiinin peptidien aiheuttamasta tyyppispesifisestä suojaavasta immuniteetista katso Beachey et al., "Type Specific Protective Immunity Evoked by Synthe- 15 tic Peptide of Streptococcus pyrogenes M Protein Nature", Vol. 292, nro 5822, ss 457-459 (30.7.1981). Lisäkirjallisuutta aiheesta: katso Hasty et al., "Hybridomas Antibodies Againts Protective and Non-Protective Antigenic Determinants of a Structurally Defined Po- 20 lypeptide Fragment of Streptococcal M Protein", J. Exp. Med. Vol. 155, p 1010 (April 1982); and Hopp and Woods, "Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid Aequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, nro 6, pp 3824-28 (June 1981). 25 Näistä edistysaskelista huolimatta on vieläkin olemassa täyttämätön tarve suun kautta annettavasta rokotteesta, jossa olisi näitä ei-ristiinreaktiivisia immunogeenisia polypeptidejä. Tarjoamalla näitä peptidejä lievennetyn ei-virulentin rekombinantin bakteerin muodossa, 30 joka pystyy syntesoimaan niitä, tämä keksintö on uusi edistysaskel lääketieteessä erityisesti streptokokki-infektioiden hallinnassa. Tunnetaan useita M-proteiinien serotyyppejä, jotka on koodattu geeneihin, jotka ovat toistensa alleeleja. Ku- 35 kin serotyyppi vastaa eri S. pyogenes-kantaa ja nämä serotyypit eroavat vain aminoterminaalisekvenssiensä osalta.
5 Tämä keksintö liittyy yleisesti geeniteknologiseen lähestymistapaan streptokokki-m-proteiinin antigeenin tai antigeenifragmentin valmistamiseen, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita streptokokki-infektioita vas- 5 taan. Tarkemmin, keksintö tarjoaa menetelmän transformoidun ei-virulentin bakteerin valmistamiseksi, joka sisältää heterologisen nukleotidisekvenssin, johon nukleotidisekvenssiin on koodattu streptokokki-m-proteiinin anti- 10 geeni ja joka ekspressoi sitä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Tässä esitetään myös transformoitu ei-virulentti kantaja, jossa ekspressoitu streptokokki-m-proteiinin an- 15 tigeeni pystyy aiheuttamaan opsonisia antigeeneja streptokokki-infektiota vastaan. Eräs keksinnön tavoite on tarjota proteiiniantigeeni, joka tehoaa ei-virulentin bakteerin virulentteihin muotoihin. 20 Keksinnön spesifinen tavoite on tarjota transformoitu ei-virulentti Salmonella-suvun, erityisesti typhimurium-lajin bakteeri, joka sisältää plasmidin, johon on koodattu M-proteiinin geeni, tarkemmin tyyppi 5:n M-proteenin geeni. 25 Lisäksi keksinnön tavoite on tarjota streptokokki- M-proteiinin antigeeni, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita, jotka tuottavat systeemisen immuniteetin streptokokki-infektioita vastaan. Eräs tämän keksinnön tavoite on tarjota multiva- 30 lentti streptokokki-m-proteiinin antigeeni, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita useamman kuin yhden serotyypin M-streptokokkikantaa vastaan. Lisäksi keksinnön tavoite on tarjota streptokokki- M-proteiinin antigeeni, joka isännässä ilmetessään, eri- 35 tyisesti ei-virulentissa heterologisessa mikrobikantajas-
6 1 sa, johon streptokokki-m-proteiinin antigeenin geeni on kloonattu, on vaikuttava antigeeni, joka aiheuttaa immuniteettia eikä ole serologisesti ristiinreaktiivinen ihmisen kudosten, erityisesti sydämen, antigeenien kanssa. 5 Lisäksi tämän keksinnön tavoite on transformoitu isäntäbakteeri, erityisesti ei-virulentti enterobakteeri, joka huolimatta ei-virulenttisuudestaan aiheuttaa silti vasta-aineita. Tämän keksinnön tavoite on tarjota transformoitu ei-virulentti isäntäbakteeri, joka ei kolonisoidu 10 immunisoituvassa kohteessa vaan lisääntyy tarvittavassa rajoitetussa määrin vasta-aineiden aiheuttamiseksi. Keksinnön eräs tavoite on Salmonella typhimuriumin transformaatio. Lisäksi keksinnön tavoite on transformoitu ei-viru- 15 lentti isäntäbakteeri, johon on kloonattu toisen bakteerin heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodaa ja joka tuottaa proteiiniantigeenin, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita toista bakteeria vastaan. Lisäksi keksinnön tärkeä tavoite on tarjota nuk- 20 leotidisekvenssit geenille, joka koodaa ja joka ekspressoi toisen bakteerilajin antigeenit. Lisäksi keksinnön tavoite on tarjota erilaisia muita geeniteknologiatuotteita, jotka johtavat transformoituun ei-virulenttiin kantajaan. 25 Lisäksi keksinnön tavoite on kloonata isäntäbakteeriin nukleotidisekvenssit, joihin on koodattu immunogeeniset polypeptidit, jotka pystyvät aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita streptokokki-infektioita, erityisesti streptokokkiserotyyppejä 5, 6 ja 24, vastaan. 30 Lisäksi keksinnön tavoite on kloonata isäntäbaktee- riin nukleotidisenvenssit, joihin on koodattu E. colin pinta-antigeeni, joka aiheuttaa adhesiivinvastaisia vastaaineita. Lisäksi keksinnön tavoitteena ovat geenitekniikan 35 vaiheet, jotka johtavat ei-virulentin bakteerin valmista- miseen.
