(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT 1 1 10 111 (10) F18 (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 28.02.2007 SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.lk. - Int.kl. A61K 39/095 (2006.01) CO7K 14/21 (2006.01) A61K 38/04 (2006.01) (21) Patenttihakemus - Patentansökning 961407 (22) Hakem ispäivä - Ansökningsdag 28.03.1996 (24) Alkupäivä - Löpdag 27.09.1994 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 21.05.1996 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US94/10932 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 29.09.1993 US 129719 P 20.09.1994 US 306871 P (73) Haltija - Innehavare 1 The Research Foundation of State University of New York, State University of New York at Buffalo, 518 Capen Hall, Buffalo, NY 14260-0001, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Murphy,Timothy F., 31 Whispering Court, East Amherst, NY 14051, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab Annankatu 42 C, 00100 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Branhamella catarrhalista vastaan Förfarande för att framställa ett vaccin mot Branhamella catarrhalis (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer US 5124246 A, US 4683195 A, US 4358535 A, Infection and Immunity, voi. 60, nro 3, March 1992, p. 804-809, Satwar et al., "Characterization of an Antigenically Conserved Heat-Modifiable Major Outer Membrane Protein of Branhamella catarrhalis", The Journal of Infectious Diseases, vol. 162, November 1990, p. 1128-1135, Goldblatt et al., "Branhamella catarrhalis: Antigenic Determinants and the Development of the IgG Subclass Response in Childhood", Infection and Immunity, voi. 61, nro 5, May 1993, p.2003-2010,helminen et al., "A Major Outer Membrane Protein of Moraxella catarrhalis Is a Target for Antibodies That Enhance Pulmonary Clearance of the Pathogen in an Animal Model", Infection and Immunity, vol. 57, nro 10, October 1989, p.2938-2941, Murphy et al., "Surface-Exposed and Antigenically Conserved Determinants of Outer Membrane Proteins of Branhamella carrhalis" (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksinnössä on kuvattu Branhamella catarrhaliksen ulkomembraaniproteiinia "CD" ja tämän peptidejä ja oligopeptidejä sisältäviä koostumuksia. Keksinnössä on lisäksi kuvattu kyseessä olevaa proteiinia, peptidiä tai oligopeptidiä koodaavia nukleiinihapposekvenssejä sekä näitä sekvenssejä sisältäviä yhdistelmävektoreita. Proteiinia, peptidiä tai oligopeptidiå voidaan tuottaa näitä yhdistelmävektoreita sisältävistä isäntäsolujärjestelmistä. Peptidejä tai oligopeptidejä voidaan syntetoida myös kemiallisesti. Keksinnössä on kuvattu tämän proteiinin
ja näiden peptidien ja oligopeptidien käyttömuotoja rokoteformulaatioihin soveltuvina antigeeneinä, sekä antigeeneinå diagnostisissa immunomäärityksissä. Nukleotidisekvenssit ovat käyttökelpoisia sellaisten vektorien konstruointiin, joita on tarkoitus käyttää rokotteina ja jotka on määrä liittää heikennettyihin bakteereihin yhdistelmäbakteerirokotetta konstruoitaessa ja jotka on määrä liittää virusvektoriin yhdistelmävirusrokotetta konstruoitaessa. Keksinnössä on myös kuvattu CD:tä koodaavaan geeniin liittyvien nukleotidisekvenssien käyttö alukkeina ja/tai koettimina B. catarrhaliksen havaitsemiseen tarkoitetuissa molekyylidiagnostisissa määrityksissä. Uppfinningen skildrar sammansättningar, som innehäller ett yttre membranprotein "CD" av Branhamella catarrhalis och peptider och oligopeptider därav. Uppfinningen skildrar också nukleotidsekvenser, som kodar för proteinet, peptiden eller oligopeptiden, samt rekombinantvektorer innehållande dessa sekvenser. Proteinet, peptiden eller oligopeptiden kan framställas från ett värdcellsystem innehållande dessa rekombinantvektorer. Peptider och oligopeptider kan också syntetiseras kemiskt. Uppfinningen skildrar användningsformer av proteinet, peptiderna och oligopeptiderna som antigener för vaccinformulationer och som antigener i diagnostiska immunbestämningar. Nukleotidsekvenserna är användbara för konstruering av vektorer för användning som vacciner för införing i försvagade bakterier vid konstruering av en rekombinant bakteriell vaccin, och för införing i en viral vektor vid konstrueringen av en rekombinant viral vaccin. Uppfinningen skildrar också användningen av nukleotidsekvenser anknytande till genen som kodar för CD som primer och/eller prober i molekylardiagnostiska bestämningar för påvisning av B. catarrhalis.
1 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Branhamella catarrhalista vastaan - Förfarande för att framställa ett vaccin mot Branhamella catarrhalis 5 Keksintö on tehty Yhdysvaltain hallituksen tuella National Institutes of Health -instituutin myöntämällä apurahalla Al28 304. Yhdysvaltain hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön. 10 Tämä patenttihakemusjulkaisu on jatkopatenttihakemusjulkaisu patentin hakijan aikaisemmalle haettavana olevalle USpatenttihakemusjulkaisulle nro 08/129 719, joka on jätetty 29. syyskuuta 1993 ja joka on liitetty tähän patentti- 15 hakemusjulkaisuun siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Keksinnön ala Keksintö liittyy koostumuksiin, jotka sisältävät Branhamella catarrhaliksen ulkomembraaniin liittyvää proteiinia sekä 20 tämän peptidejä ja oligopeptidejä. Tarkemmin sanottuna tämä keksintö kohdistuu koostumuksiin, jotka sisältävät proteiinia, sekä tämän peptidejä ja oligopeptidejä, jotka liittyvät B. catarrhaliksessa esiintyvään ulkomembraaniproteiiniin, "CD", jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 25 55 000-60 000 daltonia. Tässä keksinnössä on esitetty myös menetelmiä CD:n ja CD-peptidien valmistamiseksi yhdistelmä- DNA-menetelmillä sekä biokemiallisilla menetelmillä. Tähän liittyen tässä keksinnössä on esitetty CD:tä koodaava DNAsekvenssi ja CD:n ja CD-peptidien ja -oligopeptidien ilmen- 30 tämisen ohjaamisessa käyttökelpoisia yhdistelmävektoreita, sekä tällaisilla yhdistelmävektoreilla transformoituja isäntäsoluja. Näitä proteiineja, peptidejä ja oligopeptidejä käytetään 35 immunogeeneinä aktiiviseen immunisaatioon soveltuvissa rokoteformulaatioissa; ja niitä voidaan käyttää passiiviseen immunisaatioon soveltuvien käyttökelpoisten proteiinispesifisten ja peptidispesifisten antiseerumien muodostami-
