LAPPEENRANNAN TEKNILLINEN YLIOPISTO Teknillinen tiedekunta Kemiantekniikka

LAPPEENRANNAN TEKNILLINEN YLIOPISTO Teknillinen tiedekunta Kemiantekniikka Sari Vesanen STEROIDIEN SELEKTIIVINEN EROTTAMINEN SÄHKÖ- AVUSTEISESTI MIKROEMULSIOITA KÄYTTÄEN Työn tarkastajat: Työn ohjaaja: Professori Heli Sirén, LUT Kemia Dosentti Johanna Suomi, Helsingin yliopisto Professori Heli Sirén, LUT Kemia

TIIVISTELMÄ Lappeenrannan Teknillinen Yliopisto Teknillinen tiedekunta Kemiantekniikka Sari Vesanen Steroidien selektiivinen erottaminen sähköavusteisesti mikroemulsioita käyttäen Diplomityö 0 3 sivua, 30 kuvaa, 4 taulukkoa ja liitettä Tarkastajat: Professori Heli Sirén Dosentti Johanna Suomi Hakusanat: Mikroemulsiot, kapillaarielektroforeesi, mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia, steroidit Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia on sähköavusteinen erotusmenetelmä. Yhdisteiden erottuminen tapahtuu mikroemulsiopisaroiden vaikutuksesta, kun nanometrien kokoiset öljypisarat ovat dispergoituneena veteen valmistettuun puskuriliuokseen. Yleensä mikroemulsiot valmistetaan raakaöljynkin sisältämistä hiilivedyistä, joita ovat esimerkiksi oktaani ja heptaani. Työn kokeellisessa osassa perehdyttiin seitsemän hydrofobisen ja varauksettoman steroidihormonin erottamiseen mikroemulsioliuoksessa kapillaarielektroforeesitekniikalla. Työssä valmistettiin öljyistä koostuvia mikroemulsioita, joista osan koostumus valittiin kirjallisuuden perusteella. Työssä kokeiltiin myös uusia mikroemulsiokoostumuksia, joissa käytettiin luonnosta peräisin olevia öljyjä: rypsi-, oliivi-, pellavansiemen- ja saksanpähkinäöljyä. Seitsemästä steroidihormonista viisi yhdistettä saatiin erottumaan optimoiduilla menetelmillä. Steroidien erotus perustuu niiden oktanoli-vesi jakautumiskertoimien avulla saatavaan migraatiojärjestykseen. Mikroemulsiossa, jossa käytettiin -oktanolia, steroidihormonit erottuivat nopeammin, kuin saksanpähkinäöljyä käytettäessä. Lyhyimmät migraatioajat saatiin mikroemulsiolla, jossa öljyfaasina käytettiin -heksanolia ja viidentenä yhdisteenä asetonitriiliä. Selektiivisimmillään menetelmä on, kun erotus tapahtuu liuoksessa, joka koostuu etyyliasetaatista, natriumdodekyylisulfaatista, butanolista, asetonitriilistä ja natriumtetraboraatista. Toteamisrajat tutkituille steroidihormoneille olivat 0,0 0,43 mg/l mikroemulsioissa.

ABSTRACT Lappeenranta University of Technology Faculty of Technology Chemical Technology Sari Vesanen Electricity-assisted selective separation of steroids using microemulsions Master s thesis 0 3 pages, 30 pictures, 4 tables and appendices Examiners: Professor Heli Sirén Docent Johanna Suomi Keywords: Microemulsions, capillary electrophoresis, microemulsion electrokinetic chromatography, steroids Microemulsion electrokinetic chromatography is an electrodriven separation technique. The compounds are separated by effect of microemulsion droplets as nanometred-sized oil droplets are dispersed in an aqueous buffer. Usually the microemulsion is prepared from hydrocarbon obtained from petroleum, like octane or heptane. In the experimental part of this study seven hydrophobic and neutral steroidhormones were separated in a microemulsion solution with capillary electrophoresis method. Microemulsions were prepared from different oils of which part of the compositions were based on the literature. In addition some new natural oil microemulsion compositions were tested: rapeseed, olive, linseed and walnut oils. Five steroidhormones of seven were successfully separated with optimized methods. Steroids separation is based on the migration order, obtained from their octanol-water partition coefficient values. In microemulsion where -octanol was used, steroids were separated faster than with walnut oil. The shortest analysing times were achieved with microemulsion where -hexanol was used as an oil phase and acetonitrile as the fifth component. The most selective results were achieved with microemulsion composition of ethylacetate, sodium dodecyl sulphate, -butanol, acetonitrile and sodium tetraborate. The detection limits of these steroidhormones were 0,0-0,43 mg/l in the tested microemulsions.

SYMBOLILUETTELO A n A std c n c o c std c w yhdisteen piikin pinta-ala sisäisen standardin piikin pinta-ala yhdisteen pitoisuus, mg/l yhdisteen pitoisuus oktanolifaasissa, mg/l sisäisen standardin pitoisuus, mg/l yhdisteen pitoisuus vesifaasissa, mg/l E sähkökenttä, V/m L det L tot LOD log P n kapillaarin pituus detektorille, m kapillaarin kokonaispituus, m toteamisraja, mg/l jakautumiskerroin toistojen lukumäärä N teor teoreettisten pohjien lukumäärä, /m RSD suhteellinen standardipoikkeama, % t m U v w b x i yhdisteen migraatioaika, s jännite, V yhdisteen nopeus, m/s piikin pohjan leveys, m näytteen pitoisuus toistossa, mg/l näytteen pitoisuuden keskiarvo, mg/l yhdisteen havaittu liikkuvuus, m /Vs yhdisteen elektroforeettinen liikkuvuus, m /Vs of liuoksen elektro-osmoottinen liikkuvuus, m /Vs σ p piikin keskihajonta

LYHENTEET Brij-30 Polyoksietyleeni-4-lauryyli-eetteri CE Kapillaarielektroforeesi (engl. Capillary Electrophoresis) CHAPS 3-[(3-kolamidopropyyli-dimetyyliammonio]--propaanisulfonaatti CHAPSO 3-[(3-kolamidopropyyli)dimetyyliammonio]--hydroksi-- propaanisulfonaatti CMC Kriittinen misellikonsentraatio (engl. Critical Micelle Concentration) CTAB Setyylitrimetyyliammoniumbromidi DET Dietyyli-ʟ-Tartraatti DHEA Dehydroepiandrosteroni DLS Dynaaminen valon sironta (engl. Dynamic light scattering) DOSY Diffuusio-erotteinen ydinmagneettinen resonanssi (engl. Diffusion- Ordered Nuclear Magnetic Resonance) DTAB Dodekyylitrimetyyliammoniumbromidi Elektro-osmoottinen virtaus (engl. Electro-Osmotic Flow) EPR Elektroparamagneettinen resonanssi (engl. Electron Paramagnetic Resonance) LOD Toteamisraja (engl. Limit of Detection) MEEKC Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia (engl. Microemulsion Electrokinetic Chromatography) OG Oktyyliglukosidi O/W Öljy/vesi-mikroemulsio SAXS Pienkulmaröntgensironta (engl. Small-Angle X-ray Scattering) SC Natriumkolaatti SDS Natriumdodekyylisulfaatti Triton X-00 Polyetyleeniglykoli-mono(oktyylifenyyli)eetteri TFA Trifluoroetikkahappo TTAB Tetradekyyli Trimetyyli Ammonium Bromidi Tween 80 Polysorbaatti 80 W/O Vesi/öljy-mikroemulsio β-cd β-syklodekstriini

SISÄLLYSLUETTELO Johdanto... Mikroemulsiot... 4. Öljyt... 5. Pinta-aktiiviset aineet..... Kriittisen misellikonsentraation määrittäminen... 9.3 Valmistus ja koostumukset....4 Ominaisuuksien karakterisointi... 4.5 Sovellukset... 3 Kapillaarielektroforeesi... 7 3. Menetelmän periaate... 7 3. Laitteisto... 3.3 Näytteensyöttö... 4 Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia... 3 4. Erottumiseen vaikuttavat tekijät... 5 4.. Pinta-aktiivinen aine... 5 4.. Liukoisuutta lisäävä aine... 4..3 Puskuriliuos... 4..4 Öljy... 4..5 Orgaaninen liuotin... 7 4.. Näytteiden liuotus... 7 4. Sovellukset... 7 5 Steroidihormonit... 33 Kokeellinen osuus... 3. Työn tarkoitus... 3. Laitteet ja menetelmät... 37.3 Kemikaalit... 38.4 Mikroemulsiot... 38.5 Laskukaavoja... 40 7 Tulokset... 4 8 Yhteenveto... 54 LÄHTEET... 5 LIITTEET... 3

