Laskuharjoitus 2 vastauksia ja selityksiä

Transkriptio

1 Laskuharjoitus vastauksia ja selityksiä Selitykset ovat usein jonkin verran laajempia kuin vastaukseen edellytetyt, jotta asia selviäisi niillekin, jotka eivät sitä aluksi olleet keksineet. Tehtävä : Proteiinien ja hiilihydraattien perusasioita 0 8 p. A. Primäärirakenteesta ja muusta a) Kuinka monta erilaista 00 aminohapon polypeptidiketjua voidaan rakentaa 0 erilaisesta aminohaposta? Millaiset translaation jälkeiset modifikaatiot lisäävät entisestään mahdollisten erilaisten muotojen määrää? Koska peptidiketjulla on suunta eli aminohappo ei voi esiintyä ketjussa kumpaan suuntaan hyvänsä, on mahdollisuuksia 0 00, b) Jos geenissä on viisi eksonia, joista kukin koodaa n. 00 aminohapon kokoista domeenia, niin mitä mahdollisuuksia tuottaa geenistä erilaisia proteiineja edellisen kohdan vaihtelun lisäksi? Lisävaihtelua tuottaa se, että eksoneista vain osa voidaan lukea proteiiniksi. Proteiinia koodaava mrna voi siis olla yhdistelmä eri eksoneista ja näin ollen proteiinia voi sisältää eri domeeneja. c) Hiilihydraattikoodissa lisävariaatiota tuo mahdollisuus muodostaa erilaisia sidoksia eri monosakkaridien välillä ja näin ollen mahdollisuus tehdä haarautuneita ketjuja. Lasketaan yksinkertaistettu havainnollistava lasku. Ajattele, että sinulla on käytössäsi viittä erilaista molekyylejä, jotka voivat sitoutua toisiinsa neljän molekyylin molekyylin pituiseksi lineaariseksi ketjuksi, joka on toisesta päästään kiinnittynyt johonkin partikkeliin ja jossa molekyyleillä on suunta muodostaa sidoksia kolmella avaruudellisesti erilaisella ryhmällä (sidokset -, -, -, -, -, -, -, - ja - mahdollisia kahden molekyylin välillä) ja muodostaa näin ollen paitsi lineaarisia myös haaroittuneita ketjuja, jotka ovat samaten neljän molekyylin mittaisia ja yhdestä päästään kiinni jossakin partikkelissa. Kuinka monta erilaista lineaarista ketjua voit muodostaa tilanteissa ja? Kuinka monta ketjua voit kaikkiaan muodostaa tilanteessa, kun otat haaroittuneetkin huomioon? Hahmottele pieni joukko samasta monomeeristä rakentuvia, partikkeliin kiinnittyviä, mahdollisia ketjuja tilanteessa. Tilanne on samanlainen kuin olisi tapaus, jossa on vain viisi erilaista aminohappoa. Mahdollisuuksia on siis 5 4 =65. Tilanteessa on lineaarisia eli haarattomia ketjuja olemassa suurempi määrä. Ensimmäiseen alustaan sidottuun voi seuraava sitoutua kahdella eri tavalla. Samoin sitä seuraavaan jne.