2 seen sekä reagensseina diagnostisissa määrityksissä. Tässä keksinnössä kuvattujen nukleotidisekvenssien avulla on mandollista syntetoida niitä vastaavia oligonukleotideja, joita voidaan käyttää reagensseina B. catarrhaliksen geneet- 5 tisen materiaalin havaitsemiseen suunnatuissa diagnostisissa määrityksissä, sekä liittää ilmentämisvektoreihin käytettäväksi geneettisinä rokoteformulaatioina. 25... Keksinnön tausta 10 Branhamella catarrhalis (tästä käytetään myös nimitystä Moraxella catarrhalis) on merkittävä ihmisen hengitysteiden patogeeni. Streptococcus pneumoniaen ja kapselittoman Haemophilus influenzaen jälkeen B. catarrhalis on kolmanneksi yleisin välikorvantulehduksen aiheuttaja imeväis- 15 ikäisillä ja lapsilla, mikä on osoitettu tutkimuksissa, joissa etiologinen agenssi on selvitetty tympanosenteesillä [Murphy, Pediatr. Infect. Dis. J. 8 (1989) S75 - S77]. B. catarrhalis aiheuttaa usein sinuiittia ja konjuktiviittia sekä lapsilla että aikuisilla [tätä on käsitelty esimerkiksi 20 julkaisuissa Bluestone, Drugs 31 (1986) 5132 - S141; Brorson, et al., Scand. J. Infect. Dis. 8 (1976) 151-155; ja Romberger, et al., South. Med. J. 80 (1987) 926-928]; ja kroonista bronkiittia ja kroonista obstruktiivista keuhkosairautta sairastavilla aikuisilla se on merkittävä alempien hengitysteiden infektioiden aiheuttaja [Murphy, et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146 (1992) 1067-1083; Catlin, Clin. Microbiol. Rev. 3 (1990) 293-320]. Edellä mainittujen lisäksi B. catarrhalis voi aiheuttaa pneumoniaa, endo- kardiittia, sepsistä sekä meningiittiä potilailla, joiden :: 30 immuunivaste on heikentynyt [Cocchi, et al., Acta Paediatr. Scand. 57 (1968) 451-3; Douer, et al., Ann. Intern. Med. 86 (1977) 116-119; McNeely, et al., Am. Rev. Respir. Dis. 114 (1976) 399-4021.... 35 Koska toistuvan välikorvantulehduksen morbiditeetti on huomattavan suuri, on haluttua identifioida strategioita näiden infektioiden estämiseksi. Yksi tällainen lähestymis-
3 tapa on rokotteiden kehittäminen. Bakteerien aiheuttaman välikorvantulehduksen estämiseen tarkoitetun tehokkaan rokotteen täytyisi sisältää antigeeneja, jotka saisivat aikaan suojan S. pneumoniaen, kapselittoman H. influenzaen 5 ja B. catarrhaliksen aiheuttamia infektioita vastaan. Pneumokokkia ja kapselitonta H. influenzaeta vastaan suunnattujen rokotteiden kehitys onkin jo siinä vaiheessa, että on tunnistettu potentiaalisesti suojaavia antigeeneja ja näitä rokotteita tutkitaan parhaillaan [tätä on käsitelty 10 esimerkiksi julkaisuissa Murphy, et al., US-patenttijulkaisu nro 5 173 294; ja Vella, et al., Infect. Immun. 60 (1992) 4977-4983]. Näiden rokotteiden kehittämisen ja käytön laajentumisen myötä B. catarrhaliksen suhteellinen merkitys välikorvantulehduksen aiheuttajana kasvaa ensi vuosi- 15 kymmenellä. Sen lisäksi, että imeväisikäiset ja lapset hyötyvät B. catarrhaliksen aiheuttamaa välikorvantulehdusta estävästä rokotteesta, niin B. catarrhaliksen aiheuttamia infektioita estävästä rokotteesta hyötyisivät myös kroonista obstruktiivista keuhkosairautta sairastavat aikuiset sekä 20 lapset ja aikuiset, joiden immuunivaste on heikentynyt... 30 : ". 35 t Mandollisina rokotteessa käytettävinä antigeeneinä tutkittuja bakteerien komponentteja ovat polysakkaridit, lipopolysakkaridit tai niiden modifikaatiot sekä ulkomembraaniproteiinit. Polysakkaridiantigeenien on yleensä osoitettu olevan huonoja immunogeenejä alle 18 kuukauden ikäisillä lapsilla, mistä on esimerkkinä H. influenzaen tyypin b kapselipolysakkaridi. Lipopolysakkaridin (LPS) avulla tehtävä aktiivinen immunisaatio ei ole hyväksyttävää, koska tämä on luonnostaan toksinen. LPS:n patofysiologisia vaikutuksia voivat olla kuume, leukopenia, leukosytoosi, Schwartzmanin reaktio, disseminoitunut intravaskulaarinen koagulopatia ja suurilla annoksilla sokki ja kuolema. Proteiinit ovat yleensä immunogeenisiä noin kolmen kuukauden ikäisillä imeväisillä. Ulkomembraaniproteiineja ollaankin parhaillaan tutkimassa mandollisina rokoteantigeeneina.
25. 4 Vaikkakin viimeaikaisissa tutkimuksissa on painopiste alkanut siirtyä B. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiineihin, niin näiden proteiinien antigeenisesta ja molekulaarisesta rakenteesta tiedetään vasta vähän. SDS-PAGE:lla puhdiste- 5 tuille ulkomembraaneille tehdyissä tutkimuksissa on saatu selville, että niiden rakenne on bakteerin eri kannoissa melko homogeeninen [Bartos ja Murphy, J. Infect. Dis. 158 (1988) 761-765]. On tunnistettu kandeksan ulkomembraanin pääproteiinia, joiden nimitykseen on käytetty kirjaimia A 10 H [Murphy, et al., Microbial Pathogen. 6 (1989) 159-174; Bartos, et al., J. Infect. Dis. 158 (1988) 761-765]. Ulkomembraaniproteiinien C ja D näennäiset suhteelliset moolimassat eroavat jonkin verran toisistaan, joten ne esiintyvät SDS-PAGE-elektroforeesissa omana vyöhykeparinaan. B. 15 catarrhalista vastaan on kehitetty monoklonaalista vastaaineita, minkä tuloksena on saatu kaksi monoklonaalista vasta-ainetta 7D6 ja 5E8, jotka tunnistavat sekä proteiinin C että proteiinin D [Sarwar, et al., Infect. Immun. 60 (1992) 804-809]. Ennen tätä keksintöä ei tiedetty, tar- 20 koittiko tämä vyöhykepari yhtä proteiinia (CD), j olla on kaksi pysyvää konformaatiota, vai ovatko C ja D kaksi eri geenien koodaamaa läheisesti toisiinsa liittyvää proteiinia (Sarwar, et al., edellä). Proteiinit C ja D ovat kiinnostuksen kohteena erityisesti rokotteen kehittämisen kannalta, koska nämä proteiinit ilmentävät vähintään yhtä säilynyttä epitooppia ehjän B. catarrhaliksen pinnalla [Sarwar, et al. (1992), edellä]. : 30 ; ; ; * : 35 ;... Sen myötä, että B. catarrhalis tunnustetaan lisääntyvässä määrin merkittäväksi bakteeripatogeeniksi, on siis olemassa tarve saada käyttöön rokote, joka on immunogeeninen lapsilla ja aikuisilla. Tällaisen rokotteen täytyisi kohdistua bakteerin komponenttiin, joka sisältää ehjien bakteerien pinnalla esiintyvän epitoopin, joka epitooppi on säilynyt eri B. catarrhalis -kannoissa.
