KE ORGAANINEN RAKENNEANALYTIIKKA (5 op)

Transkriptio

1 KE ORGAANINEN RAKENNEANALYTIIKKA (5 op) Staff Scientist, FT Jari Koivisto uone: C 308b Puhelin: Sähköposti: jari.koivisto@aalto.fi 1

2 ORGAANINEN RAKENNEANALYTIIKKA Yleistä Luennot: Maanantaisin klo 12:15 14:00 salissa Ke5 ja torstaisin 14:15 16:00 salissa Ke4 ( ). arjoitukset ja kotitehtävät: Perjantaisin klo 12:15 15:00 salissa Ke4 ( ). Vapaaehtoinen kotitehtävä, joka käydään läpi viimeisen harjoituksen yhteydessä. Laitedemonstraatiot: Erikseen sovittavina ajankohtina yht. max. 7h. Luentomateriaali: Luentomoniste Kurssin suoritus: Tentti keskiviikkona klo 8:00 11:00 luentosaleissa 1 ja 2 ja/tai torstaina klo 8:00 11:00 luentosaleissa 1 ja 2 (max. 100p.). 2

3 ORGAANINEN RAKENNEANALYTIIKKA Sisältö ja tavoitteet Sisältö: Kurssilla perehdytään massaspektrometrian (MS), infrapunaspektrometrian (IR) ja ydinmagneettisen resonanssispektroskopian (NMR) käyttöön orgaanisten yhdisteiden rakennetutkimuksessa ja identifioimisessa. Tavoitteet: Kurssin suoritettuaan opiskelija osaa 1. tulkita MS-, IR- ja NMR-spektrejä 2. ratkoa orgaanisten molekyylien rakenteita MS-, IR- ja NMR-spektrien avulla 3. MS-, IR- ja NMR-spektrometrien toimintaperiaatteet 3

4 1. Johdanto 1.1 MS, IR ja NMR tällä kurssilla Massaspektrometria Fragmentaatio IR-spektroskopia Molekyylipaino UV-spektroskopia (ei käsitellä kurssilla) Funktionaaliset ryhmät (O, C=O,...) Molekyylikaava Kromoforit (-C=C-C=C-,...) TA (DBE) NMR-spektroskopia Avaruusrakenne eli konformaatio (3D-rakenne) Miten atomit ovat liittyneet toisiinsa (2D-rakenne) 4

5 1. Johdanto 1.2 Molekyylin kaksi- ja kolmiulotteinen rakenne 2D-rakenne kuvaa sitä, miten ja missä järjestyksessä yhdisteen atomit liittyvät toisiinsa Konformaatiosta (3D rakenne) näkyy molekyylin muoto Ei käy ilmi molekyylin todellinen muoto 3D-rakenne vaikuttaa molekyylien ominaisuuksiin Lääkeaineet O N N C 2 C 3 Orgaaninen syntetiikka Molekyylin reaktiivisuus Ympäristömyrkyt Yhdisteen käyttäytyminen luonnossa ja myrkyllisyys Tietty rakenne voi toimia tehokkaana lääkkeenä Samanlaisen yhdisteen toisenlainen isomeeri saattaa olla terveydelle vahingollinen 5

6 1. Johdanto 1.3 Sähkömagneettinen säteily Kvanttimekaniikka: sähkömagneettinen säteily koostuu diskreeteistä energiapaketeista, eli fotoneista Oskilloiva magneettikenttäkomponentti M Klassinen esitys Oskilloiva sähkökenttäkomponentti E 6

7 1. Johdanto 1.3 Sähkömagneettinen säteily Aallonpituus Kahden perättäisen aallon vastinpisteiden välinen etäisyys Amplitudi Fotonin energia E riippuu sen taajuudesta Taajuus eli frekvenssi [z] eli [s -1 ] Aallon huipun korkeus tai pohjan syvyys Aaltojen lukumäärä, joka ohittaa tietyn pisteen sekunnissa E = h hc / missä h = Planckin vakio (6,62618 x Js) ja c = valon nopeus (2,99792 x 10 8 m s -1 ) 7

8 1. Johdanto 1.4 Molekyylin kokonaisenergia Elektroniset energiat Molekyylin kokonaisenergia Kvantittuneita Spektroskopisesti tärkeitä energiamuotoja Värähtelyenergia Pyörimisenergia Kineettinen energia (eteneminen avaruudessa eli translaatio) Ei ole kvantittunut Ei näy spektroskopisissa mittauksissa 8

9 1. Johdanto 1.4 Sähkömagneettisen säteilyn spektri Fotonit voidaan ryhmitellä niiden energian perusteella sähkömagneettisen spektrin eri alueille Molekyylin energiamuodot pyöriminen värähtely elektronit 9

10 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) Molekyylien rakenteita voidaan tutkia erilaisten spektroskopioiden avulla Spektroskopiassa mitataan kahden kvantittuneen tilan välisen siirtymän aiheuttamaa sähkömagneettisen säteilyn emissiota tai absorptiota Molekyylin siirtyessä tilasta E 2 (korkea energia) tilaan E 1 (matala energia) vapautuu kvantin h verran sähkömagneettista säteilyä, jolla on taajuus Absorptio Emissio Vangitsemalla säteilyä kvantin h verran molekyyli voi siirtyä alemmasta energiatilasta E 1 korkeampaan energiatilaan E 2 10

11 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) E Molekyyli absorboi fotonin vain jos fotonin energia vastaa täsmälleen molekyylin kahden tilan välistä energiaeroa E E 2 E = E 2 E 1 = h E 1 11

12 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) Aallonpituus tai taajuus,jossa absorptio tapahtuu Virittymiseen liittyvä energia Absorption intensiteetti Absorboivan systeemin konsentraatio Absorption intensiteetti Energiatilojen välisen siirtymän helppous E 4 E 8 E 3 E 2 1. viritetty tila E 1 E 2 E 3 E 4 E 8 Perustila Taajuus kasvaa Aallonpituus lyhenee Energia kasvaa 12

13 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) Spektroskopioiden ryhmittely tutkittavan energiamuodon mukaan 1. Elektroniset spektroskopiat Röntgen- ja UV-säteily sekä näkyvä valo Spektri syntyy, kun molekyylin kokonaisenergia muuttuu elektronien uudelleenjärjestäytymisen seurauksena Värähdys- ja pyörimisenergian muutokset näkyvät spektrin hienorakenteena 13

14 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) Spektroskopioiden ryhmittely tutkittavan energiamuodon mukaan Infrapunasäteily 2. Infrapunaspektroskopia 3. Raman spektroskopia Näkyvä valo ja UV-säteily Spektri syntyy, kun molekyylin värähdysenergia muuttuu Molekyylejä viritetään esim. laserilla ja mitataan sironnutta valoa Pyörimisenergian muutokset näkyvät spektrin hienorakenteena 14

15 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) Spektroskopioiden ryhmittely tutkittavan energiamuodon mukaan 4. Mikroaaltospektroskopia Mikroaaltosäteily 5. NMRspektroskopia Radioaallot Spektri syntyy, kun molekyylin pyörimisenergia muuttuu Molekyyli on sijoitettuna ulkoiseen magneettikenttään Spektri syntyy, kun ydinten spintilat muuttuvat 15

16 1. Johdanto 1.5 Spektroskopia (spektrometria) Massaspektrometria Toisin kuin edellä mainitut spektroskopiset menetelmät, massaspektrometria ei perustu sähkömagneettisen säteilyn absorptioon Massaspektrometria perustuu ionien tuottamiseen neutraaleista yhdisteistä Ionien uni- tai bimolekulaaristen reaktioiden tutkimista Massaspektrometri on pohjimmiltaan pitkälle kehittynyt punnituslaite (vaaka) Käytetään ensisijaisesti molekyylien massan määrittämiseen 16

17 1. Johdanto 1.6 Molekyylikaavan antama esi-informaatio rakenteesta Tyydyttymättömyysaste (TA) (Double Bond Equivalent (DBE)) [(2n 4 + 2) (n 1 n 3 )] / 2 = n 4 + (n 3 / 2) (n 1 / 2) + 1 n 4 = neliarvoisten atomien lukumäärä molekyylissä (C) n 3 = kolmi... (N, kolmiarvoinen P) {n 2 = kaksi... (=O, -S- jne.)} n 1 = yksi... (-, Cl-, Br- jne.) [(2C + 2) X + N] / 2 Yhtälöä ei voida soveltaa semipolaarisiin sidoksiin eikä suolojen molekyylikaavoihin 17

18 1. Johdanto 1.6 Molekyylikaavan antama esi-informaatio rakenteesta Esim. C 3 6 O TA = [(2 x 3 + 2) 6] / 2 = 1 TA = 4 (kolme kaksoisidosta + rengas) Yhdisteellä on joko yksi kaksoissidos tai yksi rengas TA = 2 O O O O O 18

19 2. Massaspektrometria 2.1 Yleistä Massaspektrometriassa näytemolekyyleistä muodostetaan ioneja jollain sopivalla menetelmällä Ionit erotetaan toisistaan niiden massa/varaussuhteen (m/z) perusteella Tämän jälkeen ionit havaitaan kvalitatiivisesti sekä kvantitatiivisesti massa/varaussuhteen ja esiintymisrunsauden perusteella 19

20 2. Massaspektrometria 2.1 Yleistä Taulukko 1. Eräitä massaspektrometrian sovellutuksia Sovellutus Näytteet Menetelmät Kommentti Molekyylipainon määrittäminen Puhtaat yhdisteet, seokset Tunnista kokonainen molekyyli-ioni Tuloksen vahvistamiseen useita menetelmiä Molekyylikaavan määrittäminen Tavallisesti puhtaat yhdisteet Molekyyli-ionin korkean erotuskyvyn (R) mittaus R-Mittaus yksin antaa harvoin yhden molekyylikaavan Molekyylin rakenteen määrittäminen Puhtaat yhdisteet tai seokset käyttäen LC/MS, GC/MS ja MS/MS Spektri rakennekorrelaatiot; spektrikirjastovertailut Epäillyn rakenteen vahvistaminen on tavallista; täysin tuntemattoman harvinaista Sekvensointi Proteiinit, muut biopolymeerit Tandem-massaspektrometria (MS/MS) erkkä, erittäin nopea ja yhä hyödyllisempi Isotooppitutkimukset Merkatut yhdisteet Ionien runsauden mittaus Tarkat isotooppisuhteiden mittaukset vaativat erityiset laitteistot 20

21 2. Massaspektrometria 2.2 Massaspektrometri Massaspektrometrin toiminnot Näytteen syöttö Näytteen ionisointi Ionien erottaminen Ionien havaitseminen Suorasyöttö Kromatografi Kuumennettava säiliö Elektroni-ionisaatio (EI) Kemiallinen ionisaatio (CI) Nopeat atomit (FAB) Laserdesorptio/ionisointi (MALDI) Elektrosprayionisaatio (ESI) Magneettinen sektori Kvadrupolimassasuodatin Kvadrupoli-ioniansa Lentoaika (TOF) Orbitrap Ionisyklotroniresonanssi (ICR) Elektronimonistin Mikrokanavalevy (MCP) Massaspektrometriassa toiminnat tapahtuvat yleensä korkeassa vakuumissa Näyte tuhoutuu mittausten yhteydessä ei sovellu eri massan omaavien näytteiden erotteluun yvänä puolena on laitteen erittäin suuri herkkyys (jopa ng-luokkaa) 21

22 2. Massaspektrometria 2.2 Massaspektrometri Massa-analyysin kulku Näytteen ionisointi Massaspektri Ionien erottaminen Ionien havaitseminen Suhteellinen runsaus [%] Ionien molekyylipainot [m/z] 22

23 2. Massaspektrometria 2.3 Näytteen sisäänvienti Taulukko 2. Näytteen sisäänvientimenetelmiä Näytteen Näytetyyppi Näytemäärä Ominaisuuksia Ionisointisyöttömenetelmä menetelmä Säiliö (batch) Kaasut, nesteet, matalalla sulavat kiinteät < 1 mg Tasainen näytevirta kauan EI, CI Suorasyöttöprobe eikosti haihtuvat nesteet ja kiinteät < 1 g Näytevirta riippuu lämpötilasta EI, CI, FAB Kaasukromatografi (GC) Liuoksessa olevat seokset < 1 g aihtuville, termostabiileille EI, CI Nestekromatografi (LC) Liuoksessa olevat seokset < 1 ng/ l eikommin haihtuvat ESI, EI, CI Suora infuusio Liuoksessa olevat puhtaat yhdisteet < 1 ng/ l eikommin haihtuvat ESI 23

24 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmiä Voidaan valita minkä tyyppisiä ioneja halutaan: positiivisesti tai negatiivisesti varautuneita radikaalikationeja, protonoituja molekyylejä jne... Voidaan myös valita kuinka paljon ioneja on viritetty, eli kuinka paljon sisäistä energiaa niillä on Sisäisesti viritetyt ionit voivat dissosioitua ja tuottaa pilkeioneja (fragmentti-ioneja) antavat tietoa molekyylin rakenteesta EI:tä lukuunottamatta menetelmät pystyvät tuottamaan sekä positiivisia että negatiivisia ioneja Kokonaiset molekyylit antavat yhdisteen molekyylipainon Massaspektrometrin sydän on ionilähde, missä ionisaatio ja sitä seuraavat reaktiot tapahtuvat Reaktiot ovat joko bimolekulaarisia ioni/molekyylireaktioita (ionit ja neutraalit molekyylit törmäävät) tai unimolekulaarisia prosesseja, joissa energeettiset ionit hajoavat spontaanisti 24

25 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmiä Taulukko 3. Ionisointimenetelmiä Ionisointimenetelmä Ionisoiva tekijä Tyypillinen ioni * Elektroni-ionisaatio (EI) Elektronit M + Kemiallinen ionisaatio (CI) Kaasumaiset ionit [M + ] +, [M ] -, jne Nopeilla atomeilla pommittaminen (FAB) Suurienergiset atomit [M + ] +, [M ] -, [M + Na] +, jne Matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatio (MALDI) Laservalo [M + ] +, [M ] -, [M + Na] +, jne... Elektrosprayionisaatio (ESI) Sähkökenttä, lämpö [M + ] +, [M ] -, [M + Na] +, [M + n] n+, jne * Syntyy yleensä useamman kuin yhden tyyppisiä ioneja (riippuu olosuhteista); M = koskematon analyytti 25

26 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektroni-ionisaatio (EI) Elektroni-ionisaatiossa näytettä pommitetaan sopivan energian omaavilla elektroneilla Molekyylin tai ionin fragmentoituminen riippuu hiilirungosta ja siinä olevista funktionaalisista ryhmistä Orgaanisen molekyylin ja korkeaenergiaisen elektronin törmäys aiheuttaa elektronin irtoamisen molekyylistä muodostuu orgaaninen ioni Fragmentin massasta ja rakenteesta saadaan tietoa emomolekyylin rakenteesta Ioni pilkkoutuu edelleen pienemmiksi fragmenteiksi, vapaiksi radikaaleiksi ja muiksi ioneiksi Yleensä vain positiivisesti varautuneet ionit detektoidaan e - + C 3 O : : -2e - C 3 O +. : [C 3 O] + Metanolin molekyyli-ioni m/z = 32 [C 3 O] + + [C 2 O] + Kationi m/z = 31 m/z = molekyylin massa/varaussuhde 26

27 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektroni-ionisaatio (EI) Fragmentoitumisreaktioita voi olla useita ja fragmentit voivat hajota edelleen Massaspektrit sisältävät usein lukuisia piikkejä, jotka johtuvat joko radikaalikationeista tai muista kationeista Asetofenonin 70 ev elektroniionisaatio(ei)massaspektri. Fragmentoitumisesta johtuvia piikkejä Spektristä saadaan molekyylipaino sekä tietoa yhdisteen rakenteesta. Molekyyliionipiikki O 77 C C CO -C (M + ) NIST Chemistry WebBook 27

28 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektroni-ionisaatio (EI) Taulukko 4. EI-Menetelmän etuja ja haittoja Etuja Toistettava menetelmä Tapahtuu huomattavaa pilkkoutumista yvä ionisoitumistehokkuus Ionisaatio ei ole selektiivinen aittoja Muodostuu vain positiivisia ioneja Muodostuu radikaalikationeja Näytteen täytyy olla haihtuva Ionisaatio ei ole selektiivinen Suhteellisen energeettinen menetelmä Seuraus Spektrikirjastot auttavat yhdisteiden tunnistamisessa Saadaan informaatiota molekyylin rakenteesta Menetelmä on herkkä: yksi tuhannesta molekyylistä ionisoituu Kaikki höyrystyvät komponentit ionisoituvat Seuraus Rajoittaa soveltuvuutta joidenkin yhdisteryhmien kohdalla Toisiintumiset mutkistavat spektrejä Rajoittuu yhdisteisiin, joiden M < ~1000 Da Kaikki höyrystyvät molekyylit vaikuttavat spektriin Usein huomattavaa pilkkoutumista: rajoittaa molekyylipainon määrittämistä 28