2 Näin ollen on eri muotoisia haarautumattomia ketjuja **=8. Lisäksi jokainen palikka voi olla kolmessa eri asennossa ja palikoita on viittä erilaista, joten yhteensä mahdollisuuksia on 8* 4 *5 4 = Kun otetaan lisäksi huomioon haarautuneet, vaihtoehtojen määrä kasvaa entisestään. Yllä olevasta kuvasta nähdään, että kahdeksan eri muotoisen lineaarisen ketjun lisäksi on kaksi sellaista eri muotoista haarautunutta ketjua, joissa kaikki lähtevät ensimmäisestä palikasta joko vasemmalle tai oikealle eli sellaista, joissa alustaan kiinnittyneeseen palikkaan on kiinnittynyt suoraan vain yksi palikka. Lisäksi nähdään, että on sekä vasemmalle että oikealle kiinnityttäessä kaksi eri muotoista ketjua (sininen vaihtoehto ja punainen vaihtoehto) eli yhteensä neljä vaihtoehtoa, jos ensimmäiseen palikkaan kiinnittyy suoraan kaksi palikkaa. Näin ollen eri muotoisia ketjuja on yhteensä 8++4=4. Samoin kuin edellä saadaan erilaisten ketjujen kokonaismääräksi 4* 4 *5 4 = d) Minkä sokereiden biologisen tehtävän kannalta c-kohdassa havainnollistettu seikka on mitä ilmeisimmin hyödyllinen? Sokerit toimivat monissa kudoksissa ja solujen välisissä vuorovaikutuksissa tunnistesignaaleina. Toisessa tunnistuksen osapuolessa on tunnisteproteiinissa tiettyä sokeria sitova lektiinin kaltainen domeeni. Toisella osapuolella taas on sokeriryhmä. On tietenkin edullista, että ainakin toisia tunnistesignaaleja voidaan tehdä suuri määrä erilaisia pienestä määrästä erilaisia monomeerejä ja käyttämättä suurta määrää monomeerejä. B. Sekundääri- ja tertiäärirakenteesta a) Karboksipeptidaasi on n. 00 aminohappotähteen proteiini, joka on suunnilleen pallomainen (säde 5 Å). Miten monta aminohappoa voisi enintään olla pisimmässä mahdollisessa α-heeliksissä eli α- kierteessä? Entä β-laskoksessa? α-heeliksissä toistojakso,6 aminohappoa per kierros ja kierroksen pituus on 5,4 Å (eli 540 pm). Näin ollen on noustu matka,5 Å/aminohappo. 50 Å:n eli halkaisijan matkalle mahtuu siis enintään a aminohappoa, a,5 Å < 50 Å, a < 500/5,. a=. Pitkin proteiinin halkaisijaa kulkevaan α- heeliksiin mahtuisi siis aminohappoa. (Proteiinin pinnalle vähemmän, sillä α-heeliksi ei ole kovin taipuisa.) β-laskoksessa harjanteiden (/\/\/\) välinen etäisyys on kaksi aminohappoa ja n. 7 Å, joten aminohappojen välinen etäisyys on n.,5 Å ja siis suoraan β-laskokseen mahtuisi enintään b aminohappoa, b,5 Å < 50 Å, b < 500/5 4,, joten b=4. β-laskos voisi toki kiertyä ja kaartua jonkin verran ja jos laskisi β-käännökset osaksi β-laskosta, niin silloin vaikka koko proteiini voisi muodostua β-laskoksesta ja β-käännöksistä. b) Pienille laskostuneille proteiineille liuottimen kanssa kosketuksissa oleva pinta (solvent accessible surface area, joka kuvaa sitä, miten suuri on se pinta-ala, jolle (yleensä) vesimolekyyli voisi tunkeutua) on likimain suoraan verrannollinen tekijään M / ja laskostumattomille proteiineille puolestaan likimain suoraan verrannollinen tekijään M. M on kummassakin proteiinin massa. Selitä, mistä ero johtuu ja mitä se kertoo pienten proteiinien laskostumisesta.