7 Lisäksi keksinnön tavoite on plasmidien ja muiden rakenteiden valmistus, joita tarvitaan kloonattaessa S. typhimurium-kantaan heterologinen nukleotidisekvenssi, joka tuottaa halutut streptokokki-m-proteiiniantigeenit. 5 Keksinnön tärkeä tavoite on tuottaa plasmideja, jotka stabiilisti ekspressoituvat Aro - S. typhimurium SL3261:ssa. Lisäksi esitetään nisäkkään, kuten ihmisen, immunisaatiomenetelmä, jossa mainitulle nisäkkäälle annetaan riittävänä annoksena muodostamaan opsonisia vasta-aineita 10 ja aiheuttamaan systeeminen immuniteetti streptokokki-infektioita vastaan ylläkuvattua transformoitua ei-virulenttia bakteeria, joka sisältää heterologisen nukleotidisekvenssin. Keksinnön tärkeä aspekti on tarjota rokote, joka 15 antaa immuniteettia streptokokkityyppisiä suullisia infektioita vastaan. Lisäksi keksinnön aspektina on tarjota ei-virulentti valmiste, jota kohde, jolle valmistetta annetaan, kestää hyvin. 20 Huomionarvoinen aspekti on se, että potilaan immu- niteetti on systeeminen ja se syntyy suhteellisen nopeasti jopa suun kautta annettuna. Muut keksinnön tavoitteet selviävät seuraavasta kuvauksesta. Muita ominaisuuksia ja etuja selviää seuraa-. 25 vista esimerkeistä ja oheisesta piirroksesta jossa:. kuvio 1 esittää Immunoblot-analyysiä tyyppi 5 M-, proteiinista, jota ekspressoi pmk 207-transformoitu Salmonella typhimurium LB5000 (kaista 1) ja SL3261 (kaistat 2-6). 30 Yllämainittujen patenttien ja muiden julkaisujen. lisäksi tämän keksinnön kuvauksessa huomioonotettu kirjal- 11 lisuus sisältää muun muassa: Beachey, et al., "Repeating Covalent Structure and Protec- tive Immunogenicity of Native and Synthetic Polypeptide 35 Fragments of Type 24 Streptococcal M Protein", J. Biol. Chem. Vol. 258, No 21 pp 13,250-13,257 (1983).
8 van de Rijn, et al., "Group A Streptococcal Antigens Cross-Reactive with Myocardium", J. Exp. Med., Vol. 146, pp 579-599 (1977). van de Rijn, et al., "Immunochemical Analysis of Intact M 5 Protein Secreted From Cell Wall-Less Streptococci", Infect. Immun., Vol. 32, pp 86-91 (1981). Edman and Begg, "A Protein Sequenator", European J. Biochem. Vol. 1, pp 80-91 (1967). Phillips, et al., "Streptococcal M Protein: Helical Coiled 10 - Coil Structure and Arrangement on the Cell Surface", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 78, No 8 pp 4689-4693 (August 1981). Laver, et al, "Antigenic Drift in Type A Influenza Virus: Peptide Mapping and Antigenic Analysis of A/PR/8/34(HON1) 15 Variants Selected with Monoclonal Antibodies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No 3, pp 1425-1429 (March 1979). Atassi, "Antigenic Structure of Myoglobin: The Complete Immunochemical Anatomy of a Protein and Conclusions Relating to Antigenic Structures of Proteins", Immunochemist- 20 ry, Vol. 12, pp 423-438 (1975). Kabat, Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, pp 89-100 (Holt, Rhinehart & Winston, New York, (1968). Nisonoff, Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, pp 120-187 (1977). 25 Munoz, Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 3, pp 146-160 (1970). Manjula and Fischetti, "Tropomyosin-like Seven Residue Periodicity in Three Immunologically Distinct Streptococcal M Proteins and its Implications for the Antiphagocytic 30 Property of the Molecule", J. Exp. Med., Vol. 155, pp 695-708 (1980). Beachey and Stollerman, "Toxic Effects of Streptococcal M Protein on Platelets and Polymorphonuclear Leukocytes in Human Blood", J. Exp. Med. Vol. 134, pp 351-365 (1971). 35 Dale, et al., "Heterogenecity of Type-Specific and Cross-
9 Reactive Antigenic Determinants Within a Single M Protein of Group A Streptococci", J. Exp. Med. Vol. 155, pp 1026-1038 (1980). Beachey, et al., "Purification and Properties of M Protein 5 Extracted from Group A Streptococci with Pepsin: Covalent Structure of the Amino Terminal Region of Type 24 M Antigen", J. Exp. Med. Vol. 145 pp 1469-1483 (1977). Beachey, et al., "Primary Structure of Protective Antigens of Type 24 Streptococcal M Protein", J. Biol. Chem., Vol. 10 255, pp 6284-6289 (1980). Beachey, et al., "Repeating Covalent Structure of Streptococcal M Protein", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 75, pp 3163-3167 (1978). Beachey, et al., "Human Immune Response to Immunization 15 with a Structurally Defined Polypeptide Fragment of Streptococcal M Protein", J. Exp. Med., Vol. 150, pp 862 (1979). Brown, et al., "An Attenuated aroa Salmonella typhimurium Vaccine Elicits Humoral and Cellular Immunity to Cloned- 20 Galactosidase in Mice", The Journal