Kemian tekniikan korkeakoulu Kemian tekniikan tutkinto-ohjelma Sarita Naukkarinen Lahottajasienten diversiteetin ja lajiston tutkiminen lahopuusta DGGEanalyysin avulla boreaalisessa metsässä ja laboratorio-olosuhteissa. Diplomityö, joka on jätetty opinnäytteenä tarkastettavaksi diplomiinsinöörin tutkintoa varten Espoossa 18.11.2013. Valvoja Prof. Sakari Kulmala Ohjaaja MMT Raisa Mäkipää
Aalto-yliopisto, PL 11000, 00076 AALTO www.aalto.fi Diplomityön tiivistelmä Tekijä Sarita Naukkarinen Työn nimi Lahottajasienten diversiteetin ja lajiston tutkiminen lahopuusta DGGEanalyysin avulla boreaalisessa metsässä ja laboratorio-olosuhteissa. Laitos Biotekniikan ja kemian tekniikan laitos Professuuri Analyyttinen kemia Työn valvoja Professori Sakari Kulmala Työn ohjaaja/työn tarkastaja MMT Raisa Mäkipää Professuurikoodi KE211-3 Päivämäärä 18.11.2013 Sivumäärä 85 Kieli Suomi Tiivistelmä Diplomityön tarkoituksena oli tutkia lahottajasienten monimuotoisuutta lahopuussa ja sienilajiston vähenemisen vaikusta puuaineksen hajoamisnopeuteen sienten luonnollisessa ympäristössä ja laboratorio-olosuhteissa. Työ suoritettiin Metsäntutkimuslaitoksessa ja käsitti kaksi tutkimusosiota. Ensimmäisessä tutkimusosiossa haluttiin selvittää talousmetsien metsänhoidon vaikutusta puissa eläviin lahottajasieniyhteisöihin ja niiden puunhajotuskykyyn. Näytteinä käytettiin hoidetuissa talousmetsissä ja luonnontilaisissa metsissä useita vuosia lahonneita samanlaisia koetukkeja, joiden sienilajistoa ja puun hajoamista vertailtiin keskenään. Sienilajiston monimuotoisuutta tutkittiin eristämällä sienten DNA suoraan ympäristönäytteistä, monistamalla polymeraasiketjureaktiolla (PCR) selektiivisten alukkeiden avulla ja analysoimalla denaturoivan gradientin geelielektroforeesilla (DGGE). Koetukkien hajonneisuutta määritettiin analysoimalla puun fysikokemiallisia ominaisuuksia. Tutkimushypoteesin vastaisesti hoidettujen metsien tukit olivat hajonneet nopeammin kuin luonnontilaisien metsien. Puissa elävien sienten määrässä ei löydetty suuria eroja eri metsien välillä. Tutkimuksessa jäi kuitenkin epäselväksi, johtuivatko tulokset metsänhoidon vaikutuksen myötä syntyneistä erilaisista lahottajasieniyhteisöistä vai itse koeasettelusta ja muista siihen vaikuttaneista tekijöistä. Toisen tutkimusosion tarkoituksena oli selvittää, miten lajidiversiteetin vähentäminen eri lahoamisvaiheen puusubstraateilla vaikuttaa sieniyhteisöihin kontrolloiduissa laboratorioolosuhteissa. Substraattina ja sienisiirroksena käytettiin eri lahoamisvaiheessa olevia lahopuita, joiden luonnollista sienidiversiteettiä vähennettiin laimentamalla. Sienilajistoa tutkittiin 16 viikkoisen inkuboinnin eri vaiheissa eristämällä sienten DNA suoraan näytteistä, PCR-monistamalla selektiivisten alukkeiden avulla ja analysoimalla DGGE:n avulla. Puhdistetut DNA-näytteet sekvensoitiin ja tunnistettiin vertailemalla sekvenssitietoja geenipankkien sekvenssitietokantoihin. Eri sienilajiston rakenne muuttui hieman laimennuksen myötä, mutta ei kovin merkittävästi. Suurin osa eristetyistä sienilajeista pysyivät tuntemattomina. Tunnistetuista lajeista lähes kaikki kuuluivat kotelosienten kaareen ja tehokkaiksi lahottajiksi tunnettuja sienilajeja ei tutkimuksessa löydetty. Luultavammin tutkimuksen koeolosuhteet olivat suosiolliset kotelosienten runsaaseen kasvuun, jonka takia ne dominoivat alkuperäisissä näytteissä olleita lahottajasieniä. Avainsanat lahottajasieni, sienidiversiteetti, PCR, DGGE, sekvensointi
Aalto University, P.O. BOX 11000, 00076 AALTO www.aalto.fi Abstract of master's thesis Author Sarita Naukkarinen Title of thesis Diversity and species of wood-decaying fungi in decomposing wood analysed by DGGE in a boreal forest and under laboratory conditions. Department Department of Biotechnology and Chemical technology Professorship Analytical chemistry Thesis supervisor Professor Sakari Kulmala Thesis advisor / Thesis examiner Ph. D. Raisa Mäkipää Code of professorship KE211-3 Date 18 th of November 2013 Number of pages 85 Language Finnish Abstract The purpose of this thesis was research the diversity of wood-decaying fungi and how the reduction of diversity affects on the wood decomposition rate in natural forest ecosystem as well as under controlled laboratory conditions. The research work was performed in Finnish Forest Research Institute and was consisted of two parts with the different purposes. The aim of the first part was to determine whether the intensive management of forests has effect on fungal communities inhabiting decaying wood and their decomposing capacity. Fungal communities and wood degrading capacity were compared between the decayed sample logs situated in both managed forests and unmanaged forests. Species diversity was investigated by amplifying total fungal DNA extracted directly from decomposing wood by polymerase chain reaction (PCR) with selective primers and analyzing the products via denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Decomposition states of sample logs were examined by analyzing physicochemical properties of wood. Contrary to the research hypothesis, logs in managed forests had been decomposed faster than logs in unmanaged forests. The number of fungal species was not also varying much between the different forests. However, it was unclear whether this result was due to the forest management or due to the experimental setup and other factors affected on it. The aim of the second part was to investigate how reduction of species diversity in the substrates at different decomposing states affects on fungal communities under controlled laboratory conditions. Wood at different stages of decay was used as a substrate and inoculum and the natural fungal richness of wood was reduced by dilution. Fungal species were analyzed during the different stages of incubation by extracting DNA directly from decaying wood, amplifying with selective primers by PCR and analyzing by DGGE. Purified products were sequenced and identified via comparison with genbank databases. The structure of fungal community changed slightly with the dilution but not very significantly. Most of the extracted species were unknown. Almost all identified species belonged to Ascomycota phylum and the main decomposers of wood were not found. Most likely laboratory conditions were optimal for ascomycetes and that s the reason why they dominated the proper decomposer species of the original samples. Keywords decaying fungi, fungal diversity, PCR, DGGE, sequencing
