Opinnäytetyö ORTOTOOPPINEN, SYNGEENINEN 5TGM1 MULTIPPELI MYELOOMA HIIRIMALLI. PILOTTITUTKIMUS Salla Talvitie Bioanalytiikka 2009
TURUN AMMATTIKORKEAKOULU Koulutusohjelma: Bioanalytiikka TIIVISTELMÄ Tekijä: Salla Talvitie Työn nimi: Ortotooppinen, syngeeninen 5TGM1 multippeli myelooma hiirimalli. Pilottitutkimus Suuntautumisvaihtoehto: Solu- ja Ohjaajat Mika Venojärvi, molekyylibiologia Mari Suominen Opinnäytetyön valmistumisajankohta: Sivumäärä: 83 + 5 Kevät 2009 Multippeli myelooma on syöpä, jossa B-solulinjaan kuuluva plasmasoluklooni lisääntyy luuytimessä. Kyseessä on vakava sairaus, johon ei ole olemassa parantavaa hoitoa. Tämä tauti kattaa noin prosentin kaikista syövistä. Taudille on keskeistä luun mikroympäristön muutokset, jonka seurauksena potilaille kehittyy lyyttisiä luustomuutoksia. Muutokset luuytimessä vaikuttavat myös muihin taudille tyypillisiin oireisiin kuten erilaisiin sytopenioihin ja hyperkalsemiaan. Tutkimuksen tarkoituksena oli testata julkaisuihin perustuvaa hiirimallia ja tutkia, toimiiko tämä hiirimalli samalla tavalla kuin aikaisemmissa julkaisuissa on kuvattu. Tutkimuksessa käytettiin kolmea tutkimusryhmää, joista yksi oli kontrolliryhmä ja kaksi muuta ryhmää olivat hoidollisia. Hoidolliset ryhmät saivat kahdella eri annoksella bortezomib-lääkettä, jota käytetään multippelin myelooman hoitoon. Samalla selvitettiin, onko bortezomib tehokas lääke tässä eläinmallissa multippelin myelooman hoitoon ja tutkittiin, kumpi bortezomib-annos antaa paremman annosvasteen. Hiiriltä otettiin tutkimuksen aikana verinäytteet kuudesta eri aikapisteestä, joista määritettiin P1NP-, TRACP5b- ja paraproteiinipitoisuudet. Näiden parametrien avulla saatiin vastaukset tutkimusongelmiin. Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää kyseistä hiirimallia ja löytää mahdollinen verrokkilääke tuleviin tutkimuksiin sekä saada alustava käsitys siitä minkä suuruista bortezomib-annosta olisi hyvä käyttää. Tutkimustulosten perusteella havaittiin, että malli toimi kuten aikaisemmissa tutkimuksissa on todettu. Lisäksi saatiin selville, että bortezomib on tehokas lääke multippelin myelooman hoitoon ja sitä voidaan käyttää tulevissa tutkimuksissa verrokkilääkkeenä. Samalla kuitenkin huomattiin toksisuutta odottamattoman alhaisilla pitoisuuksilla, joka antaa rajoituksia lääkkeen annokseen. Siihen kumpi bortezomib-annos antaa paremman annosvasteen ei saatu luotettavaa tulosta, koska toinen hoidollinen ryhmä (ryhmä 3) supistui tutkimuksen aikana vain kahden eläimen suuruiseksi. Näin pienestä ryhmästä ei voi tehdä statistisia analyysejä, eikä näin ollen tehdä luotettavia päätelmiä. Hakusanat: Multippeli myelooma, eläinmalli, luun biokemialliset merkkiaineet Säilytyspaikka: Turun ammattikorkeakoulun kirjasto
TURKU UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES ABSTRACT Degree Programme: Biomedical Laboratory Sciences Author: Salla Talvitie Title: Orthotopic, syngeneic 5TGM1 multiple myeloma mouse model. A pilot study Specialization line: Cell- and molecular Instructor(s): Mika biology Date: Spring 2009 Venojärvi, Mari Suominen Total number of pages: 83 + 5 Multiple myeloma is a plasma-cell cancer which multiplies in bone marrow. It covers about one percent of all cancers and there is no cure for this disease. The changes of bone microenvironment are characteristic of this disease and it causes lytic bone changes, hypercalcaemia and different kinds of cytopenias. The purpose of this study was to test a mouse model which is based on the previously published studies. There were all in all three study groups on which one was the control group and the two others were treatment groups. The treatment groups got bortezomib medicine with two different doses. At the same time was studied if bortezomib is a potent treatment for multiple myeloma in this animal model and which dose gives a better dose response. Blood samples were taken from the mice at six time points. P1NP, TRACP5b and paraprotein levels were analysed from the blood samples. The conclusions of the study were made based on the blood sample results. The goal of the study was to evolve the mouse model and to find a possible reference substance for the future studies and also get a preliminary conception of how big the dose would be best. The result of the study was that the model worked as it should. It was also found out that the bortezomib is a potent treatment for the disease and it could be used in the future studies as a reference substance. It was also found out that bortezomib had a toxic effect with unexpectedly low doses. The question of which dose would give better dose response, wasn t solved, because the other treatment group (group 3) shrank during the study to two animals. Because the group was so small the statistical analyse could not be done. Therefore reliable conclusion could not be done. Keywords: Multiple myeloma, animal model, biochemical markers of bone Deposit at: The library of Turku University of Applied Sciences
SISÄLTÖ 1 JOHDANTO 7 2 MULTIPPELI MYELOOMA JA SEN TUTKIMINEN 8 2.1 Multippeli myelooma 8 2.1.1 Patogeneesi 8 2.1.2 Taudinkulku 10 2.1.3 Hoito 12 2.2 Luusto 13 2.2.1 Luun rakenne 14 2.2.2 Luun uudistuminen 16 2.3 Luun biokemialliset merkkiaineet 19 2.3.1 Luun muodostuksen merkkiaineet 20 2.3.2 Luun hajotuksen merkkiaineet 21 2.4 Eläinmalli 22 3 TUTKIMUKSEN TARKOITUS, TAVOITE JA TUTKIMUSONGELMAT 26 4 TUTKIMUKSEN TOTEUTUS 28 4.1 Toteutussuunnitelma 28 4.2 Tutkimuksen kulku 30 4.2.1 Kokeen aloitus 30 4.2.2 Punnitus 32 4.2.3 Annostelu 32 4.2.4 Verinäytteiden otto 34 4.2.5 Kokeen lopetus 35 4.2.6 Verinäytteiden analysointi 36 4.3 Metodologiset lähtökohdat 43 4.4 Eettisyyden tarkastelu 44
4.4.1 Eläinkokeen eettisyys 44 4.4.2 Tutkijan eettisyys 47 5 TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU 49 5.1 Tilastollinen testaus 49 5.2 Tulokset 51 5.3 Tutkimustuloksien tarkastelu 68 6 POHDINTA 72 6.1 Tutkimustulosten pohdinta 72 6.2 Tutkimuksen luotettavuuden pohdinta 74 6.3 Jatkotutkimusaiheet 77 LÄHTEET 78 LIITTEET LIITE 1: Sanasto LIITE 2: Toimeksiantosopimus LIITE 3: Aikataulu KUVAT Kuva 1. Pitkän luun rakenne. 15 Kuva 2. Luun osteoneja. 16 Kuva 3. Luun uudistumisen vaiheet. 18 KUVIOT Kuvio 1. Vuokaavio tutkimuksen etenemisestä. 29 Kuvio 2. Ryhmien tutkimuspäivän -1 P1NP- pitoisuudet. 51 Kuvio 3. Ryhmien tutkimuspäivän 13 P1NP-tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 52