29 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Kemiallinen ionisaatio (CI) Kemiallinen ionisaatio (CI) on monipuolisempi ionisointimenetelmä kuin EI Ionisaatio tapahtuu sekundaaristen ionien avulla, jotka on muodostettu reagenssikaasusta EI:llä Tyypillisiä ionisaatioreaktioita: Protonin siirto (yleisin) M + C 5+ [M + ] + + C 4 Varauksen siirto M + Ar + M + + Ar Elektronin sieppaus M + e - (hidas) M - Adduktin muodostus M + TiCl 2+ [M + TiCl 2 ] + Tyyppillisiä reagenssikaasuja ovat mm. vety ( 2 ), metaani (C 4 ), isobutaani (i -C 4 10 ) ja ammoniakki (N 3 ) Näytteen täytyy olla haihtuva Kova ja pehmeä ionisaatio Taulukko 5. CI-Menetelmän ominaisuuksia Rajoittuu näytteisiin, joiden M < ~1200 Da Molekyylipainon määrittäminen tai pilkkoutuminen rakenteellisen informaation saamiseksi CI:ssä voi muodostua monenlaisia ioneja: [M + ] +, [M - ] -, M +, M -, jne... Useita ionisaatioprosesseja Universaalinen tai selektiivinen menetelmä Muodostuu helposti negatiivisia ioneja Mahdollisuus vahvistaa molekyylipaino tai rakennepiirteitä Kumpikin mahdollista, riippuu reagenssikaasun valinnasta Lisäkeino molekyylipainon, rakenteellisiin tai termokemiallisiin mittauksiin 29

30 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Kemiallinen ionisaatio (CI) Reagenssikaasun (isobutaani ja metaani) vaikutus fenyylipropyyliketonin pilkkoutumiseen CI-olosuhteissa. UOM! Spektrissä nähdään ns. M + 1-piikki eikä molekyylipiikkiä. M + 1-Piikki on yleensä voimakas intensiteetiltään (voimakkampi kuin molekyyli-ionin piikki vastaavan yhdisteen EI-spektrissä), koska muodostunut [M + ] + -ioni ei fragmentoidu helposti soveltuu hyvin molekyylipainomäärityksiin. 30

31 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Nopeilla atomeilla pommittaminen (FAB) FAB (Fast Atom Bombardment) Tyypillisesti käytetään suorasyöttöprobea, jossa olevaa näytteen ja matriisin seosta pommitetaan suurienergisillä Xe-, Ar- tai Ne-atomeilla Matriisi on vaikeasti haihtuva liuotin, johon näyte on liuotettu Yleisiä matriiseja ovat mm. tioglyseroli ja m -nitrobentsyylialkoholi (NBA) Ensimmäinen rutiinisti käytetty ionisaatiomenetelmä suurimolekyylisille ja/tai poolisille yhdisteille Eräitä FAB-menetelmän ominaisuuksia: soveltuu haihtumattomille ja/tai termolabiileille yhdisteille pehmeä ionisaatiomenetelmä vain vähän sirpaleioneja käytännössä massaraja n Da helppo lisätä kationeja ionisaation parantamiseksi ([M + Na] +, [M + K] + ) tuottaa suunnilleen saman määrän positiivisia ja negatiivisia ioneja näyte vahingoittuu vain vähän, koska sitä tutkitaan matriisissa huono herkkyys suurilla massoilla (yleesäkin huonompi herkkyys kuin ESI:ssä tai MALDI:ssa) havaitaan suuren intensiteetin ja stabiilisuuden omaava ionivirta FAB-Spektrien tulkinnassa on otettava huomioon: ionisaatiotekniikasta johtuvat vaikutukset - yleensä positiivisella moodilla poolisille yhdisteille muodostuu [M + ] + ja [M + Na] + - matriisiaineen muodostamat rypäleet - näyteionien muodostamat rypäleet vaikutukset, jotka johtuvat atomien suuresta lukumäärästä 31

32 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Nopeilla atomeilla pommittaminen (FAB) Erään 6-aminofulveeni-2-aldimiinin FAB-spektri (positiivinen ioni). Matriisina NBA. m/z = 272(68) (M + ), m/z = 273(100) ([M + ] + ), m/z = 271(10) ([M - ] - ). N C 6 5 N C6 5 Part6/General/0-076A/0079.pdf 32

33 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatio (MALDI) MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) MALDI:ssa käytetään kiinteää matriisia ja ionisaatio saadaan aikaiseksi lasersäteilyllä Kuten FAB:ssä, matriisin rooli on erittäin tärkeä ja sen tulee absorboida valoa käytetyn laserin aallonpituudella MALDI:n yleisiä ominaisuuksia: Yleisiä matriisiaineita ovat mm. nikotiinihappo, kanelihappo ja -syano-4-hydroksikanelihappo Taulukko 6. MALDI:n etuja ja haittoja Etuja Massalukualue käytännössä yli Da erkkä tyypillisesti muodostuu [M + ] +, [M + Na] +, [M + K] +, [M + A] +, missä A on jokin addukti (esim. matriisi tai muu molekyyli) erittäin herkkä tekniikka nopea, soveltuu hyvin molekyylipainon määrittämiseen tuottaa pääasiallisesti yhdesti varautuneita ioneja massa-alue n Da, matriisi voi haitata massa-alueella < 1000 Da poolittomien yhdisteiden ionisointi suhteellisen vaikeaa sietää ESI:ä paremmin biologisille näytteille tyypillisiä suoloja ja puskureita soveltuu myös ESI:ä paremmin monimutkaisten seosten analysoimiseen voidaan analysoida usean tyyppisiä molekyylejä: peptidit, proteiinit, porfyriinit, oligosakkaridit, oligonukleotidit, aromaattiset polyesteridendrimeerit ja orgaaniset synteettiset polymeerit Pehmeä Sietää suoloja aittoja Matala resoluutio Matriisista aiheutuva tausta Mahdollisuus fotohajoamiseen Kvantitointi ei ole mahdollista 33

34 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Matriisiavusteinen laserdesorptio/ionisaatio (MALDI) Erään suuren biomolekyylin MALDI-spektri. Typpilaser (355 nm), matriisina -syano- 4-hydroksikanelihappo. 34

35 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektrosprayionisaatio (ESI) ESI (ElectroSpray Ionization) Sähkösumutus on normaalipaineessa tapahtuva ionisaatiotekniikka (API = Atmospheric Pressure Ionization) Näyte liuoksessa Varattu aerosoli Näyteionit Massa-analyysi Normaalipaine Vakuumi LC N 2 [M + n] n+ Ionien muodostuminen ESI:ssä: Näyteliuos johdetaan kapillaarin läpi, joka on 3-4 kv potentiaalissa muodostuu hienojakoinen suihku suuresti varautuneita pisaroita pisarat kuivataan käyttämällä kuivauskaasua ja lämpöä pisaroiden koko pienenee varausten välinen poistovoima kasvaa yli pintajännityksen aiheuttaman voiman alkaa muodostua yksittäisiä ioneja M + M M + + M 35

36 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektrosprayionisaatio (ESI) Eräitä ESI:n ominaisuuksia: tyypillisesti muodostuu seuraavanlaisia ioneja: - pos. moodi: [M + ] +, [M + Na] +, [M + K] +, [M + liuotin + ] +, [M + liuotin + Na] +,... - neg. moodi: [M ] -, [M anioni] -,... muodostaa helposti moninkertaisesti varautuneita ioneja [M + n] n+ laajentaa spektrometrin massa-aluetta näytetyypit: - ioniset yhdisteet, joilla on varaus liuoksessa - neutraalit/polaariset yhdisteet, jotka protonoituvat (pos. moodi) tai deprotonoituvat (neg. moodi) käytetyissä liuotinolosuhteissa - ei-polaariset yhdisteet, jotka hapettuvat (pos. moodi) tai pelkistyvät (neg. moodi) elektrospraykapillaarin kärjessä - ei sovellu ei-polaarisille yhdisteille, jotka eivät hapetu/pelkisty kapillaarin kärjessä ionisoituminen tapahtuu suoraan liuoksesta voidaan tutkia ionisia ja termisesti labiileja yhdisteitä pehmeä menetelmä muodostaa vain vähän fragmentteja ei matriisivaikutusta kuten MALDI:ssa voidaan tutkia pieniäkin yhdisteitä (< 1000 Da) käytännössä massaraja n Da näytteensyöttömenetelmänä esim. LC, CZE tai suora infuusio tutkittavan analyytin lisäksi muutkin näytteessä olevat polaariset/ioniset yhdisteet saatavat ionisoitua paras herkkyys saavutetaan, jos näyte sisältää vain tutkittavaa yhdistettä näytteessä olevat elektrolyytit kilpailevat varauksista heikentää tutkittavan analyytin ionisoitumista 36

37 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektrosprayionisaatio (ESI) Leusiinienkefaliini (asetaattisuola) C N 5 O 7 ESI-spektri (pos. moodi). [M + ] + -ionin laskettu m/z = LeuEnk_020107, W+ LeuEnk_ (0.981) Cm (27:53) 100 LCT Premier [M + ] + 02-Jan :45:21 TOF MS ES+ 1.01e4 % m/z

38 2. Massaspektrometria 2.4 Ionisointimenetelmät Elektrosprayionisaatio (ESI) Sytokromi c :n (molekyylipaino n Da) ESI-spektri. (a) Alhainen resoluutio, (b) korkean resoluution spektri kapealta alueelta. Spektrissä (a) näkyvät varaustilat ([M + 10] ([M + 16] 16+ ). Spektristä (b) saadaan yhden varaustilan isotooppikoostumus (ionien varaus 15+). 38

39 2. Massaspektrometria 2.5 Massa-analysaattorit Sektorilaitteet Sektorilaitteet ovat nykyään ns. kaksoisfokusoivia laitteita, joissa on sekä magneettinen että sähköinen analysaattori Magneettikenttä toimii varsinaisena massa-analysaattorina; sähkökenttä on energia-analysaattori Sähkökenttä on ennen magnettikenttää normaalin geometrian laite (kuvassa); magneettikenttä ennen sähkökenttää käännetyn geometrian laite Sektorilaitteiden ominaisuuksia: suhteellisen suuri massalukualue (sitä suurempi mitä vahvempi B ) hyvä resoluutio ja tarkan massan määrityskyky erinomainen herkkyys = erinomainen ionien läpäisykyky kohtuullisen hyvä pyyhkäisynopeus dynaaminen alue hyvä (pienin määrä ainetta, joka voidaan havaita muiden runsaiden yhdisteiden joukosta) kokeellisesti ei kovin vaikea hallita kalliita isoja m/z = B 2 r 2 /2V missä m = ionin massa, z = ionin varaus, B = ionin kokeman magneettivuon tiheys, r = magneettikentän säde ja V = kiihdytysjännite. 39

40 2. Massaspektrometria 2.5 Massa-analysaattorit Kvadrupolilaitteet Kvadrupolilaitteen ominaisuuksia magneettilaitteeseen verrattuna: neljä sauvaa vierekkäisillä sauvoilla vastakkainen polaarisuus kussakin sauvassa sekä tasavirta että vaihtovirta (radiotaajuus) Kvadrupolilaitteissa ionit kiihdytetään muutaman ev:n jännitteellä (tyypillisesti 2-20 ev). Ionit kulkevat mutkikasta rataa laitteen läpi. Vain yksi ioni pääsee kerralla läpi. Ionin kulkureitti riippuu ainoastaan sen m/z-arvosta, ei nopeudesta todellinen massasuodatin. halvempi kevyitä ja kompakteja yksinkertaisempi, helppo automatisoida, vain jännitettä muutetaan sietää korkeampaa painetta suuri pyyhkäisynopeus lineaarinen massalukualue nopea massaluvusta toiseen siirtyminen helppo tietokoneohjattavuus helppo mitata negatiivisia ioneja positiivisia ja negatiivisia ioneja voidaan mitata samanaikaisesti korkein saavutettavissa oleva resoluutio alempi massa-alue pienempi (m/z ) ei voida havaita metastabiileja ioneja massadiskriminaatio korkeilla massaluvuilla 40

41 2. Massaspektrometria 2.5 Massa-analysaattorit Kvadrupoli-ioniloukut Kvadrupoli-ioniloukut ovat kuten edellä mainitut kvadrupolilaitteet, paitsi: ionit säilyvät analysaattorissa melko pitkiä aikoja; niitä ei poisteta ennenkuin ne ovat valmiita detektoitaviksi (kolmiulotteinen kvadrupolikenttä) koostuvat kolmesta elektrodista (rengaselektrodi ja kaksi päätyelektrodia) käytetään yleensä heliumia puskurikaasuna ( torr) hidastamaan ionien liikettä törmäykset johtavat impulssin menetykseen aiheuttaen ionien siirtymisen loukun keskelle, missä sähkökenttä on vähemmän homogeeninen 41

42 2. Massaspektrometria 2.5 Massa-analysaattorit Lentoaika-analysaattorit (TOF) TOF (Time Of Flight) on yksinkertaisin massa-analysaattori ainoa sähkökenttä on kiihdytykseen käytetty kenttä Ionilähteessä muodostuneet ionit emittoidaan nopeasti analysaattoriin, kiihdytetään mahdollisimman yhtäaikaisesti ja mitataan niiden saapumisaika detektorille Mitä pienempi massa, sitä suurempi nopeus Mittaus koostuu sykleistä, jotka sisältävät ionien tuottamisen, kiihdyttämisen ja havaitsemisen Taulukko 7. TOF:n etuja ja haittoja Etuja Yksinkertainen ja kompakti alpa Pulssitettu koejärjestely, kaikki ionit havaitaan lähes samanaikaisesti, hyvä siirtotehokkuus suuri herkkyys, erittäin nopea Laaja massalukualue (teoriassa ääretön) yvä resoluutio ja tarkan massan määrityskyky aittoja Dynaaminen alue ei välttämättä hyvä Kvantitointi ei hyvä 42

43 2. Massaspektrometria 2.5 Massa-analysaattorit Orbitrap ja Fourier-muunnosionisyklotroniresonanssi (FTICR) Orbitrap: ionit liikkuvat ympyräradoilla sähkökentässä FTICR: ionit liikkuvat ympyräradoilla magneettikentässä Ionit kulkevat ympyrärataa ja ne havaitaan mittaamalla niiden kuuntelulevyihin indusoima virta. Tuloksena on FID (Free Induction Decay)- signaali, josta saadaan massaspektri Fouriermuunnoksen (FT) kautta. Orbitrapin ja FTICR:n ominaisuuksia: molemmilla erittäin suuri resoluutio ja massatarkkuus FTICR: kallis ostaa ja ylläpitää (kryonesteet, suprajohtava magneetti); suuri koko Orbitrap: halpa hankintahinta ja edullinen ylläpitää; olemassa sekä pöydälle että lattialle sijoitettavia malleja Orbitrap FTICR FT Massaspektri commons/8/8a/orbitrappe.png chem-ed/ms/ftms.html 43

44 2. Massaspektrometria 2.6 Ionien detektointi Ionit ovat positiivisesti tai negatiivisesti varautuneita hiukkasia, joiden nopeus useimmissa massaspektrometreissa on ~200 km s -1 Ioneilla on suuri kineettinen energia fysikaalisen esteen kohdatessaan ne kaivautuvat pinnan alle vapauttaen sekä elektroneja että ioneja Ionien tulo detektorille voidaan tunnistaa niiden primaarisista vaikutuksista (varauksien purkautuminen, joka johtaa elektronivirtaan) tai sekundaarisista vaikutuksista (sekundaarinen elektronien vapautuminen) Massaspektri kuvaa todellisuudessa jännitettä ajan funktiona 44

45 2. Massaspektrometria 2.6 Ionien detektointi Elektronimonistin Elektronimonistin koostuu tyypillisesti elektrodista (dynodista) Ionit Yksi ioni sisään 20 V 40 V 80 V 120 V Ionien törmäys elektrodiin aikaansaa elektronisuihkun, joka kiihdytetään kohti seuraavaa elektrodia, josta taas irtoaa elektroneja jne V 160 V 100 V 140 V 10 6 ionia ulos Signaali vahvistetaan ja siirretään tietokoneelle 45