Esipuhe Tämä diplomityö on tehty osana Metsäntutkimuslaitoksen tutkimusprojekteja. Halua kiittää erityisesti työni ohjaajana toiminutta Raisa Mäkipäätä mahdollisuudesta tehdä diplomityöni osana hänen tutkimusprojektejaan ja kaikesta avusta, kärsivällisyydestä ja kannustuksesta koko työn suorituksen aikana. Myös työn valvojana toiminut professori Sakari Kulmala ansaitsee suuren kiitoksen joustavuudestaan tätä työtä kohtaan. Kiitän myös koko Metsäntutkimuslaitoksen henkilökuntaa, erityisesti Mikko Peltoniemeä, Tiina Rajalaa ja Lara Valentinea, heidän avustaan niin käytännön laboratoriotöissä kuin tulosten käsittelyssä ja analysoinnissa. Teidän kanssanne oli ilo työskennellä! Ennen kaikkea haluan kuitenkin kiittää kaikkia ihania ystäviäni ja perhettäni, erityisesti Jaakkoa ja Veeraa, jotka tukivat ja kannustivat koko kirjoitusprosessin aikana. Suuri kiitos teille kaikille! Espoo, 18.11.2013 Sarita Naukkarinen
Sisällysluettelo 1. Johdanto... 1 2. Puun hajoaminen luonnossa... 3 2.1. Lahottajasienten vaikutus puun hajoamiseen... 4 3. Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät... 8 3.1. Sienitutkimuksissa yleisesti käytetyt menetelmät... 8 3.2. Sienten DNA:n eristäminen... 10 3.3. Geelielektroforeesianalyysit sienitutkimuksissa... 11 3.3.1. Denaturoivan gradientin geelielektroforeesi -menetelmät... 12 3.4 Sekvensointi ja lajitunnistus... 13 4. Kokeellisten tutkimusosioiden tavoitteet ja suoritus... 14 4.1. Sienidiversiteetin tutkiminen boreaalisessa metsässä... 14 4.1.1. Näytekohteet ja näytteenotto... 14 4.1.2. DNA-analyysin reagenssit ja menetelmät... 20 4.1.3. Puun fysikokemialliset analyysit... 22 4.2. Sienilajiston tutkiminen laboratorio-olosuhteissa... 23 4.2.1. Näytteenotto... 23 4.2.2. Laboratoriotutkimuksen suoritus... 24 4.2.3 DNA-analyysin reagenssit ja menetelmät... 26 5. Tulokset... 32 5.1. Sienidiversiteetin tutkiminen boreaalisessa metsässä... 32 5.1.1. Monimuuttuja-analyysit sienilajiston tutkimisessa... 37 5.2. Sienilajiston tutkiminen laboratorio-olosuhteissa... 43
6. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset... 52 6.1. Sienidiversiteetin tutkiminen boreaalisessa metsässä... 52 6.1.1. Lahoamisnopeuden vertailu eri alueilla... 52 6.1.2. Käytettyjen menetelmien virhetarkastelu... 55 6.2. Sienilajiston tutkiminen laboratorio-olosuhteissa... 57 6.2.1. Tuloksien vertailu tutkimuksen muihin tuloksiin... 61 6.2.2. Käytettyjen menetelmien virhetarkastelu... 62 7. Yhteenveto ja jatkotutkimusehdotukset... 64 8. Lähdeluettelo... 67 LIITE 1. Sulkavan Lohikosken näytteenottopaikat. LIITE 2. Lohikosken koealueen LAH03 tukkikolmioiden sijainnit. LIITE 3. Lohikosken koealueen LAH04 tukkikolmioiden sijainnit. LIITE 4. Lohikosken koealueen LAH05 tukkikolmioiden sijainnit. LIITE 5. Lohikosken koealueen LAH06 tukkikolmioiden sijainnit. LIITE 6. Lohikosken koealueen LAH07 tukkikolmioiden sijainnit. LIITE 7. Lohikosken koealueen LAH08 tukkikolmioiden sijainnit. LIITE 8. Lohikosken koealojen kasvupaikat, kosteudet ja puustotiedot vuonna 1996 LIITE 9. Lohikosken koealueiden puustotilanne ja toimenpidehistoria 28.3.2012. LIITE 10. Mikrokosmoskokeiden sekvensoituja DNA-juovia parhaiten vastaavat referenssisekvenssit ja niiden yhdenmukaisuus.
1. Johdanto Hajoava puuaines on elintärkeä metsän ekosysteemin biodiversiteetille, ravinteiden kierrolle ja hiilidynamiikalle, ja se tarjoaa elinympäristön ja energiaa sienille, hyönteisille ja muille niitä hyödyntäville organismeille [1, 2, 3]. Arviolta ainakin 4000 5000 lajia on Suomessa riippuvaisia kuolleesta puusta ja luku voi olla todellisuudessa vielä suurempi [4, 5]. Kuolleen orgaanisen materiaalin hajoamisnopeuden arviointi on tärkeätä ja se auttaa metsän hiilitasapainon arvioinnissa ja mallintamisessa. Kuolleen puun pitkäikäisyydestä johtuen sen hajoamisesta on tehty kuitenkin vain muutamia pitkän aikavälin tutkimuksia. [3, 6, 7] Suomessa esiintyy arviolta 4000 5000 kasviainesta hajottavaa lajia, joista noin kolmasosa on sieniä. Lahottajasienillä onkin tärkeä rooli metsien ekosysteemissä ja ne ovat avainasemassa sekä metsän uusiutumisessa että biodiversiteetin ja ekosysteemin toiminnan ylläpidossa [1, 4, 8]. Metsän hoidon seurauksena lahopuun määrä metsissä on kuitenkin pienentynyt huomattavasti, jolla on samalla suora vaikutus kuolleesta puusta riippuvaiseen eliöstöön. Sienet ovat herkkiä metsän rakenteen muutoksille ja puunlahottajasieniä käytetäänkin usein indikaattorina arvioitaessa boreaalisen metsän suojeluarvoa [9]. Elinalan katoamisen myötä sadat sienilajit Fennoskandian metsissä ovat uhattuina, ja arvioiduista kääpälajeista jo 37 % on luokiteltu uhanalaisiksi tai olevan lähellä uhanalaisuutta Suomessa [4, 8, 9, 10]. Sienten monimuotoisuuden vähenemisen vaikusta ravinnonkierto- ja hajoamisprosesseihin tunnetaan edelleen hyvin huonosti ja harvat tutkimukset ovat keskittyneet boreaalisen metsän sieniyhteisöjen välisiin suhteisiin. Lahottajasienten elinympäristön ja sukkession tutkimisen avulla pystymme kuitenkin ymmärtämään paremmin myös metsän hoidon sekä ilmaston muutoksen aiheuttamia vaikutuksia sienidiversiteettiin, ja sen myötä puun hajoamiseen ja samalla koko metsän ekosysteemin toimintaan [7]. 1
Tämän työn tarkoituksena oli tutkia sienten monimuotoisuutta lahopuussa ja lajiston vähentämisen vaikusta puuaineksen hajoamisnopeuteen lahottajasienten luonnollisessa ympäristössä ja laboratorio-olosuhteissa. Sienilajistoa tutkittiin metsäkuusipuusta (Picea abies), joka on yksi yleisimmistä puulajeista Pohjois- ja Keski-Euroopan metsissä ja sisältää monimuotoisen yhteisön puuta hajottavia sienilajeja [4, 6, 7]. Tutkimuksen aineistona käytettiin puunäytteitä kahdelta eri paikkakunnalta, Sulkavan Lohikoskelta ja Lapinjärveltä. Lohikoskella tutkittiin sekä hoidettujen talousmetsien että luonnontilaisien aarnimetsien lahottajasienilajistojen monimuotoisuutta ja niiden puunhajotuskykyä, sekä vertailtiin eri metsien sienilajistojen rakennetta keskenään. Tarkoituksena oli selvittää, onko metsien käsittelyllä ollut vaikutusta sienilajiston rakenteeseen ja sen myötä puuaineksen hajottamiseen. Sieni-DNA eristettiin suoraan ympäristönäytteistä, monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja analysoitiin denaturoivan gradientin geelielektroforeesin