Kuvio 4. Ryhmien tutkimuspäivän 20 P1NP-tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 53 Kuvio 5. Ryhmien tutkimuspäivän 27 P1NP-tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 54 Kuvio 6. Ryhmien tutkimuspäivän 34 P1NP-pitoisuudet. 55 Kuvio 7. Ryhmien tutkimuspäivän 42 P1NP-pitoisuudet. 56 Kuvio 8. Ryhmien tutkimuspäivän -1 TRACP5b-pitoisuudet. 57 Kuvio 9. Ryhmien tutkimuspäivän 13 TRACP5b-tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 58 Kuvio 10. Ryhmien tutkimuspäivän 20 TRACP5b-tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 59 Kuvio 11. Ryhmien tutkimuspäivän 27 TRACP5- tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 60 Kuvio 12. Ryhmien tutkimuspäivän 34 TRACP5b- pitoisuudet. 61 Kuvio 13. Ryhmien tutkimuspäivän 42 TRACP5b tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 62 Kuvio 14. Ryhmien tutkimuspäivän -1 IgG 2b -pitoisuudet. 63 Kuvio 15. Ryhmien tutkimuspäivän 27 IgG 2b -tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 64 Kuvio 16. Ryhmien tutkimuspäivän 34 IgG 2b -tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 65 Kuvio 17. Ryhmien tutkimuspäivän 42 IgG 2b -tulosten prosentuaalinen muutos tutkimuspäivästä -1. 66 Kuvio 18. P1NP-tulosten prosentuaalisten muutosten kehitys tutkimuksen aikana.67 Kuvio 19. TRACP5b-tulosten prosentuaalisten muutosten kehitys tutkimuksen aikana. 67 Kuvio 20. Paraproteiinitulosten prosentuaalisten muutosten kehitys tutkimuksen aikana. 68 TAULUKOT Taulukko 1. Standardien laimennussarja. 41 Taulukko 2. Harjoitusnäytteiden laimennussarja. 42
7 1 JOHDANTO Multippeli myelooma on syöpä, jossa B-solulinjaan kuuluva plasmasoluklooni lisääntyy luuytimessä. Kyseessä on vakava sairaus, johon ei ole olemassa parantavaa hoitoa. Tämä tauti kattaa noin prosentin kaikista syövistä. Taudille on keskeistä luun mikroympäristön muutokset, jonka seurauksena potilaille kehittyy lyyttisiä luustomuutoksia. Muutokset luuytimessä vaikuttavat myös muihin taudille tyypillisiin oireisiin kuten erilaisiin sytopenioihin ja hyperkalsemiaan (Remes 2007, 454 490.) Työn lukemisen helpottamiseksi työn loppuun liitteeksi 1 on lisätty sanasto selventämään niitä lääketieteellisiä termejä, joita ei ole selitetty tekstissä. Tutkimus tehtiin Pharmatest Services Oy:n toimeksiannosta. Tutkimus lähti käytännön tarpeesta kehittää eläinmallia, jolla voitaisiin tutkia lääkeainekandidaatteja multippelia myeloomaa vastaan. Työ on tärkeää, koska tällä hetkellä tauti johtaa hoitoresistenttiin terminaalivaiheeseen keskimäärin 3-4 vuoden kuluessa diagnoosista (Remes 2007, 455). Omalta osaltaan tutkija halusi saada lisää kokemusta tieteellisestä tutkimuksesta. Tutkimusaihe oli tutkijasta mielenkiintoinen Tutkimuksen tarkoituksena oli testata julkaisuihin (Garrett, Dallas, Radl & Mundy 1997, 517; Wang et al. 2006, 2434; Edwards et al. 2008, 2833) perustuvaa hiirimallia, ja tutkia, toimiiko tämä hiirimalli samalla tavalla kuin aikaisemmissa julkaisuissa on kuvattu. Tutkimuksessa oli kolme tutkimusryhmää, joista yksi toimi kontrolliryhmä ja kaksi muuta ryhmää olivat hoidollisia. Hoidolliset ryhmät saivat kahdella eri annoksella uudehkoa lääkettä bortezomib:a, joka on proteasomi-inhibiittori. Sitä käytetään kliinisesti multippelin myelooman hoitoon (Harousseau et al. 2006, 1498). Samalla selvitettiin, onko bortezomib tehokas lääke multippelin myelooman hoitoon ja tutkittiin, kumpi bortezomib-annos antaa paremman annosvasteen. Tutkimuksen tavoitteena oli olla yksi kehitysaskel kohti toimivaa hiirimallia. Samalla haettiin mahdollista verrokkilääkeainetta tuleviin lääkeainekandidaattien testaamiseen, sekä selvitettiin alustavasti, minkälaista lääkeannosta olisi hyvä käyttää.
8 2 MULTIPPELI MYELOOMA JA SEN TUTKIMINEN 2.1 Multippeli myelooma Multippeli myelooma on syöpä, jossa B-solulinjaan kuuluva monoklonaalinen plasmasoluklooni lisääntyy luuytimessä. Myeloomasolut kuuluvat morfologialtaan ja tehtävältään lymfosyyttien kehityslinjan erikoistuneimpiin soluihin, plasmasoluihin. (Remes 2006, 697.) Meyloomasolut erittävät, plasmasolujen tapaan, immunoglobuliineja, joiden määrä ja laatu ovat epänormaaleja. Myeloomasolut erittävät vereen ja virtsaan monoklonaalista immunoglobuliinia tai sen osaa, jota kutsutaan paraproteiiniksi tai M-komponentiksi. Myeloomat jaetaan luokkiin juuri M- komponentin avulla. (Remes & Rajamäki 2000, 377 378.) 2.1.1 Patogeneesi Multippeliin myeloomaan sairastuneiden keski-ikä on noin 65 vuotta. Myeloomaan sairastuu vuodessa 2,5 henkilöä 100 000 suomalaista kohden. Keskimäärin Suomessa todetaan vuodessa 230 uutta multippeli myelooma tapausta. Tämä tarkoittaa, että noin prosentti kaikista syövistä on multippelia myeloomaa. Myelooman aiheuttajaa ei tiedetä. Oletetaan, että kyseessä on monitekijäinen tapahtuma, jossa geneettisellä alttiudella on merkitystä. Yleensä multippelin myelooman syntyä edeltää MGUS (monoclonal gammopathy of undetermined significance) eli merkitykseltään epäselvä monoklonaalinen gammopatia, joka vuosien tai vuosikymmenten aikana muuttuu myeloomaksi. (Remes 2006, 696 697.) Vuosittainen riski, että MGUS kehittyy myeloomaksi tai muuksi samankaltaiseksi maligniksi taudiksi, on noin yhden prosentin luokkaa. Jotta MGUS muuttuisi myeloomaksi, vaaditaan monimutkaisia geneettisiä tapahtumia, joissa muun muassa luuytimen mikroympäristö muuttuu taudin kannalta suotuisaksi. (Kyle & Rajkumar 2004, 1860 1861.) MGUS ei itsessään ole pahanlaatuinen tila (Jagannath 2008, 7). Henkilöillä, jotka ovat altistuneet ydinsäteilylle tai saaneet suuria röntgenannoksia pitkien aikojen kuluessa, kuten radiologit, on muita suurempi riski sairastua
9 multippeliin myeloomaan. On havaittu, että myös maanviljelijät ovat muuta väestöä alttiimpia myeloomalle. Epävarmoja myeloomalle altistavia ympäristötekijöitä ovat asbesti, bentseeni, hiusten värjäysaineet sekä teollisuuden eri kemikaalit. On myös mahdollista, että pitkäkestoinen antigeenialtistus, esimerkiksi nivelreumassa ja kroonisissa tulehduksissa, saattaa altistaa myelooman synnylle. Myelooman esiintyvyydessä on lisäksi rotujen välisiä eroja. Amerikan mustaihoisella väestöllä multippelin myelooman esiintyminen on kaksi kertaa yleisempää kuin valkoihoisilla. Japanilasilla ja kiinalaisilla taas taudin esiintyminen on vähäistä. (Remes 2006, 696 697; Remes 2007, 454 455.) Luuytimen mikroympäristöllä on tärkeä rooli pahanlaatuisten plasmasolujen selviytymisessä ja kasvussa. Luuytimen mikroympäristö koostuu ekstrasellulaarisen matriksin proteiineista, erilaisista kantasoluista ja niiden esiasteista, luuytimen endoteliaalisista soluista, osteoblasteista ja osteoklasteista. (Jagannath 2008, 9.) Vaikuttaa siltä, että plasmasolujen, luusolujen ja luuytimen solujen välille on muodostunut noidankehä, joka aikaansaa osteoklastien muodostumisen, joka vuorostaan stimuloi pahanlaatuisten solujen kasvua. (Libouban, Moreau, Baslé, Bataille & Charppard 2004, 859). Myeloomasolujen tarttuminen matriksin proteiineihin suojaa soluja sytostaattien vaikutuksilta sekä edesauttaa lääkeresistenssiä ja estää apoptoosia. Myeloomasolujen sitoutuminen stroomasoluihin puolestaan indusoi näitä tuottamaan sytokiineja, kuten IL-6 (interleukiini 6), IGF-1 (insulin like growth factor 1) ja VEGF (vascular endothelial growth factor). Ne taas indusoivat myeloomasolujen proliferaatiota, migraatiota, lääkeresistenssiä ja estävät apoptoosia. Myeloomasolut pystyvät itsekin tuottamaan sytokiineja, kuten TNF- (tumor necrosis factor- ), TGF-β (transforming growth factor-β) ja VEGF:a, jotka taas stimuloivat strooman IL-6 tuotantoa. Myeloomasolujen tärkein kasvutekijä on IL-6. Sytokiinit aktivoivat myös tärkeitä solun sisäisiä signaalireittejä ja niiden lopputuotteita, kuten apoptoosia estäviä proteiineja. Useat tekijät, kuten VEGF, edistävät angiogeneesiä, joka liittyy aktiiviseen tautiin. Näin ne ovat osaltaan mukana taudin synnyssä. (Remes 2006, 698.)