of Infectious Disea- ses, Vol. 155, No 1 (January 1987). Tämä julkaisu käsittelee Salmonella typhimuriumkantaa SL3261 ja heikennettyä aroa rokotekantaa jota käytettiin kantajana plasmidi pxy411:11e. 25 Tämä Brownin et al julkaisu on tässä viitteenä. Toinen kiinnostava julkaisu on Hoiseth and Stocker, "Aromatic-dependent Salmonella Typhimurium are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines", Nature, Vol. 291 (May 21, 1981); Smith, et al., "Aromatic-Dependent Salmonella Typ- 30 himurium are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines", Am. J. Vet. Res. Vol. 45, No 1 (January 1984); Smith et al., "Vaccination of Calves Against Salmonella Dublin with Aromatic-Dependent Salmonella Typhimurium", Am. J. Vet. Res., Vol. 15, No 11 (November 1984); Maskell, et al., 35 "Attenuated Salmonella Typhimurium as Live Oral Vaccines
1 0 and Carriers for Delivering Antigens to the Secretory Immune System", Vaccines 86 (Cold Spring Habor Laboratory 1986). Yleisesti kiinnostavia patentteja geeniteknologian 5 alalla ovat muun muassa: US-patentti nro 4 428 941 otsikolla "Nucleotide Sequence Coding the Surface of the Hepatitis B Virus, Vector Containing Said Nucleotide Sequence, Process Allowing the Obtention Theoreof and Antigen Obtained Thereby", myön- 10 netty Francis Galibertille, et al., 31.1.1984; US-patentti nro 4 518 584 otsikolla "Human Recombinant Interleukin-2 Muteins", myönnetty Markille, et al., 21.5.1985; US-patentti nro 4 588 585 otsikolla "Human Recombinant Cysteine Depleted Interferon-B Muteins", myönnetty Markille, et 15 al., 13.5.1986; ja US-patentti nro 4 625 252 otsikolla "Recombinant Bacterial Plasmids Containing the Coding Sequences of Insulin Genes", myönnetty Rutterille, et al., 24.3.1987. US-patentti nro 4 666 846 otsikolla "Novel Cloning 20 Vectors Containing Selectable Genetic Markers for Use in Streptomyces and Related Organisms", myönnetty Feyermanille, et al., 19.5.1987; ja US-patentti nro 4 666 847 otsikolla "Recombinant DNA Means and Methods", myönnetty Alfordille, et al., 19.5.1987. 25 Keksinnön mukaisesti on edullista, että plasmidi johon on koodattu M-proteiinigeeni kloonataan ensin ja ekspressoidaan Escherichia colissa. Mitä tahansa koliformiryhmän enterobakteeria voidaan käyttää, mutta E. coli on yleensä edullisin. Sen jälkeen M-geenin sisältävä plasmidi 30 eristetään ja puhdistetaan ja sitten rakennetaan rakenne haluttujen ei-virulenttien bakteereiden kuten aroa - S. typhimurium (SL3261) transformoimiseksi. On huomattava että tässä mutanttikannassa on ravinteellinen merkkiaine PABA:lle ja 2,3-DHB:lle. Katso Brown et al., viite yllä. 35 On huomattava että toinen haluttu S. typhimurium-laji on
11 reca~ S. typhimurium, erityisesti kanta Ty21a. Katso Clements et al., "Construction of a Potential Live Aro Vaccine for typhoid type fever and cholorea-e. coli-related diarrheas", Infect. Immun., 46:564-9 (1984). Katso myös 5 muut yllämainitussa Brown, et al.-artikkelissa olevat viitteet, jotka myöskin sisällytetään tähän viitteinä. On edullista ottaa M-proteiinigeeni virulentista S. pyogenes-kannasta. On kuitenkin mandollista ottaa geeni heikennetystä ei-virulentista S. pyogenes-kannasta tai 10 jopa valmistaa nukleotidisekvenssi, johon on koodattu haluttu M-proteiini. Tässä esitetyt rekombinantti-dna-kloonausvektorit eivät rajoitu käytettäviksi yhteen Salmonella-lajiin tai -kantaan. Päinvastoin, vektorit ovat laajakäyttöisiä ja ne 15 voidaan transformoida muidenkin gram-negatiivisten bakteerien isäntäsoluissa, kuten Enterobacteriaceae-suvun (kuten Shigella ja Klebsiella, esim. Klebsiella pneumoniae, Enterobacter kuten Enterobacter aerogenes). Salmonellae, kuten Salmonella arizona, ja Citrobacter voidaan käyttää jos ne 20 sopivasti tehdään ei-virulenteiksi tai heikennetään. Yleisiä Salmonella-lajeja joita voidaan käyttää heikennettyinä ja ei-virulenteiksi saatettuina ovat mm seuraavat: S. paratyphi, S. schottmulleri, S. typhimurium, S. paratyphi C, S. choleraesuis, S. montevideo, S. new- 25 Port, S. typhi, S. enteritidis, S. galinarum, S. anatum. Voidaan rekombinantti-dna-vektorien isäntinä käyttää myös Streptococcus-suvun bakteereita jotka ovat eivirulentteja tai jotka on tehty ei-virulenteiksi tai heikennetty, mukaan lukien immunologisten ryhmien A-0 strep- 30 tokokit, mutta yleensä muiden kuin A:n. Sopivia Streptococcus-suvun bakteereita joita voidaan käyttää isäntäbakteereina ovat mm S. cremoris, S. faecalis, S. salivarisu, S. mitior, S. mitis, S. mutans, S. sanguis, viimeksimainitun ollessa nykyisin edullisin laji.