avulla (DGGE), jonka jälkeen lajiston rakennetta voitiin analysoida monimuuttuja-analyysien avulla. Lisäksi näytteistä analysoitiin niiden fysikokemiallisia ominaisuuksia. Lapinjärven näytteitä tutkittiin kontrolloiduissa laboratorio-olosuhteissa ja tarkoituksena oli selvittää, miten sienidiversiteetin vähentäminen eri substraateilla vaikuttaa puussa eläviin sienilajeihin, ja onko alkuperäisellä sienilajistolla ja lahoasteella vaikutusta, kun sienilajistoa karsitaan. Näytteinä käytettiin eri lahoamisvaiheessa olevaa lahopuuta, jonka luonnollista sienikantaa vähennettiin laimentamalla. Näytteitä inkuboitiin 16 viikon ajan lasiastioissa ja niiden sienilajistoa analysoitiin samoja tutkimusmenetelmiä käyttäen kuin Lohikosken näytteille. Lisäksi puhdistetut DNA-näytteet lähetettiin lajimääritystä varten Macrogensekvensointipalveluun Hollantiin [11]. Saatuja sekvenssitietoja verrattiin geenipankissa ja UNITE-sekvenssitietokannassa [12] oleviin sienisekvensseihin. 2
2. Puun hajoaminen luonnossa Puun soluseinien polymeerin hajoaminen on monimutkainen prosessi, johon vaikuttavat puulajien kemiallinen koostumus, hajottajalajisto ja sen sukkessio sekä entsyymejä tuottavat sienilajit. Puun polymeerisestä ja heterogeenista luonteesta sekä niukasta typpipitoisuudesta johtuen vain suhteellisen harvat sienilajit ja bakteerit voivat hajottaa sitä erilaisien hapettumis-, hydrolyysi- ja dehydratointireaktioiden avulla. Sienidiversiteetin vaikutusta puun hajoamisaktiivisuuteen lahoamisen eri vaiheissa tunnetaan kuitenkin edelleen kovin huonosti. [2, 8, 13] Puun hajoamiseen vaikuttavat monet eri tekijät ja hajoamisnopeutta on vaikea mitata johtuen puiden erittäin pitkäikäisesti hajoamisesta. Koivujen täydelliseen hajoamiseen tarvitaan noin 24 40 vuotta, mutta männyille ja kuusille vastaava hajoaminen kestää yleensä noin 60 80 vuotta. Syynä koivun nopeampaan hajoamiseen on muun muassa sen huonompi vastustuskyky lahottajasieniä kohtaan, ja esimerkiksi valkolahottajat, kuten taulakäävät (Forties fomentarius), kolonnisoivat koivuja helposti. [3, 14] Havupuiden hajoamisnopeus on tyypillisesti aluksi hidasta, sillä hajottavat organismit kolonnisoivat puun usein hitaasti. Puun hajoamisnopeuden on todettu olevan suurinta lahoamisen keskivaiheilla, jolloin puun biomassasta on hajonnut 30 70 %. Lahoamisnopeus voi olla tällöin jopa 10-kertaa suurempi kuin lahoamisen alkuvaiheessa. Materiaalin vähetessä hajoamisnopeus jälleen laskee lahoamisen loppua kohden ja seuraa kohtuullisen hidas hajoamisvaihe. Tämä johtuu luultavammin siitä, että jäljellä on vain hitaasti hajoavia substraatteja, kun ligniiniä, jotka ovat vaikeammin hajotettavissa verrattuna pintapuuhun. Ligniinipitoisuuden suhteellinen määrä kasvaakin lahoasteen myötä [15]. Puun kuolemisikä vaikuttaa lahoamisen viimeisen vaiheen kestoon, sillä nuori puu sisältää tyypillisesti vain vähän hajoamiselle resistenttiä sydänpuuta, ja hajoaa näin ollen nopeammin kuin vanhat puut, joiden sydänpuun määrä on suurempi. [3, 5, 14, 16] 3
Puun hajoamisprosessin nopeus riippuu paljon myös rungon olosuhteista kuolemisen aikaan. Lahottajasienten kasvu lisääntyy kosteuden myötä, jolloin puun läheinen kontakti kostean maan kanssa lisää sen hajoamisnopeutta. Maahan kaatuneen puun hajoamisprosessi voikin olla jo alusta asti hyvin nopeaa, kun taas pystyyn kuolleen kelopuun matala kosteuspitoisuus hidastaa lahottajasienten kasvua. [3, 14] Myös puun maantieteellisen sijainnin ja ilmaston on todettu vaikuttavan hajoamiseen, ja puun tiheyden hajoaminen on nopeampaan etelän kuin pohjoisen puissa. Lahottajasienet kasvavat lämpöisillä alueilla runsaammissa määrin ja lauhkean vyöhykkeen sieniyhteisöt ovat yleisesti monimuotoisempia kuin boreaalisen vyöhykkeen yhteisöt [8]. Lisäksi lämpötila vaikuttaa substraatin laatuun, jolloin puulajien hajoamiskestävyys voi vaihdella lämpötilan mukaan. Myös puunrungon koolla on todettu olevan vaikutusta lahoamisnopeuteen. [3, 14, 17] 2.1. Lahottajasienten vaikutus puun hajoamiseen Sienet pystyvät hajottamaan hyvin erityyppisiä ja myös vaikeasti hajoavia orgaanisia yhdisteitä solunulkoisten entsyymien avulla. Puuta hajottavat sienet voivat usein hajottaa sekä hemiselluloosaa, selluloosaa että ligniiniä, mutta ne hajottavat niitä eri tehokkuudella. Lahopuista löydetyt sienet kuuluvat yleisimmin joko kantasienten (Basidiomycota) tai kotelosienten (Ascomycota) kaariin. Suurin osa kotelosienistä ei pysty kovin merkittävästi lahottamaan puuta, vaikka niitä usein lahopuussa elääkin [18]. Puuta hajottavia kantasieniä pidetään tärkeimpinä puuta lahottavina lajeina boreaalisessa metsässä. Tähän kaareen kuuluvat suurin osan lahopuuta tehokkaasti lahottavista valko- ja ruskolahottajasienistä. Valkolahottajasienten tiedetään olevan tehokkaita orgaanisten yhdisteiden hajottajia ja ne pystyvät hajottamaan kaikkia puupolymeerejä. Valkolahottajat tuottavat solunulkoisia hapettavia fenolioksidaaseja, kuten ligniiniperoksidaaseja, mangaaniperoksidaaseja ja lakkaasia, jotka ovat avainasemassa ligniininhajotusprosessissa. Valkolahottajat ovatkin ainoita mikro-organismeja, jotka 4
pystyvät ligniinin tehokkaaseen hajottamiseen puissa ja maaperässä. Osa valkolahottajista hajottaa selektiivisesti ligniiniä, jolloin ne hajottavat suhteessa enemmän ligniiniä kuin selluloosaa tai hemiselluloosaa. Näitä lajeja voidaan käyttää hyväksi myös bioteknisissä sovelluksissa, kuten paperinvalmistuksessa. Valkolahottajat hajottavat sekä lehti- että havupuita, mutta ne usein suosivat lehtipuita. Puun pääasiallisina hajottajina pidetyistä käävistä myös osa kuuluu valkolahottajiin, ja yleisimmin tutkittuja valkolahottajasieniä ovat muun muassa taulakääpä (Fomes Formentarius) ja Phanerochaete chrysosporium. [6, 7, 9, 13, 19, 20, 21, 22]. Vain 6 % lahopuun sienistä ovat ruskolahottajasieniä, mutta ne dominoivat boreaalisen metsän havupuiden hajoamisprosesseja. Ruskolahottajat muokkaavat ligniiniä vain osittain, mutta eivät pysty hajottamaan sitä merkittävästä. Ruskolahottajat hajottavat kuitenkin tehokkaasti hemiselluloosaa ja selluloosaa, ja ne voivat aiheuttaa nopeasti puun lahoamisen jo lahoamisprosessin alussa. [6, 13, 15, 20, 23, 24] Kotelosienet aiheuttavat usein puussa katkolahoa. Katkolahottajat (soft-rot fungi) hajottavat pääasiassa vain puun uloimpien kerroksien selluloosaa ja hemiselluloosaa solunulkoisten entsyymien avulla. Joidenkin katkolahottajien on todettu hajottavan myös ligniiniä, mutta niiden ligniininhajotuskyky on huomattavasti rajoittuneempaa kuin valkolahottajasienten [25, 26]. Useilla kotelosienillä on todettu olevan kyky tuottaa fenolioksidaaseja. Kotelosienet hajottavatkin mahdollisesti vain ligniinin fenolisia osia, jotka ovat kemiallisesti enemmän labiileja kuin ligniinin muut osat ja voivat hajota mietojen biologisten hapettimien, kuten mangaanikelaattien ja fenolioksidaasien, avulla. Ligniinin fenoliset osat käsittävät kuitenkin vain noin 10 % polymeeristä ja muut, ei-fenoliset rakenteet vaativat voimakkaampien hapettimien, kuten peroksidaasien tai lakkaasin, vaikutuksen, jotka ovat tyypillisiä vain valkolahottajille [26]. Kotelosienten hajotusmekanismista tiedetään kuitenkin vielä edelleen hyvin vähän verrattuna enemmän tutkittuihin kantasieniin. 5