10 2.1.2 Taudinkulku Taudin eteneminen on usein melko rauhallista ja on mahdollista, ettei hoitoja tarvita vuosiin, sillä oireetonta tautia ei hoideta. Keskimääräinen elinaika diagnoosin jälkeen on 3-4 vuotta. Multippelille myeloomalle on tyypillistä plasmasolujen ylimäärä luuytimessä, seerumin tai virtsan M-komponentti ja luuston lyyttiset muutokset. (Remes 2006, 699.) Usein taudin alkuvaiheessa oireet ovat epäselviä ja muistuttavat muiden tilojen oireita (Jagannath 2008, 7). Jotta diagnostiset kriteerit täyttyvät, pitää plasmasoluja olla luuytimessä vähintään 10 %:a kaikista soluista (Kyle & Rajkumar 2004, 1860). Plasmasolujen ylimäärä luuytimessä aiheuttaa luuytimen vajaatoimintaa, josta on seurauksena erilaiset sytopeniat. Punasolujen vajaatuotannosta on seurauksena anemia, jota esiintyy 60 %:lla potilaista. Leukosytopeniasta on seurauksena lisääntynyt infektioherkkyys. Bakteeri-infektiot ovat tavallisia myeloomapotilailla ja ne aiheuttavat huomattavan sairastuneisuuden ja kuolleisuuden. Immuunipuolustus on muutenkin häiriintynyt, koska plasmasolut eivät välttämättä pysty tuottamaan normaaleja immunoglobuliineja. Potilailla esiintyy myös trombosytopeniaa, joka aiheuttaa verenvuotoja. Verenvuototaipumus voi johtua myös hyperviskositeetistä, jota ilmenee alle 10 %:lla potilaista. Hyperviskositeetti aiheuttaa lisäksi väsymystä, sekavuutta ja tinnitusta. (Remes 2006, 700 701; Remes 2007, 458 560.) 70 %:lla potilaista havaitaan diagnoosivaiheessa röntgenkuvista taudille tyypillisiä reikämäisiä lyyttisiä luustomuutoksia, joista aiheutuu luustokipuja. Usein potilailla on selkäkipua, joka johtuu selkänikamien kompressiomurtumista. Useasti havaitaan myös kylkiluiden ja pitkien luiden murtumia. Osteoporoosi voi olla taudin alkuvaiheen ainoa luustomuutos. (Remes 2006, 699.) Luustotaudin kehittyminen liittyy kiinteästi luuytimen mikroympäristön muutoksiin. Luustotaudin syynä on osteoklastien lisääntynyt aktiivisuus. (Garrett, Dallas, Radl & Mundy 1997, 515.) Osteoblastien liian alhaisella aktiivisuudella ja osteoklastien liiallisella aktiivisuudella on merkittävä osa luustotaudin synnyssä (Remes 2006, 698).
11 Vuosia on ajateltu osteoklastien toiminnan olevan pääosassa myelooman luustotaudin kehittymisessä. Edwards et al. (2008, 2833) viittaavat artikkelissaan tutkijoiden Abildgaard et al. tekemään tutkimukseen, jossa alkuvaiheessa olevassa multippelissa myeloomassa on havaittu osteoblastien määrään kasvaneen luussa. Pidemmälle edenneessä taudissa osteoblastien määrä ja aktiivisuus vähenevät. Uusissa tutkimuksissa on havaittu, että tautiin sairastuneiden potilaiden luun muodostuksesta kertovien merkkiaineiden tasot ovat pienentyneet. On selvää, että luun muodostuksen pieneneminen on keskeisessä roolissa taudin patogeneesissä, vaikka siihen vaikuttavia mekanismeja ei tunneta vielä kovin hyvin. (Edwards et al. 2008, 2833.) Stroomasolut, myeloomasolut ja osteoblastit erittävät osteoklasteja aktivoivia tekijöitä, joihin kuuluu sytokiineja, mutta äskettäin löydetyt RANKL (receptor activation of Nf- B ligand)/opg (osteoprotegeriini)- systeemi ja MIP-1α (magrophage inflammatory protein 1-alfa) ovat myös hyvin tärkeitä osteoklasteja aktivoivia tekijöitä. Osteoklastien aktiivisuus riippuu RANKL:n ja OPG:n tasapainotilasta. RANKL indusoi sitoutuessaan osteoklastisoluja reseptoriinsa (RANK) mahdollistaen osteoklastiesiasteiden kehittymisen luuta hajottaviksi osteoklasteiksi. Liukoinen OPG taas estää RANKL:n sitoutumisen reseptoriinsa (RANK). Normaalisti RANKL/OPGsysteemi huolehtii siitä, että luun muodostus ja hajotus pysyy tasapainossa. Myeloomasolut pystyvät lisäämään stroomasolujen RANKL:n ilmentymistä. Samalla ne voivat estää OPG:n vaikutusta, jolloin RANKL voi vapaasti stimuloida osteoklastien toimintaa. Hiljattain on löydetty DKK-1 (Dickkopf-1), joka on osteoblastien erikoistumista ja erilaistumista estävä proteiini. Myeloomasolut ilmentävät DKK-1 geeniä ylen määrin. (Remes 2006, 698.) Multippelia myelooma sairastavilla potilailla on huomattu olevan kohonneet seerumin DKK-1 tasot, jonka on havaittu korreloivan potilaan luuleesioiden määrään. Uusissa tutkimuksissa on havaittu, että luun hajotusta ja kasvainkuormaa on saatu pienennettyä estämällä DKK- 1:n vaikutusta, jolloin osteoblastien toiminta on lisääntynyt. (Edwards et al. 2008, 2833.) Lyyttisiin luustomuutoksiin liittyy hyperkalsemia, jota tavataan noin kolmasosalla potilaista. Se on myös seurausta osteoklastien liiallisesta aktivaatiosta, jolloin luusta vapautuu runsaasti kalsiumia ekstrasellulaariseen nesteeseen. Hyperkalsemian oireita
12 ovat pahoinvointi, väsymys, sekavuus, laihtuminen ja polyuria (runsas virtsaneritys). Jos tila pääsee kehittymään hyperkalsemiakriisin asteelle, on tilanne hengenvaarallinen. Munuaisten vajaatoiminta liittyy läheisesti hyperkalsemiaan. Munuaisten vajaatoiminnasta kärsii noin 20 % potilaista jo diagnoosivaiheessa. (Remes 2006, 700 701; Oyajobi 2007 [Viitattu 18.12.2008].) 2.1.3 Hoito Multippeliin myeloomaan ei ole olemassa parantavaa hoitoa, mutta potilaiden oireita voidaan hoitaa ja elinaikaa pidentää. Oireettoman taudin hoitamisesta ei ole todettu olevan hyötyä (Kyle & Rajkumar 2004, 1861). Noin 60 %:a potilaista saavuttaa hoitovasteen. Hoitovaste voidaan saada toistuvasti, mutta lopulta tauti johtaa hoitoresistenttiin terminaalivaiheeseen. (Remes 2007, 463.) Jo yli 35 vuoden ajan myelooman standardihoitona on ollut melfalaamin ja kortikosteroidin yhdistelmä. Tämän standardihoidon hyviä puolia on sen hyvä siedettävyys ja helppo, suun kautta tehty annostelu. Tuloksia on pyritty parantamaan solusalpaajien hoitoannoksia suurentamalla, joka on osoittautunut toimivaksi. Eräs hoitoja hankaloittava tekijä on taudin taipumus tulla resistenssiksi käytetyille lääkkeille. Yksi parhaiten tunnettu syy tähän on moniresistenssigeenin ilmaantuminen myeloomasoluihin. (Remes 2007, 465 466.) Vanhojen lääkkeiden rinnalle kehitetään uusia lääkkeitä. Talidomidia on alettu käyttää taudin etenemisen hidastamiseen. Sen vaikutus perustuu angiogeneesin estoon. (Kyle & Rajkumar 2004, 1861 ja 1867.) Se myös lisää soluvälitteisiä sytotoksisia vaikutuksia, käynnistää apoptoosin ja estää stroomasolujen adheesiota (Remes 2007, 465 466). Uudehko lääke pitkälle edenneeseen multippeliin myeloomaan on bortezomib, joka on proteasomi-inhibiittori. Se on osoittautunut prekliinisissä malleissa hyvin tehokkaaksi monia eri syöpiä, mukaan lukien multippelia myeloomaa, vastaan. Sen vaikutus perustuu solujen kasvun estoon ja apoptoosin käynnistämiseen. Se lisäksi inhiboi myeloomasolujen ja stroomasolujen vuorovaikutusta, kuin myös sytokiinien kuten IL-