Johdanto Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia (MEEKC, engl. Microemulsion Electrokinetic Chromatography) on sähköavusteinen erotusmenetelmä, joka mahdollistaa varauksellisten, neutraalien, vesiliukoisten ja veteen liukenemattomien yhdisteiden erottamisen samanaikaisesti. Yhdisteiden erottuminen tapahtuu mikroemulsiossa, jossa nanometrien kokoiset öljypisarat ovat dispergoituneena veteen tehtyyn elektrolyyttiliuokseen. Mikroemulsioon lisättävät pinta-aktiiviset aineet alentavat veden ja öljyn välillä olevan pintajännityksen lähes nollaan kasvattaen faasien välistä rajapintaa ja siten mahdollistaen öljypisaroiden dispergoitumisen. (Altria, 000) Pääosin MEEKC-tutkimuksissa on käytetty samankaltaisia miselliliuoksia. Öljyn ja pinta-aktiivisen aineen pitoisuudet voivat muuttua vain rajoitetusti, jotta mikroemulsiosta tulee stabiili ja optisesti läpinäkyvä. Tyypillisesti mikroemulsio koostuu 0,8 % öljystä, 3,3 % pinta-aktiivisena aineena käytettävästä natriumdodekyylisulfaatista (SDS, engl. Sodium Dodecyl Sulphate),, % n-butanolista sekä 89,3 % veteen valmistetusta puskuriliuoksesta, kuten 0 mm boraatista (ph 9,). Mikroemulsiossa käytettävä öljy on usein n-oktaani, n-heptaani tai n-oktanoli. (Pedersen-Bjergaard et al., 000) MEEKC-menetelmässä tutkittavat yhdisteet jakautuvat öljypisaran ja vesifaasin välillä ja erottuvat sekä hydrofobisuutensa että elektroforeettisen liikkuvuutensa perusteella. Yhdisteiden erottumiseen voidaan vaikuttaa useilla tekijöillä, kuten öljyn ja pinta-aktiivisten aineiden pitoisuuksilla, niiden kemiallisilla ominaisuuksilla ja puskuriliuoksen ph:lla. MEEKC-menetelmän selektiivisyyteen voidaan vaikuttaa myös lisäämällä mikroemulsioliuokseen viidenneksi aineeksi orgaaninen liuotin, kuten asetonitriili. (Altria, 000) Mikroemulsiotekniikka tarjoaa useita etuja muihin kromatografisiin erotusmenetelmiin verrattuna. Menetelmä ei usein vaadi kalliita ja aikaa vieviä näytteiden esikäsittelymenetelmiä. Mikroemulsioiden liuotinominaisuudet mahdollistavat yhdisteiden analysoinnin useista erilaisista näytematriiseista, kuten virtsasta, väriaineista tai hapoista. Lisäksi mikroemulsioiden riittävän matala vaste UVdetektorilla mahdollistaa menetelmän käyttämisen jopa 00 nm aallonpituusalueella. (Altria, 999) Menetelmän yleisin käyttökohde on lääkeaineiden erottami-

3 nen. Menetelmää on käytetty myös vitamiinien ja proteiinien analysointiin. (Mahuzier et al., 003). Lisäksi menetelmällä on onnistuneesti analysoitu luonnosta peräisin olevia näytteitä, kuten kasveissa esiintyviä alkaloideja ja saposiinejä (Bo et al., 00) sekä teessä olevia katekoleja ja katekoliamiineja (Kartsova & Ganzha, 00). Työn kirjallisuusosassa perehdytään mikroemulsioiden muodostumiseen, ominaisuuksiin ja yleisimpiin käyttökohteisiin sekä esitellään mikroemulsiosähkökineettisen kromatografian periaate. Lisäksi esitellään viittauksia tutkimuksiin joissa menetelmää on käytetty. Kokeellisessa osassa perehdytään seitsemän steroidihormonin erottamiseen mikroemulsiotekniikalla. Tutkittavat steroidit ovat hydrokortisoni, testosteroni, progesteroni, pregnenoloni, dehydroepiandrosteroni, androstenedioni sekä 7-α-hydroksiprogesteroni. Tämän hetken tietämyksen perusteella tässä tutkimuksessa olevista steroidihormoneista vain testosteronia, hydrokortisonia ja progesteronia on aiemmin tutkittu MEEKC-tekniikkaa käyttäen (Pedersen-Bjergaard & Halvorsen, 000, Silva et al., 0, Vomastová et al., 99). Työssä kokeillaan uusia mikroemulsiokoostumuksia käyttämällä öljyfaaseina erilaisia luonnosta peräisin olevia öljyjä, kuten rypsi- ja oliiviöljyjä. Tavoitteena on löytää optimaalinen mikroemulsion koostumus, jolla tutkittavat steroidihormonit saataisiin erotettua selektiivisesti ja mahdollisimman lyhyellä analyysiajalla.

4 Mikroemulsiot Mikroemulsio on terminä peräisin vuodelta 959, jolloin nimen käyttämistä ehdotettiin kuvaamaan homogeenisia, läpinäkyviä öljy- ja vesidispersioita, joissa käytetään pinta-aktiivisia aineita. Myöhempien tutkimusten perusteella mikroemulsioiden on havaittu olevan termodynaamisesti stabiileja tasapainofaaseja, joissa nestefaasi on dispergoituneena toiseen nesteeseen. Dispergoitunut faasi on nesteessä pieninä pisaroina. Yleisimmät mikroemulsiot ovat öljy/vesimikroemulsioita (O/W, engl. Oil in Water), joissa jatkuvana faasina on vesi ja dispergoituneena faasina öljy. Kun jatkuvana faasina on öljy ja dispergoituneena faasina vesi, on kyseessä harvinaisempi vesi/öljy-mikroemulsio (W/O, engl. Water in Oil). (Malik et al., 00) Mikroemulsioiden uskotaan kuitenkin löytyneen paljon ennen 950-lukua. Ensimmäisten kaupallisten mikroemulsioiden uskotaan olleen nestemäisiä vahoja vuodelta 98. Todellinen kiinnostus mikroemulsioita kohtaan heräsi vasta 970- luvun lopulla ja 980-luvun alussa, jolloin niitä alettiin hyödyntää raakaöljyn talteenotossa. Viimeisten 0 vuoden aikana on tapahtunut paljon edistystä mikroemulsioiden ominaisuuksien ymmärtämisessä. Nykyään niiden rakennetta ja rajapintojen välistä stabiilisuutta on mahdollista tutkia erittäin yksityiskohtaisesti. (Cosgrove, 005) Mikroemulsiot koostuvat vähintään kolmesta eri aineesta: poolisesta aineesta (vesi), poolittomasta aineesta (öljy) sekä pinta-aktiivisesta aineesta. Pinta-aktiiviset aineet ovat amfifiilisiä molekyylejä, joissa on sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia funktionaalisia ryhmiä. Pinta-aktiiviset molekyylit peittävät liuoksessa olevat öljypisarat ja tekevät mikroemulsiosta stabiilin alentamalla vesi/öljy-rajapinnan pintajännitystä. Usein käytetään toista vähän poolista orgaanista ainetta, jonka vaikutuksesta mikroemulsion pintajännitys alenee lähes nollaan. Toinen aineista on joko lyhytketjuinen alkoholi tai amiini. (Moulik & Rakshit, 00) Ero mikroemulsioiden ja tavallisten emulsioiden (makroemulsioiden) välillä on niiden stabiilisuudessa. Tavallisissa emulsioissa vesi ja öljy erottuvat ajan kuluessa erillisiin faaseihin, joten ne ovat termisesti pysymättömiä ja lisäksi niiden muodostuminen vaatii paljon energiaa. Tavallisilla emulsioilla on myös suurempi pin-

