751684 Harjoitustyöt Toimitus: Kirjoittajat: Esa Hohtola Kyösti Heimonen, Esa Hohtola, Matti Järvilehto, Kyösti Marjoniemi, Satu Mänttäri, Ahti Pyörnilä, Seppo Saarela Biologian laitoksen monisteita 4/1999, ISSN 1239-1646 Kolmas painos, 2005 Biologian laitos Oulun yliopisto
Sisällysluettelo PUNASOLUJEN OSMOOTTINEN HEMOLYYSI... 3 LÄMPÖTILAN VAIKUTUS SAMMAKON HERMON JOHTONOPEUTEEN... 7 KALSIUMIN MERKITYS LIHASSUPISTUKSESSA... 11 LÄMMÖNSÄÄTELY KYLMÄSSÄ... 15 LÄMMÖNSÄÄTELY: LÄÄHÄTYS LÄMMÖPOISTOKEINONA... 19 UNI-VALVETILA JA EEG... 23 RADIOIMMUNOLOGINEN MÄÄRITYS... 27 HORMONIEN VAIKUTUS VEREN GLUKOOSI- JA RASVAHAPPOPITOISUUKSIIN... 31 MITOKONDRIOT: ERISTYS JA SYTOKROMIOKSIDAASI -AKTIIVISUUS... 37 MONOAMIINIEN HISTOKEMIALLINEN FLUORESENSSI: NOPEA GLYOKSYYLIHAPPOMENETELMÄ KRYOSTAATTILEIKKEILLE... 45 POIKKIJUOVAISEN LIHAKSEN SOLUTYYPPIEN HISTOKEMIALLINEN OSOITUS ADENOSIINI- TRIFOSFATAASIN (ATP-AASI) AVULLA... 49 FOSFORYLAASIN HISTOKEMIALLINEN OSOITTAMINEN... 51 SUKKINODEHYDROGENAASIN HISTOKEMIALLINEN OSOITTAMINEN... 53 EMG JA MONOSYNAPTINEN REFLEKSI... 57 TORAKAN JALAN MEKANORESEPTOREIDEN TOIMINTA... 61 KÄRPÄSEN LENTOLIHASTEN RAKENNE JA TOIMINTA... 65 KUDOSNÄYTTEEN KEMIALLISEN KOOSTUMUKSEN MÄÄRITYS SOXHLET-MENETELMÄLLÄ... 73 KÄRPÄSEN MAKUAISTI... 75 APOMORFIINILLA AIKAANSAATU STEREOTYYPPINEN NOKKIMINEN KYYHKYLLÄ...83 1
2
PUNASOLUJEN OSMOOTTINEN HEMOLYYSI Johdanto Diffuusiolla tarkoitetaan molekyylien lämpöliikkeestä johtuvaa konsentraatioerojen tasoittumista. Osmoosi on diffuusion erikoistapaus, jossa liuotinaine (elävissä järjestelmissä yleensä vesi) kulkeutuu selektiivisen (puoliläpäisevän) membraanin läpi. Osmoottinen paine on kolligatiivinen ominaisuus, jonka voimakkuus riippuu liuoksessa olevien partikkeleiden lukumäärästä massayksikköä kohti eli molaalisuudesta. Punasolujen membraani on täysin permeaabeli vedelle, kun taas muiden yhdisteiden permeabiliteetti vaihtelee suuresti. Molekyyleillä, joiden permeabiliteetti on pieni, on suurin osmoottinen vaikutus. Osmoottinen paine voidaan laskea suoraan liuoksen koostumuksesta, mutta veden nettovirtauksen membraanin läpi määrää liuoksen toonisuus. Jos solukalvo olisi ideaalinen kalvo ja päästäisi läpi vain vesimokyylejä, osmoottinen potentiaali ja toonisuus olisivat samat. Koska näin ei ole, solun osmoottinen käyttäytyminen riippuu paitsi laskennallisesta osmoottisesta potentiaalista myös liuenneiden partikkeleiden laadusta (läpäisevyydestä). Nisäkkään punasolu on isotoninen 0.9% (v/w) NaCl:n kanssa. Tällaisessa liuoksessa veden nettovirtaus membraanin läpi on nolla. Kun punasolu asetetaan hypotoniseen liuokseen, kulkeutuu sen sisälle vettä, koska vesimolekyylien nettovirtaus tapahtuu konsentraatiogradienttia alaspäin solun sisäpuolelle. Tämä osmoottisen paine-eron aiheuttama nettovirtaus lakkaa, kun 1) solun hydrostaattinen paine nousee niin suureksi, että se kumoaa konsentraatioeron aiheuttaman virtauksen tai 2) kun konsentraatioero tasoittuu. Lievästi hypotonisissa liuoksissa punasolut turpoavat. Laimeammissa liuoksissa vettä tunkeutuu soluun kuitenkin niin paljon, että sen membraani rikkoutuu ja hemoglobiini vapautuu liuokseen. Tätä ilmiötä kutsutaan hemolyysiksi. Punasolun osmoottinen kestävyys riippuu solukalvon ominaisuuksista ja solun muodos- ta. Jos solukalvon juoksevuus (fluiditeetti) on suuri, se voi paremmin kestää turpoamista. Jos solukalvon kationiläpäisevyys lisääntyy, voi solu hypotonisessa liuoksessa vapauttaa ioneja (lähinnä K + ja Cl - ), jolloin solun osmoottinen väkevyys laskee ja solu kestää paremmin laimeita liuoksia. Nisäkkäistä kamelin punasoluilla, jotka ovat ellipsoidin muotoisia, on paras osmoottinen kestävyys. Myös lintujen punasolut ovat muodoltaan ellipsoideja ja niiden osmoottinen kestävyys on yleensä parempi kuin nisäkkäillä (taulukko 1). Monet lääkeaineet vaikuttavat solukalvon ominaisuuksiin ja muuttavat siten solun osmoottista kestävyyttä. Taulukko 1. Punasolujen hemolyysin C 50 -arvoja eri lajeilla. Laji g NaCl/100ml lammas... 0.52 sika... 0.46 nauta... 0.44 kyyhky... 0.43 viiriäinen... 0.39 kana... 0.27 kameli... <0.20 3