3 Aminohappojen lukumäärä on likimain verrannollinen massaan. Siis laskostumattoman proteiinin jokseenkin avonaiselle ja satunnaiselle aminohappoketjulle on pinta-ala likimain yhden aminohapon pinta-ala kertaa aminohappojen lukumäärä. Koska aminohappjen lukumäärä N M ja koska A ketju =A ah N, on A M. Siispä laskostumaton ketju on avonainen. Jollekin säännöllisen muotoiselle kappaleelle puolestaan V k, A k ja L k, missä V on tilavuus, A pinta-ala, L yksiulotteinen etäisyys (esim. pituus, halkaisija tms.) ja k on mittakaava. Aminohappojen yhteistilavuus on suoraan verrannollinen massaan. Jos aminohapot ovat tiiviisti pakkautuneet proteiiniksi, on aminohappojen yhteistilavuus V ah V prot. Toisaalta jos pakkautumisen väliin jäävien tilojen määrä on suoraan verrannollinen tilavuuteen, on edelleen V prot V ah. Tällöin V prot M. Tällaiselle kappaleelle A V / M /. Koska liuottimelle altis pinta-ala kasvaisi, jos raot olisivat suuria, niin voidaan siis päätellä, että pienet proteiinit pakkautuvat likimain samanmuotoisiksi (jolloin likimain pallomainen rakenne vaikuttaa loogiselta) ja tiiviisti. c) Ns. Ramachandran plot tai Sasisekhran Ramakrishnan Ramachandran plot kuvaa peptidirungon sidosten sallittuja kulmia ja kulmia, joilla tietyt sekundäärirakenteet ovat mahdollisia. Tällainen kuvaaja voidaan piirtää myös eri aminohappotähteille erikseen (esimerkiksi laskemalla tietokonemallien avulla sallitut kulmat, joilla steeriset vuorovaikutukset eri asennoissa eivät ole liian epäedullisia). Miten tällaisissa kuvaajissa sallittujen kulmaparien osuus kaikista mahdollisista eroaisi alaniinin, valiinin ja glysiinin muodostamille ketjuille, kun niitä tarkastellaan suhteessa toisiinsa? Kaikilla aminohapoilla lukuun ottamatta proliiinia (joka oikeastaan onkin iminohappo) on samanlainen runko, joten erot johtuvat sivuketjuista. Valiinin sivuketju on -CH(-CH ), alaniinin -CH ja glysiinin vain -H. Valiinin suurin sivuketju rajoittaa eniten sallittujen kulmaparien määrää, glysiinille taasen sallittujen kulmaparien määrä on suurin, koska sen sivuketju on mitättömän pieni eli pelkkä vety. Alaniini sijoittuu näiden väliin. Tehtävä : Sekvenssistä kolmiulotteiseksi proteiiniksi tryptofaanisyntaasi 0 0 p. A. 40 vuotta sitten C. Yanofsky ym. tutkivat 960-luvulla aminohappovaihdosten vaikutusta entsyymiaktiviteettiin. Koesarjassa tutkittiin mutaatioiden vaikutusta E. coli -bakteerin tryptofaanisyntaasi-entsyymiin (Science 46:59 (964)). Sittemmin mutaatioiden vaikutuksiin perustava lähestymistapa on tullut yhdeksi keskeisimmistä solu- ja molekyylibiologian menetelmistä. Aminohappo sekvenssin kohdassa A vaihtui mutanteissa toiseksi aminohapoksi mm. seuraavasti: entsyymi aminohappo kohdassa A aktiivisuus wild type Gly täysi mutantti Glu puuttuu mutantti Arg puuttuu mutantti Ser täysi mutantti 4 Ala täysi mutantti 5 Val osittainen (wild type = luonnossa (pääasiallisesti) esiintyvä muoto) Tutkimuksen edetessä todettiin että muntanttientsyymeissä esiintyy aminohappovaihdoksia kohdan A lisäksi myös toisessa kohdassa. entsyymi aminohappo A aminohappo B aktiivisuus wild type Gly Tyr täysi mutantti Glu Tyr puuttuu mutantti 6 Glu Cys osittainen mutantti 7 Gly Cys puuttuu

4 Aikakauden tekniikalla pystyttiin selvittämään aminohappojen A ja B sijaitsevan peptidiketjussa 6 aminohapon päässä toisistaan. Riittävällä varmuudella voitiin osoittaa että muita aminohappovaihdoksia ei ole tapahtunut. Entsyymin koko aminohappojärjestys saatiin kuitenkin selville vasta joitakin vuosia myöhemmin. Muodosta tulosten perusteella hypoteesi aminohappojen A ja B merkityksestä entsyymin toiminnassa. Selitä mutantin 6 aktiivisuus mallisi perusteella. Vinkki: hae oppikirjasta esiin aminohappojen rakenteet. Oheiseen taulukkoon piirretty aminohappojen sivuketjut H glysiini tyrosiini WILD TYPE täysi aktiivisuus C O glutamaatti tyrosiini MUTANTTI ei aktiivisuutta

