(B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 83974 C (51) Kv.lk.5 Int.c1.5 C 12P 21/00, C 12N 15/38 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 832632 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent - och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 19.07.83 (24) Alkupäivä - Löpdag 19.07.83 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 21.01.84 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 14.06.91 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 20.07.82 US 400028 P 25.10.82 US 436368 P 06.07.83 US 510551 P (71) Hakija - Sökande 1. Molecular Genetics, Inc., 10320 Bren Road East, Minnetonka, Minn., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Watson, Roger John, 3300 Emerson Avenue South, Minneapolis, Minn., USA, (US) 2. Weis, John Haynes, 33 Pond Avenue, Apt. B606, Brookline, Mass., USA, (US) 3. Enquist, Lynn William, 5691 Zumbra Drive, Excelsior, Minn., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Berggren Oy Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Herpes simplex-viruksen gd-glykoproteiinin valmistus Framställning av Herpes simplex-virusets gd-glykoprotein (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Science 209 (1979) p. 541-544, Chemical Abstracts 95 (1981) 165275t, Chemical Abstracts 96 (1982) 194306e, Science 218 (1982) p. 381-384, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) p. 6612-16, Nature 302 (1983) p. 72-74 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö tarjoaa menetelmiä ja seoksia Herpes simplex-viruksen (HSV tyyppi 1 tai tyyppi 2) glykoproteiinigeenin (gd-geenin) kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi yksisoluisissa isäntäorganismeissa. Myös selostetaan menetelmiä, joilla näitä uusia yksisoluisia organismeja viljellään HSV-geenituotteiden tuottamistarkoituksessa. HSV-gD:lle sukua olevat polypeptidit, joita tuotetaan tässä kuvatulla yhdistelmä-dna-tekniikalla, voidaan formuloida käytettäviksi immunogeeneinä rokotteissa, jotka antavat suojan HSV-1- ja HSV-2-tartuntoja vastaan. Förfaranden och kompositioner beskrives för kloning och uttryckande av Herpes simplex-virusecs (HSV typ 1 eller typ 2) glykoproteingen (gd-gen) i encelligavärdorganismer. Ytterliare heskrivs förfaranden tör kultiverimi av dessa nya encelliga organismer för bildandc av HSV-genprodukler. HSV-gD-bestade polypeptider producerade genom den hår beskrivna rekombinerings-dua- 47ekniken kan formuleras för användning som immunogener i vacciner för skydd mot HSV-1- och HSV-2-infektioner.
1 83974 Herpes simplex-viruksen gd-glykoproteiinin valmistus 1. Keksinnön ala Keksintö koskee menetelmiä sellaisten proteiinien valmistamiseksi, jotka ovat Herpes simplex-viruksen (HSV) gd-glykoproteiinin kaltaisia. Keksinnössä käytetään yhdistelmä-dna-tekniikkaa, jonka avulla glykoproteiini D:tä (gd) tai sen osaa koodittava DNA-sekvenssi liitetään DNA-vektoriin, joka on virus-dna:ta, plasmidi-dna:ta tai bakteriofagi-dna:ta niin, että vektori kykenee toisiintumaan ja ohjaamaan gd-geenin ilmentymistä bakteeri-isännässä tai muussa yksisoluisessa systeemissä. Saatu yhdistelmä-dna-molekyyli siirretään isäntäsoluihin niin, että isäntäsolut kykenevät tuottamaan gd:tä tai sen osaa tai sen jollakin tavalla muuntunutta molekyyliä. Sitten tuotettu proteiini eristetään, puhdistetaan ja muunnetaan käytettäväksi immuunisuutta aiheuttavana aineena rokotteessa sekä HSV-tyypin 1 (HSV-1) ja tyypin 2 (HSV-2) aiheuttamaa tartuntaa vastaan. 2. Keksinnön tausta 2.1. Yhdistelmä-DNA-tekniikka ja geenien ilmentäminen Yhdistelmä-DNA-tekniikassa liitetään tiettyjä DNA-sekvenssejä DNA-apuvälineeseen (vektoriin) niin, että muodostuu yhdistelmä-dna-molekyyli, joka kykenee toisiintumaan isäntäsolussa. Yleensä liitetty DNA-sekvenssi on vieras vastaanottajana toimivalle DNA-apuvälineelle, so. liitetty DNAsekvenssi ja DNA-vektori on johdettu organismeista, jotka eivät vaihda keskenään geneettistä informaatiota luonnossa, tai liitetty DNA-sekvenssi voi olla täysin tai osittain synteettisesti valmistettu. Viimevuosina on kehitetty useita yleisiä menetelmiä, joilla on mandollista rakentaa yhdistelmä-dna-molekyylejä. Esimerkiksi US-patentissa
2 83974 4 237 224 kuvataan tällaisten plasmidien tuotantoa käyttämällä restriktioentsyymejä ja yhteenliittämismenetelmiä. Sitten nämä yhdistelmäplasmidit siirretään yksisoluisiin organismeihin, joissa ne toisiintuvat, josta siirtämisestä käytetään nimitystä transformointi. Koska tekniikan yleinen soveltaminen on selostetty US-patenttijulkaisussa 4 237 224, se sisällytetään viitteeksi nyt käsillä olevaan selostukseen. Vielä erästä menetelmää yhdistelmä-dna-molekyylien siirtämiseksi yksisoluisiin organismeihin on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 304 863, joka myös sisällytetään viitteeksi tässä. Kyseisessä menetelmässä käytetään bakteriofagivektoreilla tapahtuvaa pakkaus/transduktiosysteemiä. Huolimatta rakentamismenetelmästä pitää yhdistelmä-dna-molekyylin olla yhteensopiva isäntäsolun kanssa, so. sen pitää kyetä toisiintumaan autonomisesti isäntäsolussa. Yhdistelmä-DNA-molekyylin pitäisi myös sisältää sellainen merkki, joka mandollistaa yhdistelmä-dna-molekyylillä transformoituneiden isäntäsolujen valitsemisen. Lisäksi, jos blasmidissa on tarvittavat toisiintumis-, transkriptio- ja luentasignaalit oikein ryhmittyneinä, vieras geeni ilmentyy transformoituneissa soluissa ja niiden jälkeläisissä oikein. Kuten kaikille viruksille, jotka infektoivat eukaryoottisia soluja, on myös Herpes simplex-virukselle ominaista se, että se vaatii eukaryoottisen isäntäsolusysteemin voidakseen replikoida perimänsä, ilmentää virusperäisiä geenejänsä ja luoda jälkeläisiä. Eukaryooteissa esiintyvä virusjoukko ja geenin ilmentymisen ja DNA:n toisiintumisen signaalit ja ohjausyksiköt eroavat prokaryoottien vastaavista. Tämä on erittäin tärkeätä, kun prokaryoottisissa isäntäsoluissa halutaan ilmentää geeni, joka luonnossa ilmentyy vain eukaryoottisissa soluissa. Nämä erilaiset geneettiset signaalit ja prosessointitapahtumat ohjaavat monia geenin ilmentymisen tasoja, kuten DNA-transkriptiota