Työn tarkoitus Työssä tutkitaan hypo-osmoottisten liuosten aiheuttamaa hemolyysiä eri lajien (esim. kyyhky, rotta) punasoluissa. Punasoluja inkuboidaan eri NaCl-konsentraatioissa. Sentrifugoinnin jälkeen eheät solut (ja solujätteet) saostuvat, mutta vapautunut hemoglobiini jää supernatanttiin. Supernatantin värin intensiteetti ilmaisee siten hemolyysiasteen. Tarvikkeet ja liuokset Hauderavistelija, spektrofotometri, sentrifugi, sentrifugiputkia. Hepariini, NaCl. Tuoretta verta. Suoritus 1. Valmistetaan mittapulloihin 100 ml kutakin seuraavista NaCl-liuoksista: 0.300, 0.310, 0.320,...,0.500 g/100 ml (yht. 21 liuosta). Lisäksi tarvitaan 500 ml 0.9% NaCl-liuosta (voidaan käyttää myös linnun punasoluille). 2. Jokaista tutkittavaa lajia varten pipetoidaan 3 ml kaikkia NaCl-liuoksia 10 ml sentrifugiputkiin (varmista, että putket ovat samaa sarjaa, ettei sentrifugoinnissa synny epätasapainoa!). Kustakin suolaväkevyydestä valmistetaan 3 rinnakkaisnäytettä. Putket temperoidaan 5 minuuttia 37 C:ssa. Vertailuputkeen pipetoidaan tislattua vettä (100% hemolyysi, maksimaalinen väri-intensiteetti). 3. Jokaiseen putkeen lisätään mäntäpipetillä tarkasti 100 µl (nisäkkäiltä 50 µl) heparinisoitua, hyvin hapetettua verta, joka on laimennettu 1:1 0.9% NaCl:lla. Inkuboidaan hauderavistelijassa n. 1 tunti. 4. Inkuboinnin jälkeen kuhunkin putkeen (ei nisäkkäiden verta sisältäviin) lisätään 3 ml 0.9% NaCl-liuosta (estää vapautuneen hemoglobiinin uudelleensitoutumisen) ja ravistellaan hetki. Putkia sentrifugoidaan 10 min 2000xg (=3000-3200 rpm tyypillisillä pöytäsentrifugeilla, joiden roottorin säde on 20-17 cm). 5. Supernatantin absorbanssi mitataan aallonpituudella 540 nm. Kustakin väkevyydestä valitaan kolmen rinnakkaisnäytteen keskiarvo tai mediaani lopulliseksi mitta-arvoksi. 120 110 100 90 80 Hemolyysi % 70 60 50 40 30 20 10 0 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 NaCl (g/100 ml) Kuva 1. Esimerkki viiriäisen punasolujen hemolyysistä. C 50 on noin 0.36 g NaCl/100 ml. 4
Tulosten tarkastelu Piirretään kaavio (esimerkki kuvassa 1), jossa hemolyysiaste (=100 [tutkittavan putken absorbanssi/vedessä täysin hemolysoidun näytteen absorbanssi]) esitetään NaCl-väkevyyden funktiona. Määritetään kullekin lajille C 50 eli suolaväkevyys, jossa hemolyysiaste on 50%. Pohditaan punasolujen ominaisuuksien vaikutusta mahdollisiin eroihin. Miksi saatu käyrä on sigmoidinen? Miten käyrästä voidaan approksimoida solujen hemolyysipisteen keskiarvo ja keskihajonta (s)? Verrataan tuloksia taulukkoon 1, jossa esitetään eräitä kirjallisuudesta saatuja C 50 -arvoja. Kirjallisuutta Antikainen, P.J. 1981: Biotieteiden fysikaalista kemiaa (s. 59-61). -WSOY, Helsinki. Eckert, R., Randall, D. & Augustine, G. 1988: Animal Physiology. - Freeman, New York, 3. painos, s. 74-75. Good, W. 1971: Haemolysis experiments on erythrocytes. - Experiments in Physiology and Biochemistry 4:163-181. Viscor, G. & Palomeque, J. 1982: Method for determining the osmotic fragility curves of erythrocytes in birds. - Laboratory Animals 16:48-50. Liite: Mittauspöyäkirja absorbanssien kirjaamista varten. a b s o r b a n s s i NaCl (g/100 ml) N1 N2 N3 mediaani vesi 0.30 0.31 0.32 0.33 0.34 0.35 0.36 0.37 0.38 0.39 0.40 0.41 0.42 0.43 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.49 0.50 5
Muistiinpanoja 6