5 NH C NH NH arginiini tyrosiini MUTANTTI ei aktiivisuutta seriini tyrosiini MUTANTTI täysi aktiivisuus CH alaniini tyrosiini MUTANTTI 4 täysi aktiivisuus

6 CH CH CH valiini tyrosiini MUTANTTI 5 osittainen aktiivisuus C O SH glutamaatti kysteiini MUTANTTI 6 osittainen aktiivisuus H glysiini SH kysteiini MUTANTTI 7 ei aktiivisuutta Oheisesta taulukosta helposti nähdään, ettei sivuketjujen polaarisuus, vetysitoutuminen tai varaus vaikuta,esim. glysiinin substituutio sekä alaniiniksi että seriiniksi säilyttää aktiivisuuden ja toisaalta glysiinin substituutio suuriksi aminohapoiksi kuten positiivisesti varatuksi arginiiniksi, negatiivisesti varatuksi glutamaatiksi tai neutraaliksi valiiniksi heikentää aktiivisuutta. Tämän vahvistaa se, että paikan B aminohapon muuttuminen tyrosiinista pienimmäksi kysteiiniksi palauttaa osin aktiivisuutta mutantissa 6. Jos molemmat aminohapot ovat pieniä (mutantti 7), niin aktiivisuus menetetään. Mutanttien perusteella looginen hypoteesi on, että aminohapot A ja B sijaitsevat entsyymin aktiivisessa kohdassa ja että niiden yhteensä viemä tila on tärkein aktiivisuuteen vaikuttava tekijä, ts. jos molemmat ovat suuria, substraatti ei mahdu sitoutumaan ja jos molemmat ovat pieniä, on sitoutumistasku liian väljä, jotta substraatti orientoituisi oikein.

7 B. Uudet tuulet Ylläolevat tulokset pystyttiin todellisuudessa selittämään vasta vuosikymmeniä myöhemmin kun entsyymin kolmiulotteinen rakenne ratkaistiin. Tutki esim. Rasmol-ohjelmalla tryptofaanisyntaasin kiderakennetta. Aminohapot A ja B ovat ovat kyseisissä rakenteissa tyr75 ja gly. Tiedostossa BKS.PDB on wild-type entsyymin kiderakenne. Entsyymi on myös kiteytetty substraattianalogi indolipropanolifosfaatin (IPL) kanssa (tiedosto QOP.PDB). Tässä rakenteessa IPL molekyyli on sitoututuneena tryptofaanisyntaasin alfaketjun aktiiviseen kohtaan. Miten kiderakenteet muuttavat 960-luvulla tekemääsi hypoteesia? Ladataan Rasmol-ohjelmaan kiderakenne Protein Data Bankista ( Valitaan esim. =>display=>ribbons. Kirjoitetaan komentoriville "select IPL" (enter) "spacefill" (enter) "colour orange" (enter), jolloin saadaan aktiivisessa kohdassa oleva substraattianalogi osoittamaan aktiivisen kohdan paikkaa: Valitaan nyt Gly ja Tyr75, jotta näemme, miten ne sijaitsevat suhteessa aktiiviseen kohtaan. Kirjoitetaan komentoriville "select Gly" (enter) "spacefill" (enter) "colour blue" (enter) "select Tyr75" (enter) "spacefill" (enter) "colour red" (enter). Nyt näemme, miten aminohapot A ja B sijaitsevat suhteessa aktiiviseen kohtaan. Aminohappo A eli tässä tapauksessa glysiini näkyy kuvassa sinisenä ja aminohappo B eli tyrosiini 75 punaisena. Substraatin sitoutumispaikkaa osoittava substraattianalogi näkyy kuvassa oranssina. Kuvan perusteella voidaan päätellä, että alkuperäinen hypoteesi on mitä todennäköisimmin oikea, sillä molemmat aminohapot ovat aktiivisessa kohdassa ja vieläpä aivan vierekkäin samalla puolella substraatin sitoutumispaikkaa ja lähikontaktissa substraattiin.....