5 tajännitys mikroemulsioihin verrattuna. (Cosgrove, 005) Taulukkoon I on koottu mikro- ja makroemulsioiden välisiä eroja. Taulukko I Mikro- ja makroemulsioiden ominaisuudet. (Kulshreshtha et al., 00) Mikroemulsio Makroemulsio Muodostuminen Spontaani Vaatii energiaa Stabiilisuus Termodynaaminen Kineettinen Pisaran koko [nm] 0 00 >000 Pintajännitys [mn/m] 0 - -0-4 0 50 Tyypit w/o, o/w, kahtaisjatkuva w/o, o/w, o/w/o, w/o/w Kahtaisjatkuva: veden ja öljyn suhde on : (v/v).. Öljyt Yleensä mikroemulsiossa käytettävä öljy on raakaöljystä peräisin oleva hiilivety, kuten heksaani tai heptaani. Viime vuosien aikana kiinnostus kyseisten öljyjen korvaamisesta luonnosta peräisin oleviin öljyihin on kuitenkin lisääntynyt. Luonnosta peräisin olevien öljyjen etuna on niiden uusiutuvuus, ympäristöystävällisyys sekä biologinen hajoavuus. Ne ovat kuitenkin rakenteeltaan raakaöljyjä huomattavasti suurempia, jolloin niitä on vaikea saada dispergoitumaan veteen. Kyseisiä öljyjä käyttämällä onkin helpompi muodostaa W/O-mikroemulsioita, joissa vesi on dispergoituneena öljyyn. (Raman et al., 003) Kirjallisuudesta löytyy muutamia tutkimuksia, joissa mikroemulsioiden muodostamisessa on käytetty luonnosta peräisin olevia öljyjä. Biruss (007) et al. tutkivat eukalyptusöljystä valmistetun mikroemulsion käyttöä steroidien imeyttämiseen ihon läpi. Heidän käyttämänsä W/O-tyyppinen mikroemulsio koostui pintaaktiivisesta aineesta, joka oli Brij-30 (polyoksietyleeni(4)lauryyli-eetteri), ja etanolista, eukalyptusöljystä sekä vedestä. Papadimitriou (0) et al. tutkivat oliiviöljy-pohjaisessa mikroemulsiossa tapahtuvia entsymaattisia hapetusreaktioita. Tutkimuksessa mikroemulsio oli myös W/O-tyyppinen, jossa pinta-aktiivisena aineena oli lesitiiniä (soijapavuista) ja liukoisuutta lisäävänä aineena -propanolia. Lisäksi luonnonöljyistä koostuvien mikroemulsioiden ominaisuuksista on tehty tutkimuksia. Esimerkiksi Zhong (009) et al. tutkivat minttuöljyyn pohjautuvan mikroemulsion dynaamista valon sirontaa (DLS, engl. Dynamic Light Scattering) sekä elektroparamagneettista resonanssia (EPR, engl. Electron Paramagnetic Re-

sonance) ja Fanun (00) sitrusöljyyn pohjautuvan mikroemulsion johtokykyä sekä pienkulmaröntgensirontaa (SAXS, engl. Small-Angle X-ray Scattering).. Pinta-aktiiviset aineet Öljy/vesi-rajapinnalla on normaalisti korkea pintajännitys (noin 50 mn/m), joten faasit eivät sekoitu toisiinsa. Kun mikroemulsioon lisätään pinta-aktiivista ainetta, faasien välinen rajapinnan pinta-ala kasvaa ja pintajännitys alenee. Suurempi pinta-ala mahdollistaa faasien dispergoitumisen toisiinsa. (Cosgrove, 005) Pintaaktiivisilla aineilla on pitkä hydrofobinen hiilivetyketju sekä pieni hydrofiilinen pää, jossa on jokin funktionaalinen ryhmä. Hydrofiilinen ryhmä voi olla esimerkiksi sulfaatti tai sulfonaatti. Pinta-aktiivisten aineiden rakenteesta johtuen ne ovat liukoisia sekä orgaanisiin liuottimiin että veteen. (Rizvi, 0) Kuvassa on esitetty esimerkki pinta-aktiivisen aineen rakenteesta. Kuva. Pinta-aktiivisen aineen rakenne, jossa on hydrofobinen hiilivetyketju sekä hydrofiilinen ryhmä ketjun päässä. Veden ja öljyn muodostamassa seoksessa pinta-aktiivisen aineen molekyylit hakeutuvat faasien rajapinnalle siten, että molekyylin hydrofiilinen pää on kohti vesifaasia ja hydrofobinen pää on kohti öljyfaasia. Kun pinta-aktiivisen aineen pitoisuutta kasvatetaan riittävästi, molekyylit alkavat muodostaa misellejä. Pitoisuutta, jossa misellin muodostus alkaa, kutsutaan kriittiseksi misellikonsentraatioksi (CMC, engl. Critical Micelle Concentration). O/W-mikroemulsiossa öljyfaasi on misellin sisällä. W/O-mikroemulsioissa on kyse käänteismiselleistä, jolloin vesifaasi jää misellin sisälle. (Malik et al., 00) Kuvassa on esitetty misellin muodostuminen O/W- ja W/O-mikroemulsiossa.

7 Kuva. Misellin muodostuminen W/O- ja O/W-mikroemulsioissa. Pinta-aktiiviset aineet voivat olla ionisia (kationit, anionit), kahtaisionisia tai varauksettomia. Mikroemulsio voidaan valmistaa myös sappihappojen suoloista. (Lauer & Rozing, 00) Taulukkoon II on koottu yleisimmin käytettyjä pintaaktiivisia aineita.

8 Taulukko II Anioniset Pinta-aktiivisten aineiden lyhenteet, molekyylimassat, kemialliset kaavat sekä CMC-arvot vesiliuoksessa (5 C). (Lauer & Rozing, 00) Nimi Lyhenne Molekyylimassa (g/mol) Natriumdodekyylisulfaatti Kemiallinen kaava CMC (mm) SDS 88,4 NaC H 5 SO 4 8, Kationiset Setyylitrimetyyliammoniumbromidi CTAB 34.5 C 9 H 4 NBr,3 Dodekyylitrimeyyliammoniumbromidi DTAB 308,3 C 5 H 34 NBr,4 Neutraalit Polyetyleeniglykolimono(oktyylifenyyli)- eetteri Triton X-00 4,9 C 34 H 3 O 0,4 Oktyyliglukosidi OG 9,4 C 4 H 8 O - Kahtaisioniset 3-[(3-kolamidopropyylidimetyyliammonio]- -propaanisulfonaatti CHAPS 4,9 C 3 H 58 N O 7 S 8,0 3-[(3-kolamidopropyyli)- dimetyyliammonio]- -hydroksi- -propaanisulfonaatti CHAPSO 30,9 C 3 H 58 N O 8 S 8,0 Sappihappojen suolat Koolihappo 408, C 4 H 40 O 5 4 Deoksikoolihappo 39, C 4 H 40 O 4 5,0 Taurokoolihappo 55,7 C H 45 NO 7 S 0 5 Yhden pinta-aktiivisen aineen käyttäminen ei kuitenkaan riitä alentamaan pintajännitystä riittävän matalaksi. Mikroemulsioihin lisätään usein neljänneksi aineeksi kemikaalia, joka edelleen alentaa pintajännityksen arvon lähes nollaan. Tällainen aine on yleensä -butanoli. (Altria, 00) Kuvassa 3 on esitetty pisaran muodostuminen, kun pinta-aktiivinen aine on natriumdodekyylisulfaatti, vesiliukoisuutta parantava aine on -butanoli ja öljyfaasi on -oktaani.