12 Tunnetaan muitakin sopivia mikro-organismeja, joita voidaan heikentää ja transformoida. Katso Davis, et al., Microbiology, (Harper & Row, Second edition, 1973). Yleisesti mikä tahansa enterobakteeri voi toimia 5 isäntäbakteerina. On edullista, että isäntäbakteeri säilyy hengissä kohteessa vain niin kauan, että se aiheuttaa opsonisen reaktion, mutta yleensä voidaan käyttää mitä tahansa bakteerikantaa, joka on heikennetty niin, ettei se kolonisoidu mutta lisääntyy kuitenkin riittävästi aiheut- 10 tamaan vasta-aineita vieraalle proteiinille. Keksinnön edullisessa toteutustavassa käytetään S. typhimurimin Aro - -kantaa, joka vaatii kahta metaboliittia, joita ei ole nisäkäskudoksissa, PABA ja 2,3-DHB. Sen seurauksena inokuloidut bakteerit kuolevat useiden sukupolvien jälkeen näi- 15 den metaboliittien puutteeseen. Katso yllämainittu Hoiseth ja Stocker. Voidaan kuitenkin käyttää mitä tahansa mutatoitua mikrobia, jolla on ravintorajavuus sellaisten ravinteiden suhteen, joita ei myöskään ole immunisoitavan kohteen ku- 20 doksissa, tai mikrobia, joka on tehty sellaiseksi geneettisellä manipuloinnilla. On huomattava, että ei-virulentti aro - -Salmonella typhimurium SL3261, johon on transformoitu plasmidi, jossa on 5 M-proteiiniantigeenin koodaava rakenteellinen geeni, 25 ekspressoi koko 5 M-proteiinimolekyylin, joka ekspressio rajoittuu melkein täysin S. typhimurium-soluplasmaosastoon. On tämän keksinnön ainutlaatuinen ja odottamaton aspekti, että immunogeeninen ja suojaava pinta-antigeeni, kuten streptokokki-m-proteiiniantigeeni, ilmenee ei-viru- 30 lentin isäntäbakteerin solulimassa. Niinpä voidaan nähdä, että haluttu nukleotidisekvenssi, johon on koodattu ja joka ekspressoi proteiiniantigeenia, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia vasta-aineita streptokokki-infektioita vastaan, erityisesti serotyyppiä 35 5 vastaan, voidaan kloonata eri isäntiin. Laajemmassa mie-
13 lessä transformoidun kantajan, jossa nukleotidisekvenssi on replikaation jälkeen, ei tarvitse olla heterologinen nukleotidisekvenssin suhteen, eikä sekvenssin tarvitse olla heterologinen mikro-organismien suhteen. 5 Lämminverisen eläimen immunisaatiomenetelmän tietyn toteutustavan mukaisesti on osoitettu, että a) hiiret kestivät hyvin aina 1,65 x 10 9 peroraalisen annoksen mutanttia ei-virulenttia Salmonellaa joka sisälsi plasmidin pmk207, johon on koodattu serotyyppi 5 strepto- 10 kokki-m-proteiini; b) plasmidi pmk207 oli erittäin stabiili sekä in vitro että in vivo; c) hiiret jotka saivat suurimman annoksen (10 9) bakteereita pitivät mikro-organismia maksassaan jopa kolme viikkoa 15 ilman haittavaikutuksia; d) hiiret jotka immunisoitiin suun kautta ei-virulentilla transformoidulla Salmonellalla joka ekspressoi serotyyppi 5 streptokokki-m-proteiiniantigeenigeeniä kehittivät jo kolmen viikon kuluttua opsonisia seerumivasta-aineita se- 20 rotyyppi 5 streptokokkeja vastaan; ja e) immunisoidut hiiret olivat täysin suojattuja kolmen viikon kuluttua homologisen serotyyppi M 5 (muttei heterologisen serotyyppi M 24) streptokokin intraperitoneaalisia hyökkäyksiä vastaan. On huomionarvoista, että mitään ris- 25 tiinreaktiivista immuniteettia ei havaita, kun keksinnön mukaisesti valmistettua valmistetta annetaan suun kautta. M-proteiiniantigeenin ilmeneminen sytoplasmaan ei-virulentissa bakteerissa on erityisen hyödyllistä tässä suun kautta annetussa käytössä. Antigeeni on suojassa ei-viru- 30 Tentin bakteerin sytoplasmassa vatsan hapoilta ja muilta vahingoittavilta aineilta kunnes ei-virulentti solu kuolee ja vapauttaa antigeenin, tavallisesti ohutsuoleen, edullisimpaan paikkaan antigeenien vapauttamiselle. Edellä esitettyä ei-virulenttia bakteeria voidaan 35 käyttää myös isäntänä rekombinantti-dna-kloonausvektoreil-
14 le, jotka sisältävät nukleotidisekvenssejä, joihin on koodattu ja jotka ekspressoivat immunogeenisiä polypeptidejä, jotka spesifisesti aiheuttavat immuniteettiä streptokokki-infektioita vastaan ja jotka eivät ole ristiinreaktii- 5 visia ihmisen kudosten, erityisesti sydänkudoksen, anti- geenien kanssa. Keksinnön mukaisesti valmistettavia immunogeenisia polypeptidejä ovat mm synteettiset oligopeptidit, jotka ovat kopioita M-proteiinimolekyylien alueista, joista 10 puuttuu autoimmuunit epitoopit, kuten on kuvattu US-patentissa nro 4 284 537, myönnetty E. Beacheylle 18.8.1981, US-patentissa nro 4 454 121, myönnetty E. Beacheylle 12.6. 1984, US-patentissa nro 4 521 334, myönnetty E. Beacheylle 4.6.1985 ja US-patentissa nro 4 597 967, myönnetty E. 15 Beacheylle 1.7.1986, jotka kaikki sisällytetään tähän viitteinä. Serotyyppi M 24 polypeptidien kykyä toimia kantajana hyvin multivalentille rokotteelle testataan muilla serotyyppi M polypeptidifragmenteilla. 