Keksinnön yhteenveto 5 Tehdyt tutkimukset liittyvät proteiiniin ja peptideihin, liittyen B. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiiniin, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 55 000-5 60 000 daltonia ja jonka proteiinin arveltiin aikaisemmin olevan kaksi toisiaan muistuttavaa proteiinia, C ja D, mutta jonka tässä keksinnössä kuvattujen yhdistelmä-dna-menetelmien avulla tiedetään nykyisin olevan yksi proteiini, CD, joka on lämmön vaikutuksesta muuntuva, minkä seurauksena 10 SDS-geeleissä havaitaan kaksi eri nopeudella liikkuvaa proteiinia. Tässä esitetyn mukaista CD-proteiinia ja sen peptidejä (näitä käytetään tässä keksinnössä nimitystä "CDpeptidit") ja oligopeptidejä (näistä käytetään tässä keksinnössä nimitystä "CD-oligopeptidit") voidaan käyttää immuno- 15 geeneinä profylaktisissa ja/tai terapeuttisissa rokoteformulaatioissa; tai antigeenina diagnostisissa immunomäärityksissä, jotka on suunnattu B. catarrhalis -infektion havaitsemiseen määrittämällä seerumista B. catarrhalikselle spesifisen vasta-aineen tiitterin kohoami- 20 nen. Tässä esitetyn mukaista CD-proteiinia ja sen mukaisia CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan käyttää myös sellaisen CD-spesifisen vasta-aineen muodostamiseen, joka voi olla käyttökelpoinen passiivisessa immunisaatiossa, sekä reagensseina diagnostisissa määrityksissä, jotka on suunnat- 25 tu B. catarrhaliksen havaitsemiseen kliinisistä näytteistä. CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä voidaan saada aikaan syntetoimalla niitä kemiallisesti, puhdistamalla B. catarrhaliksesta tai tuottamalla yhdistelmä-ilmentämisvektorijärjestelmillä käyttäen tässä keksinnössä kuvattuja 30 nukleiinihapposekvenssejä. Yksi tämän keksinnön sovellutusmuoto kohdistuu menetelmään sellaisten uusien DNA-sekvenssien ja vektorien, kuten plasmidi-dna:n ja virus-dna:n, kuten humaanivirusten, eläin- 35 virusten, hyönteisvirusten tai bakteriofagien, konstruoimiseksi, joita voidaan käyttää ohjaamaan CD-proteiinin, CD-peptidien tai CD-oligopeptidien ilmentymistä sopivissa isäntäsoluissa, joista
6 ilmentynyt proteiini tai ilmentyneet peptidit voidaan puhdistaa. Vastaavasti kuvataan myös menetelmiä CD:tä koodaavan geenin 5 ja CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä koodaavien geenifragmenttien molekulaariseksi kloonaamiseksi. Tämän keksinnön mukaisia nukleiinihapposekvenssejä voidaan käyttää molekulaarisissa diagnostisissa määrityksissä B. catarrhaliksen geneettisen materiaalin määrittämiseksi 10 nukleiinihappohybridisaatiota käyttäen, ja lisäksi sellaisten CD-sekvenssille spesifisten oligonukleotidien synteesissä, joita voidaan käyttää alukkeina ja/tai koettimina nukleiinihappojen monistuksessa ja monistettujen nukleiinihappojen havaitsemisessa. 15 CD-proteiinia, CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan lisäksi käyttää immunogeeneinä profylaktisissa ja/tai terapeuttisissa rokoteformulaatioissa B. catarrhaliksen patogeenisiä kantoja vastaan katsomatta siihen, onko immunogeeni 20 syntetisoitu kemiallisesti, puhdistettu B. catarrhaliksesta vai puhdistettu yhdistelmä-ilmentämisvektorijärjestelmästä. CD:tä koodaava geeni tai yksi tai useampi CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä koodaava geenifragmentti voidaan vaihtoehtoisesti liittää bakteeri- tai virusrokotteeseen, joka 25 sisältää sellaista yhdistelmä-bakteeria tai -virusta, jota on muunnettu siten, että se itse tuottaa CD:n yhtä tai useampaa immunogeenistä epitooppia, tai se voidaan liittää rokotteeseen yhdistelmänä muiden patogeenisten mikro-organismien immunogeenisten epitooppien kanssa. Toiminnallisesti 30 yhteen tai useampaan säätely-yksikköön kytkettynä oleva CD:tä koodaava geeni tai yksi tai useampi CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä koodaava geenifragmentti voidaan lisäksi viedä suoraan ihmisiin ilmentämään CD-proteiinia, CD-peptidiä tai CD-oligopeptidejä suojaavan immuunivasteen aikaan- 35 saamiseksi. Täsmällisemmin keksinnön kohde on kuvattu oheisissa patenttivaatimuksissa.
7 Piirrosten pääpiirteittäinen kuvaus Kuvio 1 on kartta plasmidista pcd-1, joka on konstruoitu petllb:stä ja CD:tä koodaavan geenin sisältävästä 2,4 ke:n suuruisesta fragmentista. Varjostettu alue esittää DNA- 5 insertiosekvenssiä ja tummemmalla varjostettu alue esittää CD-geeniä. Käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: Ap: ampisilliiniresistenssiä koodaava alue; Lac: lac-operoni, ep: emäspari. 10 Kuvio 2 on kartta plasmidista pcd-2, joka on konstruoitu pgemzf-:sta ja CD:tä koodaavan geenin sisältävästä 1,5 ke:n fragmentista. Varjostettu alue esittää DNA-insertiosekvenssiä ja tummemmalla varjostettu alue esittää CD-geeniä. Käytetyt lyhenteet ovat seuraavat: Ap: ampisilliiniresis- 15 tenssiä koodaava alue; Lac: lac-operoni, ep: emäspari.. Kuvio 3 on immunoblottimääritys, jossa on käytetty kokosolulysaatteja, jotka ovat: kanava a: pgem7zf-:11a transformoitu E. coli; kanava b: CD:tä koodaavan geenin sisältävällä pcd- 20 2:11a transformoitu E. coli HB101; ja kanavat c ja d: B. catarrhalis -kanta 25240. Kanavat b ja c sisältävät yhtä suuret määrät proteiinia (- 20 gg) kun taas kanava d sisältää vähemmän proteiinia, minkä tarkoituksena on osoittaa CD:lle tyypillinen vyöhykepari. Näytteitä inkuboitiin 25 100 C:ssa 10 minuutin ajan näytepuskurissa, jonka koostumus oli 0,06 M Tris, 1,2 % natriumdodekyylisulfaattia, 12 % glyserolia ja 5,8 % fl-merkaptoetanolia. Immunoblottimääritys kehitettiin vasta-aineella 5E8, joka tunnistaa CD-proteiinin pinnalla olevan epitoopin. Suhteellisten moolimassojen. 1 ): 30 markkerit on esitetty vasemmalla puolella tuhansina dal- : *.. -.. 3 5 : toneina. Kuvio 4 on Southern-blottimääritys, jossa 13 B. catarrhalis -kannan puhdistetut genomiset DNA-molekyylit pilkottiin EcoRI:llä ja jossa koettimena käytettiin kahta leimalla varustettua CD-geenisekvenssiä vastaavaa oligonukleotidia. 3,7 ke:n vyöhykettä osoittava nuoli esittää fragmenttia,
8 joka sijaitsee vastasuuntaan CD:tä koodaavasta geenistä olevan EcoRI-kohdan suhteen, ja 325 emäsparin vyöhykettä osoittava nuoli esittää EcoRI-kohdasta myötäsuuntaan olevaa fragmenttia. Kanavat sisältävät DNA:ta kannoista, jotka 5 vasemmalta oikealle lueteltuina ovat: 105, 112, 135, 3, 6, 10, 20, 27, 31, 40, 42, 45, 56. Kuvio 5 on Southern-blottimääritys, jossa 14 B. catarrhalis -kannan puhdistetut genomiset DNA-molekyylit pilkottiin 10 EcoRI:llä ja PstI:llä ja jossa koettimena käytettiin leimalla varustettua oligonukleotidia, joka vastaa CD:tä koodaavan geenin EcoRI - ja PstI-kohtien välissä olevaa sekvenssiä. Kanavat sisältävät DNA:ta kannoista, jotka vasemmalta oikealle lueteltuina ovat: 555, 556, 585, 3583, 4223, 4629, 15 5193, 6951, 9928, 25240, M3, M3, M9. Kuvio 6 on coomassiesinellä värjätty tricine-natriumdodekyylisulfaattigeeli. Kanava A: puhdistettu CD. Kanava B: syanogeenibromidilla pilkottu puhdistettu CD. Nuolet osoit- 20 tavat syanogeenibromidilla suoritetusta pilkkomisesta saatuja fragmentteja (näiden fragmenttien lasketut koot on esitetty taulukossa 2). Kanavassa B olevan suuren fragmentin alla oleva kaksoisvyöhyke on seurausta CD:n yhteydessä usein havaittavasta proteiinin epäspesifisestä proteolyyttisestä 25 hajoamisesta. Suhteellisten moolimassojen markkerit on esitetty oikealla puolella tuhansina daltoneina. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö kohdistuu menetelmään rokotteen 30 valmistamiseksi, joka rokote sisältää B. catarrhalis -bakteerin ulkomembraaniproteiinia, ja sen peptidejä, joissa proteiinille on annettu nimi "CD". CD-proteiini liikkuu SDS-PAGE:a käyttäen tutkittuna lämmössä muokkautuvalle proteiinille luonteenomaisesti kanden vyöhykkeen 35 parina, jonka näennäinen suhteellinen moolimassa on noin 55 000-60 000 daltonia. CD:tä koodaavasta geenistä käy yhden tämän keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin (SEQ ID NO:14) perusteella ilmi, että kypsän CD-proteiinin ennuste-