9 Kuva 3. Anionisen öljypisaran muodostuminen mikroemulsiossa. (Altria, 000).. Kriittisen misellikonsentraation määrittäminen Kriittisen misellikonsentraation (CMC) määrittämiseksi on olemassa useita eri menetelmiä. CMC:n kohdalla nähdään selvä muutos liuoksen fysikaalisissa ominaisuuksissa, kuten johtokyvyssä (kuva 4). Kuva 4. CMC:n määrittäminen johtokykymittauksella. CMC:n arvo on kuvaajaan piirrettyjen tangenttien leikkauskohdassa. CMC:n arvo laskee elektrolyyttiliuoksen pitoisuuden kasvaessa. Tästä johtuen johtokykymittaus ei ole riittävän tarkka menetelmä niiden pinta-aktiivisten ainei-

0 den kohdalla, joiden CMC:n arvot ovat hyvin pieniä elektrolyyttiliuoksen pitoisuuden ollessa suuri. (Fuguet et al., 005) Muita menetelmiä kriittisen misellikonsentraation määrittämiseksi ovat esimerkiksi pintajännityksen, viskositeetin ja valon sironnan mittaaminen sekä taitekertoimen, diffuusiokertoimen, partiaalisen moolitilavuuden ja osmoottisen paineen määrittäminen. (Holmberg, 00) Myös kapillaarielektroforeesia (CE, engl. Capillary Electrophoresis) on sovellettu CMC:n määrittämiseen. Menetelmä sisältää useita eri vaihtoehtoja, joista yksi on yhdisteen elektroforeettisen liikkuvuuden määrittäminen. CMC:tä alemmassa konsentraatiossa yhdisteen elektroforeettinen liikkuvuus pysyy lähes muuttumattomana johtuen pinta-aktiivisen aineen ja tutkittavan yhdisteen heikosta vuorovaikutuksesta. Kun pinta-aktiivisen aineen pitoisuutta kasvatetaan, misellien määrä alkaa kasvaa liuoksessa. Yhdiste vuorovaikuttaa misellien kanssa ja sen elektroforeettinen liikkuvuus kasvaa misellien määrän lisääntyessä. Kuvaajassa voidaan tällöin havaita selvä muutos CMC:n kohdalla (kuva 5). (Fuguet et al., 005). Kuva 5. Naftaleenin elektroforeettinen liikkuvuus pinta-aktiivisen aineen pitoisuuden kasvaessa 0 mm fosfaatti-puskuriliuoksessa (ph 7,0). (Fuguet et al., 005) Kriittiseen misellikonsentraatioon vaikuttavia tekijöitä ovat esimerkiksi pintaaktiivisen aineen rakenne, lämpötila, paine, elektrolyyttiliuoksen koostumus sekä mahdolliset orgaaniset yhdisteet elektrolyyttiliuoksessa. Mitä hydrofobisempi rakenne pinta-aktiivisella aineella on, sitä pienempi sen CMC:n arvo on. Ionisilla

aineilla CMC:n arvo on paljon suurempi kuin samahiilimäisillä neutraaleilla pinta-aktiivisilla aineilla. Ionisten aineiden kohdalla CMC:n arvo puolittuu, kun molekyylin hydrofobiseen hiilivetyketjuun lisätään metyyliryhmä. (Holmberg, 00) Orgaanisen liuottimen lisääminen voi joko nostaa tai laskea CMC:n arvoa. Aproottiset (happo-emäsreaktioihin osallistumattomat) liuottimet, kuten asetonitriili ja asetoni, alentavat CMC-pitoisuutta, kun niitä on pieni määrä miselliliuoksessa (0 %). Jos näiden liuottimien pitoisuus on korkeampi (asetonitriilillä yli 5 %), kasvaa myös CMC:n arvo. Vastaavasti amfiproottisten (sekä happona että emäksenä toimivien) liuottimien, kuten metanolin kohdalla, CMC:n arvo kasvaa metanolin pitoisuuden kasvaessa. (Lin, 004) Taulukkoon III on koottu SDS:n kriittisten misellikonsentraatioiden arvoja elektrolyyttiliuoksissa perustuen yhdisteen elektroforeettisen liikkuvuuden määrittämiseen. Taulukko III SDS:n kriittisten misellikonsentraatioiden arvot CE:lla määritettynä. Elektrolyyttiliuos Yhdiste CMC Lähde 5 mm natriumtetraboraatti (ph 9,), 5 C Naftaleeni 5,3 Jacquier & Desbène, 995 5 mm natriumtetraboraatti + metanoli (0-35 %, v/v), ph 9,, 5 C (CMC kasvaa metanolin pitoisuuden kasvaessa) Naftaleeni 5,3 8,0 Jacquier & Desbène, 99 5 mm natriumtetraboraatti + ACN (0-5 %, 5 % v/v), ph 9,, 5 C (CMC kasvaa metanolin pitoisuuden kasvaessa, mutta laskee minimiin pitoisuuden ollessa 5 %) 5 mm natriumtetraboraatti + asetoni (0-5 %, 0 %, v/v), ph 9,, 5 C (sama johtopäätös, kuin edellä) 5 mm natriumtetraboraatti + etanoli (0-5 %, 0 %, v/v), ph 9,, 5 C (CMC kasvaa etanolin pitoisuuden kasvaessa, mutta laskee minimiin pitoisuuden ollessa 5 %) Naftaleeni Naftaleeni Naftaleeni 5,3 3,7 7,8 Jacquier & Desbène, 99 5,3 4,7 7,8 Jacquier & Desbène, 99 5,3 3, 4,0 Jacquier & Desbène, 99 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C Pyridiini, Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C Pyridiini 4,8 Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C 4-klooripyridiini 4,7 Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C 4-klooripyridiini 3, Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C,- 4,8 Lin et al., 00 b diklooripyridiini 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C,- 3,7 Lin et al., 00 b diklooripyridiini 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C,3,5- triklooripyridiini 4,8 Lin et al., 00 b

Taulukko III jatkuu. Elektrolyyttiliuos Yhdiste CMC Lähde 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C,3,5-4,8 Lin et al., 00 b triklooripyridiini 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C,3,5- triklooripyridiini 4,4 Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C Kefadriini 4,0 Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C Kefadriini 3,3 Lin et al., 00 b 0 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C Kefatsoliini 4,5 Lin et al., 00 b 70 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C, β-cd (,0 mm),3,4,- tetrakloorifenoli 7,7 Lin et al., 00 a 70 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C, β-cd (3,0 mm),3,4,- tetrakloorifenoli 8,9 Lin et al., 00 a 70 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C, β-cd (4,0 mm),3,4,- tetrakloorifenoli 9,9 Lin et al., 00 a 70 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C, β-cd (5,0 mm),3,4,- tetrakloorifenoli 0,9 Lin et al., 00 a 70 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C, β-cd (,0 mm),3,4,- tetrakloorifenoli,9 Lin et al., 00 a 70 mm fosfaatti (ph 7,0), 5 C, β-cd (7,0 mm),3,4,- tetrakloorifenoli,9 Lin et al., 00 a 0 mm fosfaatti-boraatti, ph 7,5, 0 % ACN Sappisuolat 4,0 Wiedmer et al., 997 β-cd: β-syklodekstriini, engl. β-cyclodextrin.3 Valmistus ja koostumukset Mikroemulsioiden valmistamiseksi on olemassa useita eri menetelmiä. Yleisin miselliliuoksen valmistusmenetelmä on punnitus. Siinä vesiliuos lisätään öljyn ja pinta-aktiivisen aineen muodostaman seoksen joukkoon, jolloin tuloksena on tunnetun massan omaava samea suspensioliuos. Suspensiota pidetään ultraäänihauteessa noin 30 minuuttia, kunnes liuos on kirkas. Mikroemulsioita voidaan valmistaa myös titraamalla. Veteen valmistetun puskuriliuoksen ja pinta-aktiivisen aineen muodostama liuos titrataan öljyllä, kunnes seoksessa on havaittavissa sameutta. Vaihtoehtoisesti veden ja öljyn seosta voidaan titrata pinta-aktiivisella aineella, kunnes saadaan kirkas liuos. Kolmas vaihtoehto on titrata pinta-aktiivisen aineen, alkoholin ja öljyn seosta vedellä. Titrausten päätepisteistä lasketut massaprosentit sijoitetaan faasidiagrammiin, josta nähdään mikroemulsion koostumus (kuva ). (Altria, 000, Moulik & Rakshit, 00)

3 Kuva. Faasien muodostuminen mikroemulsioissa. (a) O/W-mikroemulsio, (b) W/O-mikroemulsio, (c) kahtaisjatkuva koostumus, (d) ja (e) useita dispersioita. (Moulik & Rakshit, 00) Faasi, johon pinta-aktiivinen aine liukenee hyvin, muodostaa jatkuvan faasin. Winsor on esittänyt neljä erilaista tilannetta faasien muodostumiseen mikroemulsioissa. Ensimmäisessä tapauksessa pinta-aktiivinen aine on liukenevin veteen, jolloin muodostuva mikroemulsio on O/W-emulsio ja jatkuvana faasina oleva vesi on tasapainossa öljyn kanssa (Winsor I). Vastaavasti pinta-aktiivinen aine voi olla liukenevin öljyyn ja muodostuu W/O-emulsio. Tällöin jatkuvana faasina oleva öljy on tasapainossa veden kanssa (Winsor II). Kummassakin tapauksessa dispergoituneiden veden ja öljyn pitoisuudet ovat pienet. Winsorin II tapauksessa pintaaktiivisen aineen tarve on vähäinen. Kun pinta-aktiivisen aineen määrää kasvatetaan, vesipisaroista tulee epäsäännöllisiä. Veden ja öljyn suhteen ollessa : (v/v), vesipisarat liittyvät toisiinsa, jolloin jatkuvan öljyfaasin rinnalle muodostuu jatkuva vesifaasi. Kyseessä on tällöin kahtaisjatkuva koostumus, joka on tasapainossa sekä öljy- että vesifaasin kanssa (Winsor III). Winsorin IV tapauksessa esiintyy täysin homogeeninen yksittäinen faasi. (Moulik & Rakshit, 00) Kuvassa 7 on esitetty faasien muodostuminen Winsorin periaatteiden mukaisesti.