Puun lahoamisen edetessä myös siinä elävät lahottajasienilajit muuttuvat [2, 6]. Lahoamisen alkuvaiheessa sienilajeja on vähemmän ja pysyvä lajistorakenne ei ole vielä muovautunut, jolloin kilpailua eri lajien välillä voi tapahtua enemmän. Usein lahoamisen alkuvaiheessa kotelosienet levittäytyvät nopeasti puuhun [18], mutta lahoamisen edetessä kantasienet tulevat vallitsevimmiksi. Valko- ja ruskolahottajia havaittaan yleensä eniten lahosukkession keskivaiheella. Lahoamisen myöhäisemmissä vaiheissa, jolloin puun runko on usein jo uponnut maahan, lahopuun lajisto alkaa muistuttaa maan sienilajistoa. Lahoamisen edetessä lajidiversiteetti kasvaa ja lajiston rakenne vakiintuu. Pitkälle lahonneen puun sienilajisto on usein myös vakaampi ympäristön muutoksille ja hyvin erilainen verrattuna varhaisen lahoamisvaiheen sienilajistoon. Myöhäisen lahoasteen sienet ovat yleisesti vähiten tunnettuja ja useissa lahopuututkimuksissa iso osa sienilajeista jääkin tuntemattomiksi. [5, 7] Useat sienilajit ovat erikoistuneet vain tietynlaisessa lahovaiheessa olevan puun hajottamiseen [9, 27], jolloin niitä esiintyy runsaimmin vain lahoamisen tässä vaiheessa. Osa lajeista on erikoistunut tuhoamaan äskettäin kuollutta, vielä kovaa puuta, kun taas osa lajeista ovat spesifisiä lahotuksen myöhäisemmälle vaiheelle, jolloin jäljellä ovat vain puun vahvimmat rakenteet, kuten ligniini. Osa lajeista ovat myös edeltäjä-seuraaja lajeja, jolloin seuraajalaji voi esiintyä vasta edeltäjälajin hajottamisen seurauksena. Sienilajien ja -diversiteetin vaikutusta puun hajoamisnopeuteen lahoamisen eri vaiheissa on tutkittu vielä vähän ja sitä tunnetaan edelleen kovin huonosti. Lajistorikkauden on kuitenkin todettu kasvavan puun lahoamisen myötä ja tiheyden ja massahäviön pienentyessä, ollen runsainta hyvin lahonneissa puissa [2, 7, 14]. Joidenkin tutkimusten mukaan sienilajien rikkaus parantaa hajoamisnopeutta, mutta myös päinvastaisia tutkimuksia on esitetty, joiden mukaan sieniyhteisön kokonaisdiversiteetillä ei olisi vaikutusta lahoamisnopeuteen. Toljander & Lindahl [28] havaisivat puun lahoamisnopeuden olevan suurimmillaan keskikokoisella sienilajistolla ja sen todettiin mukautuvan paremmin vaihteleviin olosuhteisiin. 6
Oletettavasti lajiston kilpailu hidasti lahoamista suuremmilla lajiyhteisöillä. Sieniyhteisön monimuotoisuutta oleellisempaa näyttäisikin olevan tärkeiden lahottajasienten määrä oikeassa lahovaiheessa [5]. 7
3. Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät 3.1. Sienitutkimuksissa yleisesti käytetyt menetelmät Tutkimukset puuta hajottavista sienistä ovat perinteisesti rajoittuneet näkyviin itiöemiin ja niiden kartoitukseen sekä laboratorio-olosuhteissa viljeltäviin lajeihin [28, 29]. Molemmat näistä menetelmistä voivat kuitenkin aliarvioida lajien rikkautta ja kuvata epätäydellisesti sienten aktiivisuutta alkuperäisessä substraatissa [6, 7, 30]. Kaikki sienet eivät muodosta näkyviä itiöemiä ja myös ympäristötekijöillä on taipumus vaikuttaa itiöemien muodostumiseen. Lisäksi näkyviä itiöemiä muodostavien sienilajien levittäytyminen eri kasvualustoille on hyvin rajallista [7]. Pelkästään itiöemien tarkasteleminen antaakin usein hyvin rajoittuneen kuvan puussa elävästä sienidiversiteetistä [30, 31]. Sieniä voidaan kasvattaa myös keinotekoisilla kasvatusalustoilla, mutta vain noin 2 % sienilajeista kasvavat kasvatusalustoilla tunnistettavissa määrin. Viljelyalustoilla kasvatetut sieniyhteisöt eivät siis myöskään anna täydellistä kuvaa luonnollisesta sienikannasta. Joidenkin sienilajien kasvu on myös hyvin hidasta, jolloin niitä on vaikea havaita rajallisen kestoisissa laboratoriokokeissa. [5, 30] Uudet kehittyneet molekyylibiologian menetelmät ovat mahdollistaneet myös DNAeristyksen suoraan ympäristönäytteistä, jolloin myös lahoavissa puunrungoissa elävien sieniyhteisöjen tutkiminen on mahdollista. Viljelyvapaiden menetelmien käyttö on yleistynyt sienitutkimuksissa ja luonnollisessa ympäristössä tapahtuvien tutkimuksien oletetaankin kuvaavan laajemmin ja tarkemmin näytteenottopaikalla vallitsevaa sieniyhteisöä ja niiden suhdetta puun hajoamisnopeuteen [5, 6, 7, 30, 31, 32]. Eristämällä DNA suoraan ympäristönäytteestä voidaan käytännössä määrittää kaikki näytteessä olevat sienilajit, myös sellaiset lajit, joita on vaikea kasvattaa kasvatusalustoilla. DNA-tekniikoita hyödyntävien analyysien kehittyessä lahopuiden sienidiversiteetin on todettu olevan huomattavasti suurempi kuin pelkkien itiöemien 8
tarkasteluun perustuvat tutkimustulokset ovat antaneet ymmärtää [7]. Myös viljelymenetelmät voivat antaa vääristyneen kuvan puussa näytteenottohetkellä vallitsevasta sieniyhteisöstä, sillä viljelyolosuhteet ovat usein suosiolliset vain tietyille sienilajeille, jotka voivat peittää alleen alkuperäisessä näytteessä dominoineet lajit. Vainion & Hantulan [30] tutkimuksessa samoista näytteistä havaittiin kasvatusalustoilla viljelemällä useimpia lajeja mitä suorassa DNA-eristyksessä ja joissain tapauksissa jopa täysin eri lajeja havaittiin. Lajit, joita ei suoraan ympäristönäytteestä eristetystä DNA:sta löydetty lainkaan, olivat luultavammin alkuperäisessä näytteessä itiöinä tai hyvin harvoina rihmastoina ja viljelyolosuhteet olivat suosiolliset niiden kasvuun. Eri menetelmiä käyttäen voidaan siis saada esiin myös eri näkökulmia sienilajistoista. DNA-tekniikoiden käyttö sienten monimuotoisuuden tutkimisessa on vielä alkutekijöissä ja tekniikoita kehitetään jatkuvasti. DNA-tekniikoilla on myös omat huonot puolensa. Niillä voidaan tutkia vain pieniä näytemääriä ja tyypillisesti puun DNA-eristykseen käytettävä näytemäärä on vain 0,1 g, jolloin näyteotos ei kata kuin minimaalisen osan koko lahopuunäytteestä. Sienisolujen DNA ei aina myöskään kuvaa vain elävää lajistoa, sillä DNA voi olla peräisin myös kuolleesta solusta, erityisesti lahoamisen alkuvaiheessa, jolloin vain osa sienilajeista on aktiivisia. RNA hajoaa solun ulkopuolella DNA:ta nopeammin, jolloin RNA-tutkimuksella saataisiinkin parempi kuva aktiivisesta sieniyhteisöstä, mutta RNA:n käyttö tutkimuksissa on myös haastavampaa. Kun aktiivisten sienilajien määrä kasvaa lahoamisen edetessä, myös DNA:n ja RNA:n on todettu antavan yhdenmukaisempi kuva lajidiversiteetistä. [5, 6] 9
