VASKULARISOITUNEIDEN RAKENTEIDEN VALMISTAMINEN HYDROGEELI-POHJAISILLA MENETELMILLÄ IN VITRO

Sara Inget VASKULARISOITUNEIDEN RAKENTEIDEN VALMISTAMINEN HYDROGEELI-POHJAISILLA MENETELMILLÄ IN VITRO Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta Kandidaatintyö Joulukuu 2020

i TIIVISTELMÄ Sara Inget: Vaskularisoituneiden rakenteiden valmistaminen hydrogeeli-pohjaisilla menetelmillä in vitro Kandidaatin työ Tampereen yliopisto Tekniikan ja luonnontieteiden kandidaattiohjelma, Biotekniikka Joulukuu 2020 Yksi suurimmista haasteista kudosteknologiassa on vaskularisaation muodostaminen kudosrakenteisiin. Aikaisemmin kudosmallit ovat olleet hyvin yksinkertaisia ja ohuita, jolloin hapen ja ravinteiden diffuusio kasvatusliuoksesta soluille on ollut riittävää. Kudosmallien paksuuden kasvaessa ravinteiden diffuusio rakenteen ulkopuolelta ei kuitenkaan enää riitä, jolloin rakenteen keskellä sijaitsevat solut kuolevat. Verisuonien muodostaminen kudosmalleihin on siten välttämätöntä monimutkaisempien ja suurempien kudosten valmistamiseksi. Verenkierto on tärkeä osa lähes kaikkien kudosten rakennetta ja toimintaa, joten vaskularisaation avulla kudosmallit vastaavat entistä paremmin niiden luonnollisia funktioita. Tässä työssä perehdytään hydrogeeli-pohjaisiin menetelmiin, joilla voidaan valmistaa vaskularisoitavia rakenteita. Tavoitteena on muodostaa yleiskuva valmistusmenetelmistä ja niihin liittyvistä haasteista. Hydrogeelien rakenne ja ominaisuudet muistuttavat soluväliainetta ja mahdollistavat solujen adheesion ja levittäytymisen rakenteeseen. Verisuonirakenteita voidaan valmistaa muodostamalla valmiita kanavia hydrogeeleihin ja antamalla solujen levittäytyä kanavien pinnoille ja muualle rakenteeseen tämän jälkeen. Suurempien verisuonien valmistuksessa tämä lähestymistapa takaa nopeamman verisuoniverkoston muodostumisen. Pienimpien kapillaarisuonien kokoisia kanavia ei kyetä nykytekniikalla valmistamaan valmiiksi soluja varten, joten kapillaariverkostojen valmistamisessa hyödynnetään endoteelisolujen luonnollista taipumusta levittäytyä ja muodostaa uusia kapillaarisuonia hydrogeeliin. Vaskularisoitavissa hydrogeelirakenteissa on käytetty useita polymeerejä ja niiden yhdistelmiä. Kollageeni ja gelatiini ovat yleisimmin käytettyjä luonnon polymeerejä. Ne ovat hyvin yhteensopivia solujen kanssa ja tarjoavat useita sitoutumiskohtia mahdollistaen solujen adheesion ja levittäytymisen hydrogeeliin. Synteettisistä hydrogeeleistä polyetyleeniglykolin (PEG) johdannaiset ovat olleet käytetyimpiä ja ne ovat mekaanisilta ominaisuuksiltaan vahvempia kuin luonnon polymeerit. Synteettisten ja luonnon polymeerien yhdistäminen samaan hydrogeeliin antaa todennäköisesti parhaat lähtökohdat uusien hydrogeelien suunnitteluun ja kestävämpien vaskulaaristen rakenteiden valmistamiseen. Yksinkertaisimmat menetelmät perustuvat hydrogeelien valamiseen erilaisten muottien avulla. Valumenetelmien käyttö rajoittuu kuitenkin suurempien kanavarakenteiden valmistukseen. Pehmeän litografian avulla kanavarakenteiden resoluutiota on pystytty parantamaan ja entistä pienempiä ja monimutkaisempia kanavaverkostoja voidaan valmistaa hydrogeeleihin. 3Dbioprinttaus on tällä hetkellä potentiaalisin menetelmä monimutkaisimpien kolmiulotteisten verkostojen valmistamiseksi. Sen avulla kanavien arkkitehtuuri voidaan suunnitella hyvin monipuoliseksi, mutta toteuttamisessa on vielä paljon haasteita ratkaistavana. 3Dprinttauksella on kyetty valmistamaan lähes kapillaarisuonien kokoa vastaavia kanavia, mutta nykyisten hydrogeelien kestävyydestä ei vielä tiedetä tarpeeksi pitkäikäisten kudosmallien valmistamiseksi. Myöskään pitkäaikaisen ja jatkuvan perfuusion vaikutusta kanavarakenteisiin ei vielä tiedetä, sillä tutkimusjaksot ovat olleet vain muutaman viikon pituisia. Kudosmallien koon kasvaessa rakenteeseen kohdistuva rasitus tulee kuitenkin vain kasvamaan, joten hydrogeelien kehittäminen on avainasemassa vaskulaaristen rakenteiden valmistuksessa. Avainsanat: hydrogeeli, vaskularisaatio, verisuonimalli Tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck ohjelmalla.