8 ... C. Ovatko kaikki bakteerit samaa maata? Kiderakenteet ovat Salmonella typhimurium -bakteerin entsyymistä. Escherichia colin entsyymiä ei ole onnistuttu kiteyttämään eikä näin ollen tarkkaa tietoa kolmiulotteisesta rakenteesta ole. Tee tietokantoja käyttämällä sekvenssihaku ja tutki kuinka homologisia näiden kahden bakteerin tryptofaanisyntaasit ovat. Kuinka hyvin tämä homologia kuvaa kolmiulotteisen rakenteen samankaltaisuutta? Menemällä sivulle ja valitsemalla Swiss-Prot/TrEMBL-haku voidaan hakea Salmonella typhimuriumin tryptofaanisyntaasin α-ketjun sekvenssi. Valitaan oikeasta yläkulmasta Blastp-ajo. Ohjelma hakee lähisukuisia sekvenssejä ja vertailee niitä. Saadaan 78 %:n identiteetti E. colin sekvenssin kanssa, joka löytyy listalta. Painamalla kyseisestö ikkunasta align-linkkiä päästään sivulle, joka antaa seuraavat tulokset: CLUSTAL FORMAT for T-COFFEE Version_.7, CPU=0. sec, SCORE=870, Nseq=, Len=68 sp P0099 TRPA_SALTY MERYENLFAQLNDRREGAFVPFVTLGDPGIEQSLKIIDTLIDAGADALELGVPFSDPLAD sp P0098 TRPA_ECOLI MERYESLFAQLKERKEGAFVPFVTLGDPGIEQSLKIIDTLIEAGADALELGIPFSDPLAD *****.*****::*:**************************:*********:******** sp P0099 TRPA_SALTY GPTIQNANLRAFAAGVTPAQCFEMLALIREKHPTIPIGLLMYANLVFNNGIDAFYARCEQ sp P0098 TRPA_ECOLI GPTIQNATLRAFAAGVTPAQCFEMLALIRQKHPTIPIGLLMYANLVFNKGIDEFYAQCEK *******.*********************:******************:*** ***:**: sp P0099 TRPA_SALTY VGVDSVLVADVPVEESAPFRQAALRHNIAPIFICPPNADDDLLRQVASYGRGYTYLLSRS sp P0098 TRPA_ECOLI VGVDSVLVADVPVEESAPFRQAALRHNVAPIFICPPNADDDLLRQIASYGRGYTYLLSRA ***************************:*****************:*************: sp P0099 TRPA_SALTY GVTGAENRGALPLHHLIEKLKEYHAAPALQGFGISSPEQVSAAVRAGAAGAISGSAIVKI sp P0098 TRPA_ECOLI GVTGAENRAALPLNHLVAKLKEYNAAPPLQGFGISAPDQVKAAIDAGAAGAISGSAIVKI ********.****:**: *****:***.*******:*:**.**: ***************