3.2. Sienten DNA:n eristäminen DNA:n eristäminen ympäristönäytteistä on haastava, sillä näytteet ovat usein epäpuhtaita ja DNA-konsentraatiot pieniä, esimerkiksi jos DNA eristetään suoraan puunäytteestä [30, 33]. Sieni-DNA:n eristysprosessissa RNA-molekyylit erotetaan ensin erilleen eristettävästä DNA:sta. Solut hajotetaan ja proteiinit ja polysakkaridit erotetaan DNA:sta, ja lopuksi DNA puhdistetaan ja erotetaan. Eristetyt sieni-dna:t monistetaan polymeraasiketjureaktiossa sienille spesifisten alukkeiden avulla, jolloin kokonais-dna:sta voidaan monistaa vain halutut sienilajistot. PCR-reaktiossa alukkeet tunnistavat monistettavan DNA-alueen päät ja kiinnittyvät niihin emäsparisäännön mukaisesti. Kaksi aluketta rajaa monistettavan alueen sen 5'- ja 3'- päistä, joista lähtien polymeraasientsyymi monistaa halutun DNA-pätkän. PCR ohjelma koostuu eri vaiheista, joissa DNA-juosteet erotetaan toisistaan eri lämpötiloja vaihdellen. Reaktion aikana DNA:n vastinjuosteet irtoavat toisistaan, alukkeet liittyvät yksijuosteiseen DNA:han ja polymeraasi luo alukkeista uuden vastinjuosteen. Näitä vaiheita peräkkäin toistamalla monistettavan alueen kopiomäärä kasvaa eksponentiaalisesti. Oleellista PCR-reaktiossa on alkuperäisen templaatti-dna:n konsentraatio, jonka tulee olla riittävän suuri, jotta monistus onnistuu täydellisesti. [34] Monistuksessa käytetyillä alukkeilla on tärkeä merkitys. Alukkeet, jotka ovat liian laajoja, voivat monistaa muitakin kuin sienisekvenssejä ja yliarvioida sienidiversiteettiä, kun taas liian kapeat alukkeet monistavat vain joitakin sienilajeja ja aliarvioivat diversiteettiä [33]. Sienten DNA-tutkimuksissa on eniten käytetty ribosomaalisen RNA:n (rrna) geeniklustereiden 18S- ja ITS-alueita (internal transcribed spacer) [35]. ITS-alueet vaihtelevat paljon sienten välillä ja ne on todettu hyväksi sienilajien tunnistukseen. ITS-alueiden on todettu ilmentävän myös enemmän vaihtelua sienilajien välillä kuin 18S-alueen, joka voi tuottaa kapeamman näkemyksen sienidiversiteetistä verrattuna ITS-alueisiin [33]. Jotkut sienilajit voivat tosin ilmentää lajin sisäisiä vaihteluita ITS-sekvensseissään, mikä saattaa aiheuttaa lajiston koon yliarviointia. 10
3.3. Geelielektroforeesianalyysit sienitutkimuksissa Geelielektroforeesi perustuu nukleiinihappojen kulkeutumiseen viskoosissa geelissä sähköisen kentän vaikutuksesta kohti anodia negatiivisesti varautuneen sokerifosfaattiryhmän ansiosta. Erottuminen tapahtuu erikokoisien molekyylien liikkuessa eri nopeudella geelissä. Erotuksena tavanomaiseen nestekantajaelektroforeesiin geelielektroforeesissa partikkelit erottuvat geelissä varauksen lisäksi myös kokonsa puolesta. Nukleiinihappomolekyylin koko vaikuttaa sen liikkumisnopeuteen, pienimpien nukleiinihappomolekyylien kulkeutuessa geelissä nopeammin kuin isommat molekyylit. Erotuksessa käytetyllä jännitteellä voidaan nopeuttaa nukleiinihapon kulkeutumista geelillä, mutta liian suuri jännite voi heikentää resoluutiota tai pahimmassa tapauksessa sulattaa geelin. Myös geelin konsentraatiolla on vaikutusta kulkeutumiseen ja vahvasti konsentroituneessa pienihuokoisessa geelissä partikkelin liikkuminen hidastuu ja pystytään erottamaan myös pienempiä nukleiinihappoja. Vastaavasti heikosti konsentroituneessa, suurihuokoisessa geelissä partikkeli liikkuu vähemmän estyneesti. Geelielektroforeesin avulla voidaan havaita yhdenkin emäsparin ero ja sitä voidaan käyttää menetelmänä emäsjärjestyksen määrittämiseen [34, 36] Geelin ominaisuus erotella erikokoisia molekyylejä eli molekyylien seulontaefekti ei ole sama kaikille geeleille. Nukleiinihappojen tutkimisessa yleisimmin käytetyt geelit ovat agaroosi-, polyakryyliamidi- ja tärkkelysgeeli, joista agaroosigeelin molekyylien seulontaefekti on heikko, kun taas polyakryyliamidi- ja tärkkelysgeeleille seulontaefekti on hyvä. Tärkkelysgeelin toistettavuus ei ole kuitenkaan aina kovin hyvä, kun taas synteettisellä polyakryyliamidigeelillä päästään puhtailla komponenteilla samoissa olosuhteissa aina toistettavaan geeliin. Polyakryyliamidigeelin huokoskokoa voidaan myös vaihdella enemmän kuin tärkkelysgeelin, jolloin se voidaan mukauttaa useampiin erotusongelmiin. Polyakryyliamidigeelielektroforeesi onkin tehokas ja tarkka menetelmä nukleiinihappojen erotukseen, resoluutio on hyvä ja riski kontaminaatiolle suhteellisen pieni. Menetelmä on myös suhteellisen nopea ja yksinkertainen. [36] 11
3.3.1. Denaturoivan gradientin geelielektroforeesi -menetelmät Yleisesti sienitutkimuksissa käytetyssä denaturoivan gradientin geelielektroforeesi (DGGE) -menetelmässä sieni-dna:n fragmentit erotellaan geelin denaturoivien ainesosien ansiosta. Kantajana käytetään kahdesta gradientiltaan erilaisesta liuoksesta valmistuttua geeliä, jolla on tasaisesti kasvava gradientin pitoisuus. Kasvava gradientti hidastaa DNA-sekvenssin kulkeutumista geelillä, kunnes sekvenssi lopulta pysähtyy ja jättää geelille juovan. Sieni-DNA:sta riippuen tarvitaan eri määrä denaturoivia ainesosia avaamaan DNA:n kaksoisjuosteet. Lopputuloksena geelillä saadaan esiin kaikki näytteen PCR-reaktiossa monistuneiden sienilajien DNA-juovat, joiden intensiteetti kertoo epäsuorasti sienilajin runsaudesta. Geelin värjäämiseen käytetään yleensä fluoresoivaa väriainetta, kuten etydiumbromidia, joka sitoutuu kaksijuosteiseen DNA:han. DGGE-analyysia varten PCR-alukkeen sekvenssiin lisätään GC-häntä 5 loppuun, jotta PCR-tuote on sopiva DGGE-analyysin ja saadaan riittävä erotustehokkuus [7, 30]. [34, 36] DGGE-analyysi mahdollistaa yhdestä ympäristönäytteestä saatujen useiden eri PCRsekvenssien samanaikaisen analyysin ja analyysin avulla saatu diversiteetti riippuu sieniyhteisön jokaisen lajin suhteellisesta runsaudesta [30]. DGGE-analyysissa yleisesti oletetaan, että samanlainen sieni-dna kulkeutuu geelillä aina samalle tasolle, jolloin geelin samassa kohtaa olevat juovat voidaan tulkita yhdeksi sienilajiksi. Tämä pitääkin yleensä hyvin paikkaansa, jos sienilajit on eristetty saman puulajin näytteistä. Eri puulajien kohdalla kulkeutumisessa on kuitenkin havaittu eroja. Lisäksi joskus myös eri sekvenssit voivat kulkeutua samaan kohtaan geelissä, jolloin yksi juova kattaakin kahden eri sienilajin DNA:ta. DGGE-sekvensointi voi myös aliarvioida sienidiversiteettiä. DGGE-antaa kuitenkin hyvän yleisarvion näytteissä esiintyneissä lajeista ja se on yleisesti käytössä sienitutkimuksissa 12