13 6:n ja TNF- :n, tuotantoa. (Kyle & Rajkumar 2004, 1867 1868.) Sitä käytetään jo kliinisesti multippelin myelooman hoidossa ja sillä on saatu aikaan hyviä tuloksia (Harousseau et al. 2006, 1498). Lääkehoidon tueksi potilaille tehdään autologisia kantasolusiirtoja eli potilaalle annetaan hänen omia, yleensä verestä eristettyjä, kantasolujaan. Hoidosta saadaan hyviä tuloksia. Hoidon kuolleisuus on pieni, 1-2 %:a, ja useat potilaat saavat jopa täydellisen vasteen, mutta se menetetään yleensä kahdessa vuodessa. Yhdistettynä korkea-annoshoitoon potilaiden keskimääräinen elinaika pitenee noin vuodella. (Kyle & Rajkumar 2004, 1862; Remes 2007, 466.) Toinen vaihtoehto on allogeeninen kantasolusiirto, eli potilaalle annetaan toisen ihmisen kantasoluja. Sen etuna on, ettei siirrännäinen ole voinut kontaminoitua syöpäsoluilla ja täydellisiä hoitovasteita on paljon. Kuitenkin vain 5-10 %:a potilaista on sopivia allogeeniseen kantasolusiirtoon. Siirtoja rajoittavat sopivan luovuttajan löytäminen ja potilaan kunto. (Kyle & Rajkumar 2004, 1864 ja 1866.) Hoito on myös hyvin toksinen ja siihen liittyy suuri toimenpidekuolleisuus, joka voi olla jopa 30 40 %:a (Remes 2007, 466). 2.2 Luusto Ihmisen kokonaispainosta noin 10 15 %:a muodostuu luustosta (Hammett-Stabler 2004, 1). Aikuisen luusto koostuu 213 luusta, joiden tehtäviin kuuluu kehon tukirankana ja lihasten kiinnityspintana toimiminen, jolloin luusto on osaltaan mahdollistamassa liikkeet. Luut suojaavat tärkeitä elimiä, esimerkiksi kallonluut suojaavat aivoja ja kylkiluut suojaavat sisäelimiä. Luusto ylläpitää mineraalitasapainoa toimien muun muassa kalsiumin ja fosfaatin varastona. Luustosta vapautuu verenkiertoon mineraaleja tarvittaessa, jolloin tärkeiden mineraalien tasapaino säilyy. Luuytimessä tapahtuu hematopoieesi eli verisolujen tuotanto. (Tortora & Grabowski 2000, 160; Dempster 2006, 7.) Verisolujen tuotanto tapahtuu punaisessa luuytimessä, jota löytyy aikuisella pitkien luiden, kuten reisiluun ja olkavarren luiden proksimaalipäissä sekä litteissä luissa, kuten kylkiluissa (Siitonen &
14 Koistinen 2000, 13). Luuytimessä tuotetaan punasoluja, valkosoluja ja verihiutaleita. Lisäksi vanhemmiten luuhun alkaa kerääntyä keltaista luuydintä, joka toimii triglyseridien varastona. (Tortora & Grabowski 2000, 160.) Elimistön sidekudoksesta suurin osa on luuta. Luumatriksi poikkeaa muusta sidekudoksesta, koska se on fysiologisesti mineralisoitunut ja uusiutuu jatkuvasti läpi elämän. (Rodney & Boskey 2006, 12.) Luusto koostuu erilaisista luusoluista, orgaanisesta matriksista, mineraaleista ja vedestä (Tortora & Grabowski 2000, 162). Luusoluihin kuuluu mesenkymaalista alkuperää olevia kantasoluja, jotka voivat erilaistua joko luuta muodostaviksi soluiksi eli osteoblasteiksi tai rustosoluiksi (Bjorn 2006, 2). Osteoblastit tuottavat kollageenia ja muita orgaanisia rakenneosia, joita tarvitaan luun muodostuksessa (Tortora & Grabowski 2000, 162). Osteosyytit ovat kypsiä luusoluja. Ne ovat muodostuneet osteoblasteista, jäätyään valmistamansa luun vangeiksi. Vaikka ne eivät enää kykene muodostamaan luuta, ne pysyvät yhteydessä toisiinsa ja luun pinnalla oleviin soluihin. Näin ne kykenevät aistimaan ympäröivän luun mekaanisia muutoksia ja välittämään tietoa luun pinnalla oleviin soluihin. Ne kykenevät aloittamaan tai säätelemään luun uudistumista. (Dempster 2006, 9.) Kun ne järjestäytyvät lieriömäisesti verisuonten ympärille, niitä kutsutaan osteoneiksi (Nienstedt, Hänninen, Arstila & Björkqvist 2004, 63). Monosyytti-makrofagi linjaa olevat osteoklastit ovat luuta hajottavia soluja (Ross 2006, 30). Ne erittävät lysosomaalisia entsyymeitä ja happoja, joiden avulla ne liuottavat luun proteiineja ja mineraaleja (Tortora & Grabowski 2000, 163). 20 40 % luusta on orgaanista matriksia. Se koostuu valtaosaksi osteoblastien syntetisoimista kollageenisäikeistä, joka on pääasiassa tyypin 1 kollageenia. 50 70 % luusta on mineraaleja, joista tärkeimmät ovat kalsium ja fosfaatti. Ne esiintyvät luussa valtaosaksi kiteisenä hydroksiapatiittina. Vettä luustossa on 5-10 %. Alle 3 % luustosta koostuu lipideistä. (Rodney & Boskey 2006, 14.) 2.2.1 Luun rakenne Luita on monenmuotoisia ja niiden muoto on pitkälti kiinni niiden toiminnasta. Pieniä luita ovat nikamat ja ranteen pienet luut. Litteisiin luihin kuuluvat lapaluut ja
15 rintalasta. Pitkiä luita ovat raajanluut kuten reisiluu ja olkaluu. (Nienstedt et al. 2004, 105.) Tässä tarkastellaan lähemmin pitkien luiden rakennetta. (Kuva 1) Pitkien luiden onttoa varsiosaa kutsutaan diafyysiksi. Diafyysin päissä sijaitsevat epifyysit. (Dempster 2006, 7.) Lähempänä vartaloa olevassa päässä on proksimaalipää ja kauempana vartalosta olevassa päässä on distaalipää, joissa molemmissa on epifyysit. Epifyysin alla on alue, jota kutsutaan metafyysiksi. Se liittää kasvunsa päättäneessä luussa diafyysin ja epifyysin toisiinsa. Kasvavassa luussa metafyysi sisältää rustoisen epifyysilevyn eli kasvulevyn. Kasvulevy mahdollistaa diafyysin pituuskasvun, mutta kasvun loputtua kasvulevyn rusto muuttuu luuksi. (Tortora & Grabowski 2000, 161 162.) Luun ulkopuolta ympäröi sidekudoskalvo periosteum eli luukalvo. Se sisältää hermopäätteitä, osteoblasteja, osteoklasteja ja verisuonia, jotka ravitsevat luuta. Luun sisäpuolella on vastaavanlainen kalvo, jota kutsutaan endosteumiksi. (Dempster 2006, 7.) Kuva 1. Pitkän luun rakenne muokattu Tortora & Grabowski mukaan (2000, 161).