3 83974 ja lähetti-rna:n luentaa. DNA:n transkriptio on riippuvainen promoterin läsnäolosta, joka on DNA-sekvenssi, joka ohjaa RNApolymeraasin sitoutumista ja näin ollen vauhdittaa transkriptiota. Eukaryoottisten promoterien DNA-sekvenssit eroavat prokaryoottisten promoterien vastaavista. Lisäksi saattaa olla niin, että prokaryoottiset systeemit eivät tunnista eukaryoottisia promotereja ja niihin liittyviä geneettisiä signaaleja tai ne eivät toimi prokaryoottisissa systeemeissä. Vastaavasti lähetti-rna:n (mrna) luenta prokaryooteissa riippuu sopivien prokaryoottisten signaalien läsnäolosta, jotka eroavat eukaryoottien vastaavista. mrna:n tehokas luenta prokaryooteissa vaatii sen, että mrna:ssa on ribosomaalinen sidoskohta, jonka nimi on Shine Dalgarno-sekvenssi (SD). Tämä sekvenssi on mrna:ssa oleva lyhyt nukleotidisekvenssi, joka sijaitsee ennen alkukodonia (AUG), joka koodittaa proteiinin aminopään metioniinia. SD-sekvenssit ovat komplementaarisia 16S-rRNA:n (ribosomi-rna) 3'-pään suhteen ja luultavasti edistävät mrna:n sitoutumista ribosomeihin pariutumalla rrna:n kanssa niin, että tapahtuu oikea asettuminen ribosomille. Geenien ilmentämisen maksimoinnista ovat Roberts ja Lauer esittäneet katsauksen julkaisussa Methods in Enzymology, 68: 473, 1979. Monet tekijät vaikeuttavat eukaryoottisten geenien ilmentymistä prokaryooteissa vielä senkin jälkeen, kun signaalit on liitetty ja saatu oikeisiin asemiin. Selkeä tieto näiden tekijöiden luonteesta ja niiden toimintamekanismeista puuttuu tällä hetkellä. Yksi tällainen tekijä on aktiivisen proteolyyttisen systeemin läsnäolo E.colissa ja muissa bakteereissa. Tämä proteiineja hajottava järjestelmä näyttää selektiivisesti tuhoavan "epänormaalit" tai vieraat proteiinit, kuten eukaryoottiset proteiinit. Näin ollen olisi erittäin hyödyllistä, jos löytyisi tapa suojella bakteereissa ilmentyneitä eukaryoottisia proteiineja proteolyyttiseltä hajoamiselta. Yksi lähestymistapa on rakentaa yhdistelmägeenejä, joissa eukaryoottinen sekvenssi on liitettynä vaiheeseen (so. oikeaan lukukehykseen)prokaryoottisen geenin
4 83974 kanssa niin, että syntyy yhdysproteiinituote (proteiini, joka on prokaryoottisten ja eukaryoottisten aminohappojärjestysten yhdistelmä). Yhdistelmägeenien rakentaminen oli lähestymistapa, jota käytettiin eukaryoottisia proteiineja, kuten somatostatiinia, rotan proinsuliinia, kasvuhormonia ja ovalbumiinin kaltaista proteiinia, koodittavien geenien molekulaarisessa kloonauksessa. Lisäksi prokaryoottisia promotereja on liitetty tällaisiin yhteenliittyneisiin geenisekvensseihin ovalbumiinin ja 13-globiinin ollessa kyseessä (Guarente et al., 1980, Cell 20:543). Guarente et al:n järjestelmässä liitetään lac-promoteri, SD-sekvenssi mukaanluettuna, eri etäisyyksille yhdistelmägeenin ATG:n eteen. Vaikka useiden eukaryoottisten geenien molekulaarinen kloonaus ja ilmentäminen onkin saatu aikaan, näin ei ole vielä tapahtunut gd-geenin kohdalla. Tekniikan tasokaan ei liioin ole tällä hetkellä sellainen, että vieraiden tai eukaryoottisten geenien ilmentäminen prokaryoottisissa isäntäsoluissa voitaisiin suorittaa rutiininomaisesti. 2.2. Rokotteet Virusinfektioiden hallinnassa ja hoidossa on olemassa kolme perustapaa: (1) rokotteet, jotka antavat aktiivisen immuunireaktion; (2) kemoterapeuttiset aineet, jotka estävät virusten lisääntymisen; ja (3) aineet, jotka saavat aikaan interferonisynteesin. Kaikkia kolmea tapaa voidaan käyttää tartunnan saannin ehkäisyssä, mutta ne ovat tehokkaampia tartunnan alkuvaiheessa käytettyinä. Rokottaminen tai aktiivinen immuuniksitekeminen ovat tavallisesti tehottomia sen jälkeen, kun tartunta on jo saatu. Rokotteet valmistetaan yleensä tekemällä virus haitattomaksi sen immunologisia ominaisuuksia tuhoamatta. Perinteisesti tämä tehdään joko inaktivoimalla viruksen tarttuvuus (so. "tappamalla" virus tavallisesti käsittelemällä erilaisilla kemiallisilla aineilla, kuten formaldehydillä), jonka jälkeen sitä voidaan käyttää inaktivoiduissa rokotteissa, tai valitsemalla avirulentti tai heikentynyt (muunnettu) virus käytettäväksi elävissä rokot-
5 83974 teissa (heikennetyt rokotteet). Heikentyminen saadaan aikaan sopeuttamalla virus epätavallisiin olosuhteisiin (eri eläinisäntiin ja soluviljelmiin) ja käymällä läpi useita suuria virussiirrosteita sellaisten mutanttien valitsemiseksi, jotka ovat menettäneet virulenttisuutensa ja näin ollen eivät aiheuta lainkaan oireita tai aiheuttavat vain vähäisiä oireita. Muutamat vieläkin eläinten lääkityksessä käytetyt rokotteet sisältävät täysin virulenttia, tarttuvaa virusta, joka injektoidaan kohtaan, jossa viruksen lisääntymisellä on vain vähäisiä vaikutuksia. Tämä menettely on katsottu liian vaaralliseksi ihmisen kohdalla. Elävissä rokotteissa käytetyt heikennetyt virukset ovat yleensä erinomaisia immunogeenejä, koska heikentynyt virus lisääntyy isäntäsolussa antaen pitkäaikaisen immuunisuuden. Heikennetyt rokotteet aikaansaavat nesteen mukana kulkevia vasta-aineita, jotka kohdistuvat kaikkiin virusantigeeneihin, sekä virionin pinnassa että sisällä oleviin antigeeneihin. Kuitenkin elävien rokotteiden käyttöön liittyy lukuisia vaikeuksia, kuten viruksen riittämätön heikentyminen, viruksen geneettinen epästabiilisuus, satunnaisten virusten aiheuttama kontaminoituminen soluviljelmissä, joita käytetään rokoteviruksen kasvattamisessa, ja lopuksi rokotteen epästabiilisuus (esim. lämpölabiilisuus). Vaikka inaktivoiduilla rokotteilla (käyttämällä "tapettua" tai inaktivoitua virusta, joka ei lisäänny) vältetään elävien rokotteiden käytössä kohdatut vaikeudet, eivät tapetut virukset lisäänny immunisoitavassa eläimessä ja tavallisesti ne tuottavat vasta-aineita, jotka kohdistuvat vain pintakomponentteihin. Inaktivoitujen rokotteiden kohdalla on kuitenkin päävaikeutena se, miten tuottaa riittävästi virusta, jotta saataisiin aikaan riittävä määrä relevanttia antigeeniä. Muita inaktivoitujen rokotteiden käyttöön liittyviä vaikeuksia ovat ne, että saavutettu immuniteetti on lyhytaikainen ja vaatii usein lisärokotuskertoja, antigeeniset kohdat saattavat muuttua inaktivoivassa kemiallisessa käsittelyssä ja olla näin vähemmän immunogeenisiä tai ne voivat saada aikaan vasta-aineita, jotka ovat vähemmän