9 sp P0099 TRPA_SALTY IEKNLASPKQMLAELRSFVSAMKAASRA sp P0098 TRPA_ECOLI IEQHINEPEKMLAALKVFVQPMKAATRS **:::.*::*** *: **..****:*: Nähdään, että sekvenssit ovat enimmäkseen samat, joten on syytä olettaa, että kolmiulotteiset rakenteet todennäköisesti vastaavat melko hyvin toisiaan. Huomautettakoon, että lisäksi tiedetään, että E. colin ja S. typhimuriumin entsyymin eri alayksiköt muodostavat keskenään toimivia kokonaisuuksia. Näin ollen vaikuttaa luultavalta, että rakenteellinen vastaavuus on ainakin meidän tehtävämme kannalta tarpeeksi hyvä. Tehtävä : Periferaalinen membraaniproteiini sytokromi c (cytochrome c) 0 8 p. Sytokromi c:n sekvenssiä voidaan käyttää lajien sukulaisuussuhteiden määrittämiseen (esim. Lehningeristä löydät kuvan), koska se on evolutiivisesti hyvin vanha proteiineja ja monissa sen sekvenssin aminohapoissa esiintyy vain vähän muuntelua eli ne ovat konservoituneita (conserved). Yleensä tällaisten aminohappojen ajatellaan olevan erityisen tärkeitä proteiinin rakenteen ja funktion kannalta. Sekvenssivertailuohjelmilla (esim. ClustalW) voidaan nähdä, miten ne sijoittuvat sekvenssissä. Havainnollisempaa on kuitenkin nähdä, miten ne sijoittuvat proteiiniin. Tämä onnistuu ConSurfin avulla, joka tarvitsee tunnetun proteiinirakenteen ja sen jälkeen itse tekee PSI-BLAST haun, jossa se etsii tunnetuista sekvensseistä 50 samankaltaisinta ja jonka perusteella se sitten puolestaan värittää tunnetun rakenteen aminohappotähteet sen mukaan, miten konservoituneita ne ovat. Käytä ConSurfissa ( tunnettua rakennetta, jonka PDB-koodi on HRC. (Huom! Varmista, että koneella on Chime asennettuna, sillä tuloksien tarkasteluun käytettävä Protein Explorer tarvitsee sen toimiakseen. Ellei ole, sen saa imuroitua ilmaiseksi osoitteesta joskin rekisteröitymistä edellytetään.) Tuloksia tarkastellessasi kokeile myös toista katsontatapaa (hiiren oikea näppäin, Select Protein; hiiren oikea näppäin, Display Ribbons). Tämä katsontatapa helpottaa merkittävästi b- ja c-kohtia. a) Tälle proteiinille löydät pikaisestikin oppikirjaa selaamalla ja toisaalta PubMed-haun ( avulla kaksi toisistaan poikkeavaa biologista toimintoa. Mitkä ne ovat? Mikä prosteettinen ryhmä proteiinin keskellä on? Sytokromi c toimii toisaalta elektroninsiirtäjänä elektroninsiirtoketju(i)ssa ja toisaalta toimii apoptoosin eli ohjelmoidun solukuoleman signaaliketjussa ja aktivoi ohjelmoidun solukuoleman prosesseja vapautuessaan mitokondrioista. Prosteettinen ryhmä proteiinin keskellä on hemi, joka koostuu porfyriinistä ja siihen koordinoidusta rautaionista. b) Miten konservoituneet ja muuttuvat aminohapot sijoittuvat proteiinin rakenteeseen? Liitä esim. kuva ja lyhyt sanallinen selostus tai pelkästään jälkimmäinen, jos kuvan liittämisessä ongelmia.

10

11 Katsomalla kuvia havaitaan, että suuri osa konservoituneista aminohapoista keskittyy prosteettisen ryhmän ympärillä ja toisaalta kyljelle, joka on lähellä prosteettista ryhmää. Vaikuttaa siis ilmeiseltä, että ne osallistuvat toiminnan kannalta keskeisiin prosesseihin, joihin vaaditaan prosteettista ryhmää ja toisaalta sen vuorovaikutusta ympäristön kanssa. c) Rakenteessa näkyy hajanaisesti konservoituneita aminohappoja muuallakin. Valitse hiiren oikealla näppäimellä Select Residue GLY. Valitse jälleen hiiren oikealla näppäimellä esim. Display Ball and stick ja kokeile myös Display Spacefill van der Waals radii. Millaisissa rakenteen kohdissa glysiinit näyttäisivät pääosin esiintyvän? Mikä voisi olla syynä siihen, että juuri glysiinit esiintyvät tällaisissa paikoissa? Oheisessa kuvassa glysiinit valittu ja asetettu ohjelma näyttämään ne spacifill-asetuksilla, jotta ne erottuvat muusta proteiinista. Havaitaan, että suuri osa glysiineistä sijaitsee äkillisissä käännöksissä. Syynä esiintymiseen tällaisissa paikoissa voisi olla se, että glysiinin sivuketju on pieni ja se pystyy esiintymään monissa eri kulmissa ilman sivuketjun aiheuttamia steerisiä esteitä (katso tehtävää ).