9 5 10 15 tun aminohapposekvenssin laskettu suhteellinen moolimassa on noin 45 788 daltonia. Tämän keksinnön mukaista CD-proteiinia, CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan valmistaa tässä keksinnössä kuvatuilla yhdistelmä-dna-menetelmillä tai niitä voidaan syntetisoida kemiallisesti tässä keksinnössä kuvatun aminohapposekvenssin perusteella. Peptidejä voidaan lisäksi valmistaa pilkkomalla kypsää proteiinia entsymaattisesti tai kemiallisesti. Immunogeenisen(siä) epitoopin(peja) sisältävää CD-proteiinia, CD-peptidejä ja CD-oligopeptidejä voidaan käyttää immunogeeneinä monissa erilaisissa rokoteformulaatioissa B. catarrhaliksen aiheuttaman välikorvantulehduksen, sinuiitin, konjunktiviitin ja alempien hengitysteiden infektioiden estämiseksi. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettua CD-proteiinia ja CD-peptidejä voidaan käyttää lisäksi sellaisten B. catarrhalista vastaan spesifisten antiseerumien muodostamiseen, jotka ovat käyttökelpoisia passiivisessa immunisaatiossa B. catarrhaliksen aiheuttamia infektioita vastaan.... : :: 30.. 20 25... 35 tyn Tästä keksinnöstä saadaan lisäksi käyttöön CD:tä koodaavan geenin nukleotidisekvenssi sekä eristetystä geenistä päätelty aminohapposekvenssi. Tämän keksinnön yhden sovellutusmuodon mukaisesti ilmentämisvektoriin liitetään yhdistelmä- DNA-menetelmiä käyttäen CD:tä koodaava geeni tai yhden tai useamman immunogeenisen epitooppin sisältävää CD-peptidiä koodaavia geenifragmentteja, ja yhdistelmävektori liitetään sopivaan isäntäsoluun, mikä siten ohjaa näiden sekvenssien ilmentymistä juuri tässä isäntäsolussa. Isäntäsoluun liiteyhdistelmävektorin sisältävää ilmentämisjärjestelmää voidaan käyttää (a) sellaisen CD-proteiinin ja sellaisten CD-peptidien ja CD-oligopeptidien valmistamiseen, jotka voidaan puhdistaa käytettäväksi immunogeeneinä rokoteformulaatioissa; (b) sellaisen CD-proteiinin ja sellaisten CD-peptidien ja CD-oligopeptidien valmistamiseen, joita on.. tarkoitus käyttää antigeeninä diagnostisissa immuno- määrityksissä tai joita on tarkoitus käyttää sellaisten B...... catarrhalista kohtaan spesifisten antiseerumien valmistuk-
10 seen, joilla on terapeuttista ja/tai diagnostista käyttöä; (c) tai jos ilmentämiseen käytetty yhdistelmävektori on elävä virus, kuten vacciniavirus, niin vektoria itsessään voidaan käyttää elävänä tai inaktivoituna rokotevalmisteena, 5 joka on tarkoitus viedä isännän soluihin CD:n tai immunogeenisten CD-peptidien tai CD-oligopeptidien ilmentämiseksi; (d) sen viemiseen eläviin heikennettyihin bakteerisoluihin, joita käytetään CD-proteiinin, CD-peptidien tai CD-oligopeptidien ilmentämiseen; (e) tai sen viemiseen suoraan 10 potilaaseen sen koodaamaa ja ilmentämää CD-proteiinia, CDpeptidiä tai CD-oligopeptidiä vastaan suunnattua immunisaatiota varten. Tämän keksinnön kuvaamistarkoituksissa valaistaan tämän 15 keksinnön mukaisia menetelmiä ja yhdisteitä seuraavissa sovellutusmuodoissa, jotka ovat: 20 torit; Sovellutusmuoto A- CD:tä koodaavan geenin molekulaarinen kloonaus ja sekvensointi ja CD-epitooppeja ilmentävät vek- Sovellutusmuoto B- CD:tä koodaavan geenin säilyneisyys eri B. catarrhalis -kannoissa; Sovellutusmuoto C- Menetelmiä CD:Ile spesifisten nukleotidisekvenssien käyttämiseksi molekyylidiagnostisissa määrityksissä B. catarrhaliksen havaitsemiseksi; Sovellutusmuoto D- CD:n luonnehtiminen CD-peptidien muodos- 30 taminen mukaan luettuna;, 35 : Sovellutusmuoto E- Menetelmiä CD:n, tai CD-peptidien, käyttämiseksi diagnostisissa immunomäärityksissä; Sovellutusmuoto F. Menetelmiä ja yhdisteitä, jotka on tarkoitettu CD:hen ja CD-peptideihin liittyviin rokoteformulaatioihin.
11 Sovellutusmuoto A CD:tä koodaavan geenin molekulaarinen kloonaus ja sekvensointi ja CD-epitooppeja ilmentävät vektorit. 1: ** 5 Käytettynä strategiana oli genomin DNA:n eristäminen B. catarrhaliksesta, eristetyn DNA:n pilkkominen fragmenteiksi, sellaisen genomisen kirjaston konstruointi, johon kuuluu fragmenttien liittäminen ilmentämisvektoriin, yhdistelmävektorien liittäminen sopivaan isäntäsoluun ja CD:lle spesi- 10 fisiä epitooppeja ilmentävien isäntäsolukloonien immunologinen seulonta CD:lle spesifisiä antiseerumeja käyttäen. Genomisen bakteeri-dna:n lähtömateriaalina käytettiin B. catarrhalis -kantaa 25240, joka saatiin American Type Culture Collection -talletuslaitoksesta (ATCC). B. 15 catarrhalista kasvatettiin suklaa-agarmaljoilla 37 C:ssa 5-%:isessa CO2:ssa tai aivosydäninfuusiolihaliemessä. Bakteriofagi lambda-gtll:n genomisen kirjaston isäntäkantana käytettiin Escherichia coli (E. coli) Y1090:aa. Olosuhteiden mukaan E. colia kasvatettiin LB-lihaliemessä tai 50 gg/m1 20 ampisilliinia sisältävällä LB-agarilla. Kloonien immunologisessa seulonnassa käytettyjä monoklonaalisia vasta-aineita olivat 5E8 ja 7D6, jotka tunnistavat eri epitooppeja B. catarrhaliksen ulkomembraaniproteiini CD:n pinnalta (Sarwar, et al., edellä). Vasta-aine 5E8 on IgM-vasta-aine ja se 25 tunnistaa ehjän bakteerin pinnalla esillä olevan epitoopin. Vasta-aine 7D6 on I gg2 a -vasta-aine ja se sitoutuu epitooppiin, joka ei ole reaktiokykyinen pinnalta käsin tutkittuna. I. 35 :. B. catarrhalis 25240:n genomin DNA:sta konstruoitiin lambdagt11-kirjasto käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [Nelson, et al., Infect. Immun. 56 (1988) 128-134]. Agaroosigeelistä eluoitiin 2-8 kiloemäksen (ke) kokoisia genomisen DNA:n fragmentteja ja ne liitettiin ligaasilla faagin käsivarsiin. Osa kirjastosta liitettiin E. coli Y1090:aan ja tästä saadut plakit siirrettiin nitroselluloosakiekoille ja ne seulottiin immunologisesti käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita 5E8 ja 7D6. Kiekkoja
12 inkuboitiin ensin yön yli monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, minkä jälkeen niitä inkuboitiin proteiini-a-peroksidaasin ja anti-hiiri-igm-peroksidaasikonjugaatin kanssa ja ne kehitettiin seuraavaksi substraatilla immunologisesti 5 reagoivien plakkien tunnistamiseksi. Yhteensä noin 554 000 plakin seulonnan tuloksena saatiin 387 emäsparin insertiosekvenssin sisältävä klooni, joka ilmensi vastaaineiden 7D6 ja 5E8 tunnistamia epitooppeja. Tämän kloonin sisältämälle insertiosekvenssille tehdyssä nukleotidi- 10 sekvenssianalyysissä havaittiin avoin lukukehys, jossa ei ollut lainkaan aloitus- eikä lopetuskodoneita (SEQ ID NO:1). Tämän kloonin nukleotidisekvenssi vastaa nukleotidejä 775-1160 SEKVENSSISSÄ ID NO 14, joka sisältää koko CD:tä koodaavan geenisekvenssin. Kuten SEKVENSSISTÄ ID NO:1 käy ilmi, 15 tämän kloonin muodostama peptidi vastaa SEKVENSSISSÄ ID NO:14 kuvatun kypsän proteiinin aminohappoja 203-331.. 25. MJ...... Koska genomista lambda-gtll-kirjastoa useaan kertaan seulo- malla saatiin aikaan pieni CD-geenin fragmentti, niin B. 20 catarrhalis 25240:n genomin DNA:sta konstruoitiin EMBL3- kirjasto, jossa insertiosekvenssien koot olivat noin 9-23 ke. Tätä kirjastoa seulottiin immunologisesti käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita 5E8 ja 7D6. Genominen EMBL3- kirjasto konstruoitiin tällä alalla tunnetuilla menetelmillä [Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989), kustantaja John Wiley and Sons] ja valmistajan (Stratagene, LaJolla, CA) suositusten mukaisesti. Yksityiskohtiin puuttumatta, B. catarrhalis 25240:n genomin DNA puhdistettiin SDS:llä, proteinaasi K:lla ja CTAB:lla. Puh-. 30 distettu genomin DNA pilkottiin osittain Sau3A:lla, erisuuruisten fragmenttien aikaansaamiseksi. DNA-fragmentit erotettiin sakkaroosigradienttisentrifugoinnilla 10.. 40-%:isessa sakkaroosigradientissa. Noin 9-23 kiloemäksen. fragmentteja sisältävät fraktiot defosforyloitiin vasikan.. 35 alkalisella fosfataasilla ja saostettiin etanolilla, minkä : tarkoituksena oli valmistella fragementit liitettäväksi.. EMBL3:n käsivarsiin. Noin 0,7 gg näitä genomin DNA:n frag-..