6 83974 tehokkaita virusinfektioiden neutraloinnissa, eivätkä rokotteet useinkaan aikaansaa tyydyttäviä IgA-pitoisuuksia. Osarokotteet sisältävät vain tarpeellisen ja tarkoitukseen sopivan immunogeenisen materiaalin, kuten koteloitumattomien ikosahedraalivirusten kapsidiproteiinit tai koteloituneiden virusten peplomeerit (glykoproteiinipiikit). Osarokotteet voidaan valmistaa eristämällä tarkoitukseen sopiva alayksikkö erittäin hyvin puhdistetuista virusjakeista tai syntetisoimalla tarkoitukseen sopiva polypeptidi. Osarokotteisiin liittyvä pääetu on siinä, että voidaan sulkea pois virusperäinen geneettinen materiaali ja isännästä tai luovuttajasta peräisin olevat haittaavat aineet. Kuitenkin näillä menetelmillä tapahtuva osarokotteiden valmistus on liian kallista laajaa kaupallista käyttöä ajatellen. Yhdistelmä-DNA-tekniikalla on paljon tarjottavaa osarokotteiden valmistukselle, sillä sellaisten virusgeenien molekulaarinen kloonaus ja ilmentäminen isäntäsoluissa, jotka koodittavat tarkoitukseen sopivia viruksen immunogeenisiä osia tai proteiineja, voi tuottaa riittäviä määriä sopivaa immunogeeniä osarokotteessa käytettäväksi. Rokotteet annetaan usein erilaisia apuaineita sisältävinä emulsioina. Apuaineet auttavat siten; että saavutetaan kestävämpi ja suurempi vastustuskyky käyttämällä pienempiä määriä antigeeniä vähempinä annoksina kuin olisi laita, jos immunogeeni annettaisiin sellaisenaan. Apuaineiden toimintamekanismi on monimutkainen, eikä sitä ymmärretä vielä täysin. Kuitenkin kyseessä saattaa olla fagosytoosin stimuloituminen tai muut retikuloendoteliaalisen järjestelmän toiminnat sekä antigeenin viivästynyt vapautuminen ja hajoaminen. Esimerkkeinä apuaineista voidaan mainita Freund'in apuaine (täydellisenä tai epätäydellisenä), Adjuvant 65 (sisältää maapähkinäöljyä, mannidimono-oleaattia ja alumiinimonostearaattia) ja mineraaligeelit, kuten alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti ja aluna. Freund'in apuainetta ei enää käytetä rokoteformulaatioissa ihmisillä tai ravinnoksi käytetyillä eläimillä, koska se sisältää aineenvaihdunnassa hajoamatonta mineraaliöljyä ja se on mandollinen syöpääaiheuttava aine;
7 83974 kuitenkin mineraaligeelejä käytetään laajasti kaupallisissa eläinten rokotteissa. 2.3. Herpesvirukset Herpesvirukset (herpetoviridiae) ovat suuria DNA-viruksia, joille on ominaista se, että ne saavat aikaan latentteja infektioita, jotka voivat säilyä isännän koko elinajan. Esi-infektion, joka saattaa olla huomaamaton, jälkeen virus säilyy lepotilassa siihen asti, kunnes se aktivoituu uudestaan erilaisten stimuloivien vaikutusten vuoksi, joiksi epäillään sellaisia kuin säteily tai immunosuppressio. Aktiivisessa tilassa tai infektion akuutissa muodossa on tyypillistä produktiivisen tai lyyttisen infektion esiintyminen, so. virus lisääntyy, valtaa isäntäsolun toimintamekanismin, tuottaa kypsiä, tarttuvia virioneja ja aiheuttaa solun kuoleman. Lepovaiheessa virus taas säilyy isännän ganglioissa, eikä ole juuri lainkaan todisteita siitä, että tartuttavia viruksia valmistuisi lepovaiheen aikana. Useimmat esi-infektiot tapahtuvat lapsuudessa ja ne voivat olla huomaamattomia. Tartunta voi aiheutua viruksen siirtymisestä limakalvoon tai viruksen joutumisesta ihoon epidermikerroksen pinnassa olevan haavan kautta. Näin ollen virus voi siirtyä läheisessä kosketuksessa. Kun HSV kerran on saatu, se säilyy kehossa koko elinajan ja uhri joutuu sen toistuvien hyökkäysten kohteeksi, jotka voivat olla oireettomia tai johtaa erilaisiin kliinisiin ilmenemismuotoihin, kuten ihon limakalvon sairauksiin, joita ovat mm. herpes labialis (haavoja huulessa, joita usein nimitetään "kylmärakoiksi"), gingivostomatitis (suu ja ikenet peittyvät rakkuloilla, jotka puhkeavat ja muuttuvat haavoiksi), pharyngitis, tonsillitis, keratoconjuctivitis (keratitis tai silmän sarveiskalvon tulehdus, joka etenee haaraiseksi haavaksi, ja voi lopulta johtaa sarveiskalvon arpeutumiseen ja sokeuteen) ja sukuelinherpes. Harvemmin HSV-tartunta voi aiheuttaa sairauksia, joiden nimet ovat encephalitis, eczema herpeticum, traumaattinen herpes, hepatitis ja vastasyntyneen herpes.
8 83974 Aktiivisten puhkeamisten aikana voidaan tartunnan aiheuttanut virus eristää haavoista tai niitä ympäröivistä nesteistä, esim. syljestä, kun kyseessä on herpes labialis. Näiden vammojen, jotka ovat taipuvaisia puhkeamaan kyseisen yksilön samoissa kohdissa, syntymistä edesauttavat lukuisat ärsykkeet, kuten menstruaatio, pitkä altistuminen auringonvalolle tai kylmälle tuulelle, aivolisäke- ja lisämunuaishormonit, allergiset reaktiot tai erittäin tavallisesti kuume. Tällaisten puhkeamisten aikana sairastuneet levittävät virusta ja voivat aiheuttaa tartunnan muille kosketuksen välityksellä. Tutkimuksissa on osoitettu,että infektion latentin vaiheen aikana virus pesii muussa paikassa kuin mihin vammat myöhemmin muodostuvat. Lepovaiheessa virus on paikannettu tuntoganlioiden neuroneista (kasvovammojen ollessa kyseessä, usein mukana on kolmihaarainen ganglio) eikä sitä voida eristää tavallisista vaikutusalueista. Vaikka useimmat lapset toipuvat nopeasti esi-infektiosta, joskus saattaa käydä niin, että hepatiitille ominainen hajapesäkkeinen vastasyntyneen herpestartunta valtaa koko vastasyntyneen. Kohtalokkaimmat tartunnat saadaan synnytyksen yhteydessä tartuntaa kantavilta apuhenkilöiltä tai tavallisemmin tartuntaa kantavalta äidiltä, kun lapsi joutuu kosketukseen synnytyskanavassa olevan sukuelinherpeksen kanssa. Vulvovaginitis naisilla ja lapsilla ja penisinfektiot miehillä katsottiin aikaisemmin HSV-2:n aiheuttamiksi, mutta viimeaikaiset tulokset osoittavat, että joko HSV-1 tai HSV-2 voi olla syyllinen; lisäksi herpeksen aiheuttaman veneerisen tartunnan on naisilla katsottu olevan yhteydessä kohdunkaulan syöpään. Herpeksen aiheuttamat tartunnat ovat saavuttaneet epidemian mittasuhteet nyky-yhteiskunnassa. Tällä hetkellä ei ole olemassa parantavaa hoitoa HSV-tartunnoille ja käytössä olevissa hoidoissa käytetään yhdisteitä, jotka estävät DNA-synteesiä. Nämä yhdisteet ovat tietysti epäspesifisiä siten, että ne estävät jakautuvien solujen solu-dna:n synteesiä ja virus-dna:n synteesiä.