4 Kuva 7. Faasien muodostuminen veden, öljyn ja pinta-aktiivisten aineiden muodostamassa seoksessa. (Moulik & Rakshit, 00).4 Ominaisuuksien karakterisointi Mikroemulsioiden ominaisuuksien tutkiminen on haastavaa johtuen erityisesti pisaroiden pienestä koosta. Eri karakterisointimenetelmien yhdistäminen onkin usein kannattavaa. Valonsironta-mittaukset ovat yleisimpiä menetelmiä, kun halutaan saada tietoa mikroemulsion koosta, muodosta tai rakenteesta. Dynaamisella valon sironnan mittauksella määritetään pisaroiden kokonaisdiffuusiokerroin, jonka avulla saadaan laskettua pisaroiden hydrodynaaminen säde. Staattisen valon sironnan mittauksella voidaan sen sijaan tutkia pisaroiden välisiä vuorovaikutuksia. (Holmberg, 00) Diffuusio-erotteisella ydinmagneettisella resonanssilla (DOSY, engl. Diffusion- Ordered Nuclear Magnetic Resonance) määritetään samanaikaisesti veden, öljyn ja pinta-aktiivisen aineen ominaisdiffuusiokertoimet. Menetelmässä saadaan kaksiulotteinen spektri, josta nähdään atomien kemialliset siirtymät sekä yhdisteiden ominaiset liikenopeudet eli diffuusiokertoimet. O/W-mikroemulsioissa sekä pintaaktiivinen aine että öljy diffundoituvat, joten niiden diffuusiokertoimet ovat samat. W/O-mikroemulsioissa tilanne on päinvastainen, jolloin pinta-aktiivisen aineen ja veden diffuusiokertoimet ovat samat. Jos veden ja öljyn diffuusiokertoimet ovat samaa suuruusluokkaa, mikroemulsio on koostumukseltaan kahtaisjatkuva. Diffuusiokertoimen avulla saadaan lisäksi määritettyä pisaran hydrodynaaminen säde. (Hathout, 00, Holmberg, 00)

5 Mikroemulsioiden viskositeetti riippuu vahvasti koostumuksesta, mutta se on misellisessä liuoksessa alhainen (0 - Pas). Kun pyöreänmuotoiset pisarat kasvavat ja muuttuvat epäsäännöllisen muotoisiksi, viskositeetin arvo kasvaa. (Holmberg, 00) Toisin kuin monien muiden nesteiden kohdalla, lämpötilan nostaminen voi nostaa mikroemulsioiden viskositeettiä (Moulik & Rakshit, 00). Taulukossa IV on esitetty viskositeetin arvoja W/O-mikroemulsiossa, joka koostuu vedestä, pinta-aktiivisena aineena käytettävästä polysorbaatti 80:stä (Tween 80, engl., Polysorbate 80) sekä sykloheksanolista tai heksaanista. Heksaani ja sykloheksanoli ovat liuottimia, jotka osallistuvat Tween 80:stä valmistetun misellin muodostukseen. Taulukko IV Mikroemulsioiden viskositeetit 5 C lämpötilassa. (Rymes et al., 00) Wt. % Viskositeetti, mpas Öljy Tween 80 Vesi γ=0 s - γ=000 s - 78,5 Sykloheksanoli,40 0,00,00 7,80 85,0 Sykloheksanoli 0,70 4,30 3,00 4,00 94,5 Heksaani 0,40 5,00 -,00 89,3 Heksaani 0,70 0,00 0,00,00 83,8 Heksaani,0 5,0 330,00 3,00 77,8 Heksaani,50 0,70 70,00 5,00 γ: leikkausnopeus Taulukon IV tuloksista nähdään, että sykloheksanolia käytettäessä viskositeettien arvot ovat huomattavasti pienempiä kuin heksaanin kohdalla. Sykloheksanolin tapauksessa veden määrällä ei ole suurta vaikutusta viskositeettien arvoihin. Kun heksaania sisältävissä mikroemulsioissa veden määrää vähennetään, viskositeetin arvo kasvaa ja mikroemulsiosta tulee geelimäinen. Johtokykymittaukset antavat hyödyllistä tietoa mikroemulsioiden rakenteellisesta järjestäytymisestä. O/W-mikroemulsioiden johtokyky on suurempi W/Omikroemulsioihin verrattuna. Johtokyvyn arvo kasvaa, kun veden määrää mikroemulsiossa lisätään. (Holmberg, 00)

.5 Sovellukset Mikroemulsioita käytetään useissa eri sovelluksissa. Yksi yleisimmistä käyttökohteista on raakaöljyn talteenotto. Noin 0 % öljyvaroista on vaikeasti hyödynnettävissä johtuen öljyn ja suolaveden välisestä korkeasta pintajännityksestä (0 5 mn/m). (Paul & Moulik, 00) Öljyvarasto koostuu öljystä ja vedestä, joten mikroemulsion muodostamiseksi tarvitsee lisätä vain pinta-aktiivista ainetta. Öljy voi sijaita huokoisessa kivimateriaalissa, jonne pinta-aktiivista ainetta pumpataan 5-30 % huokosten kokonaistilavuudesta. Lopuksi öljyvarastoon pumpataan polymeeriä ja vettä, joka korvaa pois pumpattavan öljyn. (Kumar et al., 0) Samalla tavoin mikroemulsioita voidaan hyödyntää epäpuhtauksien poistamiseen saastuneesta maa-aineksesta (Holmberg, 00). Mikroemulsioita käytetään nestemäisinä kalvoina esimerkiksi etikkahapon erottamiseen vedestä. Myös raskasmetallien talteenotto öljyhappoa sisältävästä saastuneesta vedestä onnistuu mikroemulsioiden avulla. Winsorin I tyypin mikroemulsioilla voidaan erottaa öljyyn liukenevia yhdisteitä ja Winsorin II tyypin mikroemulsioilla veteen liukenevia. (Paul & Moulik, 00) Mikroemulsiot nostavat bensiinin oktaanilukua ja dieselin setaanilukua, mikä mahdollistaa niiden käytön polttoaineina. Mikroemulsiossa oleva vesi laskee palamislämpötilaa ja siten vähentää haitallisten aineiden päästöjä sekä mahdollistaa vesiliukoisten lisäaineiden käytön, joita tavallisissa polttoaineissa ei voida käyttää. Mikroemulsiot ovat lisäksi tehokkaita korroosion esto- sekä voiteluaineita. (Paul & Moulik, 00) Lääketeollisuudessa mikroemulsioita käytetään lääkeaineiden imeyttämiseen ihon läpi, jolloin lääkeaine on liuotettuna mikroemulsioon. Mikroemulsioissa olevat pisarat ovat hyvin pieniä, joten ne pääsevät hyvin kontaktiin ihon kanssa ja lääkeaineen imeytyminen paranee. Etuna on, että samaa mikroemulsiota voidaan käyttää liuottamaan sekä vesi- että rasvaliukoisia lääkeaineita. Mikroemulsiot ovat helposti vereen sekoittuvia, joten niitä voidaan myös hyödyntää lääkkeiden antamiseen ruiskulla. (Moulik & Rakshit, 00) Pinta-aktiivisen aineen määrällä ja tyypillä on suurin vaikutus lääkeaineiden imeytyksessä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että lisäämällä pinta-aktiivisten aineiden määrää mikroemulsiossa ei kuiten-