LÄMPÖTILAN VAIKUTUS SAMMAKON HERMON JOHTONOPEUTEEN Johdanto Lämpötilan vaikutusta kemiallisiin reaktioihin voidaan kuvata ns. Q 10 -approksimaatiolla, jolla tarkoitetaan reaktionopeuden (oikeammin nopeusvakion) muutoskerrointa lämpötilan noustessa 10 C. t t 10 1 2 10 1 2 Q = ( K K ) missä K 1, K 2 = reaktionopeudet lämpötiloissa 1 ja 2 t 1, t 2 = vastaavat lämpötilat. Jos kokeessa käytetty lämpötilaväli on tasan 10 C, pelkistyy yhtälö muotoon Q 10 = K 1 /K 2 Koska Q 10 ei ole vakio kaikilla lämpötila-alueilla, on käytetty mittausalue aina mainittava. Monien aineenvaihduntareaktioiden Q 10 on 2-2.5, kun taas eräiden membraanitason reaktioiden Q 10 vaihtelee välillä 1-2. Molekyylien kineettinen energia on suoraan verrannollinen absoluuttiseen lämpötilaan. Jos lämpötila siis nousee +20 C:sta +30 C:een, lisääntyy molekyylien kineettinen energia vain (273+30)/(273+20) = 1.034-kertaiseksi. Kuitenkin reaktionopeus voi jopa kaksinkertaistua. Arrhenius havaitsi kokeellisesti tämän vuosisadan alussa, ettei reaktionopeus riipukaan ainoastaan molekyylien kineettisestä energiasta vaan siitä, kuinka suuri osa molekyylien välisistä törmäyksistä ylittää energialtaan tietyn aktivaatiokynnyksen E a (kuva 1). E a Molekyylien lukumäärä T 1 T 2 A 1 A 2 Energia Kuva 1. Molekyylien kineettisen energian jakautuminen kahdessa eri lämpötilassa (T 1 ja T 2 ) suhteessa aktivaatioenergiaan (Ea). Aktiovaatioenergian ylittävien molekyylien osuus kasvaa moninkertaiseksi (A 1 <<A 2 ), vaikka lämpötilan suhteellinen nousu on pieni. 7
Työssä tutkitaan sammakon lonkkahermon (n. ischiadicus) johtonopeutta eri lämpötiloissa. Hermo preparoidaan irti (ks. peruskurssi) ja asetetaan elektrodikammioon, jonka lämpötilaa voidaan säätää. Hermo peitetään parafiiniöljyllä ja kammioon asetetaan lämpötila-anturi, jossa on digitaalinen näyttö tai jonka ulostulo voidaan rekisteröidä piirturille. (Jos mahdollista, hermon elektrodeihin koskettavat osat peitetään vaseliini-parafiiniöljyseoksella ja muut osat Ringerillä). Kytketään stimulaattori, etuvahvistin ja oskilloskooppi. Stimulointiin käytetään 0.1 ms supramaksimaalisia ärsykkeitä 50-100 Hz taajuudella. Säädetään vahvistin ja oskilloskooppi siten, että stimulusartefakti ja summapotentiaalin huippu ovat selkeästi nähtävissä. Mittaamalla stimulaatiokatodin ja ensimmäisen rekisteröivän elektrodin välimatka kammiossa sekä aktiopulssin kulkuaika oskilloskoopin kuvaputkelta lasketaan johtonopeus. Hermon mahdollisesta roikkumisesta johtuva epätarkkuus välimatkan mittauksessa ei vaikuta Q 10 eikä E a -arvoihin. Nämä voitaisiin laskea myös suoraan kulkuajan käänteisarvoista vaikka välimatka olisi tuntematon. Mikäli sum- Arrheniuksen havaintoja kuvaa yhtälö: k A e E a = RT missä k = reaktion nopeusvakio (s -1 ) R = yleinen kaasuvakio 8.314 J/mol/ K T = absoluuttinen lämpötila ( K) A = vakio Termi e -E a /RT (=<1) on kerroin, joka ilmaisee E a :n ylittäneiden molekyylien suhteellisen osuuden. Arrheniuksen yhtälö voidaan esittää myös muodossa: lnk = lna - E a /R 1/T Kun siis lnk esitetään 1/T:n funktiona, saadaan kuvaajaksi suora, jos tutkittavan reaktion luonne ei muutu käytetyllä lämpötilavälillä. Suoran kulmakerroin on -E a /R, joten E a = -(kulmakerroin 8.314) J/mol E a voidaan laskea myös suoraan kahden mittauspisteen avulla (joiden täytyy noudattaa Arrheniuksen periaatetta, so. sijaita samalla suoralla vähintään 1 muun pisteen kanssa) seuraavasti E a = [(RT 1 T 2 )/(T 2 -T 1 )] ln(k 2 /k 1 ) jossa T 1 ja T 2 ovat koelämpötilat ( K) sekä k 1 ja k 2 vastaavat nopeusparametrit. Tarvikkeet ja liuokset Pumpulla ja jäähdyttimellä varustettu vesihaude, hermokammio elektrodeineen, stimulaattori, stimulus-isolaaattori, AC-etuvahvistin, oskilloskooppi, kaapeleita BNC- ja banaaniliittimin, digitaalinen lämpömittari. Sammakko-Ringer, parafiiniöljyä, puhdistettua vaseliinia. Suoritus 8