20 On lisäksi mandollista kloonata isäntäorganismiin yhdessä M-proteiinia ekspressoivan plasmidin kanssa plasmidi, joka ekspressoi kolmannen bakteerilajin antigeenia. Tarkemmin E. coli-kannasta CSHSO kloonattu psh-2 plasmidi on kloonattu Sal. typhimuriumiin, mikä saa isännän eks- 25 pressoimaan E. coli 29 kilodaltonin pinta-antigeenia, joka aiheuttaa Fim H antiadhesiivisia vasta-aineita. Nämä vasta-aineet eivät vain vaikuta E. colia vastaan, vaan vaikuttavat myös muita gram-negatiivisia bakteereita vastaan. Muita keksinnölle tyypillisiä etuja selviää seuraa- 30 vista ei-rajoittavista esimerkeistä. Esimerkki 1 Ei-virulentin isäntäbakteerin transformaatio strep- tokokki-m-proteiinin ilmentämiseksi Stockerin ja Hoseithin (viite yllä) kehittämä Salmonella typhimurium SL3261 aro - - 35 kanta valittiin, koska tämä mikrobin mutanttimuoto kykenee
15 invaasioon aiheuttamatta sairautta. Tässä mutanttikannassa on ravinteellinen merkki sekä p-aminobentsoehapon (PABA) että 2,3-dihydrobentsoehapon (DHB) suhteen. Katso Stocker ja Hoseith, viite yllä. 5 M 5-proteiiniantigeenin rakenteellinen geeni (smp 5) kloonattiin ja ekspressoitiin E. coli LE392:ssa, kuten on kuvattu seuraavissa julkaisuissa: Kehoe et al, "Cloning and Genetic Analysis of Serotype 5M Protein Determinant of Group A Streptococci: Evidence for Multiple Copies of the 10 M5 Determinant in the Streptococcus pyogenes Genome", Infect. Immun., Vol. 48, pp 190-197 (1985) ja Poirer, et al., "Expression of Protective and Cardiac Tissue Cross- Reactive Epitopes of Type 5 Streptococcal M Protein in Escherichia coli", Infect. Immun., Vol. 48, pp 198-203 15 (1985), jotka molemmat sisällytetään tähän viitteinä. Plasmidi pmk207 eristettiin, puhdistettiin ja transformoitiin ensin Sal. typhimurium rm+ kantaan LB5000, kuten kuvataan julkaisussa Bullas ja Ryo, "Salmonella typhimurium LT2 Strains which are rm+ for all Three Chromo- 20 somally Located Systems of DNA Restriction and Modification", J. Bacteriol., Vol. 156, pp 471-474 (1983) ja Lederberg ja Cohen, "Transformation of Salmonella typhimurium by Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol., Vol. 119 pp 1072-1074 (1974), jotka molemmat sisällytetään 25 tähän viitteinä. LB5000:sta eristettyä ja puhdistettua plasmidia käytettiin sitten transformoimaan aro - Sal. typhimurium SL3261 käyttäen samoja yllämainittuja menetelmiä jotka on kuvannut Lederberg ja Cohen sekä Bullas ja Ryo. Transformoitu LB5000 ja SL3261 ekspressoivat koko 30 M 5-proteiinimolekyylin, kuten on demonstroitu Western Blot-analyysillä kokosolulysaateista (kuva 1; kaistat 1 ja 2). Tyypillinen M 5-proteiinitripletti (katso Poirer et al., ja Kehoe et al., viite yllä) liikkui nauhoina M r 59, 56 ja 54k. Esitutkimukset Sal. typhimurium SL3261:n eks- 35 pressoiman M 5-proteiinin paikan tutkimiseksi osoittivat,
16 että rekombinanttiproteiini rajoittui melkein täysin sytoplasmaosaan. SL3261 ekspressoi M 5-proteiinia stabiilisti myös ilman antibioottista painetta, toisin sanoen ekspressio oli selvä viiden päivän ajan suoritettujen jatko- 5 viljelyjen jälkeen, mikä edustaa noin 35 sukupolven kasvua (kuva 1; kaistat 3-8). kestävyys Esimerkki 2 Hiirten transformoidun Sal. typhimurium SL3261:n 10 Alustavissa tutkimuksissa BALB/c-hiirille annettiin kasvavia annoksia SL-3261-pMK207 sen määrittämiseksi kestäisivätkö eläimet transformoituja organismeja. Mikään hiiristä, jotka saivat enintään 1,65 x 10 9 organismia/suun kautta annettu annos, ei sairastunut tai kuollut 1, 3, 5 15 ja 10 viikon kuluttua inokulaatiosta. Kaksi hiirtä kustakin annostusryhmästä tapettiin ja niiden maksat, pernat ja suolet viljeltiin SL3261-pMK207 varten McConkeyn agarilla, joka sisälsi 50 mg/ml kanamysiinisulfaattia ja 10 mg/ml PABA ja DHB. Laktoosia fermentoimattomia pesäkkeitä voi- 20 tiin viikon kuluttua eristää vain hiiristä, jotka saivat 10 6 organismia tai yli, ja kolmen viikon kuluttua vain niistä, jotka saivat 10 9 organismia (taulukko 1). Kolmen viikon kuluttua isolaatteja ei löytynyt. Kolmen viikon kuluttua eristetyt pesäkkeet ekspressoivat koskematonta 25 M 5-proteiinia, mikä osoittaa, että smp5 oli stabiili in vivo (kuva 1; kaista 9). 1, 3, 5, 9, 10, 15 ja 20 viikon seerumeissa suun kautta inokuloiduista hiiristä osoitettiin olevan vasta-aineita tyyppi 5 M-proteiinille ja tyypin 5 streptokokeille ELISA:lla ja opsonaatiokokeilla 30 (taulukko 2). Syljessä, joka oli otettu hiiristä 20 viikkoa immunisaation jälkeen, osoitettiin myös olevan anti- M5-proteiinivasta-aineita, ensisijaisesti IgA-luokkaa (taulukko 3).