9 83974 Lisäksi nämä yhdisteet ovat hyödyllisiä vain infektion aktiivisessa vaiheessa eikä niillä ole tähän mennessä osoitettu olevan vaikutusta lepovaiheessa. Herpesvirukset ovat eukaryoottien viruksia ja ne sisältävät lineaarisen, kaksisäikeisen DNA-perimän, jonka koko on 80 x 10 6-150 x 10 6 daltonia. Jokaisella virionilla on ikosahedraalinen nukleokapsidi ja kalvokuori, joka muodostuu ottamalla isännästä solun lipidikaksoiskerrosta kypsymisen ja silmikoitumisen aikana. Viruksen kuori on lipidikaksoiskerros, joka sisältää useita virukselle ominaisia spesifisiä proteiineja, jotka osaksi tunkeutuvat kalvon ulkopuolelle, vaikka ovatkin osaksi kalvon ympäröimiä. Kalvokuorta tarvitaan esi-infektion yhteydessä, jotta virushiukkanen pystyy tehokkaasti tunkeutumaan soluun. Vasta-aineet, jotka spesifisesti sitoutuvat lipidikaksoiskerroksen ulkopuolella oleviin virusproteiineihin, kykenevät neutraloimaan viruksen tarttuvuuden. Ne viruksen proteiinit, jotka ovat oleellisimpia viruksen soluuntunkeutumiselle, ovat glykoproteiineja (proteiinimolekyylejä, joihin on liittyneinä sokerimolekyylejä). Herpes simplex-viruksen tyypit 1 (HSV-1) ja 2 (HSV-2) tuottavat kukin vähintään neljää erilaista glykoproteiinia, jotka eroavat toisistaan antigeeniominaisuuksiltaan. Eräillä näistä HSV-1- ja HSV-2-proteiineista on samoja epitooppeja (so. antigeenikohtia tai vasta-aineen kiinnittymiskohtia). Yksi esimerkki tällaisista proteiineista on glykoproteiini, jolle on annettu nimitys gd, ja jonka koko on 49 000-58 000 daltonia. Polyvalenttinen HSV-1- gd:n vastainen antiseerumi kykenee neutraloimaan sekä HSV-1- että HSV-2-infektioita (Norrild, 1979, Current Topics'in Microbiol. and Immunol. 19: 67). 3. Yhteenveto keksinnöstä Keksintö tarjoaa menetelmiä ja seoksia HSV-glykoproteiinin geenin kloonaamiseksi ja ilmentämiseksi yksisoluisessa isäntäorganismissa. Myös kuvataan menetelmiä näiden yksisoluisten organismien viljelemiseksi niin, että saadaan HSV-geenituote, ja menetelmiä geenituotteen puhdistamiseksi. Tässä kuvatuilla yhdistelmä-dna-menetelmillä valmistettu gd:n kaltainen proteiini
10 83974 voidaan formuloida käytettäväksi vastustuskyvyn aiheuttavana aineena rokotteissa antamaan suoja HSV-1- ja HSV-2-infektioita vastaan. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa. HSV-1:n gd-geeni (eristetty HSV-1 Patton-kannasta) identifioitiin viruksen perimästä tyyppienvälisellä yhdistelmäanalyysillä (intertypic recombinational analysis) ja mrnakartoituksella. Kun kyseessä oleva DNA-jakso oli paikannettu, geenin nukleotidijärjestys määritettiin ja sen perusteella voitiin ennustaa gd-proteiinin aminohappojärjestys. HSV-2:n gd-geeni (eristetty HSV-2-kannasta G) identifioitiin viruksen perimästä vastaavasti kuin gd paikannettiin HSV- 1:n perimästä ja hybridisaatioanalyysillä. Sitten eristetyt gd-geenit tai geenijaksot (tyyppi 1 tai tyyppi 2) liitettiin plasmidivektoreihin niin, että saatiin yhdistelmäplasmideja, jotka toimivat biologisina replikoitumisyksikköinä. Nämä yhdistelmäplasmidit rakennettiin siten, että gd-geenit pystyivät sekä replikoitumaan että ilmentymään sen jälkeen, kun sopivat isäntäsolut olivat transformoituneet. Lisäksi plasmidit ovat sellaisia, että niillä voidaan yksivaiheisella toimenpiteellä identifioida sellaiset transformoituneet mikro-organismit, jotka ilmentävät gd-geenejä aktiivisesti. Lopuksi kuvataan menetelmiä ilmentyneiden geenituotteiden eristämiseksi ja käyttämiseksi rokotteen formuloinnissa. 4. Liitteenä olevat kuvat Keksintö voidaan ymmärtää täydellisemmin seuraavan yksityiskohtaisen selostuksen, keksinnön toteutustapaesimerkkien ja liitteenä olevien kuvien avulla, joista: Kuva la esittää HSV-1:n perimää ja osoittaa yhden ainoan lyhyen alueen (Us) paikan, jossa HSV-1:n gd-geeni sijaitsee (käytetään tästä lähtien nimitystä gd-1-geeni).
11 83974 Kuva lb esittää lambda gtwes::ecori-h:ssa olevan liitetyn HSV-1- EcoRI-H-palasen restriktiokarttaa. Vain selostuksen kannalta oleelliset katkaisukohdat on merkitty kuvaan. Restriktioentsyymien tunnistuskohdat on lyhennetty seuraavalla tavalla: BamHI (Ba4-Ba8); BglII (Bg2); BstEII (Bs); EcoRI (RI); HindIII (H3); KpnI (Kp); PvuII (Pv); SacI (Sc); SalI (Sa) ja XhoI (Xh). Kuva lc esittää plasmidin prwf6 rakentamista, jossa lambda gtwes:ecori-h:n BamHI-8-BamHI-7-palanen liitetään plasmidiin pbr322. Kuva ld esittää psc3o-4:ään liitetyn HSV-1-Sac I-DNA-palasen restriktiokarttaa. Paksunnettu alue kuvaa gd-1-mrna:ta koodittavan sekvenssin sijaintia ja asemaa. Kuva 2 esittää gd-l-geenin sekvenssinmääritystapaa ja restriktiokarttaa. Koodittava alue on merkitty paksunnettuna ja koodittamaton alue pelkällä ohuella viivalla. Palasten eristämisessä, radioaktiivisessa merkitsemisessä ja sekundäärisessä hajotuksessa käytetyt restriktioendonukleaasien katkaisukohdat on merkitty. Vaakasuorat nuolet edustavat niitä alueita, joiden DNA-sekvenssi on määritetty: restriktiokartan yläpuolella olevat nuolet merkitsevät, että koodittamattoman säikeen sekvenssi määritettiin; restriktiokartan alapuolella olevat nuolet merkitsevät, että templaattisäikeen sekvenssi määritettiin. Kuva 3 esittää gd-l-geenin nukleotidisekvenssiä ja gd-l-proteiinin ennustettua aminohapposekvenssiä. Relevantit restriktiokohdat on merkitty kuvaan ja numeroidut pystysuorat nuolet gd-1:n aminoa koodittavassa päässä osoittavat kohtaa, jossa gd-l:n aminoa koodittava pää on liittynyt pjs413:een seuraavissa yhdistelmäplasmideissa: peh51, peh6o, peh62, peh66, peh71, peh73 ja peh74, jotka sisältävät loput gd-l-sekvenssistä sen luonnolliseen TAG:hen asti; ja peh4-2, peg82, peh3-25 ja peh9o-n-sarja, jotka koodittavat Cro/gD-1/f3-galaktosidaasiyhdys - proteiineja. gd-l:n karboksipäässä olevat numeroidut pystysuorat nuolet tarkoittavat kohtia, joissa gd-l:n karboksia
12 83974 koodittava pää on liittynyt (1) pjs413:n P.-galaktosidaasigeeniin (z-geeni) seuraavissa yhdistelmäplasmideissa: peh4-2, peh82, peh3-25; tai (2) phk414:n z-geeniin peh9o-n-sarjan plasmideissa. Kuva 4 (ei ole piirretty mittakaavaan) esittää peh25:n rakentamista, joka on yhdistelmäplasmidi, joka on johdettu gd-l-geenin osasta ja E. colin ilmentämisvektorista pjs413. Yhdistelmäplasmidi peh25 ohjaa HSV-1-gD:lle sukua olevan proteiinin tuotantoa, jota koodittaa noin 87 % gd-l:tä koodittavasta sekvenssistä, joka on liitetty ilmentämisvektorista johdettuun "johtosekvenssiin" (cro). Kuva 5 esittää peh25:ssä olevan Cro/gD-1-liitoksen DNA-sekvenssiä ja ennustettua aminohapposekvenssiä. Kuva 6 esittää peg25-gd-tuotteen immuunisaostumisen inhiboitumista, kun lisätään HSV:llä infektoituneiden HeLa-solujen lysaateissa olevia kilpailevia antigeenejä. Avoimet ympyrät edustavat infektoitumattomien HeLa-solujen lysaatteja (verrokit); avoimet neliöt edustavat HSV-l:llä infektoituneiden HeLa-solujen lysaatteja. Kuva 7 (ei ole piirretty mittakaavaan) esittää peh4-2:n rakentamista, joka on peh25:stä johdettu gd-l:n ilmentämisplasmidi, jossa gd-l:tä koodittavan sekvenssin 3'-päästä on poistettu 205 nukleotidia (69 aminohappoa) ja korvattu noin 3000 lisänukleotidilla, jotka koodittavat E. colin 13-galaktosidaasiproteiinia. Tällä yhdistelmäplasmidilla voidaan tuottaa "voileipäproteiinia" (tai yhdysproteiinia), jossa E. coliin liittyviä polypeptidejä (so. Cro ja (3-galaktosidaasi) on liittynyt gd-1-spesifisen proteiinin päihin vastaavasti. Kuva 8 (ei ole piirretty mittakaavaan) esittää menetelmää useiden gd-l:tä ilmentävien plasmidien, pehso+x, tuottamiseksi, joista kukin sisältää eripituisen jakson gd-geenin aminoa koodittavasta päästä.