46 2. Massaspektrometria 2.6 Ionien detektointi Mikrokanavalevy (MCP) 46

47 2. Massaspektrometria 2.7 Massaspektrin esittäminen Massaspektri esitetään joko taulukkomuodossa tai graafisesti Graafisen esityksen etuna on fragmentoitumisen helppo havaitseminen Taulukkoesitys: Piikkien korkeudet mitataan ja korkein valitaan peruspiikiksi (base peak) edustaen arvoa 100. Muiden piikkien korkeus ilmoitetaan prosenteissa peruspiikistä. Piikkien korkeus on suoraan verrannollinen ionien lukumäärään. m/z % 148 (M + ) NIST Chemistry WebBook 47

48 2. Massaspektrometria 2.7 Massaspektrin esittäminen Massasignaali voidaan esittää joko jatkuvassa (continuum) A tai keskitetyssä (centered) B muodossa. A B

49 2. Massaspektrometria 2.8 Resoluutio ja tarkkuus Resoluutiolla (erotuskyvyllä) tarkoitetaan massaspektrometrin kykyä erottaa eri m/z-arvolla olevia ioneja toisistaan Mitä suurempi resoluutio, sitä paremmin ionit erottuvat toisistaan Resoluutio: matala keskisuuri suuri > Useimpien ionien massat poikkeavat hieman kokonaislukuarvosta. Esim. asetonin molekyyli-ionin m/z = 58 ja tarkka massa Sovellutuksesta riippuu miten tarkasti massat on tunnettava ja massaspektrometrin resoluutio säädetään tämän mukaisesti. Yksikköresoluutio = massaspektrin kaksi vierekkäisillä kokonaisilla massaluvuilla olevaa piikkiä erottuvat ilman merkittävää päällekäisyyttä Matalalla resoluutiolla M = 1 ja korkealla M < 1, eli kahdella ionilla on sama nimellinen massa, mutta eri tarkka massa (resoluution numeerinen arvo M/ M on tarkennettava piikkien erottumista kuvaavalla luvulla) Resoluution numeerinen arvo määritellään: R = M/ M missä M ja M + M ovat kaksi vierekkäisillä massaluvuilla olevaa piikkiä 49

50 2. Massaspektrometria 2.8 Resoluutio ja tarkkuus 10% laakson määritelmä: Piikkien välisen laakson korkeuden pitää olla alle 10% piikkien korkeudesta. (h/) x 100 = 10 (R = M 1 / M). M 1 M 2 Resoluutio voidaan määritellä myös piikin leveyteen perustuen: Massan M omaavien ionien aikaansaamalle yksittäiselle piikille resoluutio voidaan ilmaista suhteena M/ M, missä M on piikin leveys tietyllä korkeudella. h = 50%, 5% tai 0.5% (R = M/ M). M 10% h h M M 50

51 2. Massaspektrometria 2.8 Resoluutio ja tarkkuus Runsain massa Massaspektrometrin resoluutiosta riippuu, millä tavalla yhdisteiden massat lasketaan. C O50S N 42 O 50 S Keskimääräinen massa monoisotooppinen massa = tarkka massa, runsaimpien isotooppien massat keskimääräinen massa, kaikkien isotooppien painotetut keskiarvot (tällä yleensä lasketaan molekyylipaino) nominaalinen massa, kaikki atomit kokonaislukuna Monoisotooppinen massa Yhdistelmiä, joiden nominaalinen massa on 122: Molekyylikaava: C 9 14 C 7 10 N 2 C 8 10 O Tarkka massa: Molekyylikaava: C 7 6 O 2 C 4 10 O 4 C 4 10 S 2 Tarkka massa: Nominaalinen massa Mikä täytyy MS:n resoluutio olla, jotta C 9 14 ja C 7 10 N 2 voidaan erottaa toisistaan? R = M/ M = 122/( ) =

52 2. Massaspektrometria 2.8 Resoluutio ja tarkkuus Tarkkuus: kuinka tarkkoja massoja massaspektrometri pystyy antamaan M = M mitattu M laskettu M (ppm) = (M mitattu M laskettu )/M laskettu x 10 6 Tarkkuus ja resoluutio kulkevat käsi kädessä alhaisen resoluution instrumentti ei pysty antamaan tarkkoja massoja Esim. leusiinienkefaliini C N 5 O 7 [M + ] + -ioni: M mitattu = , M laskettu = M (ppm) = / x 10 6 = 1.1 ppm Massatarkkuudella 10 ppm (ytimet C,, N, O) saadaan 24 ehdotusta molekyykaavaksi. Massatarkkuudella 5 ppm saadaan 12 vaihtoehtoa ja tarkkuudella 1.5 ppm enää 4 vaihtoehtoa. Esim. ACS:n julkaisut vaativat, että massat on mitattu vähintään 5 ppm tarkkuudella. 52

53 2. Massaspektrometria 2.9 Molekyylikaavan määrittäminen Jatkossa käsitellään massaspektrien tulkintaa olettaen, että ionisoituminen on tapahtunut EI-menetelmällä Isotooppipiikit Bentsamidin (C 7 7 NO) molekyyli-ionin m/z = 121, eli atomien runsaimpien isotooppien painojen kokonaislukujen summa: O (7 x 12 C = 84) + (7 x 1 = 7) + (1 x 14 N = 14) + (1 x 16 O = 16) Useilla atomeilla esiintyy myös vähemmän runsaita isotooppeja, jotka antavat massaspektrissä ns. isotooppipiikkejä kohdissa M + 1, M + 2 jne... Bentsamidilla M + 1-piikkin intensiteetti on n. 8% molekyyli-ionin piikistä, jolle tässä tapauksessa annetaan 100%:n intensiteetti (UOM! Todellinen 100%:n piikki on m/z = 77). M + 1-Piikin intensiteetistä vastaavat isotoopit 13 C, 2, 15 N ja 17 O. M + 2-Piikin intensiteetistä vastaa vain 18 O, jonka suhteellinen runsaus on erittäin pieni M + 2-piikkiä ei havaita. Sivulla 55 taulukossa 8 on annettu eräiden alkuaineiden isotooppien suhteelliset esiintymisrunsaudet. N 2 NIST Chemistry WebBook M M + 1 Jos molekyyli sisältää vain C,, N, O, F, P ja I, voidaan M + 1:n ja M + 2:n intensiteetit arvioida (prosenteissa): %(M + 1) 1.1 x C-atomien lkm x N-atomien lkm. %(M + 2) [(1.1 x C-atomien lkm.) 2 /200] x O-atomien lkm. Jos molekyylissä on rikkiä tai silikonia, on M + 2-piikki selvästi intensiivisempi: Yksi 34 S 4.40% vaikutus M + 2-piikkiin Yksi 30 Si 3.35% vaikutus M + 2-piikkiin 53

54 2. Massaspektrometria 2.9 Molekyylikaavan määrittäminen Isotooppipiikit 1. Yhdiste, jossa on yksi klooriatomi, antaa M + 2-piikin, jonka intensiteetti on n. 1/3 molekyyli-ionin intensiteetistä luonnon kloori koostuu 75.78% 35 Cl ja 24.24% 37 Cl. 2. Yhdiste, jossa on yksi bromiatomi, antaa M + 2-piikin, jonka intensiteetti on lähes sama kuin molekyyli-ionin intensiteetti luonnon bromi koostuu 50.70% 79 Br ja 49.30% 81 Br. 3. Yhdiste, jossa on kaksi klooria tai kaksi bromia tai yksi kloori ja yksi bromi antaa M + 2-piikin lisäksi selvän M + 4- piikin (esim. C 2 Cl 2, molekyyli-ioni m/z = 84) C 2 Cl 2 M 3. M + 2 M + 4 NIST Chemistry WebBook 54

55 2. Massaspektrometria 2.9 Molekyylikaavan määrittäminen Isotooppipiikit Taulukko 8. Eräiden alkuaineiden isotooppien suhteelliset esiintymisrunsaudet Alkuaine Isotooppi Suhteellinen runsaus iili 12 C 100 Vety Typpi 14 N 100 appi 16 O 100 Pii 28 Si 100 Fosfori 31 P 100 Rikki 32 S 100 Fluori 19 F 100 Kloori 35 Cl 100 Bromi 79 Br 100 Jodi 127 I 100 Isotooppi Suhteellinen runsaus 13 C N O Si S 0.78 Isotooppi Suhteellinen runsaus 18 O Si S Cl Br

56 2. Massaspektrometria 2.9 Molekyylikaavan määrittäminen Miten määritän molekyylikaavan alhaisen resoluution spektristä? Yleisiä ohjeita molekyylikaavan määrittämiseksi alhaisen resoluution massaspektristä: 1. Tunnista molekyyli-ioni. Usein suurimman m/z-arvon omaava piikki kuuluu molekyyli-ionille. Jos intensiteetti riittää, voidaan molekyyli-ionia seuraavista isotooppipiikeistä päätellä Br-, Cl- ja S-atomien mahdollinen esiintyminen ja lukumäärä yhdisteessä. Jos molekyyli-ionin m/z-luku on pariton, on yhdisteessä pariton määrä typpi-atomeja. 2. Etsi IR-spektristä funktionaalisia ryhmiä. Tutki massaspektrin fragmentoitumista. 3. Määritä 1 NMR-spektristä protonien lukumäärä integraalien avulla. 4. Laske 13 C-spektristä hiilien lukumäärä. Analysoi DEPT-spektrit (C 3 -, C 2 -ja C-ryhmät). 5. Valitse taulukosta (Appendix A,) edellä saatuun dataan sopivin molekyylikaava kyseisen nominaalisen massan kohdalta. 56

57 2. Massaspektrometria 2.9 Molekyylikaavan määrittäminen Korkean erotuskyvyn (R) molekyyli-ioni Molekyylikaava voidaan määrittää pelkän massaspektrin avulla, jos mittauksen tarkuus on riittävä korkean erotuskyvyn massaspektrometria (high-resolution, R) Molekyylikaava saadaan taulukosta kyseisen monoisotooppisen massan kohdalta (Appendix A) Tämä on mahdollista, koska ytimien massat eivät ole kokonaislukuja (taulukko 9 s. 58) Alhaisen resoluution massaa 28 (nominaalinen massa) vastaavat seuraavat yhdisteet: CO ( 12 C) ( 16 O) = N 2 2 x ( 14 N) = C 2 N ( 12 C) + [2 x ( 1 )] ( 14 N) = C 2 2 [2 x ( 12 C)] + [4 x ( 1 )] = Esim. CO:n molekyyli-ionin massa on hapen ja hiilen runsaimpien isotooppien tarkkojen massojen summa (monoisotooppinen massa). Tämä lukema poikkeaa CO:n molekyylipainosta, joka perustuu kaikkien isotooppien painotettuihin keskiarvoihin (atomipainoihin; esim. C = ja O = ). 57

58 2. Massaspektrometria 2.9 Molekyylikaavan määrittäminen Korkean erotuskyvyn (R) molekyyli-ioni Taulukko 9. Eräiden isotooppien tarkkoja massoja Alkuaine Atomipaino Ydin Massa Vety (D) iili C (std.) 13 C Typpi N N appi O O O Pii Si Si Si Fosfori P Rikki S S S Fluori F Kloori Cl Cl Bromi Br Br Jodi I

59 2. Massaspektrometria 2.10 Molekyyli-ionin tunnistaminen 1. M + edustaa korkeinta m/z-arvoa spektrissä Poikkeukset: isotoopeista aiheutuvat heikot [M + n] + -piikit ioni-molekyylireaktiot (M + + R [M + 1] + + R ) helposti hajoavilla näytteillä M + on hyvin heikko tai sitä ei näy ollenkaan; korkein m/z-arvo edustaa frgamenttia Typpisääntö: 2. M + on aina radikaalikationi UOM! Fragmentti-ioni voi olla joko radikaalikationi tai parillisen elektronimäärän omaava kationi Jos yhdiste sisältää parillisen määrän typpiatomeja (0, 2, 4,...), sen monoisotooppinen molekyyli-ioni saa parillisen m/z-arvon (kokonaisluku). Jos yhdiste sisältää parittoman määrän typpiatomeja (1, 3, 5,...), sen monoisotooppinen molekyyli-ioni saa parittoman m/z-arvon. Typpiatomeja Yhdiste M + [m/z] 0 asetoni, C 3 6 O 58 1 asetonitriili, C 2 3 N 41 2 urea, C 4 N 2 O 60 Pätee yleisimmille orgaanisessa kemiassa esiintyville ytimille (, C, N, O, S, P, F, Br, Cl, I, B, Si,...). 59

60 2. Massaspektrometria 2.10 Molekyyli-ionin tunnistaminen Fragmentoituminen: 3. Molekyyli-ionia seuraavaksi alemmalla m/z-arvolla esiintyvä fragmenttipiikki edustaa järkevää, sääntöjen mukaista atomin tai atomiryhmän menetystä M + A + + parillisen elektronimäärän omaava molekyyli tai M + B + + radikaali edelleen A + C + + radikaali A + D + + parillisen elektronimäärän omaava molekyyli B + E + + parillisen elektronimäärän omaava molekyyli mutta ei E + F + + radikaali Ei ole olemassa fragmentteja: M + - (4-14) M + - (21-25) M M + - (37-38) Even-Electron Rule : [pariton] + [parillinen] + + R [pariton] + [pariton] + + neutraali [parillinen] + [parillinen] + + neutraali [parillinen] + ei [pariton] + + R 60

61 2. Massaspektrometria 2.11 Metastabiilit ionit Se mitä tapahtuu spektrometrissa tietyn rakenteen omaavalle ionille, voidaan jakaa kolmeen ryhmään A. Ionit (m 1 ) saapuvat detektorille hajoamatta (stabiili-ioni, k < 10 5 s -1 ) C. Ionit (m 1 ) hajoavat kiihdytysvaiheen jälkeen sektoreiden välisessä kenttävapaassa tilassa ioneiksi (m 2 ) (epästabiili-ioni, k > 10 6 s -1 ) B. Ionit (m 1 ) hajoavat ennen kiihdytysvaihetta ioneiksi (m 2 ) ja ne rekisteröidään detektorilla sellaisina (metastabiili-ioni, 10 5 s -1 < k < 10 6 s -1 ) Tapauksessa B. ei todeta piikkiä arvossa m 1 eikä m 2, vaan yleensä saadaan leveä (epämääräinen) piikki, jota kutsutaan metastabiiliksi piikiksi (m * ) Metastabiili piikki esiintyy likimäärin arvossa m * = m 22 /m 1 Metastabiilien ionien analysoiminen on tärkeää silloin, kun pyritään selvittämään tuntemattoman yhdisteen rakennetta m * :n esiintyminen osoittaa m 2 :n syntymisen m 1 :stä m * -Ionien alhainen suhteellinen runsaus johtuu siitä, että ne syntyvät hyvin kapealla hajoamisnopeusvakion alueella: 10 5 s s -1 61

62 2. Massaspektrometria 2.12 Ionisoitumistapahtuman lähempi tarkastelu (EI) Kun näytettä pommitetaan elektroneilla, muodostuu positiivinen ioni: M + e - M + + 2e - (molekyyli-ioni) Elektronin poistamiseen tarvitaan tietty minimienergia, joka vaihtelee eri molekyyleillä (yleensä n ev) Molekyylin ionisaatioenergia (IE) EI-Menetelmässä käytetään yleensä 70 ev:n elektronienergioita syntyneillä yhdenarvoisilla positiivisilla ioneilla on melko paljon ylimääräistä energiaa pyrkivät hajoamaan eli fragmentoitumaan edelleen (unimolekulaarinen prosessi) Pehmeä ionisaatio: e - e - M e - M + (Stabiili) Unimolekulaariset hajoamisreaktiot voidaan esittää seuraavasti: Kova ionisaatio: ABC + AB + + C ABC + AB + C + ABC + A + + BC ABC + A + BC + Samanaikaisesti voi olla käynnissä useita hajoamisreaktioita. Syntyneet tuotteet ovat usein epästabiileja ja pyrkivät hajoamaan edelleen. Myös yksinkertaisten sidosten katkeamisen lisäksi tapahtuu monimutkaisempia toisiintumisreaktioita, jolloin useampia sidoksia katkeaa ja syntyy samanaikaisesti. e - M Netto: Kova + Pehmeä e - e - M + * M + Fragmentteja + Fragmentteja 62