13 mentteja liitettiin T4-DNA-ligaasilla 1 gg:aan EMBL3-käsivarsia. Ligaasilla toisiinsa liitetyt faagin käsivarret ja insertiosekvenssit pakattiin faagiin ja kirjaston tiitteri määritettiin maljaamalla se E. coli P2 392:een, joka on 5 genomisen lambda-embl3 kirjaston isäntäkanta. Genomista EMBL3-kirjastoa seulottiin immunologisesti monoklonaalisilla vasta-aineilla 5E8 ja 7D6 edellä kuvatulla tavalla. Kun noin 3 500 EMBL-kirjastosta saatua plakkia oli seulottu 10 immunologisesti, saatiin yksi reagoiva plakki, jolle annettiin nimitys klooni 5. Puhdistettu klooni määritettiin erikseen vasta-aineilla 5E8 ja 7D6 ja se reagoi kummankin vastaaineen kanssa. Kontrollitutkimukset osoittivat, ettei proteiini A eikä anti-hiiri-igm-peroksidaasikonjugaatti sitou- 15 tunut kloonin 5 plakkeihin. noonista 5 peräisin oleva faagi-dna puhdistettiin ja se pilkottiin Sali:llä insertiosekvenssin poistamiseksi. Agaroosigeelielektroforeesilla saatiin selville, että kloo- 20 nissa 5 oli 13 ke:n suuruinen insertiosekvenssi. Insertiosekvenssi pilkottiin useilla restriktioentsyymeillä ja sille tehtiin Southern-blottimääritys. Blottia käsiteltiin käyttäen koettimena oligonukleotidiä, joka vastaa lambda-gt11-. kirjastosta saatua CD-geenin 387 ep:n fragmentin DNA-sek- 25 venssiä. CD:tä koodaava geeni paikallistuu suoritettujen 9 f*,. '47. 4 määritysten mukaan 2,4 ke:n Ncol - Sali -fragmenttiin. Tämä 2,4 ke:n fragmentti jatkokloonattiin pet11b:n (Novagen, Madison, WI) BamH1-kohtaan tasoittamalla sen päät ensin Klenowin DNA-polymeraasilla ja liittämällä BamH1-kytkijä- 30 sekvenssit sitten ligaasilla insertiosekvenssiin. Tulokseksi saadulle 2,4 ke:n insertiosekvenssin sisältävälle plasmidille annettiin nimitys pcd1 (kuvio 1). Plasmidia petllb sekä yhdistelmä-pcd1:tä kasvatettiin E. coli HB101:ssä agarilla, joka sisälsi ampisilliinia 50 µg/ml. pcdl:tä sisältävistä - 5 3 transformoiduista soluista tehdylle kokosolulysaatille ; :.49 tehtiin SDS-PAGE ja immunoblottimääritys vasta-aineilla 7D6 1,
14 ja 5E8. Tulokset osoittavat, että pcd1 koodaa kummankin vasta-aineen kanssa reagoivaa täysimittaista CD-proteiinia. pcd1:n 2,4 ke:n suuruisen insertiosekvenssin kumpikin 5 1727 ep:n suuruinen juoste sekvensoitiin dideoksimenetelmällä käyttäen apuna vielä muita oligonukleotideja, jotka oli syntetisoitu siten, että ne vastasivat insertiosekvenssin sekvenssiä sopivien välimatkojen päässä toisistaan, kuten SEKVENSSEISTÄ ID NO:2-13 käy ilmi. Tunnistettiin 10 453 aminohapon mittainen avoin lukukehys (SEQ ID NO:14), joka edustaa 48 277 daltonin suuruista proteiinia. Sekvenssissä havaittiin voimakas transkription terminaattori, joka alkoi 54 ep:n kohdalla lopetuskodonista myötäsuuntaan. 15 Kypsän proteiinin laskettu suhteellinen moolimassa (47 788 daltonia) poikkesi merkittävästi SDS-PAGE:ssa havaitusta OMP-CD:n näennäisestä suhteellisesta moolimassasta (pelkistyneenä 60 000 daltonia tai pelkistymättömänä 55 000 daltonia). Tästä syystä konstruoitiin plasmidi, joka 20 sisälsi avoimen lukukehyksen ilman myötäsuuntaan sijaitsevaa sekvenssiä sen määrittämiseksi, saako tämän lukukehyksen ilmentyminen aikaan täysikokoisen CD-proteiinin. Avoimesta lukukehyksestä 48 ep myötäsuuntaan sijaitsee Cla1-kohta. Uutta plasmidia pcd2 (kuvio 2) konstruoitaessa jatkokloonat- 25 tiin oletetun CD-geenin sisältävä 1558 ep:n BamHl - Clal -DNA-fragmentti pgem7zf-:een (Promega Corp., Madison, WI).. Kuviossa 3 (kanava b) esitetyn immunoblottimäärityksen perusteella pcd2:n sisältävissä transformoiduissa E. coli -soluissa ilmentyy täysikokoista CD-proteiinia. Tämän lisäk- 30 si immuhoblottimäärityksessä havaitaan, että CD-geenituote. liikkuu vyöhykeparina (kanava b), mikä osoittaa, että molemmat vyöhykkeet edustavat paremminkin yhden geenin tuotteita kuin että ne edustaisivat vastaavien geeniensä tuottamaa.. kahta lähisukuista proteiinia. 35 Tässä sovellutusmuodossa on siten esitetty esimerkki siitä, että CD:tä tai sen osia koodaavia nukleotidisekvenssejä
15 voidaan liittää moniin erilaisiin vektoreihin, kuten faageihin ja plasmideihin, ja ilmentää niitä näiden avulla. Suotuisiin tuloksiin näiden proteiinien ja peptidien ilmentämisessä vaaditaan sitä, että joko geenin tai geenifragmentin 5 sisältävä insertiosekvenssi tai vektori itsessään sisältää jonkin transkriptioon tai translaatioon tarvittavan elementin, joka on yhteensopiva tietyn nimenomaisen ilmentämiseen käytetyn isäntäjärjestelmän suhteen ja jonka isäntäjärjestelmä tunnistaa. CD-proteiinia, CD-peptidejä tai CD- 10 oligopeptidejä koodaava DNA voidaan syntetisoida tai eristää ja sekvensoida käyttäen menetelmiä ja alukesekvenssejä esitetyssä muodossaan tämän keksinnön sovellutusmuotojen A, B ja D mukaisesti. CD-proteiinin, CD-peptidien ja CD-oligopeptidien ilmentämiseen voidaan käyttää monia erilaisia 15 isäntäjärjestelmiä, joita ovat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, bakteriofagivektorilla, plasmidivektorilla tai kosmidi-dna:lla transformoidut bakteerit; hiivavektoreita sisältävät hiivat; sienivektoreita sisältävät sienet; viruksella (esimerkiksi