13 83974 Kuva 9 (ei ole piirretty mittakaavassa) esittää menetelmää, jolla peh4-2:n gd-l-geenin aminoa koodittava pää rekonstruoidaan niin, että plasmidilla peh82 transformoituneet isäntäsolut ilmentävät gd-l-proteiinia, joka on liittynyt 8-galaktosidaasiin. Kuva 10 (ei ole piirretty mittakaavassa) esittää peh9o-loamplasmidin rakentamista, joka on peh3-24:stä ja phk414:stä johdettu gd-1:n ilmentämisplasmidi. Yhdistelmäplasmidi peh90-10am tekee mandolliseksi sekä erillisen että 8-galaktosidaasiin liittyneen gd-l:n valmistamisen E.coli-transformanteilla, jotka sisältävät kullanruskean (amber) suppressori-trna:ta. Kuva lla esittää HSV-2-perimää ja siihen on merkitty BglII-palasen sijainti ainoassa, lyhyessä alueessa (Us), joka sisältää HSV-2:n gd-geenin (käytetään tästä lähtien nimitystä gd-2-geeni). BglII-katkaisukohdista, jotka määrittelevät L-palasen, on käytetty merkintää Bg. Kuva llb esittää phv1:een liitetyn BglII L-palasen restriktiokarttaa. Ainoastaan relevantit restriktioendonukleaasien tunnistuskohdat on merkitty esiin. Restriktioentsyymien tunnistuskohdat on lyhennetty seuraavasti: BamHI (Ba); BglII (Bg); ClaI (C); HindIII (H3); PvuII (Pv); SalI (Sa); SacI (Sc); SphI (Sp) ja XhoI (Xh). Paksunnettu alue tarkoittaa gd-2-mrna:ta koodittavan sekvenssin sijaintia ja asemaa. Kuva llc esittää phv2:n liitännäisen HSV-2-XhoI-DNA-palasen restriktiokarttaa. Kuva 12 esittää gd-2-geenin nukleotidisekvenssiä ja ennustettua gd-2-proteiinin aminohapposekvenssiä. Relevantit restriktiokohdat on merkitty ja numeroidut pystysuorat nuolet gd-2-geenin aminoa koodittavassa päässä tarkoittavat kohtia, joissa gd-2:n aminoa koodittava pää on liittynyt pjs413:een yhdistelmäplasmideissa phv5 (joka sisältää gd-2:n karboksia koodittavan pään kokonaan) ja phv6. BamHI-kohta on se kohta, jossa gd-2:n
14 83974 karboksia koodittava pää on liittynyt phk414:n z-geeniin phv6:ssa. Kuva 13 esittää gd-1:n ja gd-2:n ennustettujen aminohapposekvenssien vertailua. Aminohappotähteet on merkitty yhden kirjaimen koodilla. Ne aminohappotähteet, jotka ovat homologisia gd-1- ja gd-2-sekvenssissä on merkitty viivoilla gd-2-sekvenssiin. gd-2-sekvenssi on yhtä aminohappotähdettä lyhempi kuin gd-1- sekvenssi. gd-2:sta "puuttuva" aminohappo on merkitty tähdellä (*). Kuva 14 (ei ole piirretty mittakaavassa) esittää phv5:n rakentamista, joka on gd-2-geenin osasta ja pjs413:sta johdettu yhdistelmäplasmidi. Yhdistelmäplasmidi phv5 ohjaa HSV-2:n gd:lle sukua olevan proteiinin tuotantoa, jota proteiinia koodittaa noin 90 % gd-2:ta koodittavasta sekvenssistä, joka on liitetty ilmentämisvektorista johdettuun "johtosekvenssiin" (Cro). Kuva 15 esittää phv6:n rakentamista, joka on phv5:stä johdettu gd-2:n ilmentämisplasmidi, josta on poistettu 259 nukleotidia (86 aminohappoa) gd-2:ta koodittavan sekvenssin 3'-päästä ja korvattu noin 3000 lisänukleotidilla, jotka on johdettu ilmentämisplasmidista phk414 ja koodittavat E.colin B-galaktosidaasiproteiinia. Yhdistelmäplasmidi phv6 tekee mandolliseksi yhdysproteiinin ("sandwich" protein, fusion protein) tuotannon, jossa E. colille sukua olevat polypeptidit (so. Cro ja 3-galaktosidaasi) on liitetty gd-2:lle sukua olevan proteiinin päihin vastaavasti. 5. Keksinnön kuvaus Tämä keksintä koskee yhdistelmä-dna-tekniikan käyttöä HSV-proteiineille sukua olevien proteiinien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää vastustuskyvyn aiheuttavina aineina rokotteissa. Tarkemmin sanottuna tässä kuvataan gd:lle sukua olevien proteiinien valmistus. Koska polyvalenttinen antiseerumi, joka kohdistuu HSV-1-gD:hen, kykenee neutraloimaan sekä HSV-1:n että HSV-2:n, voidaan puhdasta gd-proteiinia tai sen antigeenisesti merkittävää
15 83974 osaa käyttää osarokotteessa, joka suojaa rokotteen saajan tehokkaasti sekä HSV-1:n että HSV-2:n aiheuttamilta primäärisiltä infektioilta. Yhdistelmäplasmidit, jotka on rakennettu tässä selostetulla tavalla, saavat aikaan sen, että isäntäsolu tuottaa proteiinia, joka on gd:lle sukua oleva polypeptidi, ja joka on stabiili eikä hajoa isäntäsolun vaikutuksesta; tällaiset plasmidit tekevät mandolliseksi tuottaa suuria määriä gd:lle sukua olevaa proteiinia tai yhdysproteiinia, jolla on gd:n immunologiset ja antigeeniset ominaisuudet. Kuitenkaan tässä kuvatut DNA-rakenteet eivät rajoitu pelkästään gd:lle sukua olevien proteiinien valmistamiseen, vaan niitä voidaan käyttää mille tahansa HSVproteiineille sukua olevien polypeptidien valmistamiseen. On helposti ymmärrettävissä, että erilaisia immunogeenejä ja rokotteita voidaan valmistaa. Selostuksen kannalta tämän keksinnön kohteena oleva menetelmä voidaan jakaa seuraaviin vaiheisiin: (1) HSV-glykoproteiinigeenin tai -geenijakson identifiointi ja eristäminen, (2) geenin tai geenijakson liittäminen kloonauksessa käytettyyn ilmentämisvektoriin niin, että saadaan yhdistelmä-dna-molekyyli, jolla transformoidaan yksisoluiset organismit, (3) sellaisten transformoituneiden yksisoluisten organismien tunnistaminen ja kasvatus, jotka kykenevät replikoimaan ja ilmentämään geenin, (4) geenituotteen identifiointi ja puhdistus ja (5) geenituotteen immuunisuutta aiheuttavan tehon määrittäminen mittaamalla sen kyky herättää neutraloivien vasta-aineiden tuotanto. Selvyyden vuoksi koko menetelmää selostetaan gd-geeniä käyttäen. Kuitenkin samoja menetelmiä voidaan käyttää vastaavalla tavalla mille tahansa HSV-glykoproteiinille sukua olevan polypeptidin valmistamiseksi. 5.1. HSV-glykoproteiinigeenien identifiointi ja eristäminen HSV-glykoproteiinigeeni (gd) voidaan saada mistä tahansa HSVtyypin 1 tai 2 kannasta. HSV-geenin (tai sen osan) eristämisessä eristetään ensin HSV-DNA, aikaansaadaan HSV-DNA-palaset ja tunnistetaan ne palaset, jotka sisältävät glykoproteiinigeeni-