Kuva 1. Sammakon lonkkahermon johtumisnopeuden Arrhenius-kuvaaja. Saadussa kuvaajassa on taitekohta, joten reaktiolla on eri aktivaatioenergia tämän lämpötilan eri puolilla. Kuvaan on merkitty aktivaatioenergia taitekohtaa alemmissa lämpötiloissa. mapotentiaalilla on useita huippuja, lasketaan johtumisnopeus kullekin. Jos käytetään tavallista sammakkoa (Rana temporaria), suoritetaan mittaus n. 5 C välein esim. seuraavissa lämpötiloissa: +30, +25, +20, +15, +10, +5 C. Kynsisammakolle sopiva lämpötila-alue on 17-32 C ja lämpötilaväli 2-3 C. Tulosten tarkastelu Piirretään johtonopeus (v) lämpötilan funktiona ja lasketaan Q 10 kullekin lämpötilavälille ja myös äärilämpötilojen erotukselle. Piirretään Arrheniuksen kuvaaja, jossa y-akselina on lnv ja x-akselina 1/ K ja todetaan onko tutkittavan reaktion luonne pysynyt samana kokeen aikana (so. onko kuvaaja suora). Määritetään suoralta aktivaatioenergia(t) joko graafisesti tai yhtälön (2) avulla. Paljonko johtonopeus kasvaa yhtä astetta kohti eri Q 10 -arvoilla? Kirjallisuutta Cossins, AR & Bowler, K. 1987: Temperature biology of animals. - Chapman and Hall, London, s. 23-60 Harper, A.A., Watt, P.W., Hancock, N.A. & MacDonald, A.G. 1990: Temperature acclimation effects on carp nerve: A comparison of nerve conduction, membrane fluidity and lipid composition. - Journal of Experimental Biology 154:305-320. Prosser, C.L. 1973: Comparative animal physiology. - W.B. Saunders, Philadelphia, s. 362-428. 9
Muistiinpanoja 10
KALSIUMIN MERKITYS LIHASSUPISTUKSESSA Johdanto Poikkijuovaisen lihassolun supistuksessa voidaan erottaa seuraavat vaiheet: - liikehermon aktiopotentiaali - asetyylikoliinin vapautuminen päätelevystä - päätelevypotentiaali lihassolun aktiopotentiaali - depolarisaation leviäminen T-järjestelmää pitkin - T-putkiston jänniteherkät proteiinit ovat suoraan kytkeytyneet sarkoplasmaattisen kalvoston Ca 2+ -kanaviin (ns. ryanodiini-reseptori), jotka aukeavat - kalsium-ionien vapautuminen sarkoplasmaattisen kalvoston rakkuloista - kalsiumin diffuusio (n. 0.5 µm) ja sitoutuminen tropomyosiiniin, joka irtoaa aktiinista ja mahdollistaa sen sitoutumisen myosiiniin - kontraktiilisten proteiinien reaktio, joka johtaa lihassolun supistukseen - kalsium-ionien aktiivinen takaisinotto rakkuloihin (Ca 2+ -ATPaasi) lihassolun relaksaatio. Kalsium-ionit toimivat siis solun sisäisenä välittäjänä. Kalsiumin läsnäolo sarkoplasmassa liipaisee supistumistapahtuman ja kalsiumin aktiviinen takaisinpumppaus lopettaa supistuksen. Kalsiumpitoisuuden muutoksia lihassolun supistuksen aikana voidaan tutkia injisoimalla soluihin proteiineja (esim. aequorin), jotka fluorisoivat kalsiumin läsnäollessa. Tässä työssä tutkitaan ärsytys-supistus -kytkentää käyttämällä lääkeaineita, jotka vaikuttavat kalsiumin vapautumiseen sarkoplasmaattisesta kalvostosta. Kafeiini (1,5,7-trimetyyylikasantiini) aiheuttaa kalvorakkuloiden hajoamisen ja kalsiumin pysyvän vapautumisen sarkoplasmaan, mikä johtaa lihaksen hitaaseen, pitkäkestoiseen supistumiseen (ns. contracture). Prokaiini taas on membraanistabilisaattori (puudute), joka vähentää kafeiinin vaikutusta. Kafeiinin tilalla voidaan käyttää 4- kloro-m-kresolia, joka avaa spesifisesti kalsiumkanavia. Tarvikkeet ja liuokset O Grass FTO3C-voima-anturi vahvistimineen, piirturi tai mittaustietokone, 2 statiivia, kalibrointipunnukset. 5-10 mm kafeiini sammakko-ringerissä sekä sama liuos, jossa mukana 1 mg/ml prokaiinia. H 3 C O C N C N H3C C C N CH 2 N Kafeiini CH3 Suoritus 1) Preparoidaan irti sammakon m. gastrocnemius (ks. kuva) ja kiinnitetään se toisesta päästään (akillesjänne) mittauskammion pohjassa olevaan metallikoukkuun ja toisesta päästään Grass FTO3C voima-anturiin siten, että lihasta voidaan samalla ärsyttää sähköisesti. Kammio täytetään sammakko-ringerillä. 2) Kalibroidaan voima-anturi punnuksen avulla (100 g = 0.98 N). 3) Mitataan yksittäisen lihasnykäyksen maksimaalinen voima (twitch tension) käyttämällä 1 ms:n supramaksimaalista ärsykettä. Mitataan samoilla arvoilla tetanusvoima käyttäen n. 50 Hz:n ärsytystaajuutta. Mittaustietokoneen näytetaajuus sovitetaan lihasnykäyksen kestoon. 4) Rekisteröidään perusviivaa (lihas Ringer-liuoksessa) n. 2 minuutin ajan. 5) Imetään Ringer-liuos pois ja täytetään kammio nopeasti 10 mm kafeiinilla (valmistettu Ringe- 11