7 kaan lisätä niiden kulkeutumista ihon läpi. Misellien ylimäärä voi jopa alentaa lääkeaineiden termodynaamista aktiivisuutta. (Heuschkel et al., 007) Biotekniikassa mikroemulsioita on käytetty proteiinien uuttamiseen käymisprosessien nesteistä, tekstiiliteollisuudessa jätevesien värinpoistoon ja kosmetiikkateollisuudessa erilaisissa ihonhoitotuotteissa (Moulik & Rakshit, 00). Mikroemulsioita käytetään myös analyyttisissä sovellutuksissa kuten kromatografiassa. Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia on erotusmenetelmä, jossa yhdisteiden erottuminen tapahtuu mikroemulsiossa. (Paul & Moulik, 00) Menetelmää on tarkemmin käsitelty kappaleessa 4. 3 Kapillaarielektroforeesi Kapillaarielektroforeesista (CE) on viime vuosikymmenen aikana tullut tärkeä erotusmenetelmä perinteisten kaasu- ja nestekromatografiatekniikoiden rinnalle. CE:n yhdistäminen muihin analyysilaitteistoihin laajentaa sen käyttömahdollisuuksia rajattomasti. Lääketeollisuuden laadunvalvonnassa ja kliinisessä kemiassa, joissa vaaditaan nopeita ja toistettavia analyysejä, CE on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä. Sitä käytetään esimerkiksi lääkeaineiden pitoisuuksien, rakenteiden sekä ominaisuuksien määrittämiseen. CE soveltuu hyvin myös ruokaaineiden analysointiin, joissa tutkittavat yhdisteet voivat esiintyä hyvinkin monimutkaisissa matriiseissa. Elintarviketeollisuudessa sen käyttökohteita ovat esimerkiksi amiinien, vitamiinien, hiilihydraattien, proteiinien, peptidien sekä erilaisten lisäaineiden analysointi. CE soveltuu hyvin myös fenolien, pinta-aktiivisten aineiden sekä aromaattisten ja alifaattisten amiinien analysointiin ja erottamiseen ympäristönäytteistä. Vaikka kapillaarielektroforeesia käytetään jo nyt laajalti, on menetelmä kuitenkin vielä kehitysasteella instrumentoinnin ja sovellutuksien suhteen. CE:n käyttömahdollisuuksien uskotaankin kasvavan lähitulevaisuudessa. Tulevaisuudessa CE:lla voitaneen saavuttaa korkeita erotustehokkuuksia vain muutamien sekuntien analyysiajoilla. (Marina et al., 005) 3. Menetelmän periaate Kapillaarielektroforeesissa varauksellisten yhdisteiden erottuminen perustuu niiden erilaiseen liikkuvuuteen sähkökentässä. Yhdisteet erottuvat ohuessa kapillaa-

8 rissa, joka on täytetty sähköä johtavalla elektrolyytti- eli puskuriliuoksella. Yksittäisen yhdisteen nopeus sähkökentässä voidaan laskea yhtälöllä () (Marina et al., 005) = () jossa ν yhdisteen nopeus, m/s yhdisteen elektroforeettinen liikkuvuus, m /Vs E sähkökenttä, V/m Yhdisteiden havaittu liikkuvuus voidaan määrittää seuraavalla yhtälöllä (Marina et al., 005) = () jossa L det L tot t m U yhdisteen havaittu liikkuvuus, m /Vs kapillaarin pituus detektorille, m kapillaarin kokonaispituus m yhdisteen migraatioaika, s jännite, V Yhdisteen elektroforeettinen eli todellinen liikkuvuus voidaan määrittää yhdisteen havaitun liikkuvuuden ja liuoksen elektro-osmoottisen liikkuvuuden summasta (Marina et al., 005) = ± (3) jossa yhdisteen elektroforeettinen liikkuvuus liuoksen elektro-osmoottinen liikkuvuus Kapillaarielektroforeesin erotustehokkuutta kuvataan teoreettisten pohjien lukumäärää kuvaavalla luvulla, joka saadaan suoraan piikin keskihajonnan ja kapillaarin tehopituuden avulla (Agilent Technologies, 00)

9. = (4) jossa N teor teoreettisten pohjien lukumäärä, /m σ p piikin keskihajonta, - Piikin keskihajonta voidaan määrittää seuraavasti (Agilent Technologies, 00) = (5) jossa w b piikin pohjan leveys, m Kapillaarielektroforeesissa käytettävien puskuriliuosten tyypilliset pitoisuudet ovat 0 50 mm. (Beckman Coulter). Taulukkoon V on koottu muutamia yleisimmin käytettyjä puskuriliuoksia. Taulukko V Kapillaarielektroforeesissa käytettävien puskuriliuosten optimaalinen ph-alue sekä näkyvyys UV/VIS-detektorilla. (Agilent Technologies, 00). Puskuri Optimaalinen ph-alue Fosfaatti, 3, 95 Fosfaatti, 8, 95 Formaatti,7 4,8 00 Asetaatti 3,8 5,8 00 Sitraatti 3,8 4,8 00 Sitraatti 5,4 7,4 00 Boraatti 8, 0, 80 Tris(hydroksyylimetyyli)aminometaani 7,3 9,3 0 Näkyvyys UV/VISdetektorilla (> nm) Käytettävän kapillaarimateriaalin tulee olla kemiallisesti ja sähköisesti inertti, läpinäkyvä UV- ja näkyvän valon alueella, kestävä sekä edullinen. Kapillaarit on valmistettu silikasta ja päällystetty polyimidilla, mikä tekee niistä joustavia ja helpommin käsiteltäviä. Detektointi-ikkuna saadaan polttamalla pieni osa päällysteestä pois esimerkiksi sähkölämmitteisellä johtimella. Käytettävien kapillaarien tyypilliset sisä- ja ulkohalkaisijat ovat 5 00 µm ja 350 400 µm sekä pituudet 5 75 cm. (Agilent Technologies, 00) Silika-kapillaarin sisäseinämä koostuu vapaista silanoliryhmistä, SiOH, jotka ionisoituvat riittävän korkeassa ph:ssa (>) (yhtälö ()) ja saavat aikaan negatiivisesti varautuneen kerroksen kapillaarin seinämään (Li, 99). Si O H SiO + H ()

0 Kun sähkökenttä kytketään päälle ja kapillaaria tämän jälkeen huuhdellaan elektrolyyttiliuoksella, liuoksessa olevat positiiviset ionit (kationit) kulkeutuvat seinämän lähelle ja seinämään muodostuu kaksoiskerros (kuva 8). Osa kationeista jää negatiivisesti varautuneen seinämän pintaan muodostaen siihen ns. Sternin kerroksen ja osa jakautuu seinämän lähelle muodostaen siihen diffuusiokerroksen. Sternin ja diffuusiokerroksen välistä potentiaalia kutsutaan zeta-potentiaaliksi (ζ), jonka arvo on 0-00 mv. (Smith, 999) Kuva 8. Sähköinen kaksoiskerros (Smith, 999) Elektro-osmoottinen virtaus (, engl. Electro-Osmotic Flow) syntyy, kun diffuusiokerros alkaa liikkua (kuva 9). Kun laitteen jännite on positiivinen, kulkee anodilta katodille. (Altria, 99) Kuva 9. Elektro-osmoottinen virtaus. (Altria, 99)