3.4 Sekvensointi ja lajitunnistus DNA:n sekvensoinnissa määritettään kunkin PCR-tuotteen emäsjärjestys, joka suoritetaan yleensä automatisoiduilla sekvensointilaitteilla. Lajimääritys tapahtuu vertailemalla DNA:n emäsjärjestystä tunnettujen sienilajien emäsjärjestykseen. DNAtutkimuksien avulla tehtävä lajin tunnistus edellyttääkin kattavaa geenipankkia, johon tuloksia voidaan verrata. Nykyiset geenipankit eivät kuitenkaan sisällä vielä kaikkien sienilajien sekvenssejä ja niiden avulla on mahdollista tunnistaa vain tunnetuimpien ja eniten tutkittujen sienten sekvenssit. Tutkijoiden kuvaamia sienilajeja on tähän mennessä noin 100 000, mutta todellinen lajimäärä on arviolta yli 5 miljoonaa. Tämä onkin rajoittavana tekijänä sienitutkimuksissa, jonka takia suurin osa puussa elävistä sienistä jää edelleen tunnistamatta. Myöskään geenipankkiin tallennettujen sekvenssien yhteyttä lajimäärityksiin ei voida yhdenmukaisesti varmistaa, jolloin osa niistä voi olla väärin tunnistettuja. [5] 13
4. Kokeellisten tutkimusosioiden tavoitteet ja suoritus 4.1. Sienidiversiteetin tutkiminen boreaalisessa metsässä Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, miten lahopuussa elävien sienilajistojen koostumus vaihtelee erirakenteisissa metsissä ja miten lajisto vaikuttaa puun lahoamisnopeuteen. Lohikosken alueen kohteet edustivat puuston rakenteeltaan ja lahopuujatkumoltaan erilaisia metsiä, ja ennen tutkimuksen aloitusta oletuksena olikin, että hajottajasieniyhteisö on eri metsissä erilainen. Ensimmäisenä tutkimushypoteesina oli, että luonnontilaisen metsän, jossa lahopuujatkumo on turvannut sienilajiston monimuotoisuuden, lahottajadiversiteetti on suurempi kuin käsitellyissä, vähälahopuustoisissa metsissä. Toisena hypoteesina oli, että monilajinen sieniyhteisö on tehokkaampi hajottaja kuin niukkalajinen yhteisö, jolloin myös ensimmäisen hypoteesin toteutuessa voitaisiin todeta puiden lahoamisnopeuden olevan suurempi luonnontilaisissa metsissä verrattuna käsiteltyihin metsiin. 4.1.1. Näytekohteet ja näytteenotto Tutkimuksen näytteinä käytettiin Sulkavalla sijaitsevan Lohikosken valtionpuistosta peräisin olevia lahopuita, jotka oli alun perin viety paikoilleen vuonna 1994 Suvi Raivion johtaman Talousmetsien luonnonsuojelu - hankkeen aikana [37, 38]. Lokakuussa vuonna 1994 Lohikoskelle vietiin liitteenä 1. olevan kartan näyttämille paikoille samanlaisia, noin 2 m pituisia ja 20 25 cm läpimitaltaan olevia kuusipuutukkeja eri kehitysluokkaa edustaviin metsiin. Kuvassa 1. on tarkempi kuva alueesta ja kuusilahoamiskokeiden kohteista. Lahopuut olivat aseteltu kolmionmuotoisiin asetelmiin ja alun perin tarkoitettu hyönteis- ja kääpätutkimuksia varten. Tässä tutkimuksessa käytettiin tukkeja, jotka oli sijoitettu kohteisiin LAHO3- LAH08 (taulukko 1.). Nämä alueet edustivat alun perin nuorta kasvatusmetsää, vanhaa talousmetsää sekä suojelualueena ollutta vanhaa aarnimetsää. Tukkikolmioiden aluekohtaiset indeksikartat löytyvät liitteistä 2-7. 14
Kuva 1. Suvi Raivion koordinoimassa Talousmetsien luonnonsuojelu -hankkeessa perustettujen kuusilahopuun lahoamiskokeiden sijainnit Lohikoskella [38]. Taulukko 1. Kuusilahoamiskokeiden kohteista käytetyt koodinimet, niiden kehitysvaihe vuonna 1994, paikat ja yhtenäiskoordinaatit. Yhtenäiskoordinaatit ovat kilometrin ruuduista. Koodinimi Kehitysvaihe vuonna 1994 Paikka Yhtenäiskoordinaatit LAHO1 Avohakkuu Huosio 6827, 596 LAHO2 Avohakkuu Ahmalampi 6831, 591 LAHO3 Nuori kasvatusmetsä Konnanlampi 6830, 599 LAHO4 Nuori kasvatusmetsä Mustanlamminlehto 6831, 599 LAHO5 Vanha talousmetsä Suolahti 6834, 589 LAHO6 Vanha talousmetsä Räpylävuori 6830, 602 LAHO7 Aarnimetsä Kokkolansalo 6832, 595 LAHO8 Aarnimetsä Kivijärvi 6829, 595 15
Koealueilta määritettiin myös niiden puustotietoja vuonna 1996 (liite 8.). Kuviin 2. ja 3. on koottu koealueiden puustojen kokonaistilavuudet, kuusipuun osuus kyseisen metsän puustosta sekä maahan kaatuneiden puiden määrät. m 3 / ha 400 350 300 250 200 150 100 50 0 LAH03 LAH04 LAH05 LAH06 LAH07 LAH08 Puuston kokonaistilavuus Kuusipuun tilavuus Kuva 2. Koealueiden puustojen kokonaistilavuudet ja kuusipuun osuus puustosta vuonna 1996. 30 25 20 m 3 / ha 15 10 5 0 LAH03 LAH04 LAH05 LAH06 LAH07 LAH08 Kuva 3. Koealueiden maapuiden määrät vuonna 1996. 16
Tutkimuksen suunnitteluvaiheessa tarkoituksena oli, että kutakin kehitysvaihetta olisi edustanut kaksi eri metsikköä ja näytteenottoa ei tehtäisi avohakkuualalla. Näytteenoton yhteydessä kuitenkin huomattiin, että vaikka talousmetsän alueet olivat näytetukkien sijoituksen aikana edustaneet vanhaa talousmetsää (iältään noin 60 vuotiaita puita), muutamia vuosia ennen näytteenottoa osassa alueista oli tehty avohakkuuta ja kulotusta. Näiden alueiden puulajisto ei siis sisältänyt näytteenoton aikana varttunutta puustoa lainkaan ja alueet koostuivat joko nuoresta taimikosta tai avohakkuualueesta. Näin ollen talousmetsän kohdalla osa alueista edusti näytteenotonaikana nuorta taimikkoa, osa avohakkuualuetta ja osa alkuperäistä vanhaa talousmetsää. Nuoren kasvatusmetsän ja vanhan aarnimetsän alueet vastasivat kuitenkin alkuperäisiä metsikköjä. Nuori kasvatusmetsä käsitti istutettuja mäntyjä ja kuusia sekä luontaisesti syntyneitä rauduskoivuja, jotka olivat iältään noin 44 vuotiaita. Vanhan aarnimetsän lajisto koostui luonnollisesti syntyneistä männyistä, kuusista ja rauduskoivuista, jotka olivat 41 147 vuotta vanhoja (liitteet 8-9). Kuvan 4. mukaisesti koetukit oli aseteltu tutkimusmetsiköissä kuuteen kolmen tukin ryhmään, jotka oli puolestaan jaettu kahteen ryhmään, A ja C. Ryhmät B ja D olivat hyönteispyydysten sijoituspaikkoja ja niitä ei tässä tutkimuksessa tutkittu. Ryhmissä A ja B oli kolme tukeista muodostettua kolmion muotoista asetelmaa, jotka merkittiin tunnuksilla 1, 2 ja 3. Jokaisen kolmion tukit merkittiin kirjaimilla a, b ja c. Esimerkiksi tunnus 3A3c viittasi alueeseen LAHO3, alueen ryhmään A, tukkikolmioon 3 ja tukkiin c. 17