16 83974 sekvenssejä. Ennen tunnistamista HSV-DNA-palaset tavallisesti liitetään kloonausvektoreihin, joilla transformoidaan isäntäsolut; näin on mandollista valmistaa suuri määrä HSV-DNA-palasten kopioita niin, että niitä on tarjolla runsas määrä analyysin ja tunnistamisen suorittamista varten. HSV-DNA voidaan saada joko (1) eristämällä suoraan viruksesta, joka on puhdistettu viruksella infektoiduista eukaryoottisista soluista, tai (2) bakteriofageista tai plasmideista, joihin sisältyy osa viruksen perimää, jossa on gd-geeni. HSV-DNA-palasten aikaansaamiseksi voidaan DNA katkaista tietyistä kohdista restriktioentsyymejä käyttämällä; vaihtoehtoisesti voidaan käyttää DNAasia mangaanin läsnäollessa DNA:n katkomiseksi; tai DNA voidaan leikata fysikaalisesti esim. sonikaatiolla. Sitten lineaariset DNA-palaset voidaan erottaa koon mukaan tavanomaisilla menetelmillä, kuten esim. agaroosi- tai polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja pylväskromatografisesti. Mitä tahansa restriktioentsyymiä tai restriktioentsyymiyhdistelmää voidaan käyttää gd-sekvenssin sisältävän HSV-DNA-palasen aikaansaamiseksi edellyttäen, että entsyymit eivät tuhoa gd-geenituotteen immuunisuutta aiheuttavaa tehoa. Proteiinin antigeeninen kohta voi sisältää noin 7 - noin 14 aminohappoa. Näin ollen proteiini, joka on gd:n kokoa, voi sisältää monia erillisiä antigeenisiä kohtia, mandollisesti tuhansia, kun otetaan huomioon päällekkäiset sekvenssit, sekundääriset rakenteet ja prosessointitapahtumat, kuten asetylointi, glykosylointi ja fosforylointi. Näin ollen monet osittaiset gd-geenin sekvenssit voivat koodittaa antigeenistä kohtaa. Siksi voidaan käyttää monia restriktioentsyymiyhdistelmiä sellaisten DNA-palojen aikaansaamiseksi, jotka sopivaan vektoriin liitettyinä kykenevät yksisoluisessa organismissa ohjaamaan spesifisten gd-aminohapposekvenssien tuotantoa, joilla on erilaisia antigeenisiä ominaisuuksia. Kun isäntäsolut transformoidaan näillä yhdistelmä-dna-molekyyleillä, jotka sisältävät HSV-DNA-palaset, voidaan tuottaa suuri
17 83974 määrä virus-dna:n kopioita, jotka voidaan analysoida sen palasen tunnistamiseksi, joka sisältää gd-geenisekvenssin. HSV-DNArestriktiopalasten liittäminen kloonausvektoriin voidaan suorittaa helposti, jos vektorilla on komplementaariset kohesiiviset päät. Kuitenkin, jos niitä kompelementaarisia katkaisukohtia, jotka aiheutuivat HSV-DNA:n katkaisussa, ei ole läsnä kloonausvektorissa, voidaan HSV-DNA:n tai kloonausvektorin päät muuntaa. Näissä muutostoimenpiteissä mm. muodostetaan tylppiä päitä hajottamalla pois yksisäikeisiä DNA-päitä tai täyttämällä yksisäikeisiä päitä niin, että päät voidaan liittää yhteen tylppinä. Vaihtoehtoisesti voidaan muodostaa mikä tahansa haluttu katkaisukohta liittämällä DNA:n päihin nukleotidisekvenssejä (sidoksenmuodostajia); nämä liitetyt sidoksenmuodostajat voivat olla erityisiä kemiallisesti syntetisoituja oligonukleotideja, jotka koodittavat restriktioentsyymien tunnistussekvenssejä. Toisten menetelmien mukaan voidaan katkaistu vektori ja HSV-DNA-jakso modifioida homopolymeerisilla hännillä (vrt. Morrow'n esittämää katkaisua julkaisussa Methods in Enzymology, 1979, 68:3). gd-geenin sisältävän erityisen DNA-palasen identifiointi voidaan suorittaa eri tavoin. Ensinnäkin on mandollista määrittää viruksen DNA-palasten emäsjärjestys (Maxam and Gilbert, 1980, Methods in Enzymology 65:499) ja sen jälkeen identifioida gdgeenin sekvenssin sisältävä palanen vertaamalla ennustettua aminohappojärjestystä gd-proteiinin aminohappojärjestykseen. Toisaalta gd-geenin sisältävä palanen voidaan identifioida mrna-valinnalla. HSV-DNA-palasia käytetään komplementaarisen mrna:n eristämiseen, joka tapahtuu hybridisoinnilla. Eristettyjen mrna-laatujen in vitro-luentatuotteiden immuunisaostusanalyysi identifioi mrna:n ja näin ollen komplementaariset HSV-DNA-palaset, jotka sisältävät gd-geenisekvenssejä. Vielä eräs mandollisuus valita gd:n suhteen spesifiset mrna:t on suorittaa HSV:llä infektoiduista soluista eristettyjen polysomien adsorptio immobilisoituihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, jotka kohdistuvat gd-proteiiniin. Radioaktiivisesti merkitty gd-mrna tai -cdna voidaan syntetisoida käyttämällä valittua mrna:ta (adsorboituneista polysomeista) templaattina. Radioaktiivisesti merkittyä mrna:ta tai cdna:ta voidaan
18 83974 sen jälkeen käyttää koettimena niiden HSV-DNA-palasten identifioimiseksi, joissa on gd-sekvenssejä (Southern, 1975, J.Mol.Biol. 98: 503; Alwine et al., 1979, Methods in Enzymology, 68:220). Sopivia tapoja gd-geenin eristämiseksi ovat mm. itse geenin kemiallinen syntetisointi (edellyttäen, että sekvenssi tunnetaan) tai cdna:n (komplementaarinen DNA) tekeminen mrna:lle, joka koodittaa gd-geeniä. Tätä varten gd:n suhteen spesifinen mrna eristetään viruksella infektoiduista soluista. Eristetty mrna muunnetaan sen jälkeen tavanomaisilla menetelmillä cdna-kopioksi ja liitetään suoraan kloonausvektoriin. Kun isäntäsolut transformoidaan yhdistelmä-dna-molekyyleillä, jotka sisältävät eristetyn geenin, cdna:n tai syntetisoidun DNAsekvenssin, voidaan saada aikaan suuri määrä geenin kopioita. Näin ollen geeniä voidaan saada mikrogrammojen luokassa olevina määrinä, kun transformantteja kasvatetaan, eristetään yhdistelmä- DNA-molekyylit transformanteista ja otetaan liitetty geeni eristetystä yhdistelmä-dna:sta. Vaihtoehtoisesti voidaan gd-geeniä saada mikrogrammojen luokassa olevina määrinä gd-geenin lähteestä, esim. herpes simplex-viruksen infektoimista eläinsoluista tai sellaisista bakteereista tai fageista, joissa on virusgeeni yhdistemäplasmideissa. Viruksen tai plasmidin DNA eristetään, katkotaan paloiksi, fraktioidaan ja määritetään palojen koko samoilla menetelmillä, kuin käytettiin geenin paikantamisessa. 