16 Luukudosta on kahden tyyppistä: kuoriluuta eli kortikaaliluuta ja hohkaluuta eli trabekulaariluuta. 80 %:a aikuisen luustosta on kuoriluuta. Muun muassa diafyysit ovat pääasiassa koostuneet kuoriluusta. 20 %:a luusta on hohkaluuta, jota löytyy epifyysistä, metafyysistä ja luuytimen ympäriltä. Makroskooppisesti tarkasteltuna kuoriluu on tiivistä, kun taas hohkaluussa on hunajakennoa muistuttava verkkomainen rakenne. Mikroskooppisesti tarkasteltuna sekä kuoriluu että hohkaluu koostuvat luun lieriömäisistä perusyksiköistä osteoneista. Kuoriluun osteoneja kutsutaan usein Haversin kanaviksi. Ne on sylinterimäisiä ja muodostavat rakenteen joka muistuttaa puun oksia (Kuva 2). (Dempster 2006, 7.) Kuva 2. Luun osteoneja. Kuvan keskellä näkyy kaksi osteonia. 1 luusolu ulokkeineen, 2 soluväliainetta, 3 verisuonikanava, 4 verisuoni, 5 vanhan osteonin jäänne. Muokattu Nienstedt et al. mukaan (2004, 63). 2.2.2 Luun uudistuminen Luusto saavuttaa huippumassansa pian kasvun päätyttyä. Sen vuoksi aikuisen luustossa tapahtuvat muutokset liittyvät pääasiassa luun uusiutumiseen. Luusto uusiutuu pienissä osissa luun solujen vaikutuksesta uusiutumiskierron aikana. Luun muodostus ja uudelleenmuodostus koostuu neljästä vaihteesta: aktivaatiosta, resorptiosta eli luun hajotuksesta, palautumisesta ja formaatiosta eli luun muodostuksesta (Kuva 3). (Välimäki 2000, 190.)
17 Aktivaatio pitää sisällään ne tapahtumat, joita tarvitaan uinuvan luun pinnan muuttamiseksi sopivaksi luun hajotukseen. Tarkkaan ei tiedetä, miten luun hajotuspaikka ja -laajuus tarkalleen valikoituvat. Oletetaan, että osa luun hajotuksesta kohdistuu korjattaviin alueisiin, mutta valtaosa hajotuksesta on todennäköisesti satunnaista. Aktivaatiossa osteoklastien yksitumaiset esiasteet muuttuvat monitumaisiksi preosteoklasteiksi. Osteoklastit kiinnittävät itsensä luumatriksiin rengasmaisella erittäin tiiviillä liitoksella (engl. sealing zone). Muodostamalla liitoksen osteoklasti luo luun hajotukselle mikroympäristön itsenä ja luumatriksin välille. (Dempster 2006, 9.) Luun hajotusvaiheessa erityiset protonipumput pystyvät tuottamaan suolahappoa. Haponmuodostuksen seurauksena ph laskee osteoklastin ja luun pinnan välillä arvoon 4,0. Haponmuodostukseen liittyy myös useiden entsyymien, kuten katepsiini K:n ja TRACP:n (tartraattiresistentti hapan fosfataasi), erittyminen, jotka ovat mukana resorptiossa. Happo ja entsyymit liuottavat tehokkaasti matriksin mineraalit ja orgaanisen aineksen, muodostaen sylinterimäisiä tunneleita tai makkaran muotoisia resorptiokuoppia, joita kutsutaan Howshipin kuopiksi, riippuen siitä, minkälaisessa luussa resorptio tapahtuu. Sylinterimäisiä tunneleita muodostuu kuoriluuhun ja makkaran muotoisia kuoppia muodostuu taas hohkaluuhun. Resorptiovaihe päättyy osteoklastien apoptoosiin. (Dempster 2006, 9.) Palautumisvaiheessa resorptiokuoppaan kerääntyy mononukleaarisia soluja, kuten monosyyttejä, preosteoblasteja ja osteosyyttejä, jotka ovat vapautuneet luun sisästä osteoklastien toimesta. Tässä vaiheessa kaikki tärkeät kytkeytymissignaalit lähetetään kutsumaan osteoblasteja resorptiokuoppiin korvaamaan luuta, joka hajotettiin. Jollei olisi tehokasta kytkeytymisjärjestelmää, jokaisessa luun uusiutumissyklissä olisi seurauksena luukatoa. Tarkasti ei tiedetä kuinka kytkeytymisjärjestelmä toimii, mutta on olemassa useita teorioita, kuinka tämä voisi toimia. Yhden teorian mukaan osteoklastit vapauttavat kasvutekijöitä luusta, jotka toimisivat kemiallisina houkuttimina osteoblastien esiasteille ja stimuloivat osteoblastien jakaantumista ja erilaistumista. (Dempster 2006, 9.)
18 Luun muodostus on kaksivaiheinen tapahtuma, jossa osteoblastit aluksi syntetisoivat orgaanista matriksia ja sitten säätelevät sen mineraalisointia. Samalla kun osteoblastit muodostavat uutta luuta hajotetun tilalle, osa niistä jää itse muodostamansa luun vangeiksi muuttuen samalla osteosyyteiksi. Kun kollageeninen orgaaninen matriksi on muodostettu, osteoblastit laukaisevat mineralisaation pienillä matriksirakkuloilla, jotka muodostavat suotuisat olosuhteet mineraalien saostumiselle. (Dempster 2006, 9.) Luun mineralisaatiossa mineraalit alkavat kasaantua kerroksiksi kollageenisen matriksin päälle. Luun kypsyessä mineraalikristallit kasvavat kokoa. Valmiit kristallit ovat pääasiassa hydroksiapatiittia. (Rodney & Boskey 2006, 14.) Kuva 3. Luun uudistumisen vaiheet muokattu Välimäki mukaan (2000, 194).
19 2.3 Luun biokemialliset merkkiaineet Luun biokemialliset merkkiaineet kertovat luumetaboliasta eli sen hajoamisesta ja muodostumisesta. Biokemialliset merkkiaineet jaetaan luun hajotuksen ja muodostuksen merkkiaineisiin. (Cremers, Ganero & Seibel 2008, 1862.) Niitä voidaan määrittää seerumista ja virtsasta (Välimäki 2000, 239). Niillä on tärkeä merkitys luusairauksien hoitoon tarkoitettujen uusien lääkkeiden kehittelyssä. Niiden avulla saadaan tärkeää tietoa, kannattaako lääkkeen kehitystä jatkaa tai minkälaista annosta olisi hyvä käyttää. Lääkkeen käyttöön hyväksynnän jälkeen luun biokemiallisten merkkiaineiden avulla etsitään uusia indikaatiota lääkkeille. (Cremers et al. 2008, 1871.) Kliinisesti luun biokemiallisia merkkiaineita käytetään luun hajoamista estävän hoidon tehon seurannassa, lääkkeen imeytymisen ja annoksen arvioimisessa, potilaan hoitomyöntyvyyden selvittämiseen, murtumariskin ennakoimiseen ja luumassan vähenemisen ennustamiseen. Luun biokemialliset merkkiaineet tarjoavat tietoa luuston tilasta huomattavasti aikaisemmin kuin esimerkiksi luun tiheysmittaukset. Luun tiheysmittauksia voidaan käyttää hoidontehon seurantaan vasta 1-2 vuoden kuluttua, kun taas luun aineenvaihdunnan merkkiaineilla saadaan luun muodostumisesta tietoa 2-3 kuukaudessa ja hajoamisesta jo 4-6 viikon kuluessa hoidon aloittamisesta. Lisäksi merkkiaineet ovat suhteellisen halpa ja helposti käytettävissä oleva tapa seurata luuston tilaa. (Välimäki 2000, 239; Camacho & Kleerekloper 2006, 128 ja 130.) Arvoja on aina tulkittava potilaan henkilökohtaiseen lähtötasoon suhteutettuna (Suominen 12.2.2009, henkilökohtainen tiedonanto). Myös eläimiltä voidaan tutkia luun biokemiallisia merkkiaineita. Koirille, hevosille, hiirille ja rotille on jo olemassa ELISA- ja RIA-menetelmiin perustuvia reagenssipakkauksia, joilla voidaan määrittää osa luun biokemiallisista merkkiaineista. Niitä käytetään paljon eläinmalleissa, joissa eläimillä tutkitaan erilaisia ihmisten sairauksia kuten osteoporoosia, luumetastaaseja ja niveltulehduksia. Määrityksiin tarvittavat näytteet voidaan kerätä noninvasiivisesti, jolloin samasta eläimestä voidaan ottaa useita näytteitä ja saada tietoa luumetaboliasta pitkällä