17 Taulukko 1 Salmonella typhimurium SL3261 jakautuminen BALB/c hiirten elimissä suun kautta immunisaation jälkeen Salmonellan jakautuminen elimiin2 5 inokulaatioannos' Suoli Maksa-sappirakko Perna Alku Tehoste 1 2 3 1 2 3 1 2 3 viikkoa viikkoa viikkoa 1,7x106 1,1x109 2,1x104 <50 <50 4x10 2 3x10 2 <50 4x102 <50 <50 1,7x108 1,1x10 8 <200 <50 ND3 8x10 2 <50 ND 4x102 <50 ND 1,7x10 7 1,1x10 7 <200 <50 ND 1x10 2 <50 ND 1x10 2 <50 ND 10 1,7x10 6 1,1x10 6 <100 ND ND <50 ND ND <50 ND ND 1,7x10 5 1,1x105 <100 ND ND <50 NO ND <50 ND ND 1,7x106 1,1x106 <100 ND ND <50 ND ND <50 ND ND 1. Hiirille annettiin sarjana 10-kertaisesti laimennettuja 15 suun kautta annettavia annoksia S. typhimurium kantaa SL3261 alkaen annoksesta 1,7 x 10 9 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (cfu) päivänä 1 (alkuannos) ja suun kautta annettava tehosteannos 1,1 x 10 9 cfu päivänä 5. Kukin annos oli suspensoitu 25 ihl:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta 20 (PBS, ph 7,2), joka sisälsi 5 /1g ml - ' kanamysiinisulfaattia ja 1 1.hg ml - ' paraminobentsoehappoa (PABA) ja 2,3-dihydrobentsoehappoa (DHB). Hiiret tapettiin 1, 2 ja 3 viikkoa alkuannoksen antamisen jälkeen. 2. Suoli (mahaportista peräsuoleen), maksa-sappirakko ja 25 perna poistettiin aseptisesti, pantiin PBS:ään, homogenoitiin Cellector Tm :illa (100 mesh; Bellco) ja pantiin MacConcey-agarmaljoille, jotka sisälsivät 10 bhg ml - ' PABA ja DHB ja 50 bhg m1-1 kanamysiiniä tai ei lainkaan kanamysiiniä. 3. Ei määritetty.
18 Taulukko 2 M tyyppi 5 S. pyogenesin opsonisaatio hiiren anti- M5-proteiiniseerumilla, joka oli saatu suun kautta S. typhimurium SL3261-pMK207:11ä immunisoiduista 5 BALB/c-hiiristä, ja niiden anti-pepm proteiini ELI- SA-tiitterit Testiseerumi ELISA-tiitteri l Opsonisaatioprosentti 2 IgA IgG IgM tyyppi 5 tyyppi 24 Pre-immune <50 50 50 0 2 10 1 viikkoa 100 200 <50 4 4 3 " 400 400 <50 36 0 5 le 800 800 <50 52 2 9 " 100 1600 200 90 2 10 " 50 800 400 92 2 15 15 " 100 800 400 52 0 15 " 3 800 12800 800 82 0 20 " <50 400 200 10 2 20 " 3 400 3200 200 80 2 Anti-pepM5 4 ND 5 ND ND 96 2 20 Anti-pepM24 ND ND ND 0 98 1. ELISA-tiitterit määritettiin käyttäen immobilisoitua pepm5, joka oli reagoinut BALB/c hiiren anti-sl207-seerumien kanssa, jota seurasi peroksidaasikonjugoitu vuohen 25 anti-hiiri -IgA, -IgG tai -IgM. Kaikki hiiren antiseerumit, jotka reagoivat immobilisoidun pepm24 kanssa antoivat tiitterin <50. 2. Opsonisaatio määritettiin kokonaisneutrofiiliprosenttina assosioituneiden streptokokkien kanssa. 30 3. Hiiret tehostettiin 48 tuntia ennen verenottoa 50 mg:- 11a pepm5 0,1 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ph 7,2. 4. Sekä anti-pep-m5 että anti-pep-m24 valmistettiin kaneissa toimiakseen positiivisena (homologinen reaktio) ja 35 negatiivisena (heterologinen reaktio) kontrolleina. 5. Vasta-ainearvoja kanin anti-pep-m5:lle tai anti-pep- M24:lle ei määritetty.