bakuloviruksella) infek- 25 20 toidut hyönteissolulinjat; ja plasmidi- tai virusilmentämisvektorilla transfektoidut tai yhdistelmäviruksella (esimerkiksi vacciniaviruksella, adenoviruksella, adenoassociated-viruksella, retroviruksella ja niin edelleen) infektoidut nisäkässolulinjat. CD-aminohapposekvenssejä, toisin sanoen yhdistelmä-ulkomembraaniproteiini-cd:tä, CD-peptidiä tai CD-oligopeptidiä, koodaavaan vektoriin tai DNA-sekvenssiin voidaan molekyylibiologian alalla tunnettuja menetelmiä, edellä kuvatut 30 menetelmät mukaan luettuna, käyttäen liittää monia erilaisia promoottoreita ja käynnistäjiä CD-aminohapposekvenssin ilmentymisen tehostamiseksi edellyttäen, että CD-aminohapposekvenssien tehostunut ilmentyminen on käytetyn nimenomaisen isäntäsolujärjestelmän suhteen yhteensopivaa (esimerkiksi 35 ei-toksista). On merkittävää, että DNA-sekvenssi voi näin ollen muodostua CD-proteiinia koodaavasta geenistä tai mistä tahansa tämän geenin segmentistä, joka koodaa CD-proteiinin
16 funktionaalista epitooppia. Tämä DNA voidaan lisäksi fuusioida muita antigeenejä, kuten muiden bakteerien ulkomembraaniproteiineja tai muiden bakteerien, sienten, loisten tai virusten antigeenejä, koodaaviin DNA-molekyyleihin, 5 minkä tarkoituksena on muodostaa geneettisesti fuusioitu (yhteisen peptidirungon jakava) multivalenttinen antigeeni, jota voidaan käyttää parannettuna rokotekoostumuksena. Promoottorin valinta määräytyy käytetyn ilmentämis- 10 järjestelmän mukaan. Promoottorien voimakkuus eli niiden kyky edistää transkriptiota vaihtelee. Kloonattua geeniä ilmennettäessä on yleisesti ottaen haluttua käyttää voimakasta promoottoria, jotta geenin transkriptiotaso ja sen ilmentyminen geenituotteeksi saadaan suureksi. CD-amino- 15 happosekvenssejä koodaavan liitetyn DNA-sekvenssin transkription aikaansaamiseen voidaan käyttää esimerkiksi tällä alalla tunnettuja bakteeri-, faagi- tai plasmidipromoottoreita, joiden yhteydessä on havaittu suuri transkriptiotaso E. colin sisältävässä isäntäsolujärjestelmässä ja joita ovat 20 lac-promoottori, trp-promoottori, reca-promoottori, ribosomaalisen RNA:n promoottori, P R - ja PL-promoottorit, lac, UV5, ompf, bla, lpp ja muut näitä vastaavat promoottorit. Jos tämän lisäksi CD-proteiini, CD-peptidit tai CD-oligo- - 25 peptidit sattuisivat olemaan letaaleja tai haitallisia. isäntäsoluille, niin isäntäsolukanta/linja ja ilmentämis- 1 : vektori voidaan valita siten, että promoottorin toiminta on estynyt spesifiseen induktioon asti. Liitetyn DNA:n tehok- kaan transkription aikaansaamiseksi tiettyihin operoneihin t. : * : 30 on esimerkiksi tarpeen liittää spesifisiä induktoreja (esi- : : merkiksi laktoosin tai isopropyylitio-beeta-d-galaktosidin lisääminen indusoi lac-operonin). Monet erilaiset operonit,. kuten trp-operoni, ovat toisenlaisten säätelymekanismien alaisia. Trp-operoni indusoituu kun kasvatusliuoksessa ei. 35 ole tryptofaania. PL -promoottori voidaan indusoida kohot-. tamalla lämpötilaa isäntäsoluissa, joissa on lämpöherkkä : : lambda-repressori. Tällä tavoin yli 95 s promoottorin ohjaa-
17 masta transkriptiosta pystytään estämään indusoitumattomissa soluissa. Näin ollen yhdistelmä-cd-proteiinin, CD-peptidien tai CD-oligopeptidien ilmentymistä voidaan säädellä viljelemällä transformoituja ja transfektoituja soluja sellaisissa 5 olosuhteissa, joissa CD-aminohapposekvenssejä koodaavasta 10 DNA:sta tapahtuvaa ilmentymistä ohjaava promoottori ei indusoidu, ja promoottori voidaan indusoida liitetyn DNA:n ilmentämiseksi, kun solujen määrä kasvatusliuoksessa saavuttaa sopivan tiheyden. Muita geenin tehokkaan transkription tai lähettimolekyylien translaation säätely-yksikköjä ovat käynnistäjät ja säätelysignaalit. Käynnistäjäsekvenssit ovat DNA-yksikköjä, jotka ilmeisesti lisäävät transkription tehokkuutta tavalla, joka 15 on suhteellisen riippumaton niiden sijainnista ja suuntautumisesta läheisen geenin suhteen. Niinpä käynnistäjä voidaan käytetyn isäntäsoluilmentämisvektorin mukaan sijoittaa transkription tehokkuuden lisäämiseksi joko CD-aminohapposekvenssejä koodaavien liitettyjen DNA-sekvenssien suhteen 20 myötäsuuntaan tai vastasuuntaan. Kuten tässä sovellutusmuodossa on aikaisemmin esitetty, on tunnistettu myös muita spesifisiä säätelysekvenssejä, jotka saattavat vaikuttaa CD:tä koodaavan geenin ilmentymiseen. Näitä tai muita säätelykohtia, kuten transkription tai translaation aloitus- 25 signaaleja, voidaan käyttää ohjaamaan CD:tä koodaavan geenin tai sen geenifragmenttien ilmentymistä. Tällaisia säätely- t : yksikköjä voidaan liittää CD-aminohapposekvenssejä koodaaviin DNA-sekvensseihin tai niiden lähellä sijaitseviin. vektori-dna-sekvensseihin käyttäen tässä keksinnössä DNA- t : 30 sekvenssien liittämisen yhteydessä kuvattuja yhdistelmä-dna- menetelmiä. Edellä kuvatun mukaisesti CD-proteiinia, CD-peptidejä tai CD-oligopeptidejä koodaavia alueita sisältäviä B. 35 catarrhaliksen nukleotidejä voidaan liittää ligaasilla spesifiseen kohtaan ilmentämisvektorissa suhteessa vektorin promoottori-, ohjaus- ja säätely-yksikköihin niin, että B.