20 aikavälillä. Lisäksi luun biokemiallisia merkkiaineita voidaan hyödyntää tutkittaessa luustokasvainten kasvua. Esimerkiksi BALP:n (luustoperäinen alkalinen fosfataasi) hyödyntämistä koirien luusyövän kehityksen ennakoimiseen on tutkittu. Merkkiaineita voidaan käyttää myös nivelrikon tutkimiseen eläimillä. Lisäksi hammassairauksien tutkimisessa on hyödynnetty luun biokemiallisia merkkiaineita. Vielä tällä hetkellä yksittäisen eläimen luustosairauden tutkimisessa merkkiaineilla ei ole kovinkaan suurta merkitystä, johtuen muun muassa suuresta biologisesta variabiliteetista. Sen sijaan prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa, jossa käytetyt ryhmäkoot ovat riittävän suuria, luun biokemialliset merkkiaineet ovat hyvin hyödyllisiä. (Allen 2003, 108 111.) 2.3.1 Luun muodostuksen merkkiaineet Luun muodostuksen merkkiaineisiin kuuluvat P1NP eli tyypin 1 kollageenin aminoterminaalinen propeptidi ja P1CP eli tyypin 1 kollageenin karboksiterminaalinen propeptidi. Nämä kaksi merkkiainetta kertovat tyypin 1 kollageenin tuottamisen aktiivisuudesta ja ovat sille spesifisiä. Tyypin 1 kollageenia on muodostunut prokollageenista, ja sitä löytyy luuston lisäksi pehmytkudoksista kuten ihosta, jänteistä, suurista suonista ja lihaksista, mutta eniten sitä on luustossa. Siksi muutokset kollageenin konsentraatiossa kertovat pääasiassa luustossa tapahtuvista muutoksista, koska kollageenin vaihtuvuus on nopeampaa luussa kuin muissa kudoksissa. (Cremers et al. 2008, 1862.) P1NP:n ja P1CP:n pitoisuudet ovat vuorokaudenaikaan sidottuja (Hammett-Stabler 2004, 47). Korkeimmillaan pitoisuudet ovat aikaisin aamulla (klo 4.00 8.00), kuten muillakin seerumiin tai virtsaan erittyvillä luunmuodostuksen merkkiaineilla (Camacho & Kleerekloper 2006, 129). P1NP arvot nousevat huomattavasti 1-4 viikon kuluttua murtumasta ja pysyvät koholla vähintään vuoden (Cremers et al. 2008, 1862). Osteokalsiini on herkkä ja spesifi merkkiaine, jota esiintyy ainoastaan luussa ja hammasluussa. Sitä syntetisoivat kypsät osteoblastit, liikakasvuiset rustosolut ja odontoblastit (Cremers et al. 2008, 1861) eli hammasluuta muodostavat solut (Niensted et al. 2004, 298). Se kertoo kuitenkin lähinnä vain osteoblastien aktiivisuudesta ja sitä myöden luun muodostuksesta, koska odontoblasteja on paljon
21 vähemmän kuin osteoblasteja (Hammett-Stabler 2004, 43). On kuitenkin syytä muistaa, että osteokalsiini on kiinnittyneenä luumatriksiin ja sitä vapautuu myös luun hajotuksen aikana. Sen vuoksi osteokalsiinia voidaan pitää luun metabolian merkkiaineena, eikä ainoastaan luun muodostuksen merkkiaineena. (Camacho & Kleerekloper 2006, 128.) BALP eli luustoperäinen alkalinen fosfataasi kertoo myös luun muodostumisesta. Sitä muodostuu osteoblastien toiminnan seurauksena, ja sillä on tärkeä merkitys mineralisaatiossa, vaikka sen tarkkaa roolia prosessissa ei tiedetä. Se saattaa kyetä hillitsemään osteoklastien aktiivisuutta (Hammett-Stabler 2004, 43). BALP:n pitoisuuksien ei ole havaittu olevan sidoksissa vuorokauden aikaan. (Camacho & Kleerekloper 2006, 128 129.) 2.3.2 Luun hajotuksen merkkiaineet Tartraattiresistenttillä happamalla fosfataasilla eli TRACP:lla on kuusi isoentsyymiä, joista TRACP5b kertoo luun hajotuksesta. Hapan fosfataasi on lysosomaalinen entsyymi, jota löytyy luun lisäksi useista kudoksista, kuten prostatasta, pernasta ja verihiutaleista (Camacho & Kleerekloper 2006, 129). TRACP5b:tä löytyy luusta kypsistä osteoklasteita hajotuksen yhteydessä. TRACP5b osallistuu tyypin 1 kollageenin hajotukseen. Tyypin 1 kollageenin hajotuksessa osittain hajonnut kollageeni otetaan käsiteltäväksi osteoklastien vesikkeleiden sisään. Vesikkeleissä TRACP5b hajottaa tyypin 1 kollageenin hajoamistuotteita vielä pienemmiksi osiksi. Näin ollen se kertoo spesifisti osteoklastien aktiivisuudesta. Uusimmat tutkimukset ovat kuitenkin antaneet viitteitä, että TRACP5b kertoisi enemmänkin osteoklastien lukumäärästä kuin luun hajotuksen nopeudesta. (Cremers et al. 2008, 1861.) Tähän tulokseen ovat tulleet tutkijat Rissanen, Suominen, Peng ja Halleen (2007, 108), jotka osoittivat rotilla tehdyllä ovariektomia (munasarjojen poisto) kokeella, että TRACP5b on luotettava merkkiaine osteoklastien lukumäärälle eikä niinkään luun hajotuksen nopeudelle. Lisäksi ihmiset, jotka kärsivät Albert-Schönbergin taudista eli ADO-II:sta eli autosomaali dominantti osteopetroosi tyyppi II:ta, on korkeat TRAPC5b arvot, vaikka heidän osteoklastinsa ovat tehottomia. Heillä on suuret määrät osteoklasteja,
22 vaikka ne ovat kykenemättömiä suorittamaan tehtäväänsä. Tämäkin viittaa siihen, että TRACP5b kertoo nimenomaan osteoklastien lukumäärästä. (Alatalo et al. 2004, 883.) TRACP5b nousee multippelin myelooman edetessä, kuten muutkin hajotuksen merkkiaineet, ja niitä käytetään taudin tilan seuraamiseen. Luun muodostuksen merkkiaineiden merkittävyydestä löytyy kahdenlaista tietoa. Lähteestä riippuen kerrotaan, että luun muodostuksen merkkiaineet pysyvät yleensä normaaliarvojen sisällä, ja niillä ei ole multippelin myelooman kehityksen kannalta merkitystä. (Cremers et al. 2008, 1870 1871.) Tutkijat Pika et al. (2008, 62) puolestaan havaitsivat tutkimuksessaan, että 21 %:lla multippelia myeloomaa sairastavista potilaista oli epänormaalit P1NP-tasot. Muita hajotuksen merkkiaineita ovat virtsasta mitattavat NTx eli tyypin 1 kollageenin N-terminaalinen telopeptidi ja CTx eli tyypin 1 kollageenin C-terminaalinen telopeptidi. Kollageeniketjut ovat kiinnittyneet toisiinsa animo (N)- ja karboksi (C)- terminaalisidosten avulla. Telopeptidit ovat se alue, jossa nämä sidoskohdat sijaitsevat. Kollageenin hajotessa telopeptidit pääsevät verenkiertoon ja päätyvät munuaisiin, joista ne erittyvät virtsaan. (Camacho & Kleerekloper 2006, 129.) Ne ovat kumpikin herkkiä merkkiaineita, vaikkakin CTx on melko epävakaa. Lisäksi CTxpitoisuus on riippuvainen munuaisten ja maksan toiminnasta. (Cremers et al. 2008, 1863 1864.) 2.4 Eläinmalli Multippelin myelooman mallintamiseen tarvitaan eläinmalleja, jotta opittaisiin ymmärtämään multippelin myelooman vaikutusmekanismeja, ja mitkä tekijät siihen vaikuttavat. Eläinmallien avulla pystytään myös tutkimaan potentiaalisten lääkeainekandidaattien tehokkuutta. Multippeli myelooman mallintamiseen käytetään C57BL/KaLwRij kannan hiiriä, koska on todettu, että tämän kannan ikääntyvillä eläimillä ilmenee spontaanisti multippelia myeloomaa, jossa on samat piirteet kuin ihmisissä esiintyvässä taudissa. Kokeissa käytetään kuitenkin alun perin terveitä nuoria eläimiä, joihin istutetaan eri solulinjoja, jotka on alun perin saatu spontaanisti ilmenneistä tautitapauksista. (Garrett, Dallas, Radl & Mundy 1997, 515.)