19 5 Taulukko 3 Syljen vasta-ainereaktio' MS-proteiinia vastaan BALB/c-hiirissä, jotka oli immunisoitu suun kautta S. typhimurium SL3261-pMK207:11ä ELISA-tiitteri 2 pepm5 vastaan Testiseerumi IgA IgA+IgG+IgM 10 Ennen immunisointia <4 <4 20 viikkoa 3 32 32 20 viikkoa + tehoste 4 64 128 1. Sylkeä kerättiin hiiristä ja yhdistettiin (neljä/ryhmä) ja annettiin intraperitoneaalisesti lisäten 0,1 ml 2 % pilokarpiinia 15 2. ELISA-tiitterit määritettiin käyttäen immobilisoitua pepm5, joka oli reagoinut syljen kanssa (sarjassa laimennettu kaksinkertaiseksi), jota oli kerätty BALB/c-hiiriltä, jotka oli immunisoitu SL3261-pMK207:11ä, jota seurasi peroksidaasikonjugoitu vuohen anti-hiiri -IgA:lla tai an- 20 ti-hiiri -IgA + -IgG + IgM-seoksella 3. Hiiret immunisoitiin 20 viikkoa ennen syljen keräämistä (katso taulukko 2) 4. Hiiriin injektoitiin tehosteannos, jossa oli 50,Ag pepm5 0,1 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, ph 25 7,2, 60 tuntia ennen syljen keräämistä. Esimerkki 3 Ryhmä hiiriä inokuloitiin suun kautta kandella annoksella SL3261-pMK207 ja altistettiin 22 vuorokauden kuluttua ensimmäisestä annoksesta tyyppi 5 ja 24 streptoko- 30 keille; tai virulentille alkuperäiselle Sal. typhimurium 1344:11e (taulukko 3). Kuten tuloksista voidaan helposti havaita, M 5 ekspressoivaa Sal. typhimurium-mutanttia saaneilla hiirillä oli täydellinen suoja tyyppi 5 streptokokkien intraperitoneaalista hyökkäystä vastaan mutta ei 35 tyyppi 24 streptokokkia vastaan. Myös kontrollihiiret, joita altistettiin intraperitoneaalisesti virulentille SL1344 Sal. typhimuriumille, olivat suojattuja. Tyyppi 5
20 saaneilla hiirillä oli suoja annosta vastaan, joka ylitti LD 50-arvon 100-kertaisesti (taulukko 4). Tämä suojaus tyyppi 5 streptokokkien hyökkäystä vastaan osoittaa, että saatu immuniteetti on systeeminen. 5 Taulukko 4 Altistaminen M tyyppi 5 ja tyyppi 24 streptokokeille tai S. typhimurium SL1344:11e intraperitoneaalisella injektiolla BALB/c-hiirissä, jotka on immunisoitu suun kautta' elävillä tyyppi 5 M-proteiinia 10 ekspressoivalla pmk207 transformoidulla aro - S. typhimuriumilla 15 20 Altistusorganismit 2 Annos 3 Eloonjääminen r M5 Streptococci (Smith-kanta) M24 Streptococci (Vaughn-kanta) S. typhimurium (kanta SL1344) 1,7x10 5 1,7x10 6 1,7x10 1,6x10 3 1,6x10 5 1,6x10 7,3x10' 7,3x10 2 3 7,3x10 Immunisoimaton 2/4 0/4 0/4 1/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Immunisoitu 1. Kukin immunisoitu hiiri sai 1,2 x 10 9 pmk207-transformoitua SL3261 S. typhimurium pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (cfu) 22 vuorokauden kuluttua ja 1,6 x 10 9 cfu 17 vrk ennen altistusta. Kukin annos annettiin suun kautta sus- 25 pensoituna 25 /Al:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 5 µg/m1-1 kanamysiinisulfaattia ja 1 µg/ml -1 2. LD 50 M5 ja M24-streptokokeille ja SL1344:11e BALB/c-hiirissä oli suunnilleen 2 x 10 4, 3 x 10 3 ja 1 x 10 cfu. 30 3. Annos määritettiin annettujen cfu:ien mukaan. 4. Eloonjääminen määritettiin eloonjääneiden hiirten määränä jaettuna altistettujen hiirten määrällä. 5. Kaikki kirjatut kuolemat tapahtuivat 3-6 vuorokautta altistuksen jälkeen. Kaikki eloonjääneet hiiret vaikutti- 35 vat terveiltä vielä 30 vuorokautta altistuksen jälkeen. 4/5 5/5 5/5 1/3 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 paraminobentsoehappoa ja 2,3-dihydroksibentsoehappoa.
21 Ryhmälle BALB/c-hiiriä, jotka oli immunisoitu suun kautta SL3261-pMK207:11ä annettiin intranasaalisesti tyyppi 5 tai 24 streptokokkeja tai virulenttia alkuperäistä Sal. typhimurium 1344. Kuten taulukosta 5 voidaan helposti havaita, 5 vain ne hiiret, jotka oli immunisoitu suun kautta SL3261- pmk207:11ä pystyivät selviytymään intranasaalisesta hyökkäyksestä annoksella homologisia organismeja, jotka muuten riittivät tappamaan kaikki immunisoidut eläimet. Lisäksi rekombinanttia M 5-proteiinia ekspressoivan Sal. typhimu- 10 rium SL3251:n suoja on M-tyyppispesifistä, minkä osoittaa intranasaalisesti altistettujen hiirten kyvyttömyys kestää M-tyyppi 24 streptokokkeja. Se että hiiret olivat vastustuskykyisiä intranasaaliselle inokulaatille osoitti, että suun kautta immunisaatio M 5-proteiinia ekspressoivalla 15 Sal. typhimurium SL3251:11ä riitti tuottamaan paikallisen immuniteetin. Taulukko 5 Altistus intranasaalisella tyyppi 5 tai 24 streptokokki- tai Sal. typhimurium 1344-inokulaatiolla 20 BALB/c-hiirissä, jotka oli immunisoitu suun kautta' elävällä tyyppi 5 M-proteiinia ekspressoivalla pmk207:11a transformoidulla aro - S. typhimuriumilla Altistusorganismit 2 Annos 3 Eloonjääminen 4. 5 25 Immunisoimaton Immunisoitu M5 Streptococci 3,9x10 7 0/4 6/6 (Smith-kanta) M24 Streptococci 3,5x10 7 0/4 0/6 (Vaughn-kanta) 30 S. typhimurium (kanta SL1344) 4,3x10 4 0/4 6/6 1. Kukin immunisoitu hiiri sai 1,2 x 10 9 pmk207-transformoitua SL3261 S. typhimurium pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (cfu) päivänä 1 ja 1,6 x 10 9 cfu päivänä 5. Kukin annos 35 annettiin suun kautta suspensoituna 25 gl:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, ph 7,2), joka sisälsi 5 gg/ m1-1 kanamysiinisulfaattia ja 1 gg/m1-1 paraminobentsoehappoa ja 2,3-dihydroksibentsoehappoa.