63 2. Massaspektrometria 2.13 Fragmentoitumisen energeettiset edellytykset Elektronit luovuttavat eri energiamääriä molekyylille: a) Ionisaatioenergiaa (IE) vastaavan määrän ~10 ev b) Suurempia määriä (> 10 ev), jolloin elektronit irroittavat molekyylistä sidoselektroneja. Syntyvien molekyyli-ionien saama ylimääräinen energia muuttuu ennen fragmentoitumista termiseksi värähdysenergiaksi molekyylille jää vaihtelevia määriä ylimääräistä sisäistä termistä energiaa: E = E el -IE + E th jossa E el = pommittavan elektronin luovuttama energia ja E th = molekyylin terminen energia ennen ionisointia. Koska paine ionilähteessä on vain n mmg, ei molekyyli-ionien välillä tapahdu energianvaihtoa yhteentörmäysten kautta molekyyli-ioneiksi jäävät ne ionit, joiden alunperin saama energia < E 0 (= molekyyli-ionin helpoimman fragmentoitumisreaktion aktivoimisenergia). Ts. molekyyli-ionin runsaus spektrissä on pieni, kun E 0 on pieni (molekyyli on helposti hajoava). Kun E > E 0, M + voi hajota fragmentoituminen. Toisiintumisreaktiot vaativat vähemmän energiaa kuin yksinkertaisten sidosten katkeaminen. 63

64 2. Massaspektrometria 2.13 Fragmentoitumisen energeettiset edellytykset 1. M + :n runsaus on suuri, kun helpoin M + :n fragmentointi vaatii korkeaa aktivoitumisenergiaa. Jos M + sisältää heikkoja sidoksia, M + -piikki on heikko tai sitä ei näy ollenkaan. Elektronisuihkun energialla 70 ev: M + vahva (> 30%) M + keskivahva (5% - 30%) M + heikko (0-2%) Ar Konjugoitu dieeni Pitkä alkaaniketju ArF ArBr aarautunut alkaani ArCN ArI tert alifaattinen RO ArN 2 Ar-CO-R tert alifaattinen RBr Ar-C 2 Cl 2. Jos tapahtuu kaksi tai useampia kilpailevaa reaktiota (samasta ionista), aiheuttaa vain se, jolla on alhaisin aktivoitumisenergia, metastabiilin piikin. 3. Jos molekyyli-ionin hajoamisella voidaan olettaa olevan kaksi tai useampaa hajoamistietä, havaitaan alimmalla E 0 :lla syntyvä fragmentti-ioni spektrissä. 64

65 2. Massaspektrometria 2.14 Merkinnöistä Mikäli mahdollista, on pyrittävä määrittämään positiivisen varauksen paikka molekyylissä ja sen jälkeen yrittää selvittää fragmentoituminen tällaisen ionin avulla Esim. rakenteet A ja B kuvaavat sykloheksadieenin molekyyli-ionia. A on delokalisoitu rakenne, jossa on yksi elektroni vähemmän kuin alkuperäisessä dieenissä sekä elektroni että positiivinen varaus ovat delokalisoituneet -systeemissä. Koska poistettu elektroni on -elektroni, voidaan käyttää ns. valenssisidosrakenteita B ja C, joissa elektroni ja varaus ovat lokalisoituneet käyttökelpoisia kuvattaessa fragmentoitumista. Elektronin lohkaisu voi periaatteessa tapahtua mistä kohdasta molekyyliä tahansa. Voidaan kuitenkin ajatella, että elektroni lohkeaa helpoimmasta paikasta heteroatomista tai tyydyttymättömästä tai aromaattisesta -systeemistä A B C 65

66 2. Massaspektrometria 2.14 Merkinnöistä 1. Eräitä fragmentoitumisen kuvaamisessa tarvittavia merkitsemistapoja: 1. eterolyyttinen lohkaisu (kaksisakarainen nuoli) 2. omolyyttinen lohkaisu (yksisakarainen nuoli) 3. Eliminaatio 4. Toisiintuminen A B A B A B + + A + + B. A + B +. A + + B A B A B 66

67 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Suoraketjuiset ja haarautuneet alkaanit Kun alkaania pommitetaan elektroneilla, syntyy radikaalikationeja (varaus voi esiintyä millä tahansa -sidoksella) Sitten tapahtuu yksinkertaisia fissioita, jolloin syntyy parittomia m/z-fragmentteja Molekyylipiikkin intensiteetti on pieni etenkin haarautuneilla ja pitkäketjuisilla alkaaneilla C 4 NIST Chemistry WebBook C 3 Suoraketjuisilla alkaaneilla alkyyliryhmä lähtee molekyylin toisesta päästä ja sen jälkeen seuraa 14:n massayksikön (C 2 ) menetyksiä saadaan ns. homologinen sarja. [M - C 3 ] + -piikki on heikko tai sitä ei näy ollenkaan. Esim. n-heksadekaani. C 5 C 6 C 2 C 7 C 8 C9 M C 10 C 11 C 12 C 13 C

68 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Suoraketjuiset ja haarautuneet alkaanit aarautuneilla alkaaneilla lohkeaminen tapahtuu haarautumiskohdasta. Tämä haarautumiskohta voidaan havaita helposti, koska suosituin lohkeaminen tuottaa suhteellisen vahvoja fragmentti-ioneja. Jos haarautumiskohdassa voi tapahtua erilaisia fissioita, lohkeaa yleensä fragmentti, jolla on suurin massa. Esim. 5-metyylipentadekaani. C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 NIST Chemistry WebBook C 12 C 7 C 8 C 9 C 10 C 15 M + Stevensonin sääntö: Radikaali-ionin hajotessa pariton elektroni jää ensisijassa siihen fragmenttiin (= irtoava radikaali), jolla on suurempi ionisaatioenergia. C 3 C 2 C 2 C 3 > C 3 C 2 C 2 C 3 > C 3 C(C 3 ) 2 Siten ionivaraus jää fragmenttiin, jolla IE on pienempi M + :n pilkkoutuessa haarautumiskohdassa muodostuu pysyvin ioni. Karboniumionin pysyvyys: + CR 3 > + CR 2 > + C 2 R > + C Me AB + A + + B {kun IE (A ) < IE (B )} AB + A + B + 68

69 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Suoraketjuiset ja haarautuneet alkaanit Alkaanin molekyyli-ionin tai muun radikaaliionin yksinkertaisessa fissiossa tapahtuu -sidoksen katkeaminen Ionisointi tapahtuu tietyssä -sidoksessa ja varaus lokalisoituu tähän -sidokseen, joka sitten katkeaa Toinen mahdollinen fragmentoitumisprosessi on -toisiintuminen (r) R R + R R R C R -e - R C R R + C R R+ C R R R R R 1 2 r R R R + C R + R C R CR 2 + R 2 R R 69

70 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Asykliset alkeenit Alkeenien molekyylipiikki on yleensä selvästi nähtävissä Fragmentoituminen: Suoraketjuisilla alkeeneilla kaksoisidoksen paikka on vaikea määrittää alkeeniketjussa, koska se fragmentoituu helposti edelleen. C=C -C -C -C C=C-Sidoksen ja -hiilen välinen sidos on vinyylinen sidos - ja -hiilien välinen sidos on allyylisidos Tavallisimmat fissiot alkeeneilla ovat: 1. Allyylikatkeaminen: [R 1 -C 2 C=CR] + eli R 1 + C 2 C CR 1. Allyylisidoksen katkeaminen, eli -katkeaminen (yleisin) 2. McLafferty-toisiintuminen, eli -toisiintuminen (substituoiduilla alkeeneilla) R C 2 =C-CR Lisäksi voi esiintyä melko harvinainen vinyylisen sidoksen katkeaminen. 70

71 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Asykliset alkeenit 2. McLafferty-toisiintuminen: R R' -e - R + R' r R + R' i (= varauskohdan induktiivinen vaikutus) R C 3 + R' R C 3 + R' 71

72 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Asykliset alkeenit Esim. 3-etyyli-2-metyyli-1-penteeni 55 NIST Chemistry WebBook McLaffertytoisiintuminen e - + ELI M + m/z 112 -C C M Stabiilimpi karbokationi + -C m/z 83 m/z 55 m/z 84 72

73 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Sykloalkaanit Esim. metyylisykloheksaani Sykloalkaanien molekyylipiikin intensiteetti on yleensä suurempi kuin alkaaneilla C 3 NIST Chemistry WebBook 55 [M - C 3 ] + 83 C 3 -e - + C 3 -C M + 98 M + m/z 98 m/z e - TAI + + m/z 70 73

74 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Sykloalkeenit Molekyylipiikki näkyy yleensä selvästi sykloalkeenien massaspektrissä Syklohekseenin allyylikatkeaminen ( ) ja toisiintuminen (r). NIST Chemistry WebBook e M + m/z 82 r 39 M C 3 C 3 m/z 67 Retro-Dields-Alder-tyyppinen fragmentoituminen syklohekseenityyppisille yhdisteille C 2 =C 2 TAI + C 2 =C m/z 54 m/z 54 74

75 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Sykloalkeenit Syklohekseenille ja samantyyppisille yhdisteille voi tapahtua McLafferty-toisiintuminen, jos kaksoisidoksesta lähtevässä sivuketjussa on -vetyatomeja. + + C 2 + C 2 =C 2 Alkyynien massaspektrit ovat hyvin samantapaisia kuin alkeeneilla 75

76 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Aromaattiset hiilivedyt Aromaattisten hiilivetyjen molekyylipiikit ovat intensiteetiltään suurempia kuin alkaaneilla Alkyylisubstituenttien paikalla ei ole juuri vaikutusta fragmentoitumiseen esim. o -, m - ja p -ksyleenillä on hyvin samankaltaiset massaspektrit Fenyylialkaaneilla esiintyy piikkejä vastaten: C 6 5 (C 2 ) n = m/z 77, 91, 105, 119 Esimerkkimolekyyli propyylibentseeni (spektri s. 77). Tropyliumionin muodostuminen (bentsyylinen katkeaminen): Fenyylikationin muodostuminen (vinyylinen katkeaminen, ei yhtä suosittu kuin bentsyylinen katkeaminen): + -C Tropyliumioni + + -C M + m/z 120 m/z 91 m/z 91 M + m/z 120 m/z 77 McLafferty-toisiintuminen: Substituoidun tropyliumionin muodostuminen: + -C 2 4 M + m/z 120 m/z 92 C M + m/z 120 -C 3 C 3 m/z

77 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Aromaattiset hiilivedyt NIST Chemistry WebBook 91 M o -Disubstituoiduista areeneista voi eliminoitua neutraaleja fragmentteja: C-C 3 C

78 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Asykliset alkoholit 1. O Alkoholien molekyylipiikki on yleensä hyvin heikko Veden lohkeaminen (M ): 1. Terminen tapahtuma, joka tapahtuu ennen ionisoitumista. 2. Vettä voi lohjeta myös ionisoitumisen jälkeen. Vety voi lähteä joko C3:sta tai C4:stä. 3. 1,4-Dehydraatiotuote voi fragmentoitua edelleen. 4. Veden lohkeamiseen liittyy usein myös etyleenin lohkeaminen huomattavan voimakas fragmenttipiikki M + -46:ssa (M + -( 2 O + C 2 =C 2 )). 5. -Katkeamisen seurauksena syntyy oksoniumioni. Epäsymmetriset alkoholit menettävät helpoimmin suurimman alkyyliryhmän. 1 Alkoholit: R 1 ja R 2 = (m/z = 31); 2 alkoholit: R 1 tai R 2 = (m/z = 45, 59, 73,...); 3 alkoholit: R 1 ja R 2 = R (m/z = 59, 73, 87,...) C 3 3 C + C 2 R 1 O C C C 2 O C 2 C 2 C 3 C=C 2 C C 3 C C 2 C 2 C C C 2 + O R - 2 O C C 3 + -C 2 4 [C 2 =C-R] -C 3 M R C 3 CC 2 C 2 + O C + R 2 R 2 78

79 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Asykliset alkoholit Esim. 1-heksanoli 43 NIST Chemistry WebBook (M + -( 2 O + C 2 =C 2 )) 56 O 31 + O + O 2-2 O 69 (M O) 84 M M + m/z 102 m/z 84 -C 2 4 -C m/z 69 m/z 84 m/z 56 79

80 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Sykliset alkoholit Syklisillä alkoholeilla veden eliminaatio ja -katkeaminen tapahtuvat kuten asyklisillä alkoholeilla Esim. sykloheksanoli O 57 NIST Chemistry WebBook O O (M + -) 99 M M + m/z 100 m/z O O O C C -C C 3 7 C 2 C 3 O Renkaan koko vaikuttaa vedyn siirrossa (1 radikaali 2 radikaali) esim. syklobutanolilla ja syklo-oktanolilla tapahtuu vedyn siirtymistä vähemmän kuin sykloheksanolilla M + m/z hiilessä 2 hiilessä m/z 57 80

81 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Fenolit Esim. fenoli Fenoleilla on vahva molekyylipiikki ja heikko M - 1-piikki (toisin kuin alkoholeilla) O NIST Chemistry WebBook M + 94 O + O + -CO + 66 M + m/z 94 m/z Jos fenolien sivuketjuissa on -vety, voi tapahtua McLafferty-toisiintuminen m/z 65 81

82 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset eetterit Alifaattisten eetterien molekyylipiikki on pieni Fragmentoituminen: 1. -Katkeaminen. Epäsymmetrisestä eetteristä voi syntyä kaksi ionia. Kilpailevissa reaktioissa substituoidumpi fragmentti lohkeaa helpommin. Mikäli alkyyliketjun pituus kasvaa, alkaa myös hiilivetyfragmentoitumisen osuus kasvaa. 2. -Katkeamisen jälkeen lohkeaa yleensä neutraali molekyyli muodostuu oksoniumioni. 3. Varauksen indusoima katkeaminen R' C 2 O C 2 R + 2 C O C 2 C R + + -R' -R -C 2 =CR + R O R' R + OR' + 2 C O C 2 R R' C 2 O C C=O + 82

83 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset eetterit Esim. n -butyylieetteri O NIST Chemistry WebBook (M + -C 4 9 O) C=O 31 (M + -C 3 7 ) 87 M

84 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Aromaattiset eetterit Aromaattisten eettereiden molekyylipiikki on vahva NIST Chemistry WebBook M O C Esim. anisoli + O C 3 -C3 O + -CO + -C 2 2 C M + m/z 108 m/z 93 m/z 65 m/z 39 O + -C2 O M + m/z 108 m/z 78 m/z 77 84

85 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset aldehydit Alifaattisten aldehydien molekyylipiikki on melko heikko M - 1-Piikki on usein lähes yhtä intensiivinen kuin molekyyli-ionin piikki -Katkeaminen: Esimerkkimolekyyli heksanaali (spektri s. 86). O + -C 2 =CO + -Katkeaminen: + O - M + m/z 100 m/z 99 + O M + m/z 100 m/z 57 McLafferty-toisiintuminen: + O -C O + O + O + M + m/z 100 m/z 29 M + m/z 100 m/z 44 85

86 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset aldehydit 44 NIST Chemistry WebBook O Mikäli alifaattisilla, tyydyttyneellä aldehydillä esiintyy peruspiikki (100%) m/z-arvossa 44, ei -asemassa ole sivuketjua. Tämä sääntö pitää paikkansa vain sellaisilla aldehydeillä, joilla on 4-7 hiiliatomia (muutoin ketjun fragmentoituminen voi muodostua tärkeäksi m/z = 44 ei enää ole peruspiikki). Esim. 2- ja 3-metyylibutanaali (M + -) 99 M O + M + m/z 86 -C 2 =C 2 + O m/z 58 O + -C 3 -C=C 2 + O M + m/z 86 m/z 44 86

87 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset ketonit NIST Chemistry WebBook Esim. 2-pentanoni 43 Ketonien molekyylipiikki on yleensä melko vahva O -Katkeaminen. Yleensä suuremman alkyylifragmentin katkeaminen on suositumpi: M O -C 3 + O McLafferty-toisiintuminen: M + m/z 86 m/z 71 + O -C O O r O C 2 4 O M + m/z 86 m/z 43 M + m/z 86 m/z 58 87

88 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset ketonit R Ketonien fragmentoituminen saattaa olla 1 C 2 C 2 C 2 monimutkaisempaa kuin aldehydien. Esim ketoni: C O R 2 C 2 C 2 C 2 + R 1 R O O 1 + C 2 C 2 C 2 R 2 C 2 C 2 C 2 R EDELLEEN: + O R 2 + O m/z 58 C 2 + R 2 Mikäli kyseessä on dialkyyliketoni, jonka alkyyliryhmät eivät ole samat ja kummassakin on vähintään kolme hiiltä ketjussa, esiintyy spektrissä yleensä kolme parillista massalukua edustavaa toisiintumispiikkiä: 1. McLafferty-toisiintuminen ketjussa R 1 2. McLafferty-toisiintuminen ketjussa R 2 3. Kaksi perättäistä McLafferty-toisiintumista 88

89 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Aromaattiset ketonit Esim. asetofenoni O NIST Chemistry WebBook O + -C 3 + O 77 M + m/z 120 m/z 105 M O -CO + m/z 105 m/z 77 89