23 Taudin kulku riippuu siitä, minkälaista solulinjaa käytetään. Spontaanisti multippelia myeloomaa aiheuttavaa solusarjaa kutsutaan 5TMM:ksi. Tästä sarjasta on olemassa kaksi eri linjaa: 5T2MM ja 5T33MM. 5T2MM on näistä kahdesta hitaammin etenevä ja hyvin paljon ihmisen multippelia myeloomaa muistuttava. 5T33MM on hyvin aggressiivinen linja, jossa kasvaimet muodostuvat hyvin nopeasti luuytimeen ja pernaan, mutta myös muihin elimiin. Tämä solulinja ei vastaa kovin hyvin ihmisten multippelia myeloomaa. (Libouban et al. 2004, 859 860.) 5TMM solusarjaa muokkaamalla on kehitetty useita uusia solulinjoja. Tutkijat Radl, Croese, Zurcher, Van den Enden-Vieveen ja Leeuw (1988, 593) havaitsivat C57BL/KaLwRij kannan hiirillä esiintyvän spontaanisti multippelia myeloomaa. He kasvattivat eri solulinjojen soluja pistämällä sairastuneiden eläinten luuytimensoluja saman kannan nuorten eläinten laskimoon, koska solut eivät kasvaneet in vitro (Libouban et al. 2004, 860). Tässä tavassa kasvattaa soluja ongelmana oli, että vain osa solulinjoista säilytti alkuperäiset ominaisuudet, kun osa linjoista alkoi kehittyä alkuperäistä aggressiivisemmaksi (Radl et al. 1988). Tällä tekniikalla on vaikea tehdä tutkimusta, koska pistettävien solujen määrää on vaikea vakioida (Garrett et al. 1997, 515). Lisäksi tämä menetelmä on kallis ja hankala ylläpitää (Suominen 12.2.2009, henkilökohtainen tiedonanto). Garrett et al. (1997, 515 520) halusivat kehittää eläinmallin, jolla voidaan tutkia myeloomasolujen osteoklastien aktivaatiomekanismeja. He onnistuivat kasvattamaan 5T33MM solulinjan, jota voidaan kasvattaa soluviljelyllä. Tässä menetelmässä on etuna, että tutkijat pystyivät pistämään tarkan määrä soluja eläimiin. He pystyivät tarkasti ennustamaan, milloin hiirille muodostuu kasvaimia ja milloin ne saavuttavat terminaalivaiheen. Tutkijat onnistuvat tavoitteissaan ja tutkimustulostensa perusteella he olettivat, että luuytimen mikroympäristö vaikuttaa myeloomasolujen kasvuun. He olettivat, että IL-6:lla saataisi olla mahdollinen vaikuttaja luuytimen osteoklastien aktivaatioon.
24 Libouban et al. (2004, 859 865) kehittivät uuden solulinjan hiirimalliin, jossa he tutkivat erityisesti, kuinka luuytimen mikroympäristö vaikuttaa multippelin myelooman syntyyn. Heidän kehittämänsä uusi solulinja, 5THL, oli saatu aikaisemman kokeen hiiristä, joille oli tehty munasarjojen poisto ja istutettu 5T2MM linjan soluja. Tutkijat olivat aikaisemmassa kokeessa huomanneet, että munasarjojen poisto lisäsi myeloomasolujen kasvua. He kasvattivat näistä hiiristä saatuja myeloomasoluja saman kannan terveissä hiirissä kuuden sukupolven ajan, eikä solulinja muuttunut tämän kasvatuksen aikana. Tuloksena saatiin uusi solulinja, joka muistuttaa hyvin paljon ihmisen tautia ja oli nopeakasvuisempi ja aggressiivisempi kuin alkuperäinen 5T2MM linja. Munasarjojen poisto muutti luuytimen mikroympäristöä muun muassa siksi, että eläinten estrogeenitaso laski (Suominen 12.2.2009, henkilökohtainen tiedonanto). Sen seurauksena alkuperäisen 5T2MM linja ilmiasu muuttui niin paljon, että uusi solulinja syntyi ja se nimettiin 5THL:ksi (Libouban et al. 2004, 865). Vaikka edellä mainitut mallit ovat toimivia, niiden heikkoutena on se, ettei syövän kehittymistä ole voinut luotettavasti seurata. Edellä kuvatuissa malleissa syövän etenemistä seurattiin mittaamalla seerumin monoklonaalisen paraproteiinin määrä. Tämä ei ole kovin hyvä tapa seurata syövän kehitystä, koska menetelmällä on taipumusta antaa vääriä negatiivisia tuloksia. Toinen yleisesti käytetty syövän tutkimusmenetelmä on histologia ja luun histomorfometriset analyysit. Niiden avulla ei voida seurata syövänkehitystä, koska kudosnäytteiden keräämistä varten eläimet täytyy lopettaa. Lisäksi histomorfometriset analyysit tehdään yleensä vain takaraajojen pitkistä luista ja lannenikamista, koska histomorfometriset menetelmät eivät sovellu suuren työmääränsä vuoksi kovin hyvin koko luurangon kasvainkuorman arvioimiseen. (Oyajobi et al. 2007, 1701 1708.) Edellä kuvattujen ongelmien vuoksi Oyajobi et al. (2007, 1701 1708.) kehittivät hiirimallin, jolla voi eläintä vahingoittamatta, luotettavasti ja helposti seurata syövän etenemistä. He liittivät 5TGM1-solulinjaan green fluoresecent protein:n (GFP), jolloin he saivat aikaan solulinjan, joka aiheuttaa ihmisen multippelin myelooman kaltaisen taudin, ja jonka kasvaimet samalla fluoresoivat vihreällä. Solut he istuttivat pistolla
25 häntälaskimoon C57BL/KaLwRijHsd kannan hiiriin. Käyttämällä fluoresenssi illuminaattoria ja CCD-kameraa (Charge Coupled Device) nukutettujen hiirten koko kehon kasvaintaakka saadaan nopeasti selville hiirtä ja kasvaimia vahingoittamatta. Menetelmä on myös herkkä ja tarkka, sillä se ei antanut vääriä positiivisia eikä negatiivisia tuloksia.
26 3 TUTKIMUKSEN TARKOITUS, TAVOITE JA TUTKIMUSONGELMAT Tutkimuksen tarkoituksena oli testata, toimiiko tämä hiirimalli samalla tavalla kuin aikaisemmissa julkaisuissa on kuvattu. Tutkimus on suunniteltu julkaistujen artikkeleiden pohjalta. Koska tätä mallia ei ole aikaisemmin käytetty Pharmatest Services Oy:ssä, se piti testata ennen kuin sitä voidaan tarjota asiakkaalle. Samalla selvitettiin, onko bortezomib tehokas lääke multippelin myelooman hoitoon tässä eläinmallissa, ja tutkittiin, kumpi bortezomib-annos antaa paremman annosvasteen. Aiemmissa julkaisuissa on todettu, että kaksi viikkoa inokulointien jälkeen hiirten seerumin paraproteiinitasot alkavat nousta. 3-4 viikon kuluttua luumetastaasit voivat olla havaittavissa röntgenkuvissa ja osalle hiiristä on kehittynyt suurentunut perna, anemia, takaraajahalvaus, huomattavaa painonlaskua ja kakeksia eli tila, jossa eläin kuihtuu ja näivettyy. Eläimet lopetetaan tyypillisesti 3-5 viikon kuluttua inokuloinnin jälkeen. (Pharmatest Service Ltd 2009, 6.) Tutkimus oli osa laajempaa kehitysprojektia, jossa toimeksiantaja kehittää asiakkaille tarjottavaa multippeli myelooma hiirimallia. Mallia on tarkoitus käyttää asiakasprojekteissa uusien lääkeainekandidaattien tehon tutkimiseen, jolloin voidaan päättää, kannattaako lääkkeenkehitystä jatkaa, sekä siihen mikä on lääkkeen tehokkain annos ilman sivuvaikutuksia, ja mikä on paras annosteluaikataulu. Uusien lääkkeiden kehittäminen on hyvin tärkeää, koska multippeliin myeloomaan ei ole olemassa tällä hetkellä parantavaa hoitoa. Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää tätä hiirimallia. Tämä tutkimus oli kuitenkin vain yksi askel kohti toimivaa hiirimallia. Mallia on tarkoitus myöhemmin kehittää pidemmälle. Tavoitteena oli löytää myös verrokkilääke asiakkaiden lääkeainekandidaateille. Tällä kokeella saatiin alustava käsitys siitä, onko bortezomib sopiva verrokkilääkkeeksi, ja minkä suuruista annosta olisi jatkossa hyvä käyttää. Kokeessa käytetyillä annoksilla nähtiin, ilmeneekö kokeessa odottamatonta
27 variaatiota aiheuttavia seikkoja. Varsinainen annosvastekoe pitää tehdään vähintään kolmella eri annoksella. Tutkimusongelmat: 1. Toimiiko malli, niin kuin aiemmissa julkaisuissa on kuvattu? 2. Tehoaako bortezomib tässä hiirimallissa multippeliin myeloomaan? 3. Kumpi bortezomib-annos antaa paremman annosvasteen?