riin). Seurataan lihasvoiman kehitystä n. 15 min rekisteröimällä voima-anturin ulostulo piirturille. Kafeiini hajottaa sarkoplasmaattisen kalvoston vesikkeleitä ja aiheuttaa siten hitaasti kehittyvän lihassupistuksen l. kontraktion. Mitataan tämän kontraktion voimakkuus sekä absoluuttisesti että prosentteina lihasnykäyksen ja tetanuksen voimasta. 6) Vaihdetaan tilalle toisen raajan m. gastrocnemius ja toistetaan kohdat 3, 4 ja 5 siten, että yhdessä kafeiinin kanssa lisätään prokaiinia (1 mg/ml). Prokaiini toimii membraanistabilisaattorina (puudute) ja estää siten kafeiinin hajottavan vaikutuksen. 7) Otetaan toinen sammakko ja preparoidaan kummankin takaraajan m. sartorius ja m. gastrocnemius. Toisen raajan lihakset asetetaan petrimaljaan, jossa on sammakko-ringeriä ja toisen raajan lihakset 10 mm kafeiiniliuokseen. Mitataan n. 15 min kuluttua kafeiinilla käsiteltyjen lihasten pituus suhteessa kontrolleihin (Ringer-liuos). CH 3 CH 3 H 2C CH 2 N CH 2 CH 2 OH C O NH 2 Prokaiini Havainnot Voima (N tai "g") 1. Maks. lihasnykäys 2. Tetanus 3. Kafeiinikontraktio 4. Kafeiini + prokaiini 5. Kafeiinikontraktio/lihasnykäys (%) 6. Kafeiinikontraktio/tetanus (%) 7. Kafeiini+prokaiini/lihasnykäys (%) 8. Kafeiini+prokaiini/tetanus (%) KOE1 KOE2 9. Pituudet: Kafeiini Ringer sartorius gastrocnemius Kirjallisuutta Alberts, B. et al. 1994: Molecular biology of the cell. - 3. painos, Garland, New York, s. 847-858. Isaacson, A. 1981: Contracture of skeletal muscle by caffeine - probe for calcium action. - Physiologist 24:37-38. Prosser, C.L. 1973: Comparative animal physiology. - W.B.Saunders, Philadelphia, s. 719-788. 12
Muistiinpanoja 13
Muistiinpanoja 14
LÄMMÖNSÄÄTELY KYLMÄSSÄ Johdanto Tasalämpöiset eläimet pitävät ruumiinlämpötilan vakaana ympäristön lämpötilan vaihteluista huolimatta. Kylmässä tämä tapahtuu lämmönhukkaa vähentämällä ja lämmöntuottoa lisäämällä. Tärkeimmät lämmönhukkaa vähentävät mekanismit ovat 1. pintaverenkierron vähentäminen (perifeerinen vasokonstriktio), joka ilmenee iholämpötilan alenemisena, 2. karvojen ja höyhenten pörhistäminen (pilo- ja ptiloerektio) ja 3. ruumiin ulkopinta-alan vähentäminen asentoa muuttamalla. Lämmönhukan vähentäminen riittää, jos kylmäaltistus on lievä, mutta lämpötilan edelleen laskiessa tarvitaan myös lämmöntuoton lisäämistä. Se lämpötila, jossa lämmöntuoton nousu alkaa, on ns. alempi kriittinen lämpötila. Nisäkkäillä ja linnuilla on kaksi järjestelmää lämmönsäätelyyn liittyvää (siis ympäristölämpötilan mukaan vaihtelevaa) lämmöntuottoa varten: lihasvärinä ja ruskean rasvan lämmöntuotto. Lihasvärinää tavataan sekä linnuilla että nisäkkäillä, mutta ruskean rasvan lämmöntuottoa (ns. nonshivering thermogenesis, NST) tavataan vain nisäkkäillä. Erityisen hyvin NST tunnetaan vastasyntyneillä nisäkkäillä ja aikuisilla, kylmäänsopeutuneilla jyrsijöillä. Lihasvärinässä lämmöntuotto tapahtuu samalla tavoin kuin normaalissakin poikkijuovaisen lihastyössä. Koska lihas ei lihasvärinässä tee ulkoista työtä, vapautuu normaalisti mekaaniseen työhön kuluva energiakin lämpönä. Lihasvärinä muistuttaa siten pitkäkestoista, submaksimaalista lihasjännitystä. Ruskean rasvan lämmöntuotto on erikoismekanismi, jossa mitokondrioiden sisäkalvon yli vallitseva normaali protonigradientti purkautuu kemiallisen oikosulun kautta, jolloin ATP:tä ei synny ja kaikki energia vapautuu lämpönä. Oikosulun aiheuttaa erityinen proteiini (ns. termogeniini l. uncoupling protein, UCP), joka ekspressoituu yksinomaan ruskeissa rasvasoluissa. UCP:n ekspressio ja toiminta on paljolti sympaattisen hermoston säätelemä. Lämmöntuoton mittaus perustuu yleensä ns. epäsuoraan kalorimetriaan. Kaikki hapetusreaktiot ovat linnuilla ja nisäkkäillä viime kädessä aerobisia, mikä näkyy eläimen hapenkulutuksena. Kun lämmöntuotto lisääntyy, kasvaa myös hapenkulutus. Tekemällä tiettyjä oletuksia eläimen RQ:sta (tai mittaamalla hiilidioksidin tuotto) voidaan hapenkulutuksen perusteella laskea energiankulutus hyvinkin tarkasti. Työn tarkoitus Työssä tutkitaan kyyhkyn lämmönsäätelyä kylmässä. Lämmönhukan (pintaverenkierron) vähenemistä kuvaa koiven ihon höyhenettömän osan lämpötila. Lämmöntuottoa seurataan rekisteröimällä lihaksen sähköistä aktiivisuutta (elektromyogrammina, EMG) rintalihaksesta, ja lihasvärinän aiheuttamaa lämmöntuottoa mitataan hapenkulutuksen avulla. Lihasvärinää seurataan oskilloskoopista ja sen voimakkuutta mitataan EMG-integraattorilla, joka muodostaa eräänalaisen liukuvan keskiarvon lihaksen summapotetiaalien amplitudista. Vaihtoehtoisesti voidaan mittaustietokoneen avulla rekisteröidä EMG:n rms-arvoa, joka vastaa amplitudin keskihajontaa. Lämpötilaa portaittain alentamalla seurataan molempia muuttujia ja arvioidaan ns. alempi kriittinen lämpötila, jossa lämmöntuotto alkaa kohota. Ruumiin syvälämpötilan vakautta seurataan mittaamalla paksusuolen lämpötilaa. 15
Tarvikkeet ja kemikaalit Aineenvaihduntakammio, ilmapumppu, massavirtausmittari, natronkalkki- ja silikageelipatruunoita, happianalysaattori, kupari-konstantaanitermoelementtejä, lämpötilapiirturi, EMGelektrodi, AC-vahvistin, oskilloskooppi, EMG-integraattori (mittaustietokone), piirturi. Suoritus 1) Vuorokauden paastonnut lintu punnitaan, koiven iholle kiinnitetään ohut lämpötila-anturi (kupari-konstantaani termoelementti), paksusuoleen asetetaan samanlainen anturi viemärisuolen kautta, ja rintalihakseen kiinnitetään EMG-elektrodi. Lintu siirretään mittauskammioon, joka suljetaan tiiviisti. 2) Kammioon ajetaan hiilidioksiditonta (natronkalkki) ja kuivattua (silikageeli) ilmaa vakionopeudella (n. 2 l/min). Virtausnopeus mitataan ennen kammiota massavirtausmittarilla. 3) Kammiosta ulostulevasta ilmasta poistetaan hiilidioksidi ja se kuivataan, minkä jälkeen siitä ohjataan erillinen näytevirta (n. 250 ml/min) analysaattoriin (paramagneettinen tai elektrokemiallinen, ks. kurssi: Laboratoriotekniikka ja laitetuntemus). EMG-elektrodi kytketään AC-vahvistimeen ja vahvistettu EMG johdetaan oskilloskooppiin ja integraattorille. Integraattorin ulostulo kytketään piirturiin. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää mittaustietokonetta rms-arvon laskemiseksi. 4) Ympäristön lämpötila säädetään n. 25 C:een. Noin puolen tunnin kuluttua merkitään muistiin ulostulevan ilman happipitoisuus ja lämpötilat (ympäristö, kloaakki, jalan iho) ja integroidun EMG:n arvo (µv). Toistetaan mittaus esim. 20, 15, 10 ja 0 C:ssa. Kussakin lämpötilassa tarvitaan n. puolen tunnin stabiloitumisaika. 5) Lasketaan hapenkulutus eri lämpötiloissa seuraavasti (kaava johdetaan kurssilla): FiO2 FoO2 1 V O2( ml /min/ kg) = F 1 Fo O2 M VO 2 = hapenkulutus ml/min/kg F = kammioon menevän ilman virtausnopeus (ml/min, massavirtausmittarin antaa NTP-tilavuuden) F i O 2 = kuivan hiilidioksidittoman ulkoilman happiosamäärä = 0.20953 F o O 2 = kammiosta ulostulevan kaasun happiosamäärä (ks. edellä). M = eläimen massa (kg) 6) Lasketaan hapenkulutuksesta (ml/min/kg, NTP) eläimen lämmöntuotto (W/kg) olettaen RQ-arvoksi 0.8 (vrt. paasto): lämmöntuotto (W/kg) = (0.266 + 0.086 RQ) VO 2 (ml/min/kg) 7) Piirretään kuvaajat, joissa esitetään syvälämpötila, jalan ihon lämpötila, integroitu EMG ja lämmöntuotto ympäristölämpötilan funktiona. Kirjallisuutta Hill, R.W. 1972. Determination of oxygen consumption by use of the paramagnetic oxygen analyzer. - Journal of Applied Physiology 33, 261-263. Hohtola, E. 1980: Thermal and electromyographic correlates of shivering thermogenesis in the pigeon. - Comparative Biochemistry and Physiology 73A:159-166. Kleiber, M., 1961. The fire of life. - John Wiley, New York. McLean, J.A. & Tobin, G. 1990:Animal and human calorimetry. Cambridge Un iversity Press, Cambridge. 16
Muistiinpanoja 17
Muistiinpanoja 18