ii ALKUSANAT Tämä kandidaatintyö on tehty Tampereen yliopiston Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekuntaan osana tekniikan kandidaatin tutkintoa. Haluan kiittää erityisesti ohjaajaani Jennika Karvista mielenkiintoisesta aiheesta sekä kommenteista ja parannusehdotuksista työtä tehdessäni. Lisäksi haluan kiittää ystäviäni, joilta sain arvokasta vertaistukea ja palautetta työstäni. Tampereella, 7.12.2020 Sara Inget

iii SISÄLLYSLUETTELO 1. JOHDANTO... 1 2. VERISUONTEN ANATOMIA JA FYSIOLOGIA... 3 3. HYDROGEELIT KUDOSTEKNOLOGIASSA... 5 3.1 Hydrogeelien yleisiä ominaisuuksia... 5 3.2 Hydrogeelien yhteensopivuus ja vuorovaikutus solujen kanssa... 7 3.3 Hydrogeelien hajoaminen... 7 4. VASKULARISOITUNEISSA HYDROGEELIRAKENTEISSA KÄYTETTÄVIÄ MATERIAALEJA... 9 4.1 Luonnon hydrogeelit... 9 4.2 Synteettiset hydrogeelit... 10 4.3 Hybridihydrogeelit... 11 4.4 Solutyypit... 12 4.4.1 Endoteelisolut... 12 4.4.2 Rakennetta tukevat solut... 13 5. VASKULARISOITUNEIDEN HYDROGEELIRAKENTEIDEN VALMISTUSMENETELMIÄ... 14 5.1 Mikrokanavien muodostaminen kiinteillä objekteilla... 14 5.2 Uhrimateriaalin käyttäminen... 15 5.3 Mikrokanavien muodostaminen litografisilla menetelmillä... 18 5.4 Vaskulaaristen rakenteiden modulaarinen valmistaminen... 25 5.5 3D- ja 4D-bioprinttaus... 29 6. VASKULARISOITUNEIDEN KUDOSMALLIEN KÄYTTÖ TAUTIMALLINNUKSESSA JA LÄÄKKEIDEN TESTAUKSESSA... 34 6.1 Body-on-chip... 34 6.2 Verenkierron häiriöt ja niihin liittyvät sairaudet... 35 6.3 Veri-aivoesteen tutkiminen lääkeaineiden kehityksessä... 37 7. VASKULAARISTEN RAKENTEIDEN VALMISTAMISEN HAASTEET JA TULEVAISUUS... 38 8. YHTEENVETO... 41 LÄHTEET... 43