Kuva 4. Esimerkki Suvi Raivion lahopuukokeen yhden alueen koejärjestelystä. Alueet oli jaettu osiin A, B, C ja D, joista B ja D olivat hyönteispyydysten sijoituspaikkoja. Alueet A ja C koostuivat kolmesta kolmion muotoisesta asetelmasta, jotka merkittiin numeroin. Kolmioiden tukit merkittiin kirjaimilla. Jokaisen tukkikolmion keskellä oli hyönteispyydyksiä, joita ei tässä tutkimuksessa tutkittu. Tukkikolmioryhmien välinen etäisyys oli noin 50 m ja koetukit sijaitsivat vähintään noin 50 m:n päässä kuvion reunasta. [38] Alun perin kussakin metsässä oli siis 18 tukkia. Tukkien annettiin lahota metsissä usean vuoden ajan ja niistä tutkittiin ajoittain hyönteislajistoa sekä kääpälajistoa. Lahottajasienilajistoa DNA-analyysien avulla ei kuitenkaan oltu tutkittu ennen tätä tutkimusta. Tämän tutkimuksen näytteet otettiin toukokuussa vuonna 2011. Kaikkia vuonna 1994 metsiin vietyjä tukkeja ei kuitenkaan enää löydetty. Syynä tähän oli muun muassa 18
tukkien täydellinen lahoaminen tai tuhoutuminen metsien muokkauksen yhteydessä. Jälkimmäinen syy kosketti erityisesti talousmetsän alueita 5C ja 6C, joissa metsää oli avohakattu ja hakkuukoneet olivat tuhonneet ja kolhineet osaa näytepuista. Alueen 6C metsää oli lisäksi kulotettu vuosi ennen näytteenottoa ja tältä alueelta löytyikin vain muutama hyvin hajonnut näytetukki. Alueelta 5A ei tukkeja löydetty lainkaan, johon syynä on voi olla alueen rehevyys ja metsän äestys. Alueella olleet tukit olivat luultavammin jo hyvin lahonneita ennen metsän äestystä, jonka taas tiedetään hajottavan tukkeja helposti vielä lisää. Tiedot tässä tutkimuksessa käytetyistä näytetukeista löytyvät taulukosta 2. Taulukko 2. Tutkimuksessa käytetyt näytetukit ja tiedot niiden metsäalueista. Alue (koodi) Näytetukit (kpl) Kehitysvaihe vuonna 2011 Status Puuston ikä (vuotta) 3 A 9 Nuori kasvatusmetsä Talousmetsä 44 Lisätietoa 3 C 8 Nuori kasvatusmetsä Talousmetsä 44 4 A 7 Nuori kasvatusmetsä Talousmetsä 40 4 C 6 Nuori kasvatusmetsä Talousmetsä 40 5 A 0 Nuori taimikko (ent. vanha talousmetsä) 5 C 6 Nuori taimikko (ent. vanha talousmetsä) 19 Talousmetsä 3 Äestetty ja istutettu v. 2008 Talousmetsä 3 Avohakattu v. 2006, istutettu v. 2008 6 A 6 Vanha talousmetsä Talousmetsä 74 Harvennus- ja väljennyshakkuu v. 2006 6 C 4 Avohakkuualue (ent. talousmetsä) Talousmetsä 0 Avohakattu v. 2008, kulotettu v. 2010 7 A 9 Aarnimetsä Suojelualue 40-145 7 C 6 Aarnimetsä Suojelualue 40-130 8 A 9 Aarnimetsä Suojelualue 146 8 C 9 Aarnimetsä Suojelualue 146
Löydetyistä tukeista sahattiin kiekkonäyte moottorisahalla siten, että tukkien päistä sahattiin ensin lyhyt hukkapala ennen varsinaista näytettä. Näin haluttiin näytekiekon edustavan mahdollisimman luotettavasti koko rungon lahovaihetta, sillä tukin pää oli mahdollisesti saattanut lahota jo pidemmälle kuin itse runko. Näytekiekkoja sahattiin kaksi kappaletta jokaisesta tukista, joista toinen oli DNA-analyysia ja toinen tiheyden määritystä varten. Näytekiekot pakastettiin näytteenoton jälkeen -20 C:een. Näytteenoton yhteydessä näytetukkien pituus ja läpimitta mitattiin ja lahoaste kirjattiin puukolla testaten rungon viidestä eri kohdasta. Lahoasteen havainnollinen määritys tehtiin Mäkinen, et al. [3] kuvaamalla tavalla. Tarkoituksena oli kerätä havaintoja rungoista, jotka olisivat hyvin epätasaisesti hajonneet ja vaikuttaisivat tuloksiin. DNA-eristystä varten jäisistä kiekkonäytteistä porattiin steriilillä poralla puuainesta suoraan pussiin ja puupurupussit pakastettiin ennen varsinaista eristystä. 4.1.2. DNA-analyysin reagenssit ja menetelmät Purunäytteet sulatettiin ja jokaista näytettä punnittiin noin 50 100 mg DNA-eristystä varten. Eristys tehtiin kaupallisella Omega E.Z.N.A TM SP Plant DNA Mini Kitillä (Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Georgia) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetty kokonais-dna monistettiin PCR:llä käyttäen ITS-alueita (internal transcribed spacer). Alukkeina käytettiin sienien rdna:lle tyypillisiä ITS1F GC- ja ITS2 alukkeita [35, 39]. Käytetyssä ITS1F-alukkeessa GC-häntä oli kiinnittynyt 5 loppuun, jotta PCR tuotteet olivat sopivat DGGE-analyysiin [6, 7, 40, 41]. Reaktion toimivuutta seurattiin positiivisen kontrollin avulla, joka sisälsi tunnettua sieni-dna:ta ja jonka tiedettiin varmasti monistuvan reaktion toimiessa. Mahdollista reaktiossa tapahtunutta kontaminaatiota seurattiin negatiivisella kontrollilla, joka ei sisältänyt lainkaan näytetemplaattia. PCR reaktioseos sisälsi 25 µl MyTaq TM HS Red Mix-liuosta [sisältää reaktiopuskurin, nukleotidi-dntp:n, DNA polymeraasin ja latausvärin (Bioline, Germany)], 1 µl kumpaakin aluketta, 2,5 µl templaatti-dna:ta ja 20,5 µl steriiliä vettä. 20
Monistukseen käytetty PCR-ohjelma koostui 1 minuutin alkudenaturaatiosta 95 C:ssa, 15 s denaturaatiosta 95 C:ssa, 15 s liittymisvaiheesta 58 C:ssa ja 10 s pidentymisvaiheesta 72 C:ssa. Käytettyjen syklien määrä oli 34. PCR-tuotteet tarkastettiin agaroosigeeliektroforeesilla (1 % m/v agaroosigeeli, V = 120 V, t = 45 60 min), jolla haluttiin varmistaa, että DNA oli monistunut onnistuneesti. Ajon jälkeen agaroosigeelit kuvattiin UV-valon avulla ja saatiin arvioidut DNA-määrät jokaiselle PCR-tuotteelle. PCR-tuotteet analysoitiin DGGE-analyysissa (DCode Universal Mutation Detection System, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) jossa käytettiin polyakryyliamidigeeliä (7.5 % m/v akryyliamidi/bisakryyliamidi 37.5:1) ja denaturoivaa gradienttia 18 58 %. Geeli valmistettiin gradientin muodostajan (Model 485, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) ja peristaattisen pumpun (Minipuls 3, Gilson SAS, Villiers-le-Bel, France) avulla. Näytteitä pipetoitiin geeliin agaroosigeelin antamien DNA määrien perusteella arvioidut määrät, noin 10 40 µl. Ajopuskurina käytettiin 1 x TAE-puskuria (40 mm Tris, 20 mm etikkahappo, 1 mm EDTA) ja ajossa käytettiin 75 V jännitettä, 60 C lämpötilaa ja 16 h ajoaikaa. Ajon jälkeen geeli värjättiin Sybr Gold värillä (SYBR Gold Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) ja kuvattiin sinisen valon avulla (SafeImager TM transilluminator Invitrogen, Carlsbad, California, USA). AlphaDigiDog-kuvanmuokkausohjelmaa käytettiin apuna kuvien muokkaukseen, jolla kuvien kontrastia ja värejä voitiin tarpeen mukaan muokata. Sieniyhteisöt analysoitiin GelCompar II -ohjelmalla (Applied Maths BVBA, Belgia), jonka avulla eri geelejä ja niiden sisältämiä juovia verrattiin keskenään. Sieni-DNA:n kulkeutunut matka geelillä voitiin ilmaista prosentuaalisesti, jolloin yhden taksonomisen yksikön (Operational Taxonomic Unit, OTU) oletettiin koostuvan yhdestä sienilajista ja samaan kohtaan geeleillä kulkeutuneiden juovien edustavan samaa sienilajia. Ohjelman avulla geeleistä merkittiin kaikki selvästi erottuvat juovat, jonka jälkeen näytteiden OTU-luvuista muodostettiin 0/1-binääridata. Binääridatan avulla voitiin vertailla tukeissa esiintyvien sieniyhteisöjen rakennetta. 21