5.2. HSV-glykoproteiinigeenin liittäminen kloonauksessa käytettyyn ilmentämisvektoriin Kun gd-geeni tai sen palanen on saatu eristetyksi, se liitetään sopivaan ilmentämisvektoriin, so. vektoriin, joka sisältää kaikki liitetyn geenin transkription ja luennan kannalta tarpeelliset elementit (ks. Roberts and Lauer, 1979, Methods in Enzymology, 68: 473). Jotta gd-geeni (tai sen osa) ilmentyisi tehokkaasti, pitää ilmentämisvektorissa olla promoottori. RNA-polymeraasi sitoutuu tavallisesti promoottoriin ja aloitaa geenin tai yhteenliittyneiden geenien ja ohjauselementtien (nimeltään operoni)
19 83974 transkription. Promottorien "vahvuus" vaihtelee eli ts. niiden kyky edesauttaa transkriptiota. Kun on kyseessä molekulaarinen kloonaus, on edullista käyttää vahvoja promoottoreita, jotta saadaan tapahtumaan suuri määrä transkriptiota ja sen seurauksena suuri määrä ilmentynyttä geeniä. Käytetystä isäntäsolusta riippuen voidaan valita joku lukuisista sopivistapromoottoreista. Esimerkiksi kloonattaessa E. coli-isäntäsolu voidaan käyttää mitä tahansa pro moottoria, joka on eristetty E. colista, sen bakteriofageista tai plasmideista (esim. lac-promottori). Liitetyn geenin transkription aikaansaamiseksi voidaan myös käyttää sellaisia E. colin promottoreita, jotka on saatu aikaan yhdistelmä-dna-tekniikalla tai muilla synteettisillä DNA-menetelmillä. Tarkemmin sanottuna kolifagi lambdan PR- ja PL-promottorit ohjaavat niihin liittyneiden DNA-palasten transkriptiota niin, että syntyy suuria määriä. Myös E. colin rec-prorroottori saa aikaan liittyneiden palasten geenitranskription suurina määrinä. Jotta geenin transkriptio ja luenta tapahtuisi tehokkaasti prokaryoottisissa ja eukarvoottisissa soluissa, tarvitaan tietyt aloitussignaalit. Nämä transkription ja luennan aloitussignaalit voivat vaihdella "vahvuudeltaan", kun mitataan geenin suhteen spesifisen mrna:n ja syntetisoituneen proteiinin määrinä vastaavasti. DNA:n ilmentämisvektori, joka sisältää promoottorin, voi sisältää myös minkä tahansa yhdistelmän "vahvuudeltaan" erilaisia transkription ja/tai luennan aloitussignaaleja. Näin ollen voidaan käyttää mitä tahansa SD-ATG-yhdistelmää, jota isäntäsolujen ribosomit voivat käsitellä, joita ovat mm. SD-ATG-yhdistelmä, joka on saatu kolifagi lambdan cro-geenistä tai N-geenistä tai E.colin tryptofaani E-, D-, C-, B- tai A-geenistä. Myös voidaan käyttää mitä tahansa SD-ATG-yhdistelmää, joka on valmistettu yhdistelmä-dna-tekniikalla tai jollakin muulla syntetisointitekniikalla. Mitä tahansa edellä kuvattuja menetelmiä, joita kuvattiin DNApalasten liittämiseksi vektoriin, voidaan käyttää promoottorin ja muiden ohjauselementtien liittämiseksi tiettyihin kohtiin vektorin sisällä.
20 83974 Näin ollen gd-geeni (tai mikä tahansa sen osa) voidaan liittää ilmentämisvektoriin tiettyyn kohtaan suhteessa vektorin sisältämään promoteriin ja ohjauselementteihin niin, että gd-geenin sekvenssi on oikeassa luentakehyksessä (so. faasissa) vektorin ATGsekvenssiin nähden. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää gd:n ATGkodonia tai synteettistä ATG-kodonia. Saatu yhdistelmä-dnamolekyyli siirretään sen jälkeen sopivaan isäntäsoluun transformaatiolla, transduktiolla tai transfektiolla (riippuen vektoriisäntäsolusysteemistä). Transformantit valitaan sen mukaan, miten ne ilmentävät vektorissa tavallisesti läsnäolevia geenimerkkejä, kuten vastustuskyky ampisilliinin tai tetrasykliinin suhteen pbr322:ssa tai tymidiinikinaasiaktiivisuus eukaryoottisessa isäntäsysteemissä. Tällaisten merkkiproteiinien ilmentyminen osoittaa, että yhdistelmä-dna-molekyyli on ehyt ja replikoituu. Sopivia merkkifunktion sisältäviä ilmentämisvektoreita ovat mm. seuraavat vektorit ja niiden johdannaiset: SV40 ja adenovirusvektorit, hiivavektorit, bakteriofagivektorit, kuten la:lbda gt-wes-lambda B, Charon 28, Charon 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda gt-l-lambda B, Ml3mp7, M13mp8, M13mp9 tai plasmidi-dnavektorit, kuten pbr322, pac105, pva51, pacy177, pkh47, pacyc184, pub110, pmb9, pbr325, Col El, psc101, pbr313, pml21, RSF2124, pcrl tai RP4. Lisäksi voidaan valita sellaisia isäntäsolukantoja, jotka kykenevät estämään promoottorin toiminnan, ellei toimintaa erityisesti käynnistetä. Tällä tavalla yli 95 % vektorin promoottorin tehokkuudesta voidaan inhiboida, jos soluja ei indusoida. Tiettyjen operonien ollessa kyseessä pitää lisätä erityisiä indusoijia, jotta saataisiin aikaan liitetyn DNA:n tehokas transkriptio tai luenta; esimerkiksi lac-operoni indusoidaan lisäämällä laktoosia tai IPTG:tä (so. isopropyylitio-8-d-galaktosidaasia). Lukuisat muut operonit, kuten trp, pro jne., ovat erilaisen ohjauksen alaisia. Trp-operoni käynnistyy, kun kasvualusta ei sisällä tryptofaania, ja lambdan PL-promoottori käynnistyy, kun kohotetaan sellaisten isäntäsolujen lämpötilaa, joissa on lämpöherkkä lambdan repressoriproteiini, esim. C1857. Näin ollen geenitekniikalla aikaansaadun gd-proteiinin ilmentymistä voidaan ohjata.