90 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Karboksyylihapot Alifaattisten karboksyylihappojen molekyylipiikki on yleensä heikko, kun taas aromaattisilla hapoilla se on vahva Esim. heksaanihappo O O 60 NIST Chemistry WebBook [C 3 C 2 C 2 ] + 43 [C 2 C 2 COO] + 73 Karboksyylihapoille tunnusomainen McLaffertytoisiintumisesta johtuva piikki (joskus peruspiikki) esiintyy m/z-arvolla 60: [C 2 C 2 C 2 COO] + 87 M O O + O O + + M + m/z 116 m/z 60 90

91 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Esterit -Katkeaminen. Muodostuu ioneja R +, RCO +,, + OR, + OCOR 1 ja R 1+ : Suoraketjuisen, alifaattisen hapon metyyliesterin molekyylipiikki on yleensä melko heikko, mutta havaittava C 3 C 3 C 3 + O C + O C O C OR 1 OR 1 OR 1 3 CCO OR 1 CO C 3 OR C 3 OCOR CCO + McLafferty-toisiintuminen. Metyylioktanoaatin spektrissä (s. 92) peruspiikki m/z-arvolla 74 on seurausta McLafferty-toisiintumisesta: O OR -C O OR + O C 3 C O + R 1 3 CCO 2 + R 1 91

92 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Esterit Esim. metyylioktanoaatti O O [C 2 =C(O)OC 3 ] + 74 NIST Chemistry WebBook [C 2 C 2 CO 2 C 3 ] + 87 [C(C O)OC 3 ] + 59 M + -OC M

93 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset amiinit C C 2 N C 2 C 3 3 C C 2 N C C 3 M + m/z 73 m/z 72 a) + Amiinien molekyylipiikki on yleensä melko heikko b) -C 3 3 C C 2 N C 2 + -C N C 2 m/z 58 m/z C C C 2 N C 2 C 3 3 C C 2 N M + m/z 73 C 2 + -C 2 2 Esimerkkimolekyyli dietyyliamiini (spektri s. 94). + a) Vetyradikaalin lohkeaminen. b) -Katkeaminen. Suurempi alkyyliryhmä eliminoituu helpommin kuin pienempi ryhmä. C 2 2 N C 2 m/z 44 93

94 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Alifaattiset amiinit NIST Chemistry WebBook N M M

95 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Sykliset amiinit + N + N Esim. pyrrolidiini N NIST Chemistry WebBook M + m/z 71 -C 2 =C N 2 C-N=C 2 m/z 43 M M + 71 m/z TAI C 3 + N N + -C C=N=C 2 Syklisillä amiineilla on melko vahva molekyylipiikki ja M-1-piikki m/z 42 95

96 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Aromaattiset amiinit Esim. aniliini N 2 Aromaattisilla monoamiineilla on voimakas molekyyli-ionin piikki NIST Chemistry WebBook M N 2 N 2 N 2 + N 2 -CN M + m/z 93 m/z 66 m/z 65 96

97 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Amidit + O N 2 -Katkeaminen: -C O C N 2 M + m/z 87 m/z 44 Esim. butaaniamidi O N 2 NIST Chemistry WebBook 59 TAI Resonanssistabilointi 44 O + N 2 -C O C N 2 M + m/z 87 m/z 44 McLafferty-toisiintuminen: M + 87 O + + -C O 2 4 N 2 N 2 Alifaattisten amidien molekyylipiikki on yleensä melko heikko M + m/z 87 m/z 59 97

98 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Amidit Substituoitujen amidien tapauksessa pitää ottaa huomioon seuraava fragmentoituminen: O + 3 C C N C 2 R -R O 3 C C N C 2 + m/z 72 2 N C 2 -C 2 =C=O O + + C N C 2 m/z 30 C 2 m/z 72 98

99 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit Nitriilit -Vedyn lohkeaminen: Esim. butaaninitriili + N - C + N C N + N NIST Chemistry WebBook M + m/z 69 m/z McLafferty-toisiintuminen: + N + -C 2 N 4 C C 2 M + m/z 69 m/z 41 + N C C 2 M Alifaattisten nitriilien molekyylipiikki on yleensä liian heikko havaittavaksi -Vedyn lohkeaminen tuottaa heikon, mutta havaittavan M piikin 99

100 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit alogeeniyhdisteet Alkyylihalidien molekyylipiikki on yleensä erittäin heikko X:n Eliminaatio: + X C-X-Sidoksen katkeaminen: 2 C 2 C (C 2 ) n C 2 X + (C 2 ) n + C 2 + R C 2 X R C 2 + X + -Katkeaminen: + R C 2 X R C X + + R C 2 X 2 C X R + Syrjäyttäminen. Erityisesti alkyyliklorideilla ja -bromideilla, joilla hiiliatomien lukumäärä on yli 5 (C 6 -C 12 ). Voimakas piikki (joskus peruspiikki): Syrjäyttäminen yleisesti: m/z 91 (ja 93) + Cl Cl Br m/z 105 (ja 107) + m/z 135 (ja 137) + (C 2 ) n + X R + (C 2 ) n X + 100

101 2. Massaspektrometria 2.15 Eri yhdisteryhmien massaspektrit alogeeniyhdisteet Esim. heptyylikloridi ja -bromidi Cl Br NIST Chemistry WebBook NIST Chemistry WebBook M M

102 3. IR-Spektroskopia 3.1 IR-Spektrometri (spektrofotometri) Dispersiivinen IR (syrjäytynyt) Fouriermuunnos (FT) IR IR-lähde Johtokyky tai pyrosähköinen Detektori Näyte Säteen jakaja Yhdistetty säde ADC Liikkuva peili Tietokone Tulostin Kiinteä peili Michelsonin interferometri 102

103 3. IR-Spektroskopia 3.1 IR-Spektrometri (spektrofotometri) Interferogrammi Fourier-muunnos IR-spektri 103

104 3. IR-Spektroskopia 3.1 IR-Spektrometri (spektrofotometri) Absorptioviivojen paikat esitetään yleensä aaltolukuna [cm -1 ] (x-akseli, abskissa) NIR MIR FIR Normaali mittausalue (200) cm -1 = /c = 1 / Absorptioviivojen intensiteetit ilmaistaan yleensä transmittanssin (T ) funktiona (y-akseli, ordinata) Käytetään melko mielivaltaisesti valittuja merkintöjä osoittamaan kunkin absorptioviivan intensiteettiä: s (strong), m (medium) ja w (weak) Esim. s. 103 spektri: ~1000 cm -1 s ~2900 cm -1 m ~1800 cm -1 w 104

105 3. IR-Spektroskopia 3.2 IR-Näyte Oikea näytetekniikka erittäin tärkeää! Kyvettimateriaalin pitää olla läpinäkyvä halutulla mittausalueella Voidaan mitata kaasuja, nesteitä (myös liuoksia) sekä kiinteitä aineita Taulukko 10. Eräiden IR-spektroskopiassa käytettyjen kyvettimateriaalien ominaisuuksia Materiaali IR läpäisyraja [cm -1 ] Taitekerroin 4000 cm -1 :ssa Liukoisuus veteen [g/100 ml 20 C:ssa] NaCl KCl KBr CsI CaF BaF KRS ZnSe Ei liukene Polyetyleeni Ei liukene 105

106 3. IR-Spektroskopia 3.2 IR-Näyte Kaasumaiset näytteet Absorption intensiteetti kasvaa kaasun määrän lisääntyessä 10 cm 100 m kyvetit, joissa esim. NaCl-ikkunat Normaaliin IR-spektrometriin ei mahdu yli 10 cm kyvettiä Detektorin pituutta lisätään kyvetin sisällä olevilla peileillä 106

107 3. IR-Spektroskopia 3.2 IR-Näyte Nestemäiset näytteet Kideikkunamenetelmä Kyvettimenetelmät Koottavat ja kiinteät NaCl-kyvetit Tippa näytettä kahden tasomaisen kiteen (esim. KBr) väliin yvä spektri, jossa vähän matriisivaikutusta Käytettävä vedettömiä ja halutulla alueella läpinäkyviä liuottimia Taulukko 11. Eräitä IR-spektroskopiassa käytettyjä liuottimia Liuotin Käyttökelpoiset alueet [cm -1 ] Tyypillinen näytteen paksuus [mm] CS 2 Kaikki paitsi ja CCl 4 Kaikki paitsi CCl 3 Kaikki paitsi ja alle Bentseeni Kaikki yli 750 paitsi C 2 Cl 2 Kaikki yli 820 paitsi Asetoni ja alle Sykloheksaani Alle

108 3. IR-Spektroskopia 3.2 IR-Näyte Kiinteät näytteet KBr-tekniikka Mull-tekniikka Näyte jauhetaan vedettömän KBr:n kanssa ja puristetaan tabletti (~2 mg näytettä/200 mg KBr) Näyte öljyssä (liuotin) kahden KBr-ikkunan väliin KBr:n kosteus näkyy tabletin sameutena ja häiritsevänä leveänä piikkinä spektrissä ~3450 cm -1 Näytteen kidekoon oltava pieni (aaltoluvun suuruusluokkaa) 108

109 3. IR-Spektroskopia 3.2 IR-Näyte Kiinteät näytteet Filmitekniikka Matriisi-isolaatiotekniikka Näyte liuoksena kiteelle, jonka jälkeen liuotin haihdutetaan pois Kaasumainen näyte ja inertti kaasu sekoitetaan ja seos kiinteytetään jäädyttämällä Yleinen polymeereille Näytemolekyylit matriisissa erillään ja toisistaan riippumattomia Rotaatio eliminoitu 109

110 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Molekyylin vapausasteet Polyatomisella molekyylillä voi esiintyä useampi kuin yksi värähtelyabsorptio z Absorptioiden lukumäärä riippuu molekyylin ns. vapausasteista x y Koordinaattien määrä, jotka tarvitaan määrittämään molekyylien kaikkien atomien paikat avaruudessa (tässä tapauksessa kolme) Vapausasteiden lukumäärä = 3 (translationaaliset eli siirtymävapausasteet 110

111 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Molekyylin vapausasteet n-atomisen molekyylin vapausasteiden kokonaismäärä on 3n (translationaalinen, rotationaalinen ja vibrationaalinen) Rotationaalinen vapausaste Translationaalinen vapausaste (kts. s. 110) Molekyylin painopiste liikkuu säteilyssä Molekyyli pyörii painopisteensä kautta käyvän akselin ympäri Kuluu 3 vapausastetta Kuluu 3 vapausastetta 111

112 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Molekyylin vapausasteet Vibraationaalinen vapausaste Molekyylin värähtely sisältää 3n 6 vapausastetta (kokonaislkm. translationaaliset rotationaaliset) Näitä normaalivärähdyksiä on useita eri tyyppejä, joista tärkeimpiä ovat venytysvärähdykset ja taivutusvärähdykset IR-piikien maksimimäärä Lineaarisella molekyylillä 3n 5 Perusvärähtelyt Molekyylin atomien lukumäärän kasvaessa IR-spektri monimutkaistuu 112

113 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Valintasääntö IR-säteilyä absorboituu, kun molekyylin dipolimomentissa tapahtuva rytminen muutos (johtuu molekyylivärähtelystä) on vuorovaikutuksessa IR-säteilyn värähtelevän sähköisen vektorin kanssa Ei muutosta dipolimomentissa: Ei IR-aktiivinen B B A B Vain sellaiset värähtelyt, joista aiheutuu rytminen muutos molekyylin dipolimomentissa, voidaan havaita IR-spektroskopiassa Dipolimomentti muuttuu: IR-aktiivinen B C A B 113

114 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Valintasääntö Jokaista värähdysvapausastetta vastaava absorptio havaitaan IR-spektrissä seuraavin edellytyksin 4. Absorption intensiteetti on riittävän suuri 1. Värähtely aiheuttaa muutoksen molekyylin dipolimomentissa (kts. s. 113) 3. Absorptio tapahtuu rekisteröitävän spektrin alueella ( cm -1 ) 2. Absorptiosta aiheutuva signaali ei ole jonkin muun signaalin peitossa 114

115 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Värähdystyypit 115

116 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Värähdystyypit Venytys Taivutus (tasossa) Taivutus (ei tasossa) + + Symmetrinen venytys ( s ) Symmetrinen saksitaivutus ( s ) Symmetrinen huojunta ( ) + - Epäsymmetrinen venytys ( as ) Epäsymmetrinen keinunta ( ) Epäsymmetrinen vääntyminen ( ) 116

117 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Veden värähdykset as s s Symmetrinen venytys ( s O) 3652 cm -1 Epäsymmetrinen venytys ( as O) 3756 cm -1 Symmetrinen saksitaivutus ( s O) 1596 cm

118 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt CO 2 :n värähdykset Ei IR-aktiivinen s Symmetrinen venytys ( s CO 2 ) 1340 cm -1 as Epäsymmetrinen venytys ( as CO 2 ) 2350 cm -1 Saksitaivutus ( s CO 2 ) 666 cm Saksitaivutus ( s CO 2 ) 666 cm

119 3. IR-Spektroskopia 3.3 Molekyylivärähtelyt Muut värähdykset IR-Spektrissä voi näkyä perusvärähtelyjen lisäksi myös muita värähdyksiä Fermin resonassit Ylivärähdykset Kombinaatioabsorptiot a, missä a = 2, 3... (yleensä 2) Piikit aaltoluvuilla x cm -1 ja y cm -1 kombinaatiot aaltoluvuilla (x + y) cm -1 ja (x y) cm -1 Vuorovaikutus perusvärähdyksen ja kombinaation tai perusvärähdyksen ja ylivärähdyksen välillä 119

120 3. IR-Spektroskopia 3.4 IR-Spektrin jako osa-alueisiin Ryhmäfrekvenssit Sormenjälkialue Johtuvat molekyylien funktionaalisista ryhmistä, kuten O, N ja C=O < 1300 cm -1 Tällä alueella jokaisella molekyylillä on sille tyypillinen absorptiokuvio elpoiten tunnistettavat ryhmäfrekvenssit ovat venytysvärähdyksiä alueella cm -1 Taivutusvärähdykset löytyvät alueelta < 1500 cm

121 3. IR-Spektroskopia 3.4 IR-Spektrin jako osa-alueisiin Taulukko 12. IR-Spektrin jako osa-aluisiin Spektrialue [cm -1 ] Ryhmä Mahdollinen yhdiste O N Alkoholi, aldehydi, karboksyylihappo Amidi, amiini C Alkyyni C Aromaattinen yhdiste C 2 C C Alkeeni tai tyydyttämätön rengas C C 2 C 3 Alifaattinen ryhmä CO Aldehydi (Fermin dupletti) PO S P Fosforiyhdiste Merkaptaani ja tioli Fosfiini C N Nitriili C C Alkyyni (ei ehkä näy symmetrisellä molekyylillä) C O Aldehydi, ketoni, amidi, esteri, karboksyylihappo, anhydridi, aminohappo, laktoni, kinoni 121

122 3. IR-Spektroskopia 3.4 IR-Spektrin jako osa-alueisiin Taulukko 12. IR-Spektrin jako osa-aluisiin (jatkoa s. 121) Spektrialue [cm -1 ] Ryhmä Mahdollinen yhdiste C C, C N, N Tyydyttymätön alifaattinen yhdiste (ei ehkä näy symmetrisellä molekyylillä), aromaattinen yhdiste, amidi, amiini, aminohappo, tyydyttymätön heterosykli NO 2 Nitroyhdiste C O C, C O Eetteri, alkoholi S O, P O, C F Rikki-, fosfori- ja fluoriyhdiste Si O, P O Organopii- ja organofosforiyhdiste C Alkeeni ja aromaattinen yhdiste N Alifaattinen amiini C X alogeeniyhdiste Aromaattinen rengas Aromaattinen yhdiste 122

123 3. IR-Spektroskopia 3.5 Normaalit alkaanit C -Venytysvärähtelyt Alkaanien C -venytykset alueella cm -1 Metyyli as (C 3 ) 2960 cm -1 (s) s (C 3 ) 2870 cm -1 (s) s (C 2 ) Metyleeni s (C 3 ) as (C 2 ) 2925 ± 10 cm -1 (s) s (C 2 ) 2850 ± 10 cm -1 (s) as (C 3 ) as (C 2 ) 123

124 3. IR-Spektroskopia 3.5 Normaalit alkaanit C -Taivutusvärähtelyt Metyyli as (C 3 ) ~1460 cm -1 s (C 3 ) ~1380 cm -1 (ns.sateenvarjotaivutus) Metyleeni s (C 2 ) 1470 cm -1 (saksitaivutus) (C 2 ) 720 cm -1 (keinunta, suoraketjuiset alkaanit joissa 7 C-atomia) (C 2 ) ja (C 2 ) cm -1 (huojunta ja vääntyminen) s (C 2 ) as (C 3 ) s (C 3 ) (C 2 ) 124