LÄMMÖNSÄÄTELY: LÄÄHÄTYS LÄMMÖPOISTOKEINONA Johdanto Homeotermian edellytyksenä on, että eläin pystyy tuottamaan riittävästi lämpöä, ja että lämmöntuotto ja lämmönpoisto ovat yhtä suuret. Lämpöä voidaan poistaa konduktion, konvektion, säteilyn, ja (veden) haihtumisen (evaporaatio) avulla. Ympäristön lämpötilan noustessa lämmönpoistoa on lisättävä. Nousun jatkuessa evaporaatioon perustuvan lämmönpoiston merkitys lisääntyy ja ruumiinlämpötilaa korkeammissa ympäristönlämpötiloissa evaporaatio on ainoa lämmönpoistokeino. Ympäristönlämpötilan noustessa 40 asteeseen jo 78 % kyyhkyn lämmönpoistosta tapahtuu evaporaation kautta. Koska linnuilta puuttuvat hikirauhaset, hengitysteiden kautta tapahtuvan lämmönpoiston merkitys korostuu. Evaporaatio kasvaa, kun hengitys muuttuu matalataajuisesta (nokka kiinni) korkeataajuiseksi (panting, läähätys, Kuva 1). Hyvin korkeassa Kuva 1. Läähätys. lämpötilassa lintu voi vielä lisätä evaporaatiota hengitysteiden yläosan nopeiden lihasliikkeiden avulla (gular flutter, kurkunleyhytys ). Läähätys on pinnallista hengistystä, joka lisää ilmanvaihtoa lähinnä hengistysteiden yläosissa (ns. dead space), jolloin hiilidioksidin liiallisen poistumisen eli hypokapnian ja sitä seuraavan alkaloosin riski on pienenpi. Uusimpien tutkimusten mukaan eräillä lajeilla, esim. kyyhkyllä, voi myös ihon kautta tapahuva evaporaatio olla merkittävä lämmönpoistotie. Kyyhkyllä läähätyksen avulla tapahtuvaa lämmönpoistoa tehostaa verenkierron lisääntyminen kaulan alueen verisuonipleksuksessa. Erittäin korkeissa lämpötiloissa evaporaation kautta on hukattava yli 100 % peruslämmöntuotosta, sillä läähätyksen vaatima lihastyö lisää sekin osaltaan lämmöntuottoa. Kyyhkyn normaali hengîtystaajuus on n. 0.5 Hz, mutta voi läähätyksessä olla jopa 650 Hz. Kurkunlehyhytys voi lisäksi tehostaa lämmönpoistoa. Esimerkki evaporaation lisääntymisestä ympäristönlämpötilan noustessa kyyhkyllä ja peltopyyllä. 19
Suoritus 1. Kyyhky (paastonnut 1 vrk) punnitaan, ja sen ihon alle kiinnitetään hengitystaajuuden rekisteröimiseksi neulaelektrodit tai pietsosählöinen anturi. Vaihtoehtoisesti läähätystä voidaan seurata visuaalisesti. 2. Asetetaan lintu metaboliakammioon, jonka lämpötila on säädetty n. 20 C:een. Kytketään mittauselektrodien kaapeli EMG-mittalaitteiston vahvistinyksikköön ja tämä suotimeen. Suotimen alarajataajuudeksi asetetaan 0.5 Hz ja ylärajataajuudeksi 30 Hz. Johdetaan kammioon kuivaa ilmaa (silikageelin läpi). 3. Linnun rauhoituttua rekisteröidään a) hengitystaajuus (hengitysliikettä/min) ja b) mitataan 30 min aikana haihdutetun veden määrä (ohjataan ulostuloilma silikageelilla täytetyn U-putken läpi; punnitus ennen ja jälkeen). 4. Säädetään kammion lämpötila 40 C:een ja menetellään kuten kohdassa 3. 5. Mikä on hengitystaajuus a) 25 C:ssa, b) 40 C:ssa? Paljonko lämpöä (W/kg) poistuu evaporaatiossa a) 25 C:ssa ja b) 40 C:ssa kun tiedetään, että veden höyrystymislämpö on 2428 J/g? Kyyhkyn lepoaineenvaihdunta on on n. 5W/kg. Kuinka suuri evaporaationopeus tarvitaan, jotta koko perusaineenvaihdunnan tuottama lämpö voidaan poistaa sen avulla? Kirjallisuutta Dawson, W.R., 1982. Evaporative losses of water by birds. - Comparative Biochemistry and Physiology 71A:495-509. Ehlers, R. & Morton, M.L., 1982. Metabolic rate and evaporative water loss in the least seed-snipe, Thinocorus rumicivorus. - Comparative Biochemistry and Physiology 73A:233-235. Peltonen, L. 1998: Physiological and morphological aspects of cutaneous water evaporation in the rock pigeon (Columbia livia) in a hot and dry environment. - Acta Universitatis Ouluensis. Series A, Scientiae rerum naturalium A310:1-55 Richards, S.A., 1970. The biology and comparative physiology of panting. - Biological Reviews 45, 223-264. Weathers, W.W., 1972. Thermal panting in domestic pigeons, Columba livia, and the barn owl, Tyto alba. - Journal of Comparative Physiology B 79:79-84. 20
Muistiinpanoja 21
Muistiinpanoja 22