Kun näytteet injektoidaan elektrolyyttiliuoksella täytettyyn kapillaariin, siinä olevat yhdisteet kulkeutuvat sähkökentässä eri nopeuksilla ja erottuvat toisistaan. Kun elektrolyyttiliuoksen ph on korkea ja laitteiston jännite positiivinen, kulkeutuvat kationit ensimmäisenä detektorille. :n mukana tulevat neutraalit yhdisteet ja viimeisenä anionit, jotka pyrkivät kulkeutumaan kohti anodia virtausta vastaan. (Beckman Coulter) Sähköinen kaksoiskerros aiheuttaa :lle tylpän virtausprofiilin (kuva 0). Virtausprofiilin muodosta johtuen kapillaarielektroforeesilla on mahdollista saada hyvinkin teräviä piikkejä kromatografisiin erotusmenetelmiin verrattuna. on jakautunut yhtenäisesti koko kapillaarin pituudelta, joten virtaus pysyy vakiona eikä painehäviöitä ilmene. (Beckman Coulter, Marina et al., 005) Kuva 0. Virtausprofiili elektro-osmoottisessa ja hydrodynaamisessa virtauksessa. (Beckman Coulter) 3. Laitteisto Kapillaarielektroforeesilaitteisto koostuu jännitelähteestä, kapillaarista, detektorista sekä näyte- ja puskuriastioista (kuva ). Analyysin alkaessa kapillaari täytetään puskuriliuoksella ja asetetaan molemmista päistään puskuriliuosastioihin. Puskuriastioissa olevissa liuoksissa on myös elektrodit, joilla korkeajännitelähteestä johdetaan sähköä kapillaariin. Näyte injektoidaan kapillaariin korvaamalla

toinen puskuriastia näyteastialla. Tämän jälkeen jännite kytketään päälle ja erotus alkaa. Yhdisteet detektoidaan kapillaarin polyimidikerrokseen poltetun ikkunan läpi. Detektointikohta sijaitsee kapillaarin ulostulopään läheisyydessä. (Beckman Coulter) Kuva. Kapillaarielektroforeesilaitteiston periaatekuva. (Beckman Coulter) UV/VIS-spektrofotometri on yleisin kapillaarielektroforeesissa käytetty detektori johtuen sen soveltuvuudesta useille eri yhdisteille sekä monille kapillaarielektroforeesin sovellutuksille. UV/VIS-detektointi tapahtuu suoraan kapillaarissa, jolloin erotustehokkuus säilyy. Toteamisrajat yhdisteille ovat 0 0 mol/l. Muita detektointimenetelmiä ovat fluoresoivien yhdisteiden tunnistamisessa käytettävä fluoresenssidetektori sekä massaspektrometri, jolla saadaan rakenteellista tietoa tutkittavista yhdisteistä. (Agilent Technologies, 00) 3.3 Näytteensyöttö Kapillaariin syötettävät näytetilavuudet ovat suuruudeltaan nanolitran luokkaa (-50 nl). Näytteen tilavuuden näyteastiassa tulee kuitenkin olla vähintään muutamia mikrolitroja. Yleisimmät injektointimenetelmät ovat hydrodynaaminen ja elektrokineettinen näytteensyöttö. (Agilent Technologies, 00) Hydrodynaamisessa näytteensyötössä injektointi tehdään paineella. Näyteastia voidaan paineistaa tai vaihtoehtoisesti elektrolyyttiastia voidaan alipaineistaa, jolloin näyte saadaan virtaamaan kapillaariin. (Agilent Technologies, 00)

3 Elektrokineettisessä näytteensyötössä kapillaarin toinen pää ja elektrodi on sijoitettu näyteastiaan. Jännitteen kytkemisen jälkeen näyte siirtyy kapillaariin. Tässä vaiheessa jännite on yleensä 3-5 kertaa pienempi kuin erotuksessa käytettävä jännite. (Agilent Technologies, 00, Marina et al., 005) Kuvassa on esitetty hydrodynaamisen ja elektrokineettisen näytteensyötön menetelmät. Kuva. Kapillaarielektroforeesissa käytettävän hydrodynaamisen ja elektrokineettisen näytteensyötön periaate. (Altria, 99) 4 Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia Mikroemulsiosähkökineettinen kromatografia (MEEKC) on kapillaarielektroforeesiin perustuva menetelmä, jossa yhdisteiden erottuminen tapahtuu mikroemulsioissa (kappale ). Toisin kuin kapillaarielektroforeesilla, MEEKC-menetelmällä on mahdollista erottaa varauksellisia, neutraaleita, veteen liukenevia ja liukenemattomia yhdisteitä. Yleensä mikroemulsioissa käytetään korkean ph:n puskuriliuoksia, kuten boraattia ja fosfaattia, koska niillä saadaan aikaan voimakas elektro-osmoottinen virtaus. (Pyell, 00) MEEKC-menetelmästä löytyy myös tutkimuksia, joissa erotukseen on käytetty hapanta liuosta (Pedersen-Bjergaard & Halvorsen, 000, Maciá et al., 00, Kartsova & Ganzha, 00) Pinta-aktiivisesta aineesta riippuen öljypisarat voivat olla positiivisesti tai negatiivisesti varautuneita. Myös kahtaisionisia ja neutraaleita pinta-aktiivisia aineita on

4 käytetty. Kun pisarat ovat negatiivisesti varautuneita, ne pyrkivät liikkumaan kohti anodia :a vastaan. on kuitenkin niin voimakas, että pisarat kulkeutuvat hitaasti virtauksen mukana katodille. Tutkittavat yhdisteet jakautuvat öljypisaroiden ja vesipohjaisen puskuriliuoksen välillä siten, että hydrofobiset yhdisteet pyrkivät liittymään öljypisaroihin ja hydrofiiliset yhdisteet jäävät vesifaasiin. Mitä hydrofobisempi yhdiste on, sitä kauemmin sillä kestää kulkeutua detektorille. Erittäin hydrofiiliset ja neutraalit yhdisteet kulkeutuvat nopeasti :n mukana. (Ryan et al., 0) Neutraalit yhdisteet migroituvat jakautumiskertoimiensa mukaisessa järjestyksessä (Altria, 999). Jakautumiskerroin (log P) kuvaa yhdisteen jakautumista veden ja orgaanisen liuottimen välillä. Orgaaninen liuotin on yleensä oktanoli, jolloin puhutaan oktanoli/vesi jakautumiskertoimesta. Jakautumiskerroin määritetään seuraavalla yhtälöllä (Poole & Poole, 003) log = (7) jossa c o c w yhdisteen pitoisuus oktanolifaasissa, mg/l yhdisteen pitoisuus vesifaasissa, mg/l Varauksellisten yhdisteiden erottuminen perustuu niiden kokoon ja varaukseen sekä vuorovaikutuksiin pisaroiden kanssa. Jos sekä yhdiste että öljypisara ovat negatiivisesti varautuneita, ne hylkivät toisiaan. Jos yhdiste on positiivisesti varautunut, sen ja öljypisaran välillä voi tapahtua ioniparivuorovaikutuksia. (Ryan et al., 0) Kuvassa 3 on esitetty MEEKC-menetelmän periaate.

5 Kuva 3. MEEKC-menetelmän periaate, kun öljypisarat ovat negatiivisesti varautuneita (Altria, 000) 4. Erottumiseen vaikuttavat tekijät MEEKC-menetelmässä useilla eri tekijöillä voidaan vaikuttaa yhdisteiden erottumiseen ja selektiivisyyteen. Näitä ovat esimerkiksi pinta-aktiivisen aineen, öljyn sekä puskuriliuoksen tyyppi ja pitoisuus, puskuriliuoksen ph, orgaanisen liuottimen lisääminen, lämpötila sekä näytteiden liuottamiseen käytettävät liuottimet. (Altria, 000) 4.. Pinta-aktiivinen aine Pinta-aktiivisen aineen valinnalla voidaan vaikuttaa öljypisaran kokoon ja varaukseen sekä :n suuntaan ja voimakkuuteen. SDS on mikroemulsioissa yleisimmin käytetty anioninen pinta-aktiivinen aine, joka muodostaa negatiivisesti varautuneita öljypisaroita. SDS:n pitoisuus on tyypillisesti noin 0 mm (3 %, w/w), jolloin mikroemulsio pysyy stabiilina jopa useita kuukausia. CTAB on kationinen pinta-aktiivinen aine, joka muodostaa positiivisesti varautuneita öljypisaroita ja saa aikaan kapillaarin seinämään positiivisesti varautuneen kerroksen. liikkuu tällöin katodilta anodille, joten CTAB:n kanssa tulee käyttää negatiivista jännitettä. (Altria, 003) CTAB:a käytetään yleisesti eliminoimaan ioniparivuorovaikutuksia, joita kationisilla yhdisteillä on negatiivisesti varautuneen öljypisaran kanssa (Marina et al., 005). Triton X-00 on esimerkki neutraalista pintaaktiivisesta aineesta. Neutraaleilla pinta-aktiivisilla aineilla ei voida kuitenkaan