125 3. IR-Spektroskopia 3.5 Normaalit alkaanit eptaanin IR-spektri SDBSWeb: (C 2 ) s (C 3 ) as (C 3 ) s (C 2 ) s (C 3 ) s (C 2 ) as (C 3 ) as (C 2 ) 125

126 3. IR-Spektroskopia 3.6 aaroittuneet alkaanit C -Venytys- ja taivutusvärähtelyt Tertiaaristen C-ryhmien C -venytysvärähtelyt (C) ~2890 cm -1 (w) Isopropyyliryhmän C -taivutusvärähtelyt s (C 3 ) cm -1 s (C 3 ) cm -1 (C 3 ) ~920 cm -1 (w) t-butyyliryhmä C -taivutusvärähtelyt s (C 3 ) cm -1 s (C 3 ) ~1370 cm -1 (C 3 ) ~930 cm -1 (w) s (C 3 ) 2 kpl. s (C 3 ) johtuu siitä, että sateenvarjot taipuvat joko samaan tai eri suuntaan as (C 3 ) 126

127 3. IR-Spektroskopia 3.6 aaroittuneet alkaanit ,3-Dimetyylibutaanin IR-spektri SDBSWeb: 3 C C C 3 C C 3 C 3 2,3-Dimetyylibutaanilla ei näyvissä (C 3 ) (C) s (C 3 ) as (C 3 ) s (C 3 ) as (C 3 ) 127

128 3. IR-Spektroskopia 3.7 Sykliset alkaanit C -Venytys- ja taivutusvärähtelyt Metyleenin C -venytysvärähdykset samalla alueella kuin asyklisillä alkaaneilla Syklisaatio laskee C 2 saksitaivutuksen taajuutta Esim. sykloheksaani s (C 2 ) 1452 cm -1 ja n heksaani s (C 2 ) 1468 cm

129 3. IR-Spektroskopia 3.7 Sykliset alkaanit Sykloheksaanin IR-spektri SDBSWeb: Sykloheksaanilla ylivärähdys ~ cm -1 as (C 2 ) s (C 2 ) s (C 2 ) 129

130 3. IR-Spektroskopia 3.8 Alkeenit C -Venytysvärähtelyt Terminaalinen vinyyli (R C = C 2 ) as (C 2 ) cm -1 (m) s (C 2 ) ja (C) cm -1 (m) ( C) as ( C 2 ) Terminaalinen vinylidiini (R 2 C = C 2 ) as (C 2 ) cm -1 (m) s ( C 2 ) cis ja trans RC = CR (C) cm -1 (m) 130

131 3. IR-Spektroskopia 3.8 Alkeenit C = C-Venytysvärähtelyt Terminaalinen vinyyli (R C = C 2 ) (C = C) cm -1 (m) cis R 2 C = CR 2 (C = C) cm -1 (m) Terminaalinen vinylidiini (R 2 C = C 2 ) (C = C) cm -1 (m) trans R 2 C = CR 2 (C = C) cm -1 (w) 131

132 3. IR-Spektroskopia 3.8 Alkeenit C -Taivutusvärähtelyt Terminaalinen vinyyli (R C = C 2 ) (C 2 ) cm -1 (m) ( trans C) cm -1 (s) (C 2 ) cm -1 (s) cis R 2 C = CR 2 (C) cm -1 (m) (cis C) cm -1 (m s) Terminaalinen vinylidiini (R 2 C = C 2 ) (C 2 ) cm -1 (m) (C 2 ) cm -1 (s) trans R 2 C = CR 2 (trans C) cm -1 (s) 132

133 3. IR-Spektroskopia 3.8 Alkeenit ekseenin IR-spektri SDBSWeb: Ylivärähdys 2 (C 2 ) (=C) as (=C 2 ) (C 2 ) s (=C 2 ) (C=C) ( trans C) (C 2 ) 133

134 3. IR-Spektroskopia 3.9 Alkyynit C -Venytys- ja taivutusvärähtelyt Alkyynien C -taivutus alueella cm -1 Alkyynien C -venytys alueella cm -1 Voimakas ja leveä piikki Voimakas ja kapea piikki eikko ja leveä ylivärähdys alueella cm

135 3. IR-Spektroskopia 3.9 Alkyynit C C-Venytysvärähtelyt Alkyynien C C-venytys alueella cm -1 Symmetrisesti substituoiduilla alkyyneillä ei esiinny (C C) absorptiovyötä Monosubstituoidut (C C) cm -1 (w) Disubstituoidut (epäsymmetriset) (C C) cm -1 (w) 135

136 3. IR-Spektroskopia 3.9 Alkyynit Pentyynin IR-spektri SDBSWeb: ( C) (C C) Ylivärähdys 2 ( C) ( C) 136

137 3. IR-Spektroskopia 3.10 Aromaattiset yhdisteet Aromaattiset C -venytysvärähtelyt alueella cm -1 C = C-Rengasvenytysvärähtelyt alueilla ja cm -1 eikkoja kombinaatioita ja ylivärähtelyjä alueella cm -1 Tasossa tapahtuvat C -taivutukset alueella cm -1 Ns. bentseenisormet, jotka antavat tietoa renkaan substituutiosta Ei-tasossa tapahtuvat voimakkaat C -taivutukset alueella cm

138 3. IR-Spektroskopia 3.10 Aromaattiset yhdisteet Ei-tasossa tapahtuvat C -taivutukset alueella cm -1 Rengasvedyn ei-tasossa tapahtuva taivutus on voimakkaasti kytkeytynyt viereisten vetyatomien kanssa Ei-tasossa tapahtuvan taivutusvärähdyksen absorptiovyön paikka riippuu paljolti aromaattisen renkaan substituutiosta Taulukko 13. Aromaattisen renkaan substituution vaikutus ei-tasossa tapahtuvan C -taivutuksen absorptiovyön paikkaan Renkaan substituutio Aaltolukualue [cm -1 ] Mono ja orto-di meta-di para-di ,2,3-Tri ja ,3,5-Tri ja ,2,4-Tri ja ,2,3,4-Tetra ,2,4,5-Tetra ,2,3,5-Tetra ,2,3,4,5-Penta ,2,3,4,5,6-eksa

139 3. IR-Spektroskopia 3.10 Aromaattiset yhdisteet Tolueenin IR-spektri SDBSWeb: C 3 Renkaan C -venytys Bentseenisormet (monosubstituoitu) Renkaan C=C-venytys C -Taivutus tasossa C -Taivutus ei-tasossa Renkaan C=Ctaivutus ei-tasossa 139

140 3. IR-Spektroskopia 3.11 Alkoholit ja fenolit O -Venytysvärähtelyt Vapaat (ei vetysitoutuneet) O -venytysvärähtelyt alueella cm -1 Vapaat fenoliset O - venytysvärähtelyt lähempänä arvoa 3580 cm -1 Vetysitoutuneet O -venytysvärähtelyt alueella cm -1 Intensiivisiä ja leveitä piikkejä Vapaiden O -venytysvärähtelyjen signaaleilla yleensä pienempi intensiteetti kuin vetysitoutuneilla O -signaaleilla 140

141 3. IR-Spektroskopia 3.11 Alkoholit ja fenolit O -Venytysvärähtelyt Esim. 1-heksanoli O Kaasufaasi (ei vetysitoutumista) O) 3670 cm -1 Nestefilmi (vetysitoutumista) O) 3324 cm

142 3. IR-Spektroskopia 3.11 Alkoholit ja fenolit O -Taivutusvärähtelyt Tasossa tapahtuva O - taivutusvärähtely ~1450 cm -1 (nestefaasi) ~1350 cm -1 (kaasufaasi) C 2 -ryhmän taivutus ~1450 cm -1 :ssä voi peittää O -taivutuksen O -taivutuksen piikki on yleensä huomattavasti leveämpi johtuen vetysitoutumisista Nestefaasissa alkoholeilla ja fenoleilla leveä absorptiovyö alueella cm -1 Ei-tasossa tapahtuva O - taivutusvärähtely 142

143 3. IR-Spektroskopia 3.11 Alkoholit ja fenolit C O-Venytysvärähtelyt Alkoholeilla C O-venytysvärähdys ja O -taivutus tasossa ovat kytkeytyneet Tuloksena kaksi piikkiä ~1450 cm -1 ja cm -1 Jälkimmäisen piikin paikka riippuu siitä, onko alkoholi primaarinen, sekundaarinen vai tertiaarinen Taulukko 14. Alkoholien C O-venytysvärähtelyjen aaltolukualueita Alkoholin tyyppi Aaltolukualue [cm -1 ] Primaarinen Sekundaarinen alifaattinen Sekundaarinen aromaattinen Sekundaarinen syklinen ekvatoriaalinen Sekundaarinen syklinen aksiaalinen Tertiaarinen Fenoli

144 3. IR-Spektroskopia 3.11 Alkoholit ja fenolit eksanolin IR-spektri O SDBSWeb: as (C 3 ) 1468 cm -1 s (C 2 ) 1461 cm -1 s (O) 1430 cm -1 (peittynyt) (C 2 ) 726 cm -1 (O) 660 cm -1 s (C 3 ) 1379 cm -1 (O) 3324 cm -1 as (C 3 ) 2958 cm -1 as (C 2 ) 2933 cm -1 s (C 3 ) 2874 cm -1 s (C 2 ) 2861 cm -1 Kombinaatio (CO) + (O) 1069 cm

145 3. IR-Spektroskopia 3.12 Eetterit C O-Venytysvärähtelyt Eettereille tunnusomaisia voimakkaat C O C-systeemin venytysvärähdykset Usein kytkeytyneet muihin värähdyksiin apen vieressä olevan hiilen haaroittuminen aiheuttaa C O C- venytyksestä johtuvan piikin jakautumisen Alifaattiset eetterit asymmetrinen C O C-venytys cm -1 Symmetrinen venytys erittäin heikko 145

146 3. IR-Spektroskopia 3.12 Eetterit C O-Venytysvärähtelyt Aryylialkyylieetterit C O C-venytys cm -1 (asymmetrinen) ja cm -1 (symmetrinen) Vinyylialkyylieettereillä intensiivisempi C = C-venytysvärähdys alueella cm -1 kuin alkeeneilla Vinyylialkyylieetterit C O C-venytys cm -1 (asymmetrinen) ja cm -1 (symmetrinen) Esiintyy duplettina johtuen rotaatioisomeerien (cis ja trans) erilaisesta absorptiosta 146

147 3. IR-Spektroskopia 3.12 Eetterit Etoksibentseenin IR-spektri SDBSWeb: OC 2 C 3 Asymmetrinen C O C-venytys 1245 cm -1 Symmetrinen C O C-venytys 1049 cm

148 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C = O-Venytysvärähtelyt Ketonit, aldehydit, karboksyylihapot, esterit, laktonit, happohalidit, anhydridit, amidit ja laktaamit antavat voimakkaan C = O-venytysvärähdyspiikin alueella cm -1 Intensiivinen piikki alueella, jossa vähän muita piikkejä Erinomainen ryhmäfrekvenssi 148

149 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C = O-Venytysvärähtelyt C = O-Venytysvärähdyspiikin paikkaan vaikuttavat 1. Fysikaalinen tila 5. Renkaan geometria 2. Naapuriryhmän elektroniset ja massaefektit 4. Vetysitoutuminen 3. Konjugaatio 149

150 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C = O-Venytysvärähtelyt Normaalin alifaattisen ketonin absorptiotaajuus on 1715 cm -1 (esim. asetoni ja sykloheksanoni) Naapuriryhmän induktiivinen efekti lyhentää C = O-sidosta ja kasvattaa absorptiotaajuutta Polaarinen liuotin pienentää ja pooliton liuotin kasvattaa absorptiotaajuutta Resonanssiefekti pidentää C = O-sidosta ja pienentää absorptiotaajuutta Liuotinefektit ±25 cm

151 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C = O-Venytysvärähtelyt Alkeeni- tai fenyyliryhmän kanssa konjugoitunut C = O- ryhmä absorboi alueella cm -1 Intermolekularinen vetysitoutuminen ketonin ja hydroksyylisen liuottimen välillä pienentää hieman C = O-ryhmän absorptiotaajuutta C = O-Ryhmän -elektronien delokalisointi vähentää C O-sidoksen kaksoissidosluonnetta Absorptio siirtyy kohti pidempää aallonpituutta 151

152 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C = O-Venytysvärähtelyt -Diketoneilla intensiivinen ja leveä absorptiovyö alueella cm -1 Kinoneilla C = O- venytysvärähdys alueella cm -1 Molekyylin sisäisen vetysidoksen stabiloima enolimuoto Lisääntynyt konjugaatio siirtää absorption alueelle cm -1 -Diketoneilla yksi C = O- venytysvärähdys ~1715 cm -1 Asyklisillä -klooriketoneilla kaksi C = O-venytysvärähdystä johtuen rotaatioisomeereistä 152

153 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C = O-Venytysvärähtelyt Rengassysteemeissä sidoskulma voi olla <120 Sykloheksanoni 1715 cm -1 Karbonyyliryhmän vieressä olevan C C-sidoksen venytys lisää C = O-ryhmän venytykseen tarvittavaa energiaa Syklopentanoni 1751 cm -1 C = O-Venytysvärähdyksen absorptiotaajuus kasvaa sidoskulman pienentyessä Syklobutanoni 1775 cm

154 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit C (C = O) C-Ryhmän venytys- ja taivutusvärähtelyt Ketoneilla keskivahva C (C = O) C-ryhmän venytys ja taivutus alueella cm -1 Alifaattiset ketonit alueella cm -1 Aromaattiset ketonit alueella cm -1 Voi sisältää useampia piikkejä 154

155 3. IR-Spektroskopia 3.13 Ketonit eptanonin IR-spektri SDBSWeb: O (C=O) ylivärähdys 3415 cm -1 as (C 3 ) 2962 cm -1 as (C 2 ) 2939 cm -1 s (C 3 ) 2876 cm -1 s (C 2 ) 2870 cm -1 (C=O) 1715 cm -1 C (C=O) C venytys ja taivutus as (C 3 ) 1461 cm -1 s (C 2 ) 1455 cm -1 s (C 2 ) 1408 cm -1 (karbonyylin vieressä) s (C 3 ) 1378 cm

156 3. IR-Spektroskopia 3.14 Aldehydit C -Venytysvärähtelyt Aldehydinen keskivahva C -venytysvärähdys alueella cm -1 Yleensä kaksi piikkiä Aromaattisilla aldehydeillä, joilla on elektronegatiivinen substituentti orto asemassa, piikki voi olla ~2900 cm -1 Fermin resonanssi aldehydin C venytyksen ja C - taivutuksen 1. ylivärähdyksen (~1390 cm -1 ) välillä 156

157 3. IR-Spektroskopia 3.14 Aldehydit C = O-Venytysvärähtelyt Alifaattisilla aldehydeillä C = O-venytysvärähdys alueella cm -1 Konjugointi kaksoisidosten kanssa pienentää karbonyylin absorptiotaajuutta C = O-Venytysvärähdys alueella cm -1 Elektronegatiivinen substituentti -hiilessä kasvattaa karbonyylin absorptiotaajuutta Molekyylin sisäinen vetysidos siirtää absorptiota IR-spektrissä oikealle 157

158 3. IR-Spektroskopia 3.14 Aldehydit eptaldehydin IR-spektri SDBSWeb: (aldehydi C ) 2818 cm cm -1 as (C 3 ) 2959 cm -1 as (C 2 ) 2931 cm -1 s (C 3 ) 2874 cm -1 s (C 2 ) 2860 cm -1 (C=O) 1729 cm -1 as (C 3 ) 1468 cm -1 s (C 2 ) 1460 cm -1 s (C 2 ) 1411 cm -1 (karbonyylin vieressä) (aldehydi C ) 1390 cm -1 s (C 3 ) 1379 cm -1 O 158

159 3. IR-Spektroskopia 3.15 Karboksyylihapot O -Venytysvärähtelyt Karboksyylihapot muodostavat vetysidottuja dimeerejä nesteja kiinteässä faasissa sekä CCl 4 - liuoksissa (c > 0.01 M) Karboksyylihapoilla erittäin leveä ja intensiivinen O -venytysvärähdys alueella cm -1 (keskikohta ~3000 cm -1 ) Vapaan O-ryhmän venytysvärähtelyjä (~3550 cm -1 ) voidaan havaita ainoastaan erittäin laimeissa liuoksissa (pooliton liuotin) tai kaasufaasissa Peittää alleen heikommat C -venytykset O -Venytyksen oikealla puolella esiintyvä hienorakenne johtuu kombinaatioista ja ylivärähdyksistä 159