UNI-VALVETILA JA EEG Tasalämpöisten eläinten valvetilojen vaihtelussa erotetaan 3 eri tasoa: valvetila (W), hidasaaltoinen uni (SWS) ja nopea-aaltoinen eli paradoksinen uni (PS). Nisäkkäillä SWS voidaan jakaa useampaan eri asteeseen ja PS-unesta käytetään myös nimitystä REM-uni (rapid eye movement). Linnuilla voidaan erottaa myös ns. drowsy tai transitional state ( torkkuminen ). Unitila voidaan päätellä eläimen käyttäytymisestä, mutta varmin ja objektiivisin indikaattori on aivosähkökäyrä (elektroenkefalogrammi, EEG), joka voidaan rekisteröidä suoraan isojenaivojen kuorelta tai päänahalta. Jänniteheilahdusten frekvenssi ja amplitudi vaihtelevat tajunnan eri asteissa ja eri osissa aivoja. EEG-aaltoja esiintyy selkärankaisilla eläimillä aina kaloista ihmiseen joten kehittynyt aivokuori ei ole välttämätön niiden syntymiselle. Valvetilassa EEG:n frekvenssi on suuri ja amplitudi pieni, EEG:n sanotaan olevan aktivoitunut tai desynkronoitunut (kuva 1). SWS:ssa EEG synkronoituu jolloin amplitudit kasvavat ja jänniteheilahdusten frekvenssi pienenee. PS:ssa aivosähkökäyrä muistuttaa valveilla olevan eläimen EEG:tä. Kuitenkin uni on ilmeisen syvää päätellen mm. kohonneesta ärsytyskynnyksestä ja heikentyneestä lihastonuksesta (Hyvärinen et al., 1977). Vaihtolämpöisistä eläimistä sammakoilla EEG-muutokset ovat päinvastaisia kuin nisäkkäillä ja linnuilla: valveillaollessa EEG on hidasta ja suuriamplitudista ja horroksessa pieniamplitudista ja suuritaajuista. Matelijoiden inaktiivisuuden aikana niiden EEG-frekvenssi puolestaan laskee mutta amplitudi ei kasva (Monnier et al., 1980). Varsinaisissa unitutkimuksissa unitilojen jakauma kuvataan hypnogrammina (Kuva 1), jossa eri esitetään eri unitilojen osuus vuorokauden kokonaisajasta. Tässä työssä käytetään kyyhkyä, jonka uni-valvetilan vaihteluja tutkitaan kurssiajan puitteissa sekä käyttäytymistä seuraamalla että EEG-rekisteröinnein. Kyyhkyn hypnogrammi.w = walvetila, TS = torkkuminen, SWS = hidasaaltoinen uni, PS = paradoksinen uni. Tb = ruuminlämpötila. A = kontrollikyyhky, B = paastonnut kyyhky (Rashotte et al. 1998). 23
Eri univaiheiden tunnusmerkit ovat seuraavat (Ks. myös kuva 2): Käyttäytyminen W - silmät auki - seisoo kaula ojentuneena SWS - silmät kiinni tai räpyttelee - kyyhöttää - höyhenet pörhistyvät - kesto yleensä useita minuutteja EEG - matala amplitudi - nopeat heilahdukset (so. suuri taajuus, n. 20 Hz) - amplitudi kasvaa - taajuus laskee (n. 10 Hz) PS - silmät kiinni - pää roikkuu - kesto vain 1-15 s - kuten W! Suoritus EEG-rekisteröintejä varten kyyhkyn aivokuoreen (hyperstriatum) asetetaan kolme elektrodia.tätä varten kyyhky nukutetaan (ketamiini/ksylatsiini 30/30 mg/kg). Kyyhkyn pääalen höyhenet leikataan ja lintu kiinnitetään steotaksiseen laitteseen (Kopf). Tehdään n. 2 cm:n ihoviilto päälaen keskiviivan suuntaisesti, jolloin aivojen ääriviivat voidaan nähädä kallon läpi. Merkitään elektrodien paikat kalloon ja puhdistetaan kiinityasalue kalvoista. Elektrodien keskelle kiinnitetään pienoisruuvi, jonka kanta jää n. 2 mm kallon pinnan yläpuolelle, ja elektrodit painetaan luuhun juuri ja juuri kallon läpi. Kiinnitys tapahtuu luusementillä (Palacos, Schering), jolla ympäröidään elektrodien tyviosat ja ankkurina toimivan ruuvin kanta. Tarvittaessa ihoviillon reunaat suljetaan ompeleilla. Kyyhkyn anetaan toipua operaatiosta noin viikon ajan ennen mittauksia. Mittauksessa kyyhky asetetaan häkkiin, joka on sijoitettu rauhalliseen paikkaan, esim. kylmähuoneeseen. Yleensä noin puolen tunnin kuluttua lintu alkaa torkkua ja nukahtaa (sensorinen deprivaatio!). Käyttäytymistä tarkkaillaan videomonitorin kautta. Mittausta varten EEG-elektrodeihin kiinnitetään liittimen avulla kaapeli, joka tuetaan siten, ettei se liiaksi kuormita lintua. Kaapeli kytketään vahvistimeen (vahvistus n. 4000-kertainen), jonka taajuusalue on 0.5-70 Hz. Ulostulo johdetaan polygrafille tai mittaustietokoneelle.tutkitaan seuraavat seikat: käyttäytymisen perusteella havaitut valvetilan muutokset ja niiden korrelaatio EEG-muutoksiin linnun ulkonäkö eri unitiloissa EEG:n maksimiamplitudi ja keskimääräinen taajuus (spektri) eri unitiloissa ulkopuolisen herätyksen vaikutus. 24