18 catarrhaliksen CD:lle spesifiset DNA-sekvenssit pystyvät ilmentymään isäntäsolussa, kun yhdistelmä-vektori viedään isäntäsoluun. Esimerkiksi CD:lle spesifiset DNA-sekvenssit, jotka sisältävät omat säätely-yksikkönsä, voidaan liittää 5 ligaasilla ilmentämisvektoriin oikeassa suhteessa tai suuntautuneena oikeaan suuntaan vektorin promoottoriin ja ohjausyksikköihin nähden, jotka mandollistavat CD:n aminohapposekvenssien ilmentymisen. Tämän jälkeen yhdistelmävektori liitetään sopiviin isäntäsoluihin ja isäntäsoluille 10 suoritetaan valinta ja niistä seulotaan esiin yhdistelmävektorin sisältävät solut. Valinta ja seulonta voidaan tehdä tällä alalla tunnetuilla menetelmillä, mukaan luettuna plasmidissa olevan markkerigeenin (esimerkiksi lääkeaineresistenssimarkkerin) ilmentymisen havaitseminen, 15 immunologinen seulonta CD:lle spesifisten epitooppien muodostumisen suhteen käyttäen CD:lle spesifisiä epitooppeja vastaan muodostettuja antiseerumeita ja isännän solujen DNA:n käsittely koettimilla CD:lle spesifisten nukleotidisekvenssien suhteen käyttäen yhtä tai useampaa tässä keksin- 20 nössä kuvattua sovellutusmuodon C mukaista oligonukleotidia ja menetelmää. CD-peptidien tai CD-proteiinin luonnehtimiseen, modifiointiin ja/tai muokkaamiseen voidaan käyttää myös geenien 25 muokkausmenetelmiä. Saattaa esimerkiksi olla haluttua muut- taa ulkomembraaniproteiinin fragmenttia kohdemutageneesillä : suojaavien rakennealueiden ulkopuolisilta alueilta osafragmentin liukoisuuden parantamiseksi, minkä avulla tämä on helpompi puhdistaa. Geenien muokkausmenetelmiä voidaan t:: 30 käyttää lisäksi sellaisten DNA - sekvenssien muodostamiseen, t:: jotka koodaavat osaa CD:n aminohapposekvenssistä. Esimerkiksi SEKVENSSISSÄ ID NO:14 esitetystä sekvenssistä voidaan määrittää, mitä restriktioentsyymiä tai restriktioentsyymien. yhdistelmää voidaan käyttää CD-peptidejä tai CD-oligo- 35 peptidejä koodaavien sekvenssien muodostamiseen. Restriktio-... entsyymien avulla suoritettava valinta voidaan tehdä siten, : ettei tulokseksi saatavan peptidin tai oligopeptidin immuno-
19 loginen potentiaali häviä. Proteiinin antigeenisten kohtien koko saattaa vaihdella, mutta se voivat sisältää noin 7 - noin 14 aminohappoa. Niinpä CD:n kokoinen proteiini voi sisältää monia erillisiä antigeenisiä kohtia; tästä syystä 5 monet geenin osasekvenssit voivat koodata CD:n antigeenisia epitooppeja. Tästä seuraa, että esimerkiksi SEKVENSSIN ID NO:14 opastamana voidaan restriktioentsyymiyhdistelmiä käyttäen muodostaa DNA-sekvenssejä, jotka sopivaan vektoriin liitettynä kykenevät ohjaamaan sellaisten CD:lle spesifisten 10 aminohapposekvenssien (proteiinin, peptidien tai oligopeptidien) tuotantoa, jotka sisältävät yhden tai useamman antigeenisen epitoopin. Sovellutusmuoto B 15 CD:tä koodaavan geenin säilyneisyys B. catarrhalis -kannoissa Jotta tämän keksinnön mukaiset nukleotidisekvenssit olisivat käyttökelpoisia diagnostisissa määrityksissä, täytyy CD:tä 20 koodaavan geenin olla erittäin hyvin säilynyt eri B. catarrhalis -kannoissa. Erittäin hyvin säilynyt geeni tarkoittaa lisäksi myös sitä, että myös proteiinisekvenssi on hyvin säilynyt. Jotta bakteeriproteiini tai -peptidi olisi käyttökelpoinen antigeeninä B. catarrhaliksen aiheuttamia 25 infektioita vastaan suunnatuissa alayksikkörokoteformulaa-... tioissa, täytyy proteiinin tai peptidin sisältää epitoop- peja, jotka ovat sekä immunogeenisia että säilyneitä eri B.. : catarrhalis -kannoissa. Eri B. catarrhalis -kantojen CD-.. geenin säilyneisyysasteen määrittämiseksi monista erilai- : 30 sista kliinisistä ja maantieteellisistä lähteistä saaduista 1: 30 isolaatista puhdistettiin ja analysoitiin niiden genomi-. nen DNA (taulukko 1). Analyysiin kuului DNA:n pilkkominen restriktioentsyymeillä fragmenteiksi ja näiden käsittely oligonukleotidikoettimella, jonka sekvenssi sisältää, mai- 35 nittuihin kuitenkaan rajoittumatta, SEKVENSSIEN ID NO: 2 -... 23 edustamat sekvenssit. t :
20 Taulukko 1 Branhamella catarrhalis -isolaattien lähteet Kliininen esiintymis- 5 kohta Isolaattien määrä Yskös 15 Välikorvaerite 1 7 Nenänielu 3 10 Silmä 2 Kitarisa 1 Veri 1 ATCC2 1 15 1 Välikorvaerite kerättiin tympanosenteesillä. 2. American Type Culture Collection : t.:. ' 1: : : lw Genominen DNA puhdistettiin 30 B. catarrhalis -kannasta (mukaan luettuna 25240). Tilavuudeltaan 30 ml:aan aivosydän- '20 infuusiolihalientä ympättiin yksi pesäke ja sitä inkuboitiin 37 C:ssa ravistellen yön yli. Solut kerättiin sentrifugoimaila 2 200 x g:n voimalla 10 minuutin ajan 4 C:ssa. Solunapit suspendoitiin 7 ml:aan TE-puskuria (0,01 M Tris, ph 8, 0,001 M EDTA, ph 8,0). EDTA:n konsentraatio kohotettiin 25 0,005 M:ksi ja SDS:n konsentraatio kohotettiin 0,5 %:ksi. Tätä suspensiota inkuboitiin 60 :ssa 30 minuutin ajan. Seokseen lisättiin sellainen määrä proteinaasi K:ta, että sen konsentraatioksi tuli 200 gg/ml, minkä jälkeen suspensiota inkuboitiin 37 C:ssa noin 24 tuntia. Näyte uutettiin 30 peräkkäin fenolilla ja sen jälkeen fenolin ja kloroformin suhteessa 1 : 1 valmistetulla seoksella ja sitten kloroformilla yhtä suuria tilavuuksia käyttäen. Seokseen lisättiin 10 tilavuus-% 3 M natriumasetaattia (ph 5,2) ja DNA saostettiin lisäämällä kylmää etanolia, jonka tilavuus 35 vastasi 80 % seoksen tilavuudesta. Genomin DNA saostui ja se poistettiin "kiertämällä" se pasteurpipetin ympärille. DNA pestiin 70-%:isessa etanolissa ja liuotettiin 0,05 M Tris:iin, jonka ph oli 8,0. Seokseen lisättiin sellainen määrä RNaasia, että tämän lopulliseksi konsentraatioksi tuli
21 40 gg/ml, ja näytettä inkuboitiin 37 C:ssa 30 minuutin ajan. Seokseen lisättiin sellainen määrä EDTA:ta, että sen konsentraatioksi tuli 0,001 M. Näyte uutettiin peräkkäin fenolilla ja kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Puh- 5 distettu DNA liuotettiin seokseen, joka sisälsi 0,01 M Tris'ia ja 0,1 mm EDTA:a ja jonka ph oli 8,0. DNA-näyte, joka vastasi suuruudeltaan 10 gg, pilkottiin EcoRI:llä tai PstI:llä reaktiotilavuuden ollessa 0,5 ml. 10 Tästä saadut DNA-fragmentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja siirrettiin varatulle nitroselluloosamembraanille Southern-blottaamalla. Southern-blotit käsiteltiin kandella oligonukleotidikoettimella, joiden sekvenssit vastasivat CD:tä koodaavassa geenissä olevan EcoRI- 15 kohdan suhteen vasta- ja myötäsuuntaan sijaitsevia sekvenssejä (tämä Eco RI -kohta on kuvattu kuviossa 1). Ennen kuin oligonukleotidejä käytettiin koettimina ne oli varustettu toisesta päästään [ 32P] ATP-leimalla T4-polynukleotidikinaasia käyttäen. Hybridisaatiot tehtiin 37 C:ssa ja pesut suori- 20 tettiin 48 C:ssa. Hybridisaatio- ja pesuliuokset on kuvattu aikaisemmin (Nelson, et al., edellä). Autoradiografia tehtiin -70 C:ssa... :: : Kaikista 30 kannasta saatiin identtinen vyöhykekoostumus, 25 mukaan luettuna 325 ke:n vyöhyke, joka edustaa fragmenttia, joka sijaitsee geenissä olevan EcoRI-kohdan ja geenistä myötäsuuntaan sijaitsevan kohdan välissä. Lisäksi kaikissa 30 kannassa havaittiin 3,7 ke:nvyöhyke, joka edustaa CDgeenistä vastasuuntaan sijaitsevaa fragmenttia. Tästä koos- 30 tumuksesta on esitetty esimerkki kuviossa 4, jossa on esi- tetty 13 kannasta tehty Southern-blottimääritys. CD-geenin molekulaarisen säilyneisyyden analysoimiseksi tarkemmin pilkottiin näistä samoista 30 kannasta peräisin. 35 oleva genominen DNA EcoRI:llä ja PstI:llä ja käsiteltiin oligonukleotidikoettimilla. Kuviosta 1 käy ilmi, että kannasta 25240 eristetyssä CD:tä koodaavassa geenissä on PstI-