160 3. IR-Spektroskopia 3.15 Karboksyylihapot O -Venytysvärähtelyt Esim. eptaanihappo COO Nestefilmi (vetysitoutumista) O) ~3000 cm -1 Kaasufaasi (ei vetysitoutumista) O) 3578 cm

161 3. IR-Spektroskopia 3.15 Karboksyylihapot C = O-Venytysvärähtelyt Karboksyylihappojen C = O-venytysvärähdys intensiivisempi kuin ketoneilla Resonanssi ja vetysitoutuminen heikentävät C = O-sidosta pienentäen absorptiotaajuutta Tyydytettyjen alifaattisten karboksyylihappojen C = O-venytysvärähdys ~1760cm -1 Dimeeristen tyydytettyjen alifaattisten happojen C = O-venytys alueella cm -1 Elektronegatiivinen substituentti -asemassa siirtää C = O-absorptiota spektrissä vasemalle cm -1 Konjugoiduilla dimeerisillä hapoilla C = O-venytys alueella cm

162 3. IR-Spektroskopia 3.15 Karboksyylihapot C O-Venytys- ja O -taivutusvärähtelyt appojen C O-Venytys ja O - taivutus tasossa kytkeytyvät antaen kaksi absorptiovyötä alueilla cm -1 ja cm -1 C O -Taivutus keskivahva piikki ~ cm -1 Intensiivisempi piikki ~ cm -1 yleensä C O-venytys Dupletti pitkäketjuisilla rasvahapoilla Dimeereillä ei-tasossa tapahtuva O - taivutus antaa keskivahvan ja leveän piikin ~920 cm

163 3. IR-Spektroskopia 3.15 Karboksyylihapot Butaanihapon IR-spektri COO SDBSWeb: (O ) cm -1 (C=O) (C O ) tasossa 1712 cm cm -1 (C O) 1285 cm -1 (O ) ei-tasossa 937 cm

164 3. IR-Spektroskopia 3.16 Karboksylaattianioni Ammoniumasetaatin IR-spektri C 3 CON 4 SDBSWeb: Asymmetrinen karboksylaattianionin C(C=O) 2- - venytys 1568 cm -1 Symmetrinen karboksylaattianionin C(C=O) 2- - venytys 1402 cm

165 3. IR-Spektroskopia 3.17 Esterit ja laktonit C = O-Venytysvärähtelyt Tyydytettyjen alifaattisten esterien C = O-venytysvärähdys alueella cm -1 Kaksoissidos C O-ryhmän vieressä sekä -halogeenisubstituutio nostavat C = O-venytyksen absorptiotaajuutta (~1770 cm -1 ) Formaattien,, -tyydyttymättömien ja bentsoaattiesterien C = O-venytys alueella cm -1 Oksalaatit ja -ketoesterit C = O-venytys alueella cm -1 -ketoesterit Molekyylin sisäinen C = O-venytys ~1650 cm -1 vetysitoutuminen 165

166 3. IR-Spektroskopia 3.17 Esterit ja laktonit C = O-Venytysvärähtelyt Tyydytettyjen -laktonien (6-rengas) C = O- venytys alueella cm -1 Kaksoissidos -asemassa O ryhmään nähden kasvattaa C = O-ryhmän absorptiotaajuutta Kaksoissidos -asemassa karbonyyliin nähden pienentää C = O-ryhmän absorptiotaajuutta Tyydytettyjen -laktonien (5-rengas) C = O- venytys alueella cm

167 3. IR-Spektroskopia 3.17 Esterit ja laktonit C O-Venytysvärähtelyt Kaksi asymmetristä kytkeytynyttä C O-venytystä: C (C = O) O (tärkeämpi) ja O C C alueella cm -1 C (C = O) O-Venytykset absorboivat yleensä korkeammalla taajuudella kuin O C C-venytykset C O-Venytykset ovat vähemmän luotettavia spektrianalyysin kannalta kuin C = O-venytykset 167

168 3. IR-Spektroskopia 3.17 Esterit ja laktonit eksyyliasetaatin IR-spektri O O SDBSWeb: Asymmetrinen O C C-venytys 1042 cm -1 (C=O) 1743 cm -1 Asymmetrinen C (C=O) O-venytys 1242 cm

169 3. IR-Spektroskopia 3.18 appohalidit C = O-Venytysvärähtelyt Konjugoimattomien happohalidien C = O-venytysvärähdys alueella cm -1 Konjugoiduilla hieman alhaisempi absoptiotaajuus Aromaattisten happohalidien C = O-venytysvärähdys alueella cm -1 Aroyyliklorideilla Fermin resonanssista johtuva piikki alueella cm

170 3. IR-Spektroskopia 3.18 appohalidit Asetyylikloridin IR-spektri SDBSWeb: O Cl (C=O) 1806 cm

171 3. IR-Spektroskopia 3.19 appoanhydridit C = O- ja C O-Venytysvärähtelyt Tyydyttyneillä happoanhydrideillä kaksi C = O-venytysvärähdyspiikkiä ~1820 ja ~1750 cm -1 Konjugoiduilla asyklisillä anhydrideillä kaksi C = O-venytyksestä johtuvaa piikkiä ~1775 ja ~1720 cm -1 Symmetrinen ja asymmetrinen venytys Konjugoimattomilla suoraketjuisilla happoanhydrideillä voimakas C (C = O) O (C = O) C- venytysvärähdys ~1050 cm -1 Syklisillä anhydrideillä kaksi piikkiä alueilla cm -1 ja cm

172 3. IR-Spektroskopia 3.19 appoanhydridit Asetanhydridin IR-spektri SDBSWeb: C (C=O) O (C=O) C- Venytys 1125 cm -1 O O O Symmetrinen (C=O) 1766 cm -1 Asymmetrinen (C=O) 1827 cm

173 3. IR-Spektroskopia 3.20 Amidit ja laktaamit N -Venytysvärähtelyt Primaarisilla amideilla keskivahva vapaa N -venytysvärähdys ~3520 cm -1 (asymmetrinen) ja ~3400 cm -1 (symmetrinen) Kiinteissä näytteissä (vetysitoutumista) ~3350 cm -1 ja ~3180 cm -1 Sekundaarisilla amideilla vapaa N -venytys (trans karbonyyliin nähden) alueella cm -1 Konsentroiduissa ja kiinteissä näytteissä useita piikkejä alueella cm -1 Amidit voivat muodostaa s-cis-konformaatiossa dimeerejä ja s-trans-konformaatiossa polymeerejä 173

174 3. IR-Spektroskopia 3.20 Amidit ja laktaamit C = O-Venytysvärähtelyt (amidin I vyö) Primaarisilla amideilla vahva C = O-venytysvärähdys ~1650 cm -1 (kiinteä näyte, asetamidi 1694 cm -1 ) tai ~1690 cm -1 (laimea liuos) Tertiaarisilla amideilla C = O-venytysvärähdys fysikaalisesta tilasta riippumatta alueella cm -1 Sekundaarisilla amideilla C = O-venytysvärähdys ~1640 cm -1 (kiinteä näyte) tai cm -1 (laimea liuos) Vetysitoutuminen liuottimen kanssa voi vaikuttaa absorptiovyön paikkaan Elektroneja vetävä substituentti typessä kasvattaa karbonyylin absorptiotaajuutta 174

175 3. IR-Spektroskopia 3.20 Amidit ja laktaamit N -Taivutusvärähtelyt (amidin II vyö) Primaarisilla amideilla N -taivutusvärähdys näytetekniikasta riippuen alueella cm -1 Tästä kombinaatiosta johtuu myös heikko absorptiovyö ~1250 cm -1 Sekundaarisilla amideilla N -taivutus cm -1 (kiinteä näyte) tai cm -1 (laimea liuos) N - taivutuksen ja C N-venytyksen (C N -ryhmä) kombinaatio 175

176 3. IR-Spektroskopia 3.20 Amidit ja laktaamit Muut värähtelyt Primaarisilla amideilla C N-venytys ~1400 cm -1 Laktaamien C = O-venytys 6-rengas: ~1650 cm -1 5-rengas: cm -1 4-rengas: cm -1 Primaarisilla ja sekundaarisilla amideilla N -huojunnasta (ei-tasossa) johtuva leveä ja keskivahva piikki alueella cm -1 Laktaamin fuusio toisen renkaan kanssa kasvattaa absorptiotaajuutta cm

177 3. IR-Spektroskopia 3.20 Amidit ja laktaamit eksaaniamidin IR-spektri SDBSWeb: O N 2 s (N) 3189 cm -1 as (N) 3363 cm -1 (C=O) 1662 cm -1 (N) 1634 cm -1 (C N) 1426 cm -1 (N) ~640 cm

178 3. IR-Spektroskopia 3.21 Amiinit N -Venytysvärähtelyt Primaarisilla amiineilla kaksi signaalia Vetysitoutunut: as N) cm -1 (w) s N) cm -1 (w) Ei vetysitoutumista: as N) ~3500 cm -1 (w) s N) ~3400 cm -1 (w) Signaalit heikompia, mutta terävämpiä kuin vastaavat O -piikit Sekundaarisilla amiineilla yksi leveähkö signaali N) cm -1 (w) Tertiaarisilla amiineilla ei ole N)-signaaleja 178

179 3. IR-Spektroskopia 3.21 Amiinit N -Venytysvärähtelyt Esim. heksyyliamiini (primaarinen) ja piperidiini (sekundaarinen) N 2 Primaarinen amiini Sekundaarinen amiini N 179

180 3. IR-Spektroskopia 3.21 Amiinit N -Taivutusvärähtelyt Primaarisilla amiineilla N -taivutusvärähdys alueella cm -1 (m s) Sekundaarisilla alifaattisilla amiineilla havaitaan harvoin N -taivutusvärähdystä Nestemäisissä näytteissä primaarisilla ja sekundaarisilla amiineilla ei-tasossa taphtuva taivutus N) cm -1 (m s) Sekundaarisilla aromaattisilla amiineilla N - taivutus ~1515 cm -1 Paikka riippuu vetysitoutumisen asteesta 180

181 3. IR-Spektroskopia 3.21 Amiinit C N-Venytysvärähtelyt Primaarisilla, sekundaarisilla ja tertiaarisilla alifaattisilla amiineilla C N-venytysvärähdys alueella cm -1 (w m) Aromaattisilla amiineilla C N-venytys alueella cm -1 (s) 181

182 3. IR-Spektroskopia 3.21 Amiinit eksyyliamiinin IR-spektri N 2 SDBSWeb: as (N) 3369 cm -1 s (N) 3291 cm -1 s (N) 1617 cm -1 (saksitaivutus) (C N) 1070 cm -1 (N) ~810 cm

183 3. IR-Spektroskopia 3.22 Nitriilit C N-Venytysvärähtelyt Alifaattisilla nitriileillä C N-venytysvärähdys alueella cm -1 Konjugoiduilla nitriileillä C N-venytys alueella cm

184 3. IR-Spektroskopia 3.22 Nitriilit Propionitriilin IR-spektri C N SDBSWeb: (C N) 2248 cm

185 3. IR-Spektroskopia 3.23 Nitroyhdisteet N = O-Venytysvärähtelyt Nitroalkaaneilla kaksi N = O-venytysvärähdystä ~1550 cm -1 ja~1370 cm -1 Konjugoituneilla nitroyhdisteillä N = O-venytykset alueilla cm -1 ja cm -1 Aromaattisilla nitroyhdisteillä C N-venytys ~870 cm

186 3. IR-Spektroskopia 3.23 Nitroyhdisteet o Nitrotolueenin IR-spektri SDBSWeb: NO 2 C 3 (C N) 859 cm -1 as (N=O) 1524 cm -1 s (N=O) 1347 cm

187 3. IR-Spektroskopia 3.24 Tiolit Metyyli-1-propaanitiolin IR-spektri SDBSWeb: S (S) 2554 cm -1 (C S) 710 cm

188 3. IR-Spektroskopia 3.25 Organoklooriyhdisteet ,1,1-Trikloorietaanin IR-spektri Cl 3 CC 3 SDBSWeb: (CCl) 711 cm

189 4. NMR-Spektroskopia 4.1 Ytimen spinimpulssimomentti ja magneettinen momentti Suurella osalla atomiytimiä on ominaisuus, jota kutsutaan spinimpulssimomentiksi P (vektori) P = {I (I + 1)} 1/2 ħ, missä I = spinkvanttiluku (ytimen spin) ja ħ = h /2 (h = Planckin vakio) Ytimen spin voi saada arvoja I = 0, 1/2, 1, 3/2, 2,..., 7 189

190 4. NMR-Spektroskopia 4.1 Ytimen spinimpulssimomentti ja magneettinen momentti Suurella osalla atomiytimiä on myöskin ominaisuus, jota kutsutaan magneettiseksi momentiksi (vektori) Spinimpulssimomentin ja magneettisen momentin suhdetta kuvaa yhtälö = P, missä = ytimen gyromagneettinen suhde Gyromagneettinen suhde on kullekin ytimelle ominainen luku Ytimet, joilla on suuri ovat NMR:n kannalta herkkiä ytimiä (ja päinvastoin) Positiivisilla :n arvoilla vektorit ja P ovat samansuuntaisia, kun taas negatiivisilla :n arvoilla ne ovat vastakkaissuuntaiset 190

191 4. NMR-Spektroskopia 4.1 Ytimen spinimpulssimomentti ja magneettinen momentti Spinin I arvo riippuu ytimen rakenneosasten, eli protonien ja neutronien lukumäärästä Taulukko 15. Ytimen spinin I riippuvuus järjestysluvusta Z ja massaluvusta A Järjestysluku Z Massaluku A Spinkvanttiluku I Parillinen Parillinen 0 Pariton Parillinen 1, 2, 3,... Parillinen tai pariton Pariton ½, 3/2, 5/2,... = {I (I + 1)} 1/2 ħ 1 : A = 1 (pariton) ja Z = 1 (pariton) I = 1/2 12 C: A = 12 (parillinen) ja Z = 6 (parillinen) I = 0 13 C: A = 13 (pariton) ja Z = 6 (parillinen) I = 1/2 14 N: A = 14 (parillinen) ja Z = 7 (pariton) I = 1 Ytimet, joilla I = 0, eivät anna NMR- signaalia Vain ytimet, joilla I 0, antavat piikin NMR-spektrissä 191

192 4. NMR-Spektroskopia 4.1 Ytimen spinimpulssimomentti ja magneettinen momentti Ytimillä, joilla I = ½, on pallosymmetrinen varausjakautuma Ytimillä, joilla I > 1/2 (inkrementtinä ½), varausjakautumaa havainnollistaa litistynyt pallo Tällaisella ytimellä on magneettisen momentin lisäksi sähköinen kvadrupolimomentti Q Reagoi sekä sähkömagneettisen säteilyn magneettiseen että sähköiseen komponenttiin 192

193 4. NMR-Spektroskopia 4.1 Ytimen spinimpulssimomentti ja magneettinen momentti Ydin Spin I Sähköinen kvadrupolimomentti Q [eq] [10-28 m 2 ] Taulukko 16. Eräiden ytimien NMR-ominaisuuksia Luonnollinen runsaus [%] Suhteellinen herkkyys (verrattuna 1 = 1) Gyromagneettinen suhde [10 7 rad T -1 s -1 ] Magneettinen momentti (yksikkönä N ) NMR-Taajuus [Mz] (B 0 = T) 1 ½ C C ½ N N ½ O O 5/ F ½ P ½ Orgaanisen kemian kannalta tärkeimmät NMR-ytimet ovat 1 ja 13 C Muita tärkeitä ytimiä ovat mm. 15 N, 19 F ja 31 P 193

194 4. NMR-Spektroskopia 4.2 Ydin staattisessa magneettikentässä Ytimen energia magneettikentässä Magneettisen momentin ja magneettikentän välinen vuorovaikutusenergia E = - z B 0 B 0 Matalin energia Korkein energia Spinin I omaavalla ytimellä on magneettikentässä 2I + 1 energiatilaa Energia voi saada yhtälön E = -m ħ B 0 mukaisia arvoja (m = magneettinen kvanttiluku) Deuteriumilla (I = 1) on kolme energia-arvoa (m arvot +1, 0 ja 1) Protonilla (I = ½) on kaksi energia-arvoa vastaten m arvoja +1/2 ja 1/2 m voi saada arvoja I, I 1,... I 194