4.1.3. Puun fysikokemialliset analyysit Nuoren kasvatusmetsän ja vanhan aarnimetsän näytteistä määritettiin myös vesi- ja etanoliliukoiset yhdisteet sekä Klason ligniinipitoisuus. Alueiden LAH05 ja LAH06 näytteistä ei kemiallisia fraktiointeja määritetty, koska alueilla tehdyt maanmuokkaustoimenpiteet olivat saattaneet vaikuttaa tuloksiin merkittävästä. Kemialliset fraktioinnit määritettiin gravimetrisesti uuttamalla vesi- ja etanoliliukoiset fraktiot, kuten polaariset yhdisteet (esimerkiksi liukenevat hiilihydraatit, ketonit, pektiinit ja tanniinit). Ilmakuivattuja, jauhettuja näytteitä sonikoitiin eri liuottimissa ja jokaisen uuton jälkeen punnitun massahäviön oletettiin kertovan suoraan uuttuvien yhdisteiden määrän. Uuttojen jälkeen jäljelle jäänyt aines hydrolysoitiin rikkihapossa, jolloin jäljelle jäänyt jäännös edusti Klason ligniiniä ja tuhkaa. Menetelmiä on kuvattu tarkemmin Vávrová, et al. [42] ja Rajala, et al. [7] artikkeleissa. Tiheyden määritys tehtiin Mäkinen, et al. [3] ja Rajala, et al. [7] kuvaamalla veden syrjäyttämismenetelmällä. Näytekiekot upotettiin veteen, annettiin kyllästyä vedellä ja tuoretilavuus määritettiin näytekiekkojen syrjäyttämän veden perusteella. Näytekiekkojen kuiva-ainemäärityksen jälkeen tiheys saatiin selville jakamalla kuivaaineen paino tuoretilavuudella. Jos näytekiekko oli niin lahonnut, että näyte ei pysynyt yhtenä kappaleena tilavuuden määrityksen ajan, määritettiin eri osien tilavuudet ja kuiva-painot erikseen ja tulokset laskettiin lopuksi yhteen. Joidenkin näytteiden kohdalla lahoaminen oli kuitenkin edennyt niin pitkälle, että näytemateriaali oli käytännössä pelkkää puupurua ja tiheyttä ei pystytty määrittämään tällä menetelmällä lainkaan. Kosteuden määrittämistä varten näytteistä punnittiin sekä tuorepaino että kuivapaino. Osa näytteistä oli kuitenkin niin lahonneita, tuorepainoja ei saatu mitattua edustavasti kaikille näytteille. 22
4.2. Sienilajiston tutkiminen laboratorio-olosuhteissa Tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia miten lahopuun alkuperäisen sienidiversiteetin vähentäminen vaikuttaa eri lahoasteisen metsäkuusipuun (Picea abies) sienilajistoon kontrolloiduissa laboratorio-olosuhteissa. Sieniyhteisön tutkimiseen käytettiin mikrokosmokseksi kutsuttua lasiastiaa, johon lisätiin eri määriä lahonnutta kuusipuusubstraattia ja sen luontaista sienilajistoa, jonka lajistoa vähennettiin laimentamalla. Mikrokosmoksia inkuboitiin 16 viikon ajan ja sienilajistoa määritettiin inkuboinnin eri vaiheissa, tarkoituksena tutkia sienilajiston muutoksia kokeen aikana. Tutkimuksen avulla haluttiin selvittää, onko alkuperäisellä sienilajistolla ja lahoasteella vaikutusta, kun sienilajistoa karsitaan. Tutkimuksen alussa oletettiin, että laimennuksen myötä alkuperäisessä näytteessä lähinnä runsaimmin esiintyvät sienilajit tulisivat vallitsevimmiksi. Tutkimushypoteesina oli, että näytteiden sienidiversiteetin vähentämisellä on vaikutusta myös puussa vallitseviin sienilajeihin. 4.2.1. Näytteenotto Tutkimuksen näytteinä käytettiin 46 metsäkuusipuutukkia, jotka olivat kuolleet luontaisesti myrskyn tai muun luonnonilmiön seurauksena. Näytetukit sijaitsivat hoitamattomassa metsässä Lapinjärvellä (Etelä-Suomi, 60 39.413'N, 120 26 7.352'E). Metsän ominaisuuksia on kuvattu tarkemmin Rajala, et al. [7] artikkelissa. Jokaisesta tukista sahattiin laboratorioanalysointia varten näytekiekko, joka säilöttiin välittömästi muovipusseissa -18 C:een jatkotoimia varten. Näytekiekkojen lahoamisaste määritettiin Mäkinen, et al. [3] kuvaamalla tavalla, jaottelemalla näytteet puun kovuuden mukaisesti viiteen eri laholuokkaan. Tätä tutkimusta varten tukeista valittiin lahoamisasteeltaan luokkiin yksi (I), kolme (III) ja viisi (V) kuuluvat näytekiekot. Nämä kolme luokkaa edustivat äskettäin kuollutta, lahoamisprosessin vasta alkuvaiheessa olevaa puutta (I), lahoamisprosessin keskivaiheessa olevaa puuta (III) ja lähes täysin lahonnutta (V) puuta. 23
4.2.2. Laboratoriotutkimuksen suoritus Kokeiden substraatit saatiin esikäsittelemällä viittä puukiekkoa jokaisesta lahoasteesta. Kiekot kuivattiin 105 C:ssa 48 h ajan, kuorittiin ja jauhettiin sahanpuruksi. Viiden puukiekon sahanpurut yhdistettiin yhdeksi, omaa lahoamisastettaan edustavaksi näytteeksi ja säilöttiin huoneenlämmössä. Ennen kokeiden aloitusta substraatit steriloitiin autoklaavilla (121 C, 20 min) kahteen kertaan, pitäen sterilointikertojen välillä 3 päivän välin. Sienisiirroksena käytetty sahanpuru saatiin poraamalla näytekiekoista steriilillä porankärjellä (d= 10 mm) sekä pintapuuta että sydänpuuta. Laholuokkaan I kuuluvia näytekiekkoja oli 14 kpl ja näistä poratut puupurut yhdistettiin lopuksi yhdeksi näytteeksi. Samoin tehtiin laholuokan III (12 kiekkoa) ja laholuokan V (16 kiekkoa) näytekiekoista porattujen sahanpurujen kanssa. Yhdistetyt näytteet pakastettiin -18 C:een myöhempää analysointia varten. Mikrokosmokset koostuivat 100 ml lasipulloista, jotka sisälsivät eri määriä sienisiirroksia ja substraatteja riippuen halutusta sienidiversiteetistä ja lahoasteesta (taulukko 3.). Pulloihin lisättiin steriiliä tislattua vettä siten, että kuiva-ainepitoisuus vastasi alkuperäisen puuaineksen koostumusta: lahoamisen alussa olevalle puulle (I) 77 %, keskilahonneelle puulle (III) 59 % ja lähes täysin lahonneelle puulle (V) 21 %. Pullot suljettiin muoviseptumeilla ja varustettiin yhdensuuntaisilla sulkuhanoilla, jotka olivat liitetty septumien läpi asetettuihin 50 mm neuloihin. Sulkuhanasysteemejä käytettiin ilman tyhjentämiseen ja estämään mikrokosmoksien anaerobiset olosuhteet. 24