21 83974 Tämä on tärkeätä, jos kloonatun geenin proteiinituote on letaalinen isäntäsoluille. Tällaisissa tapauksissa vieras geeni voidaan saada replikoitumaan, mutta ei ilmentymään transformanttien kasvun aikana. Kun solut ovat saavuttaneet sopivan tiheyden kasvualustassa, voidaan promoteri indusoida tuottamaan kyseessä olevaa proteiinia. gd:lle sukua olevista proteiineista, joita edellä kuvatulla tavalla transformoidut, plasmideilla (so. plasmidit, jotka ohjaavat gd:lle sukua olevien proteiinien ilmentymistä, joka päättyy luonnolliseen gd:n luennan päätössignaaliin, ja joka alkaa ATGkodonista, joka on peräisin vektorista, gd-geenistä tai synteesitoimenpiteestä) transformoituneet solut tuottavat, käytetään tästä lähtien nimitystä erilliset gd-proteiinit tai erilliset, gd:lle sukua olevat proteiinit. 5.3. Yhdysproteiinien valmistus Jotta ilmentyvän geenin määrä saataisiin mandollisimman suureksi tietyssä transformantissa, saattaa olla toivottavaa liittää kyseinen geeni sellaiseen geeniin, joka koodittaa toista proteiinia, kuten isäntäsolun omaa proteiinia. Lisäetuna on myös se, jos isäntäsolun proteiini sisältää myös jonkin mitattavissa olevan suureen. Yhteenliittyneiden geenien ilmentymistuote on yhdysproteiini (käytetään tästä lähtien nimitystä gd-yhdysproteiinit), joka voidaan identifioida suuren molekyylipainonsa ja mitattavissa olevan ominaisuutensa perusteella. Esimerkiksi gd/ft-galaktosidaasiyhdysproteiinin tuottaminen tarjoaa useita etuja, kun kloonataan ja ilmennetään gd-proteiinia E. coli-isännässä. Ensinnäkin tämä tekee mandolliseksi vektorin ohjaaman proteiinituotannon määrän arvioinnin (siis ilmentymisen arvioinnin), kun käytetään 3-galaktosidaasiaktiivisuuden suhteen spesifistä kolorimetristä määritystä Miller'in menetelmällä (ss. 47-55 ja 352-355, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, New York, N.Y., 1972). Toiseksi yhdysproteiinien tuottaminen yksinkertaistaa proteiinituotteen identifiointia ja eristämistä. Erillinen gd-proteiini, jota E. coli-transformantit tuottavat, on pienempi kuin gd/i3-galaktosidaasiyhdysproteiini ja sellaisenaan
22 83974 se voi liikkua samanaikaisesti useiden muiden isännän proteiinien kanssa, kun analyysi suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Valmistettu yhdysproteiini sen sijaan voidaan helposti ilmaista ja tunnistaa SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ainutlaatuisen, suuren molekyylikokonsa perusteella. Tämä keksintö ei rajoitu 5-galaktosidaasiyhdysproteiinin valmistamiseen, vaan mikä tahansa joko eukaryoottista tai prokaryoottista alkuperää oleva geeni voidaan liittää faasiin gd-geenin (tai minkä tahansa HSV-proteiinin geenin) kanssa niin, että saavutetaan samanlaisia etuja, kuin liittyy 5-galaktosidaasiyhdysproteiinituotteeseen. Tästä voidaan mainita esimerkkeinä mm. galaktokinaasi, trp D, E tai johtogeeni (leader), pilus-geenit ja eukaryoottiset geenit, kuten tymidiinikinaasigeeni, SV-40 T-antigeenin geeni tai Rous Sarcoma-viruksen transformointigeeni. Jotta yhdysproteiinia koodittava geeni saataisiin rakennetuksi, molemmat geenit pitää liittää yhteen niiden koodittavien sekvenssien alueella siten, että luentakehys säilyy eikä keskeydy päätössignaalien vaikutuksesta. Kuten jo edellä selostettiin, valmistuu yhdysproteiinia vain indusoitaessa, jos isäntäsolukanta on sellainen, joka inhiboi promoottorin toimintaa. 5.4. Geenituotteen tunnistaminen Kun oikean DNA-rakenteen sisältävät transformantit on ensin tunnistettu, pitää yhdistelmä-dna:n gd,-geenituotteen immunoreaktiivisuus ja antigeenisyys analysoida. Jos isäntäsolu ei kykene glykosyloimaan gd-geenituotetta samalla tavalla kuin luonnossa esiintyvää HSV-gD:tä, eroaa gd-geenituote luonnossa esiintyvästä gd-glykoproteiinista. Näin ollen immunologinen analyysi on erittäin tärkeä gd-geenituotteen kohdalla, koska lopullinen päämäärä on käyttää näin saatua gd:lle sukua olevaa proteiinia rokoteformulaatioissa. Immunoreaktiivisuusanalyysi on edullisinta suorittaa käyttämällä vastaseerumeja, jotka reagoivat HSV:llä infektoitujen solujen gd-glykoproteiinia vastaan, kun
23 83974 taas antigeenisyys voidaan arvioida mittaamalla koe-eläinten vastaseerumitiitterit, jotka kehittyvät vasteena gd-geenituotteella tapahtuvalle immunisoinnille, ja vastaseerumien kyky neutraloida HSV-infektio. Immunoreaktiivisuuden analysointiin on tarjolla useita vastaseerumeja, mukaanlukien polyvalenttiset vasta-ainevalmisteet, jotka on suunnattu koko virusta vastaan tai erityisesti gd:tä vastaan. Suurempi spesifisyys saadaan käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat vain yhden antigeenisen kohdan gd-proteiinimolekyylissä. On olemassa useita monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat gd:tä vastaan, joista vasta-aineista jotkut sekä spesifisesti immunosaostavat HSV-l:n ja HSV-2:n gd-geenituotteen että neutraloivat kummankin viruksen infektoimiskyvyn. Näin ollen tässä keksinnössä selostetun proteiinin identifiointi perustuu kahteen edellytykseen. Ensinnäkin gd:lle sukua olevaa proteiinia pitäisi valmistua vain promoottorin indusoinnin tuloksena. Toiseksi gd:lle sukua olevan proteiinin pitäisi olla immunoreaktiivinen, kun käytetään useita polyklonaalisia vasta-aineita, jotka on suunnattu HSV:tä vastaan, tai monoklonaalisia vastaaineita, jotka on suunnattu gd:tä vastaan; ja proteiinin pitäisi olla immunoreaktiivinen oli se sitten peräisin koko geenin sekvenssin ilmentymisestä, geenin sekvenssin osan ilmentymisestä tai kanden tai useampien sellaisten geenisekvenssien ilmentymisestä, jotka on liitetty yhteen ohjaamaan yhdysproteiinin ilmentymistä. Reaktiivisuus voidaan osoittaa-tavanomaisilla immunologisilla menetelmillä, kuten immunosaostuksilla, immunodiffuusiolla, radioimmuunikompetitiolla, immunoelektroforeesilla tai ilmaisemalla immunologisesti proteiinit, jotka on erotettu polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja sen jälkeen siirretty nitroselluloosaan. 5.5. Geenituotteen puhdistus gd-geenin (tai minkä tahansa HSV-glykoproteiinigeenin) sisältäviä soluja kasvatetaan suuressa tilavuudessa ja promoottorin indusoinnin
24 83974 jälkeen syntynyt proteiini eristetään tällaisista soluista tai väliaineesta, jos proteiini erittyy. Proteiini voidaan eristää ja puhdistaa joko tavanomaisilla kromatografisilla menetelmillä, kuten ioninvaihdolla, affiniteetti- tai koonerotushartseilla, sentrifugoimalla tai millä tahansa tavanomaisella proteiinienpuhdistusmenetelmällä. Koska tietyt yhdysproteiinit muodostavat aggregaatteja solujen tuottaessa niitä erittäin paljon tai ollessaan liuoksessa, on tässä keksinnössä valmistettujen yhteenliittyneiden proteiinien eristämisessä erittäin edullista käyttää aggregaatteja muodostavien proteiinien eristysmenetelmää. Sen jälkeen näitä yhdysproteiineja voidaan käyttää rokotteiden valmistuksessa. Yhdysproteiinien puhdistuksessa (käytetään tästä lähtien nimitystä aggregaatin puhdistus) suoritetaan aggregaatteja muodostavien proteiinien uutto, erotus ja/tai puhdistus rikkomalla solut ja sen jälkeen pesemällä aggregoitunut materiaali. Lisäksi aggregoitunut materiaali voidaan liuottaa lisäämällä liuotinta, joka on sekä vahva vedynvastaanottaja että vahva vedynluovuttaja (tai voidaan käyttää liuotinyhdistelmää, joka antaa nämä molemmat ominaisuudet); sen jälkeen aggregaatteja muodostavat proteiinit voidaan saostaa laimentamalla sopivalla puskurilla. Sopivia liuottimia ovat mm. urea (välillä noin 4M - noin 8M), formamidi (vähintään noin 80 tilavuus-%) ja guanidiinihydrokloridi (noin 4M - noin 8M). Eräät liuottimet, jotka kykenevät liuottamaan aggregaatteja muodostavia proteiineja, kuten esim., SDS (natriumdodekyylisulfaatti) ja 70-prosenttinen muurahaishappo, eivät sovellu tässä menetelmässä käytettäviksi, koska sen jälkeen tapahtuva liuenneiden aggregaatteja muodostavien proteiinien saostuminen on osoittautunut tehottomaksi. Vaikka guanidiinihydrokloridi ja muut samanlaiset aineet ovat denaturoivia aineita, tutkimukset osoittavat, että tämä denaturoituminen ei ole luonteeltaan irreversiibeliä, ja että renaturoituminen voi tapahtua sen jälkeen, kun denaturoiva aine on poistettu tai laimennettu (esim. dialyysillä), jolloin immunologisesti ja/tai biologisesti aktiivinen proteiini muodostuu uudestaan.