12 Tehtävä 4: Integraalinen membraaniproteiini akvaporiini (aquaporin, aquaporin-chip) 0 0 p. Tänä vuonna toinen kemian alan Nobel-palkinnon saajista eli Peter Agre sai palkintonsa akvaporiinien löytämisestä. Ainakin Ruotsin Kuninkaallinen Tiedeakatemia siis ilmeisesti piti moista oivana tekona, joten tutustukaamme siihen, mistä oikein on kysymys. A) Akvaporiinien toiminnasta a) Selitä lyhyesti, mitä akvaporiinit tekevät (nimestäkin sen jo arvaa). Akvaporiinit ovat kanavia, jotka päästävät selektiivisesti (lähinnä) vettä lävitseen. b) Selitä lyhyesti, mikä määrää (netto)kulkusuunnan akvaporiinimolekyylin läpi. Akvaporiini on kanava eikä pumppu, joten kulkusuunnan määrää veden aktiivisuus kalvon eri puolilla (/ osmoottinen paine / vapaan veden pitoisuus). c) Selitä lyhyesti, miten akvaporiinit liittyvät munuaisten toimintaan ja miksi siis niillä saattaisi olla merkitystä esim. lääketieteen kannalta. Jos päädyt tekemään hakuja verkossa, voit käyttää hakuja tehdessäsi esim. joitakin hakusanoista hakusanoja ADH, aquaporin, vasopressin, renal, fluid retention. Akvaporiinit osallistuvat munuaissoluissa vesivirtojen säätelyyn. Laimeaa primäärivirtsaa syntyy vuorokaudessa lähes 00 litraa. Suurin osa sen vedestä imeytyy takaisin elimistöön. Muutenkin munuaisen toiminnan kannalta keskeistä on konsentraatiogradienttien synnyttäminen, mikä puolestaan edellyttää munuaisen eri osien erilaista vedenläpäisevyyttä, mikä on mahdollista akvaporiinien ansiosta. Tärkeä on rooli akvaporiinilla on myös kokoojaputkissa, joissa akvaporiini- siirtyy antidiureettisen hormonin vaikutuksesta solun sisällä olevista kalvorakkuloista solukalvoon, jolloin vedenläpäisevyys kasvaa ja enemmän vettä imeytyy takaisin. Akvaporiini on siis keskeinen elimistön nestetasapainon säätelyssä. Nestetasapainoon vaikuttaminen on puolestaan keskeistä esim. sydämen vajaatoiminnassa ja toisinaan myös verenpaineen hoidossa (ns. nesteenpoistolääkkeet lienevät monille tuttuja).

13 B) Akvaporiinin sekvenssistä a) Hae Swiss-Protin ( avulla naudan (Bos taurus) aquaporin-chipsekvenssi. Syötä hakutuloksesi BLASTiin (klikkaa hakutulossivun alalaidasta "BLAST submission on ExPASy/SIB"). Millaisia proteiineja löydät hakutuloksiesi joukosta? Ohjelmalle antamaasi sekvenssiä muistuttavia proteiineja löytynee sekä samasta eliöstä että muista eliöistä. Mitä tämä kertoo proteiinien kehittymisestä menneiden aikojen kuluessa? Klikkaa hakutulosten kuvamuotoisen esitystavan ylälaidassa olevaa Pfam-valikkoa, josta saat lisätietoja proteiiniperheestä. Entä miten proteiinien evoluutio ja sukupuu muuttuisi mielenkiintoisemmaksi ja monimutkaisemmaksi, jos kyseessä olisi proteiini, jolla on monta domeenia? (Vastataksesi tähän selvitä itsellesi, mikä on domeenin määritelmä ja mitkä ovat sille tyypillisiä piirteitä suhteessa geenien eksoneihin ja toimintoihin.) Läheisimmät sukulaiset ovat akvaporiinin samaa isomuotoa eri lajeilta ja kaukaisempina sukulaisina löytyy akvaporiinin eri isomuotoja samalta ja muilta lajeilta. Toisaalta tämä tietysti kertoo sen, että funktiot ovat erilaistuneet ennen lajien erkaantumista. Lisäksi nähdään myös se, että proteiinit paitsi muuttuvat mutaatioiden tuloksena, niiden geeni voi myös kahdentua ja alkaa erilaistua eri proteiiniksi/isomuodoksi (jolla on myös erilaistuneet toiminnot). Monet eri domeenit muuttaisivat tilannetta siten, että domeeneilla olisi oma kehityshistoriansa. Yhden domeenin sukulaisia saattaisia esiintyä monissa eri proteiineissa, joiden muut domeenit eivät olisi samalla tavalla sukua keskenään. b) Ota muistiin naudan sekvenssin nimi. Elät toistaiseksi menneisyydessä ja haluat selvitellä sekvenssin perusteella joitakin alkeellisia tietoja proteiinien rakenteesta eli transmembraaniheeliksien määrää. Tässä apuna toimiin Stephen Whiten laboratorion Membrane Protein Explorer ( Kokeile ohjelmalla hieman eri hydropaattisuusasteikkoja (avautuvan Java-ikkunan oikealla puolella. Montako transmembraaniheeliksiä ohjelma ennustaa akvaporiinilla olevan? Selitä muutamin sanoin myös se periaate, johon tuollainen ennustus yleensä perustuu. Nähdään ohjelman ennustavan kuusi transmembraaniheeliksiä oletusasetuksilla. Tällaiset ennusteet perustuvat siihen, että ohjelmat etsivät erilaisiin hydrofobisuusasteikkoihin perustuen