22 t : Sa kohta geenin keskikohdan läheisyydessä ja että pilkkomalla EcoRI:llä ja PstI:llä saadaan 337 emäsparin mittainen DNAfragmentti. Southern-blottimäärityksistä havaittiin, että kaikista 30 B. catarrhalis -kannasta peräisin olevista 5 genomisista DNA-molekyyleistä saatiin identtinen 337 ep:n fragmentti, joka hybridisoitui oligonukleotidiin, jonka sekvenssi vastasi kannasta 25240 eristetyn CD:tä koodaavan geenin sekvenssiä. Tästä tuloksesta on esitetty esimerkki kuviossa 5, jossa on esitetty 13 kannasta tehty Southern- 1 5 20 10 blottimääritys. Nämä havainnot osoittavat, että CD:tä koodaava geeni on erittäin hyvin säilynyt B. catarrhalis -kannoissa, ja näin ollen tässä keksinnössä esitetyillä nukleotidisekvensseillä on sovellutuksia diagnostiikassa ja rokotteissa. Sovellutusmuoto C Menetelmiä CD:lle spesifisten nukleotidisekvenssien käyttämiseksi molekyylidiagnostisissa määrityksissä B. catarrhaliksen havaitsemiseksi. Koska CD:tä koodaava geeni on säilynyt, kuten sovellutusmuodossa B on kuvattu, niin tämän keksinnön mukaisia nukleiinihapposekvenssejä voidaan käyttää molekyylidiagnostisissa määrityksissä B. catarrhaliksen geneettisen materiaa- 25 lin havaitsemiseksi. Erityisesti voidaan syntetisoida CD:n sekvenssille spesifisiä oligonukleotidejä, joita voidaan käyttää alukkeina ja/tai koettimina B. catarrhaliksesta peräisin olevien nukleiinihappojen monistamisessa ja näiden monistettujen molekyylien havaitsemisessa. Viimeaikaisen 30 molekyylibiologian alalla tapahtuneen edistyksen ansiosta on saatu käyttöön useita keinoja nukleiinihapposekvenssien monistamiseksi entsymaattisesti. Nykyään tavallisimmin käytetyssä menetelmässä, PCR Tm :ssä (polymeraasiketjureaktio, Cetus Corporation), käytetään Taq-polymeraasia, alukkeina 35 tunnettuja sekvenssejä ja lämpösyklikäsittelyä, jolla replikoituvat deoksiribonukleiinihappo (DNA) -juosteet erotetaan ja haluttu geeni monistetaan eksponentiaalisesti. Muita
23 parhaillaan kehitettävänä olevia monistusmenetelmiä ovat LCRTM (ligaasiketjureaktio, BioTechnica International), jossa käytetään hyväksi DNA-ligaasia ja koetinta, joka koostuu kandesta sen DNA-segmentin puolikkaasta, joka on komplemen- 5 taarinen monistettavan DNA:n suhteen; entsyymi-qb-replikaasi (Gene-Trak Systems) ja ribonukleiinihappo (RNA) ~sekvenssitemplaatti, joka on liitetty kopioitavan DNA:n suhteen komplementaariseen koettimeen ja jota käytetään sellaisen DNA-templaatin valmistukseen, joka on tarkoitettu komplemen- 10 taarisen RNA:n valmistamiseksi eksponentiaalisesti; ja NASBATM (nukleiinihapposekvenssiin perustuva monistus, Cangene Corporation), jossa monistettavana nukleiinihapposekvenssinä voi olla RNA:ta tai DNA:ta. 15 Spesifisiin geenisekvensseihin hybridisoitumaan kykeneviä nukleiinihappokoettimia on käytetty suotuisin tuloksin spesifisten patogeenien havaitsemiseen biologisista näytteistä herkkyystasojen lähestyessä arvoa 10 3-10 4 organismia näytteessä (Gene Probes for Bacteria, toim. Macario ja 20 demacario, Academic Press, 1990). Kun lajispesifiset nukleiinihappokoettimet yhdistetään menetelmään, jonka avulla spesifisiä kohde-dna-sekvenssejä kyetään monistamaan, voidaan organismien havaitsemisherkkyyttä kliinisistä näytteistä lisätä huomattavasti. Näiden koettimien avulla saat-.. 25 taa olla mandollista havaita solut suoraan ennen havaitse-.... mista suoritettavaan viljelyyn ja/tai tavanomaisiin bio-.. kemiallisiin tunnistusmenetelmiin turvautumatta. Tämän keksinnön tämä sovellutusmuoto on suunnattu alukkeisiin, joiden avulla voidaan monistaa B. catarrhaliksen CD:tä ::: 30 koodaavan geenin lajispesifisiä sekvenssejä, ja koettimiin, t : : jotka hybridisoituvat spesifisesti näihin monistettuihin DNA-fragmentteihin. Tämän keksinnön mukaisia nukleiinihappo-.. ja käyttämällä ja tämän keksinnön mukaisten menetelmien.. mukaisesti voidaan havaita jopa vain yksi B. catarrhalis 35.... -organismi, kun läsnä on 10 gg/ml vierasta DNA:ta. t : I
24 Tämä sovellutusmuoto kohdistuu lajispesifisiin oligonukleotideihin, joita voidaan käyttää B. catarrhaliksen DNA-sekvenssien monistamiseen, mikäli tätä esiintyy, kliinisistä näytteistä, kuten välikorvaeritteestä, ysköksestä, verestä 5 ja nenänielu-, silmä- ja kitarisaeritteestä, eristetystä DNA:sta; ja sen jälkeen sen määrittämiseen, onko monistumista tapahtunut. Yhdessä tämän keksinnön sovellutusmuodossa käytetään 13. catarrhalikselle spesifistä oligonukleotidialukeparia, jotka hybridisoituvat B. catarrhaliksen genomin 10 DNA:han, jos sitä on kliinisestä näytteessä eristetyssä DNA:ssa, ja joiden avulla näiden kanden reunustavan alukkeen välinen spesifinen genomisen DNA:n sekvenssi voidaan monistaa ensymaattisella synteesillä ja lämpösyklikäsittelyllä. Kukin alukepari on suunniteltu siten, että ne hybridisoitu- 15 vat ainoastaan niihin tämän keksinnön mukaisiin B. catarrhaliksen nukleotidisekvensseihin, joiden suhteen ne on syntetisoitu komplementaarisiksi; kumpikin kuhunkin kaksijuosteisen DNA:n juosteeseen. Tämä reaktio on näin ollen spesifinen vaikka näytteessä esiintyisi jopa mikrogramman 20 luokkaa olevia määriä heterologista DNA:ta. Tämän patenttiselityksen tarkoituksia varten DNA:n positiivisesta (geeni) juosteesta peräisin olevasta alukkeesta käytetään nimitystä "positiivinen aluke" ja juosteen negatiivisesta (komplementaarisesta) sekvenssistä peräsin olevasta alukkeesta käyte-. 25 tään nimitystä "negatiivinen aluke". $ DNA:ta voidaan monistaa millä tahansa kaupallisesti saata-. villa olevalla menetelmällä. DNA:n monistamiseen voidaan. käyttää esimerkiksi polymeraasiketjureaktiota. Sitten kun : 30 alukkeet ovat hybridisoituneet kohde-dna:n vastakkaisiin. juosteisiin, niin lämpötilaa nostetaan siten, että lämmönkestävä DNA-polymeraasi pystyy replikoimaan kanden alukkeen XX. : välisellä alueella olevan spesifisen DNA-segmentin. Tämän jälkeen reaktioseosta käsitellään lämpösykleillä niin, että 35 jokaisen syklin aikana alukkeiden välisiä sekvenssejä edustavan DNA:n määrä kaksinkertaistuu ja tämän seurauksena B. catarrhaliksen DNA-sekvenssit monistuvat spesifisesti,