22 2. Altistusannos määritettiin annettuina cfu:na, jotka oli annettu intranasaalisesti 20 pl:ssa PBS (10 gl/sierain). 3. Hiiret altistetaan 13 viikkoa alkuperäisen immunisaation (eli päivän 1) jälkeen. 5 4. Eloonjääminen määritettiin eloonjääneiden hiirten määränä altistettujen hiirten määrää kohden. 5. Streptokokkikuolemat tapahtuivat 2-4 vuorokautta ja salmonellakuolemat tapahtuivat 5-7 vuorokautta altistuksen jälkeen. Kaikki eloonjääneet hiiret vaikuttivat terveiltä 10 vielä 30 vuorokautta altistuksen jälkeen. Ylläolevia esimerkkejä ei pidä ymmärtää rajoituksiksi, vaan ne ainoastaan kuvaavat keksintöä. Voidaan myös käyttää yhdistelmiä mistä tahansa määrästä minkä tahansa streptokokkiserotyyppi M-proteiiniantigeenin immunogeeni- 15 sia polypeptidisekvenssejä kovalenttisesti kytkeytyneinä luonnolliseen tai synteettiseen kantajaan, jolloin muodostuu multivalentti rokote, joka on laajasti suojaava serotyyppi M Streptococcusta vastaan. M-proteiinipolypeptidisekvenssiä voidaan myös käyt- 20 tää kantajana, johon muut sekvenssit ovat kovalenttisesti kytkettyinä, mikä aiheuttaa opsonisen reaktion kaikille streptokokkiserotyypeille, joiden polypeptidejä on kytkeytyneinä kantajaan, samoin kuin streptokokkiserotyypille, jonka polypeptidi toimii kantajana. 25 On myös mandollista koodata sellaisen multivalentin polypeptidin nukleotidisekvenssi S. pyogeneskromosomiin M-proteiinin strukturaalisen geenin alueelle, kloonata se plasmideihin ja transformoida plasmidit ei-virulenttiin isäntäbakteeriin. Synteettiset nukleotidisekvenssit ovat 30 edullisia, mutta myös elävistä bakteerisoluista saatuja nukleotidisekvenssejä voidaan käyttää. Keksintö mandollistaa myös sellaisen geneettisen materiaalin, joka ekspressoi immunogeenisia polypeptidejä, jotka aiheuttavat opsonisia reaktioita muille virulenteille bakteereille, 35 kloonaamisen ei-virulenttiin isäntäbakteeriin, joka on jo
23 transformoitu ekspressoimaan immunogeenisia polypeptidejä, jotka aiheuttavat opsonisia reaktioita tyyppi M streptokokki-infektioita, ja molempien lajien polypeptidien kovalenttisen kytkemisen. Syntyvä heikennetty ei-virulentti 5 isäntäorganismi voidaan antaa suun kautta laajaspektrisenä rokotteena, joka pystyy aiheuttamaan opsonisia reaktioita useampaa kuin yhtä bakteerilajia vastaan.
24 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi nisäkkään immunisoimiseksi streptokokki-infektioita vastaan aikaan- 5 saamalla opsonisten vasta-aineiden muodostuksen streptokokki M-proteiiniantigeenia vastaan saamatta aikaan vastaaineita, jotka ovat ristiin reagoivia sydänkudoksen antigeenien kanssa, tunnettu siitä, että transformoidaan elävä, ei-virulentti Salmonella-bakteeri, jossa on 10 mutaatiomuunnos, joka aiheuttaa ravintovajavuuden, plasmidilla pmk207, joka koodaa Streptococcus pyogenes-bakteerin serotyyppi 5:stä peräisin olevan koko streptokokki M-proteiiniantigeenin, joka transformoitu bakteeri ilmentää mainitun antigeenin solunsisäisesti, jolloin annet- 15 taessa se suun kautta nisäkkäälle, antigeeni vapautuu kuolevasta bakteerista ja saa aikaan opsonisten vasta-aineiden muodostuksen antigeenia vastaan, jolloin syntyy immuniteettia mainituille opsonisille vasta-aineille herkkiä streptokokki-infektioita vastaan, jotka vasta-aineet eivät 20 ole ristiin reagoivia ihmisen sydänkudoksen antigeenien kanssa. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoidaan aro - Salmonella typhimurium SL3261.
25 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av ett vaccin för immunisering mot streptokock-infektion, genom att framkal- 5 la bildning av opsoniska antikroppar mot streptokock M- proteinantigen, utan att framkalla bildning av antikroppar som är korsreaktiva med hjärtvävnadsantigener, k ä n n e- t e c k n a t därav, att man transformerar en levande, icke-virulent Salmonella-bakterie, som har en mutations- 10 form som förorsakar en näringsdefekt, med en plasmid pmk207, som kodar hela streptokock-m-proteinantigenen som härstammar från serotyp 5 av Streptococcus pyogenes, vilken transformerade bakterie uttrycker nämnda antigen intracellulärt, varvid antigenen frigörs ur den döende bak- 15 terien och framkallar bildning av opsoniska antikroppar mot antigenen, då man ger den via munnen åt ett däggdjur, varvid immunitet uppstår mot streptokock-infektioner som är sensitiva för nämnda opsoniska antikroppar, vilka inte korsreagerar med antigenen i human hjärtvävnad. 20 2. Förfarande enligt patentkrav 1, känne- tecknat därav, att man transformerar aro - typhimurium SL3261. Salmonella
IP - ^ a. - -