195 4. NMR-Spektroskopia 4.2 Ydin staattisessa magneettikentässä Ytimen energia magneettikentässä E m = -1/2 ( ) E = +1/2 ħb 0 m = -1 E -1 = + ħb 0 0 m = 0 E 0 = 0 m = +1/2 ( ) E = -1/2 ħb 0 m = +1 E +1 = - ħb 0 Ydin, jonka spin I = ½ (esim. 1 ja 13 C) Ydin, jonka spin I = 1 (esim. 2 ja 14 N) 195

196 4. NMR-Spektroskopia 4.2 Ydin staattisessa magneettikentässä Ytimen energia magneettikentässä Kahden energiatilan välinen energiaero E ( ) = ħ B 0 = (h /2 )B 0 E m = -1/2 ( ) (magneettikentän vastainen tila) Energiaeroa vastaavan fotonin taajuus ( ) = E ( )/h = B 0 /2 [( B 0 )/2 z] 0 E 1 E 2 Kahden energiatilan välinen ero magneettivuon tiheyden B 0 funktiona ytimelle, jonka spin I = ½ (esim. 1 ja 13 C) B 1 B2 m = +1/2 ( ) (magneettikentän suuntainen tila) B 0 196

197 4. NMR-Spektroskopia 4.2 Ydin staattisessa magneettikentässä Energiatasojen populaatioerot Ylemmän ( ) ja alemman ( ) tilan välinen energiaero on erittäin pieni Normaalilämpötilassa vain hyvin pieni ylimäärä ytimiä on termisen tasapainon vallitessa alemmalla energiatilalla N ylempi( ) /N alempi( ) = e E /k B T 1 ( E /k B T ) = 1 ( ħ B 0 /k B T ) Energiatilojen miehitysluvut N noudattavat Boltzmannin jakaantumislakia k B = Boltzmannin vakio ( J K -1 ) ja T = absoluuttinen lämpötila [K] Esim. protoni: Kun magneettivuon tiheys B 0 = 1.41 T (resonanssitaajuus 60 Mz) on energiaero E = ħ B J mol -1. Tällöin lämpötilassa 300 K N N. Jos B 0 = 7.05 T (resonanssitaajuus 300 Mz), kasvaa energiaero: N N. 197

198 4. NMR-Spektroskopia 4.2 Ydin staattisessa magneettikentässä Makroskooppinen magnetisaatio B 0 B 0 Magneettikenttä Ei magneettikenttää z Magneettikenttä, ei tasapainoa z Magneettikenttä, tasapaino z M 0 y y y x x x 198

199 4. NMR-Spektroskopia 4.2 Ydin staattisessa magneettikentässä Larmor-prekessio Magneettisen momentin vektori prekessoi magneettikentän suuntaisen z-akselin ympäri (vrt. hyrrä) > 0 < 0 B 0 B 0 Prekessiotaajuus eli Larmor-taajuus L on verrannollinen magneettivuon tiheyteen B 0 L = - B 0 / 199

200 4. NMR-Spektroskopia 4.3 NMR-Spektroskopian periaate Resonanssiehto NMR-Spektroskopiassa energiatilojen väliset siirtymät indusoidaan (aiheutetaan) ulkoista magneettikenttää B 0 kohtisuorassa olevan radiotaajuuksisen herätekentän B 1 avulla Jotta siirtymiä voisi tapahtua, pitää herätekentän B 1 taajuuden 1 olla sellainen, että yhtälö h = E toteutuu Tällöin B 1 :n magneettinen komponentti vuorovaikuttaa näytteen ydindipolien kanssa 200

201 4. NMR-Spektroskopia 4.3 NMR-Spektroskopian periaate Resonanssiehto Siirtymät alemmalta energiatasolta ylemmälle vastaavat energian absorptiota ja päinvastaiset siirtymät emissiota Jokaiseen siirtymään liittyy spinin orientaation muutos Molemmat yhtä todennäköisiä Koska alemmalla energiatilalla on populaatioylimäärä, on absorptio dominoiva prosessi avaitaan signaali, jonka intensiteetti on verrannollinen populaatioeroon N alempi( ) N ylempi( ) (spinien määrä näytteessä, konsentraatio) NMR-Kokeessa havaitaan absorptio- ja emissiosiirtymien nettovaikutus 201

202 4. NMR-Spektroskopia 4.3 NMR-Spektroskopian periaate Resonanssiehto E Spin I = ½ Säteilytys taajuudella 1 aiheuttaa sen, että h 1 = E indusoi absorptio-(a) ja emissiosiirtymiä (E) h A E E N alempi( ) = N ylempi( ) absorptio ja emissio kumoavat toisensa ei signaalia Saturaatio Alemmalla energiatasolla hieman enemmän spinejä absorptio on dominoiva prosessi 202

203 4. NMR-Spektroskopia 4.3 NMR-Spektroskopian periaate Resonanssiehto Resonanssiehto: L = 1 = - B 0 / 2 Yleensä käytetään tätä taajuutta, kun halutaan ilmaista kuinka tehokas NMR-laite on kyseessä Siirtymiä tapahtuu, kun sähkömagneettisen säteilyn taajuus 1 vastaa Larmor-taajuutta L Vain sellaiset siirtymät, joissa m = 1 ovat sallittuja m ( )= -1/2 (+1/2) = -1 m ( )= +1/2 (-1/2) = +1 Esim. protoni ( = T -1 s -1 ) Kentän voimakkuus 1.41 T vastaa L = 60 Mz (aallonpituus 5 m). Taulukko 17. Magneettikentän B 0 vaikutus 1 - ja 13 C-ydinten resonanssitaajuuksiin B 0 [T] Resonanssitaajuus [Mz) 1 13 C

204 4. NMR-Spektroskopia 4.3 NMR-Spektroskopian periaate NMR-Kokeen perusperiaate Näytteessä tapahtuu signaaleja tuottavia NMR-siirtymiä, kun resonanssiehto on täytetty (yhtälö s. 203) Vaihdetaan herätekenttää B 1 ja pidetään magneettikenttä B 0 vakiona (taajuuspyyhkäisy) Vaihdetaan magneettikenttää B 0 ja pidetään herätekenttä B 1 vakiona (kenttäpyyhkäisy) CW- (continuous wave) eli pyyhkäisymenetelmä Ns. pulssiherätteinen menetelmä on syrjäyttänyt CW-menetelmän erätekenttä on jatkuvasti kohdistettu näytteeseen pyyhkäisyn aikana 204

205 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi Pulssimenetelmässä näytteen kaikki ytimet, joita halutaan tutkia (esim. kaikki protonit tai kaikki 13 C ytimet) viritetään yhtäaikaa radiotaajuuspulsilla erätekentän pulssi sisältää laajan taajuusalueen, jonka määräävät pulssin kestoaika p ja herätekentän eli kantoaallon taajuus 1 Pääosa pulssin energiasta keskittyy taajuusalueelle 1 ±1/ p Pulssin kestoaika p on yleensä muutaman s:n luokkaa ( 1 ) 205

206 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi 1 -Kestoinen herätekentän B 1 pulssi taajuudella 1 Vastaava taajuusalue B 1 A B A B t p 1 p A ja B ovat ytimien A ja B resonanssitaajuudet Käytetään ns. kovia pulsseja (hard pulses) p t 0 t 1 Lyhytkestoinen pulssi suurella teholla (useita watteja) 206

207 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi NMR-Siirtymät indusoidaan radiotaajuuksisen, xy-tason suuntaisen pulssin avulla Tällöin herätekentän sähkömagneettisen säteilyn magneettinen komponentti voi vuorovaikuttaa näytteen ydindipolien kanssa Magneettinen komponentti vuorovaikuttaa myös makroskooppisen magnetisaation vektorin M 0 kanssa (kts. s. 198) 207

208 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi x-akselin suuntainen lineaarinen muuttuva magneettikenttä (ts. oskilloiva magneettikenttä) voidaan esittää kahden samansuuruisen vektorin B 1 (l) ja B 1 (r) avulla, jotka pyörivät x,y-tasossa taajuudella L 2B 1 B 1 (l) B 1 (r) y Muuttuva magneettikenttä x-suunnassa on näiden vektorien summa (max. 2B 1 ) y x Vain prekessoivien ydindipolien kanssa samaan suuntaan pyörivä komponentti voi vuorovaikuttaa ydindipolien ja M 0 :n kanssa B 1-2B 1 x B 1 (l) x y B 1 (r) 208

209 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi B 0 B 0 Otetaan käyttöön pyörivä koordinaatisto x, y ja z, joka pyörii samalla taajuudella kuin herätekenttä B 1 Tässä systeemissä B 1 :n suunta ja suuruus pysyvät vakioina erätekentän B 1 vaikutuksesta M 0 kääntyy pois z-akselin (kentän B 0 ) suunnasta negatiivisen y -akselin suuntaan z z M 0 Pyörivässä koordinaatistossa tämä kääntyminen tapahtuu x -akselin ympäri, eli y,z-tasossa y M 0 y B 1 -Kentän aiheuttamaa M 0 -vektorin poikkeamaa z-suunnasta kuvaa yhtälö = B 1 p x = Pulssikulma x B 1 209

210 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi Pulssikulmaa voidaan suurentaa lisäämällä B 1 :n amplitudia tai pulssin kestoaikaa p (kts. yhtälö s. 209) z z z M 0 M -y B 1 M - y = M 0 y B 1 y B 1 y x x x -M 0 Makroskooppinen magnetisaatio M 0 x -pulssin jälkeen M 0 90 x -pulssin jälkeen M x -pulssin jälkeen x -pulssi B 1 on x -akselin kanssa yhdensuuntainen ja pulssin kulma on -astetta 90 x -pulssin jälkeen M z = 0 ja N alempi sekä N ylempi sisältävät yhtä paljon spinejä 180 x -pulssi kääntää populaatiot N alempi ja N ylempi täsmälleen päinvastoin 210

211 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi z Transversaalinen magnetisaatio on ratkaisevan tärkeä NMRsignaalin havaitsemisen kannalta y Vastaanottimen kela sijaitsee xy-tasossa, eli havaitaan transversaalisen magnetisaation indusoimaa signaalia x M y Pulssin jälkeen makroskooppisen magnetisaation vektori M 0 (kuten myös yksittäiset spinit) jatkavat prekessointia z-akselin ympäri Larmor-taajuudella L M x 211

212 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Relaksaatio Pulssin jälkeen makroskooppisen magnetisaation vektori M 0 (kuten myös yksittäiset spinit) prekessoi z-akselin ympäri Larmor-taajuudella L M z z M 0 M 0 :n orientaatio voidaan kuvata stationaarisessa koordinaatistossa millä hetkellä hyvänsä komponenttien M x, M y ja M z avulla x M x M y y Spinsysteemi palaa takaisin tasapainotilaan ns. relaksaatioprosessien kautta M z palaa alkuperäiseen arvoonsa M 0 ja M x sekä M y lähestyvät nollaa 212

213 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Relaksaatio F. Blochin mukaan relaksaatio on ensimmäisen kertaluokan prosessi ja sitä kuvaavat relaksaatioajat T 1 ja T 2 Blochin yhtälöt relaksaatiolle pyörivässä koordinaatistossa dm z /dt = M z M 0 /T 1 dm y /dt = M y /T 2 T 1 = Spin-hila eli longitudinaalinen relaksaatioaika (nopeusvakio T 1 1 ) dm x /dt = M x /T 2 T 2 = transversaalinen relaksaatioaika (kutsutaan myös spin-spin relaksaatioksi, huono termi) (nopeusvakio T 2 1 ) 213

214 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Relaksaatio Longitudinaalinen relaksaatio aiheutuu säteilytettävien ytimien vuorovaikutuksesta hilan (ympäristön) kanssa M 0 :n alkuperäinen arvo z Pulssista absorboitu energia siirtyy ympäristöön M 0 M z Longitudinaalinen komponentti M z palaa alkuperäiseen arvoonsa M 0 x y 214

215 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Relaksaatio Transversaalinen relaksaatio aiheutuu siitä, että ytimien prekessiot pyrkivät liukumaan pois samasta vaiheesta x,y-tasossa ollut transversaalinen magnetisaatio tuhoutuu (entropiaprosessi) y M 0 = M - y M - y y y x x x 215

216 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Aika- ja taajuusspektrit Tranversaalisen magnetisaation vastaanottimen kelalle indusoima signaali on muodoltaan aikaspektri Vapaan induktion vaimeneminen, free induction decay eli FID-signaali FID muutetaan taajuusspektriksi matemaattisella operaatiolla, jota kutsutaan Fourier-muunnokseksi FID sisältää koko spektriä varten tarvittavan informaation ja se vaimenee ajan funktiona g ( ) = - + f (t )e i t dt f (t ) vastaa aikaspektriä ja g ( ) taajuusspektriä 216

217 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Aika- ja taajuusspektrit g ( ) on kompleksifunktio, eli se muodostuu reaalisesta Re ja imaginaarisesta Im osasta, joiden vaihe-ero on 90 Reaalinen osa antaa absorptiosignaaleja ja imaginaarinen osa dispersiosignaaleja Normaalisti 1D NMR-spektrit esitetään absoptiomuodossa Detektiomenetelmästä johtuen signaalit yleensä sisältävät Fourier-muunnoksen jälkeen sekä absorptio- että dispersiokomponentteja Dispersiokomponentit poistetaan ns. faasikorjauksen avulla Absorptiosignaali Dispersiosignaali 217

218 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Aika- ja taajuusspektrit Kantoaallon taajuus 1 on sama kuin ytimen i resonanssitaajuus i (yksi NMR-siirtymä) M y 1 eroaa hieman i :stä (yksi NMR-siirtymä) 1/ t Useita resonanssitaajuuksia sisältävä FID (interferogrammi) ja vastaava taajuusspektri t FID FT t FT FT Taajuusspektri 6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 i = 1 i 1 218

219 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssikulman määrittäminen 1 NMR-signaalin riippuvuus pulssikulmasta = B 1 t p B 1 on vakio ja pulssin kestoa lisätään 1 s askelissa p [ s] 180 x -pulssi ei anna signaalia p 16 s x -pulssi antaa maksimisignaalin p 8 s 219

220 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Spektrin kerääminen Signaali-kohinasuhteen parantamiseksi kerätään yleensä useita FID-signaaleja ennen Fourier-muunnosta Mittauksen aikana kaikilla tutkittavilla spineillä pitää olla sama Larmor-taajuus, eli kentän tulee olla homogeeninen Magneettikentän on pysyttävä stabiilina pitkienkin keräysten aikana Magneettikentän homogeenisuutta säädetään ns. shimmauskelojen avulla Kentän stabiloimiseen käytetään ns. kenttä/taajuuslukkoa omogeenisuutta voidaan myös lisätä pyörittämällä näytettä Lukko pitää yllä resonanssiehtoa erillisessä NMR-kokeessa, joka on käynnissä rinnakkain oikean mittauksen kanssa Keräysaika (aquisition time) on aika, joka kuluu FID:in keräämiseen ja sen tallentamiseen digitaalisessa muodossa (verrannollinen muistipaikkojen määrään) Yleensä lukkosignaalina käytetään deuteroidun liuottimen 2 -resonanssia Muistipaikkojen määrä valitaan spektrin leveyden mukaan 220

221 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Spektrin kerääminen Käytännössä usein uusi pulssi seuraa heti kun edellisen FID on kerätty ja tallennettu Koska magnetisaatio pienenee relaksaation kautta ajan funktiona, sisältää FID:n loppuosa suhteessa enemmän kohinaa kuin alkuosa M z ei saavuta arvoa M 0 FID:n pienenemisnopeuden määräävät relaksaatioaika T 2 ja kentän epäpähomogeenisuudet ( B 0 ) x, y -Tasoon jää transversaalisen magnetisaation komponenttien M x ja M y jäänteitä Systeemin pitäisi antaa palautua tasapainotilaan ennen uutta pulssia Nykyaikaisissa NMR-laitteissa käytetään ns. PFG-(pulsed field gradient)tekniikkaa poistamaan ei-halutut transversaalisen magnetisaation komponentit 221

222 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Pulssi-NMR-spektrometri Magneetin kelat Näyte Näytteen vaihdin Kryomagneetilla varustettu pulssi- NMR-spektrometri e e Näytteenvaihdin N 2 täyttö e täyttö Magneetti N 2 N 2 Shimmauskelat Probe Esivahvistin Esivahvistin Probe Lähetin Vahvistin/ vastaanotin Elektroniikka (mm. lähetin ja vastaanotin) Shimmauskelat Tietokone Tulostin 222

223 4. NMR-Spektroskopia 4.4 Pulssi-NMR Esimerkki pulssi-nmr-mittauksesta: 1 NMR 90 x FID 1 FT d1 p1 aq ppm p1 p1 p1 p1 d1 d1 d1 d1 ze aq aq aq aq wr#0 exit Aika 223