Käänteisestä rokotetutkimuksesta ratkaisu flavobakteeriongelmiin? 26.3.2015 Kalaterveyspäivät, Tampere Krister Sundell Akvaattisen patobiologian laboratorio Åbo Akademi
Flavobacterium psychrophilum Aiheuttaa kylmän veden tautia pääasiassa lohikaloille. Maailmanlaajuinen ongelma makean- ja murtoveden kalankasvatuslaitoksissa. Erityisen ongelmallinen kirjolohen poikasille. Tauti hoidetaan ympäristölle haitallisin antibiootein. Tehokkaan universaalirokotteen tarve on suuri.
Rokotekehitystyön haasteet Eri F. psychrophilum-tyypit. Tartunnalle alttiiden kalojen pieni koko. Tartuntatapa ja -reitti epäselvät. Perinteisin menetelmin kehitetyt rokotteet eivät suojaa kaloja tarpeeksi tehokkaasti kylmän veden tautia vastaan. Siirtyminen käänteiseen rokotetutkimukseen.
Perinteinen tapa Bakteeri Rokotekehityksen eri vaiheet Kasvatus Inaktivointi Rokote
Rokotekehityksen eri vaiheet Perinteinen tapa Bakteeri Käänteinen tapa Bakteeri Kasvatus DNA Geeni Inaktivointi Rokote Proteiini
DNA geeni proteiini Deoksiribonukleiinihappo (DNA). DNA sisältää eliön kaikkien proteiinien valmistusohjeen. Geeni on palanen DNA:ta ja sisältää valmistusohjeet tietylle proteiinille. Proteiinit suorittavat lähes kaikki solun toiminnot. Bakteerien taudinaiheuttamiskyvyn kannalta tärkeitä proteiineja ovat esim. toksiinit, adhesiinit ja invasiinit. Toksiinit Invasiinit Adhesiinit DNA
Käänteinen rokotetutkimus Bakteeri Toksiinit Invasiinit DNA DNA Adhesiinit Geeni Proteiini Rokote
Proteiinista rokote Rokotteeseen soveltuvan proteiinin ominaisuuksista: löytyy bakteerilajin kaikissa tyypeissä. kulkeutuu bakteerisolun ulkopintaan. käynnistää immuunivasteen. suojaa tautia vastaan. Toksiinit Invasiinit DNA Adhesiinit
Eri Flavobacterium psychrophilum-tyypit Perinteisesti jaettu eri (sero)tyyppeihin bakteerin pintarakenteiden mukaan. Eri serotyyppien määrä epäselvää (ks. taulukko 1). Taulukko 1. F. psychrophilum-bakteerin eri serotyypit. Serotyypit Tutkimus 2 Holt 1987; Wakabayashi et al. 1994 3 Rangdale 1995, Lorenzen & Olesen 1997, Izumi & Wakabayashi 1999 Yli 7 Mata et al. 2002 Siirtyminen DNA-analyyseihin eri F. psychrophilum-tyyppien selvittämiseksi ja seurannaksi.
EMIDA ERA-NET projekti PathoFish Yhteiseurooppalainen projekti viljellyn kalan F. psychrophiluminfektioita vastaan (2011 2014). Suomessa Maa- ja metsätalousministeriön rahoittama ja Åbo Akademin Akvaattisen patobiologian laboratorion toteuttama. Tavoitteet: F. psychrophilum-bakteerin populaatiorakenteen selvittäminen. Rokotteiden kehittäminen käänteisen rokotetutkimuksen avulla.
Populaatiorakenteen selvittäminen 1000 ympäri maailmaa kerättyä F. psychrophilum-näytettä. Genotyypitys multilokussekvensoinnilla. Tulos: 166 eri F. psychrophilum-(sekvenssi)tyyppiä. DNA + + Geeni 1 Geeni 2 Geeni 3 + + Geeni 4 Geeni 5 Geeni 6 + + Geeni 7 = sekvenssityyppi
F. psychrophilum-bakteerin populaatiorakenne Sundell & Wiklund (2015). Characteristics of epidemic and sporadic Flavobacterium psychrophilum sequence types. Aquaculture 441: 51-56.
Epideeminen populaatiorakenne Lohi Kirjolohi Kirjolohi Kirjolohi Aju Aju Sundell & Wiklund (2015). Characteristics of epidemic and sporadic Flavobacterium psychrophilum sequence types. Aquaculture 441: 51-56.
Populaatiorakenteesta rokotteeseen Valittiin 21 eri F. psychrophilum-tyyppiä tarkempiin DNAanalyyseihin, eli koko genomin sekvensointiin. Etsittiin tiettyjä geenejä, jotka löytyvät kaikista eri tyypeistä. Käytettiin löydetyt geenit proteiinituotantoon. Tuotettiin 32 rokotteeseen soveltuvaa proteiinia. Testattiin kolmen proteiinin tehoa rokotteena kylmän veden tautia vastaan.
Rokotekoe proteiineilla Kolme eri proteiinirokotetta. Yksitellen injektiorokotteina (15 µg/kala) + adjuvantti. Kirjolohi (35 g, 40 kpl/rokote). Altistuskoe F. psychrophilum-bakteerilla. Tulokset: ROKOTE KUOLLEISUUS (%) RPS Proteiini 1 60 28 Proteiini 2 71 15 Proteiini 3 73 14 Ei rokotetta 84 0 RPS = suhteellinen selviytymisprosentti
Pohdinta Syyt proteiinirokotteiden heikkoon suojaan: väärät proteiinit? (vain 3/32 testattu) väärä proteiinimäärä? vaatiiko proteiiniyhdistelmän toimiakseen? Tutkimusprojekti on päättynyt; olisiko syytä jatkaa...?
Kiitokset Maa- ja metsätalousministeriö (MMM) PathoFish-projektin ohjausryhmä: Kajsa Hakulin (MMM, puheenjohtaja) Sirpa Heinikainen (Evira) Marja-Liisa Hänninen (Helsingin yliopisto) Lotta-Riina Sundberg (Jyväskylän yliopisto) Tom Wiklund (Åbo Akademi, tutkimusryhmän johtaja)