14 aminohapposekvenssistä jaksoja, joissa olisi tarpeeksi pitkä jakso (9 0) aminohappoja transmembraaniheeliksiä varten. C) Akvaporiinin rakenteesta Onneksi naudan akvaporiinin rakenne on saatu jo selvitettyä. Sen PDB-koodi on J4N. Imuroi tiedosto Protein Data Bank -palvelusta ( Tarkastele rakennetta esimerkiksi Rasmolin tai Chimen avulla (jälkimmäisessä tapauksessa avaa tiedosto selainohjelmaan, joka osaa Chime plugin -ohjelman avulla avata pdb-tiedoston). a) Väritä proteiinin hydrofiiliset/polaariset ja toisaalta hydrofobiset aminohapot eri väreillä. Onko tuloksessa mitään järkeä? Minkä mielenkiintoisen seikan huomaat membraanin uppoutuneiden heeliksien lukumäärän ja rakenteen suhteen (vertaa Bb-kohdassa saamiisi ennusteisiin)? Havaitaan, että polaariset aminohapot ovat enimmäkseen proteiinin muodostaman kanavan sisäpinnalla ja kalvon läp kulkevan osan ulkopuolella, kun taas kalvon läpäisevän osan lipideitä kohti suuntautuvat aminohapot ovat enimmäkseen hydrofobisia. Tuloksessa on mitä ilmeisimmin järkeä, sillä polaariset aminohapot ovat niitä, jotka ovat kontaktissa veden kanssa ja hydrofobiset niitä, jotka ovat kontaktissa lipidien rasvahappoketjujen kanssa. Nähdään, että varsinaisia transmembraaniheeliksejä on seitsemän. Lisäksi nähdään, että rakenteessa esiintyy yksi kahdesta lyhyestä heeliksistä muodostuva transmembraanijakso, jota transmembraaniennustusohjelman ei oikein voisikaan olettaa löytävän, koska se etsii yhtenäisiä jaksoja, jotka ovat tarpeeksi pitkiä.

15 b) Tee sille samanlainen temppu kuin tehtävässä eli väritetä se ConSurf-ohjelman avulla aminohappojen konservoituneisuuden mukaan. Millaisen tuloksen sait ja miksi se oikeastaan oli odotettu, siis miksei mikä hyvänsä polaarinen aminohappo kelpaa konservoituneen alueen tilalle? Nähdään, että konservoituneet aminohapot ovat keskittyneet kanavan sisään. Tämä oli odotettavissa, koska kanavan täytyy toimia siten, että se päästää pelkästään vettä lävitseen, muttei muita polaarisia yhdisteitä kuten H O + :aa. Näin ollen mikä tahansa polaarinen aminohappo ei kelpaa kanavan sisälle, vaan niiden täytyy olla juuri sellaisia, että ne takaavat tuon selektion. Siksi aminohappovaihdokset kanavan sisällä johtaisivat todennäköisemmin toimimattomaan proteiiniin ja mutaation karsiutumiseen luonnonvalinnassa. Näin ollen juuri kanavan sisäosa on konservoitunut.