28 4 TUTKIMUKSEN TOTEUTUS 4.1 Toteutussuunnitelma Tutkimusta varten haettiin ja saatiin lupa Pharmatest Service Oy:ltä. Tutkimusta varten tehtiin toimeksiantosopimus (LIITE 2) Pharmatest Services Oy:n laboratoriopäällikön Jukka Rissasen ja tutkijan välillä. Tutkimuksen eläinkoeosuus tehtiin 18.2 3.4.2009 välisenä aikana. Alun perin koe piti suorittaa 18.2 20.3.2009 välisenä aikana, mutta eläinkoeosuutta pidennettiin kahdella viikolla, koska hiirten taudinkulku ei edennyt odotetusti. Eläinkoeosuus suoritettiin Biolaboratorion eläintiloissa. Eläinkoeosuuden jälkeen tehtiin luun biokemiallisten merkkiaineiden mittaukset ja analysoitiin niiden tulokset. Kuviossa 1 on esitetty tutkimuksen kulku.
29 Materiaalin keruu ja tutkimussuunnitelman teko, opinnäytetyön kirjoittaminen alkaa Aloituspalaveri, jossa sovitaan aikataulu ja työnjako Eläinten randomisointi ryhmiin Punnitukset ja annostelut 3 krt/vk, säännölliset verinäytteenotot Kokeen lopetus, jossa eläimiltä otettiin viimeinen verinäyte, ne röntgenkuvattiin, lopetettiin ja niistä kerättiin talteen kudosnäytteet Verinäytteiden analysointi Tulosten analysointi ja opinnäytetyön kirjoittaminen loppuun Kuvio 1. Vuokaavio tutkimuksen etenemisestä.
30 4.2 Tutkimuksen kulku Tässä tutkimuksessa käytettiin ortotooppista, syngeenistä hiirimallia, jonka aiheuttama tauti muistuttaa suuresti ihmisen multippelia myeloomaa. Mallissa käytetyt hiiret ovat immunokompetentteja eli niillä on normaalivastustuskyky, joka mahdollistaa sen, että mallilla voidaan tehdä myös immunoterapiakokeita. Tutkimuksessa käytettiin hiiren 5TGM1 myeloomasoluja, jotka istutettiin eläimiin häntälaskimon kautta. Taudin etenemistä seurattiin säännöllisillä verikokeilla, joista analysoitiin TRACP5b-, P1NPja paraproteiinipitoisuudet. Tutkimus suunniteltiin alun perin 28 päivää kestäväksi, mutta koska koe ei edennyt odotetulla tavalla, koetta jatkettiin 42 päivän mittaiseksi. 4.2.1 Kokeen aloitus Jo hyvissä ajoin ennen tutkimuksen alkua tutkimusjohtaja Mari Suominen oli anonut eläinkoelautakunnalta eläinkoeluvan (numero STH902A) koetta varten. Ennen tutkimuksen alkua tutkimusjohtaja Suominen laati tutkimusprotokollan, joka käytiin läpi aloituspalaverissa, jossa sovittiin tutkimuksen työnjaosta ja aikataulusta (LIITE 3). Ennen kokeen alkua tohtori Oyajobilta University of Texas Healt Science Center:stä saatuja hiiren 5TGM1 myeloomasoluja kasvatettiin tarvittava määrä koetta varten Pharmatest Services Oy:ssä. Tutkimuksessa käytettiin C57BL/KaLwRiJ kannan naarashiiriä, jotka olivat kokeen alussa 7 viikon ikäisiä. Hiiret oli tilattu Harlan:lta Hollannista. Kokeessa käytettiin 24 hiirtä, jotka jaettiin kolmeen tutkimusryhmään (n = 8). Otoskooksi tutkimuksenjohtaja valitsi 24, koska koe tehtiin ensimmäisen kerran, eikä haluttu eläinten menevän hukkaan, jos koe olisi epäonnistunut, esimerkiksi sen vuoksi, etteivät käytetyt solut olisikaan olleet elinkykyisiä inokuloinnin jälkeen. Tämän vuoksi ryhmäkoot pidettiin pieninä. Kuitenkin ryhmäkoko 8 on riittävän iso, jotta voidaan tehdä tilastollisia analyysejä. Tutkimuksen alussa, tutkimuspäivänä -2 hiiret randomisoitiin eli jaettiin tutkimusryhmiin painon perusteella. Sillä pyrittiin varmistamaan, että tutkimusryhmät
31 olisivat mahdollisimman yhdenmukaisia. Randomisoinnin yhteydessä hiiret merkittiin korvamerkeillä, jotta ne tunnistettiin jatkossa. Tutkimusryhmät olivat seuraavat: Ryhmä 1: Kontrolliryhmä, joka sai vehikkeliä (1,6 % etanolia 0,9 % NaCl:ssa) vatsaonteloon kolme kertaa viikossa. Ryhmä 2: Testiaineryhmä, joka sai bortezomib:a vatsaonteloon 1 mg/kg kolme kertaa viikossa. Ryhmä 3: Testiaineryhmä, joka sai bortezomib:a vatsaonteloon 2 mg/kg kolme kertaa viikossa. Tutkimuspäivänä 0 hiiriin inokulointiin eli istutettiin hiiren 5TGM1 myeloomasolut niiden häntälaskimon kautta. Hiiriä esilämmitettiin lämpölamppujen alla muutamia minuutteja ennen inokulointia, jotta niiden hännän laskimot laajenisivat ja niihin olisi helpompi inokuloida solut. Pharmatest Service Oy:n työntekijä valmisti kaksi solususpensiota, joissa oli miljoona myeloomasolua 200 µl:ssa. Suspension sisälsi solujen lisäksi PSB-liuosta (phosphate-buffered saline). Noin puolet eläimistä inokuloitiin ensimmäisestä solususpensioerästä ja toinen puoli toisesta solususpensioerästä. Hiiriin inokuloitiin 200 µl suspensiota. Hiiriä pistettiin 27G ¾ neulalla, joka oli kiinnitetty 1 ml:n ruiskuun. Soluja sekoitettiin varovasti pasteurpipetillä joka kerta ennen uuden inokulointiannoksen ottoa ruiskuun, jotta solususpensio oli mahdollisimman tasalaatuista kaikilla eläimillä. Ruiskuun otettiin 50 µl ylimääristä solususpensiota, jotta inokuloitaessa oli hieman pelivaraa, jos pisto ei onnistuisi ensi yrittämällä. Ylimääräistä solususpensiota ei injektoitu hiireen, jos pisto onnistui hyvin. Onnistuneen inokuloinnin jälkeen neulaa ei otettu heti pois suonesta vaan odotettiin joitakin sekunteja. Odotusaikana solut ehtivät lähteä verenkierron mukaan, eikä ollut vaaraa, että ne tulisivat ulos pistokohdasta. Inokuloinnin jälkeen pistokohtaa painettiin hetki puuvanulapulla verentulon tyrehdyttämiseksi. Lopuksi kunkin eläimen seurantakaavakkeeseen kirjattiin päivämäärä, kuinka inokulointi onnistui ja kuka sen suoritti. Tutkija pisti noin puolet 24 eläimestä ja tutkimusjohtaja