erottaa neutraaleita yhdisteitä, koska neutraalit öljypisarat kulkevat :n kanssa samalla nopeudella. (Altria, 003) 4.. Liukoisuutta lisäävä aine -Butanoli on yleisimmin käytetty misellin liukoisuutta lisäävä aine mikroemulsioissa. Lisätty alkoholi vaikuttaa mikroemulsion viskositeettiin ja edelleen :n sekä yhdisteiden migraatioaikoihin. -Butanolin pitoisuutta kasvattamalla voidaan öljypisaran kokoa suurentaa ja siten vaikuttaa pisaran varaustiheyteen. (Altria, 003) -Butanolin pitoisuuden kasvattaminen ei kuitenkaan vaikuta selektiivisyyteen (Marina et al., 005). Muita MEEKC-menetelmässä käytettäviä liukoisuutta lisääviä aineita ovat esimerkiksi -propanoli, tetrahydrofuraani, -etoksietanoli, (Gabel-Jensen et al., 00), pentanoli, etanoli sekä metanoli (Klampfl, 003). 4..3 Puskuriliuos Yleisimmät MEEKC-menetelmässä käytettävät puskuriliuokset valmistetaan boraatti- ja fosfaattisuoloista siten, että liuosten ionivahvuudet ovat pienet (5-0 mm). Korkeammilla puskuripitoisuuksilla nopeutuu ja sähkövirta kasvaa, mikä taas rajoittaa analyyseissä käytettävän jännitteen suuruutta. Puskuriliuoksen ph:lla on suuri vaikutus selektiivisyyteen, koska se vaikuttaa sekä yhdisteen ionisoitumiseen että :n suuruuteen. MEEKC-menetelmässä käytettävien puskuriliuosten ph:t ovat tyypillisesti 7-9, jolloin on suhteellisen suuri ja varaukselliset yhdisteet saadaan ionisoitumaan. (Altria, 003) 4..4 Öljy Öljyn valinnalla voidaan vaikuttaa yhdisteen migraatioaikoihin. -Oktaani ja -heptaani ovat mikroemulsioissa yleisimmin käytettyjä öljyjä. -Heksaanilla, -heptaanilla ja -oktaanilla on havaittu saatavan samankaltaisia selektiivisyyksiä ja migraatioaikoja useiden neutraalien yhdisteiden kohdalla. Kyseisillä öljyillä on kuitenkin korkea pintajännitys, joten pinta-aktiivisen aineen määrän mikroemulsiossa on oltava riittävän suuri. Pinta-aktiivisen aineen suuri määrä kuitenkin hidastaa yhdisteiden erottumista ja analyysiajat ovat tällöin pitkiä. Etyyliasetaatilla ja

7 di-butyyli tartraatilla on matalampi pintajännitys, minkä vuoksi pinta-aktiivista ainetta tarvitaan vähemmän ja analyysiaika lyhenee. Muita MEEKCmenetelmässä käytettäviä öljyjä ovat dietyylieetteri, sykloheksaani, metyleenikloridi, amyylialkoholi, butyylikloridi, -oktanoli sekä -heksanoli. (Altria, 003, Marina et al, 005, Puig et al., 00) MEEKC-menetelmässä ei tämän hetken tietämyksen perusteella ole vielä käytetty luonnosta peräisin olevia öljyjä, kuten soija-, oliivi-, rypsi-, palmu-, eukalyptustai sitrusöljyjä O/W-mikroemulsioissa. Luonnosta peräisin olevien öljyjen suuret molekyylirakenteet rajoittavat niiden käyttöä O/W-mikroemulsioiden muodostamisessa. 4..5 Orgaaninen liuotin Jotkin veteen liukenemattomat yhdisteet liittyvät voimakkaasti öljypisaroihin, jolloin niiden tunnistaminen on hankalaa. Orgaanisen liuottimen lisääminen mikroemulsioihin viidenneksi aineeksi yleensä auttaa parantamaan resoluutiota sekä lyhentämään yhdisteiden migraatioaikoja. Yleisimmät mikroemulsioissa käytettävät liuottimet ovat asetonitriili, metanoli ja isopropanoli. (Altria, 003) 4.. Näytteiden liuotus Yhdisteiden erottumiseen vaikuttaa näytteen liuottamiseen käytettävän liuottimen valinta. Näytteen liuottaminen muuhun, kuin käytettävään mikroemulsioon, vaikeuttaa yhdisteiden erottumista ja voi lisäksi aiheuttaa mikroemulsion hajoamisen erillisiin öljy- ja vesifaaseihin. (Altria, 003) 4. Sovellukset MEEKC-menetelmän yleisin käyttökohde on lääkeaineiden erottaminen (Mahuzier et al., 003). Menetelmällä on tutkittu penisilliiniantibiootteja (Puig et al., 00), tulehduskipulääkkeitä vesinäytteistä (Macià et al., 00), parasetamolia (McEvoy et al., 008), parabeenejä (Marsh et al., 004) sekä useita muita lääkeaineissa käytettäviä yhdisteitä (Miola et al., 998; Altria, 999). Menetelmää on sovellettu myös vesi- ja rasvaliukoisten vitamiinien (Boso et al., 995, Aurora-

8 Prado et al., 004) sekä proteiinien erottamiseen (Sirén & Karttunen, 003; Zhou et al., 999) Taulukkoon VI on koottu menetelmän sovelluskohteita sekä niissä käytettyjen mikroemulsioiden koostumuksia. Taulukko VI MEEKC-menetelmän sovelluskohteita. Sovellus Mikroemulsion koostumus Lähde Boraatti-puskuriliuokset B-vitamiinin määrittäminen lääkeaineesta Hydrofobiset ja neutraalit lääkeaineet Penisilliini antibiootit Proteiinit 4-hydroksibentsoaattien ja niissä olevien epäpuhtauksien analysointi Säilöntäaineiden (esim. bentsoehappo ja triklosaani) analysointi lääkeaineista ja kosmetiikkatuotteista 4-kloro-7-nitro-,,3- bentsoksadiatsolilla derivatisoidut katekoliamiinit Liukoisuus määritykset (log P) 0,5 % etyyliasetaatti,, % -butanoli, 0, % SDS, 5 % -propanoli, 8,7 % 0 mm tetraboraatti (ph 9,) 0,8 % -oktaani, 3,3 % SDS,, % -butanoli, 89,7 % 0 mm natriumtetraboraatti 0,5 % etyyliasetaatti,, % -butanoli, % Brij 35, 0 % -butanoli, 8,3 % 0 mm boraatti (ph 0) 80 mm heptaani, 0 mm SDS, 900 mm butanoli,,5 mm boraatti (ph 8,5 9,5) 0,8 % -oktaani, 3,3 % SDS,, % -butanoli, 89,3 % puskuri (boraatti (ph 9,5) tai fosfaatti (ph,)) 0,8 % -oktaani, 3,3 % SDS,, % - butanoli, 89,7 % 0 mm natriumtetraboraatti (ph 9,5) 0, % etyyliasetaatti, 30 mm SDS, 0, % - butanoli, % asetonitriili, 0 mm natriumtetraboraatti (ph 9,9) 0,8 % -oktaani, 3,3 % SDS,, % -butanoli, 89,3 % 0 mm natriumtetraboraatti Aurora- Prado et al., 004 Miola et al., 998 Puig et al., 00 Zhou et al., 999 Huang et al., 003 Mahuzier et al., 00 Zhou et al., 008 Marsh & Altria, 00 Polaariset yhdisteet (esim. isoflavonoidit ja bentsodiatsepiinit) 0,9 % -oktaani, 3,3 % SDS,, % -butanoli, 89 % 0 mm natriumtetraboraatti (ph 9,5) Sirén Karttunen, 003 & Fosfaatti-puskuriliuokset Vesi- ja rasvaliukoiset vitamiinit Isokinoliini alkaloidien ja saponiinien erottaminen Tulehduskipulääkkeiden (esim. ibuprofeeni, ketoprofeeni) analysointi vesinäytteistä 0,8 % öljy,, % SDS (tai 3,3 % TTAB),, % -butanoli, 89,8 % 0 mm fosfaatti (ph 7,0) 00 mm -heptaani, 40 mm SDS, 0 % - butanoli, 5 mm SC (natriumkolaatti), % metanoli, 0 mm fosfaatti (ph 8,0) 0,8 % -heptaani,, % -butanoli, 5 % asetonitriili, 3,3 % SDS, 74,3 % 5 mm natriumfosfaatti (ph,5) Boso et al., 995 Bo et al., 00 Macià et al., 00