iv LYHENTEET JA MERKINNÄT 3D 3T3 4D α-sma AA-MA BBB bfgf BMEC CD31 DTT EDTA FITC GelMA HA HCAEC HUVEC ipsc ipsc-ec LF Map2 MMP NSC PAM PBS PDMS PEG PEGDA PEGTA PGA PLA PLGA PLLA polyhema PVA RGD TEER VE-kadheriini VEGF Kolmiulotteinen Soluviljelmissä käytetty fibroblasti-solulinja Neliulotteinen Sileän lihaksen alfa aktiini, (eng. alpha smooth muscle actin) Metakryloitu alginaatti Veri-aivoeste (eng. blood-brain barrier) Emäksinen fibroblastikasvutekijä (eng. basic fibroblast growth factor) Aivojen verisuonten endoteelisolu (eng. brain microvascular endothelial cell) Verihiutaleiden endoteelisolujen adheesiomolekyyli Ditiotreitoli Etyleenidiamiinitetraetikkahappo Fluoreseiini-isotiosyanaatti Gelatiini metakrylaatti Hyaluronihappo Ihmisen sepelvaltimon endoteelisolu (eng. human coronary artery endothelial cell) Ihmisen napalaskimon endoteelisolu (eng. human umbilical vein endothelial cell) Indusoitu pluripotentti kantasolu (eng. induced pluripotent stem cell) Indusoiduista pluripotenteista kantasoluista erilaistettu endoteelisolu (eng. induced pluripotent stem cell derived endothelial cell) Keuhkon fibroblasti (eng. lung fibroblast) Mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 2 (eng. microtubule-associated protein 2) Matriksin metalloproteinaasi Hermokantasolu (eng. neural stem cell) Polyakryyliamidi Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (eng. phosphate-buffered salin) Polydimetyylisiloksaani Polyetyleeniglykoli Polyetyleeniglykoli diakrylaatti Polyetyleeniglykoli tetra-akrylaatti Polyglykolidi Polylaktidi Poly(laktidi-ko-gykolidi) Poly-L-laktidi Poly-2-hydroksietyyli metakrylaatti Polyvinyylialkoholi Arg-Gly-Asp -aminohapposekvenssi Endoteelikerroksen yli oleva sähköinen resistanssi (eng. transendothelial electrical resistance) Endoteelisoluille spesifinen adheesiomolekyyli (eng. vascular endothelial cadherin) Verisuonikasvutekijä (eng. vascular endothelial growth factor)

1 1. JOHDANTO Kudosteknologian sovelluksissa pyritään mallintamaan oikeiden kudosten ominaisuuksia ja piirteitä mahdollisimman hyvin. Yksi tärkeimmistä ominaisuuksista kudoksissa ovat verisuonisto ja verenkierto, sillä ne takaavat solujen hapen ja ravinteiden saamisen ja kuljettavat kuona-aineita pois. Happi ja ravinteet siirtyvät verenkierrosta diffuusiolla ympäröivään kudokseen. Jotta diffuusionopeus olisi riittävä solujen tarpeisiin, solujen tulee sijaita noin 100-200 μm:n päässä lähimmästä verisuonesta [1]. Vaskularisaation eli verisuonituksen puuttuminen rajoittaa siten valmistettavien kudosmallien paksuutta ja estää etenkin isojen kolmiulotteisten kudosten ja elinten mallintamisen in vitro. Vaskulaaristen kudosmallien valmistaminen auttaa ymmärtämään verisuonien muodostumisen mekanismeja, verenkiertoelimistön fysiologiaa ja sairauksia, sekä mahdollistaa monimutkaisempien kudosten ja elinten rakentamisen. Vaskularisoituneiden rakenteiden valmistamiseen tarvitaan materiaaleja, joiden ominaisuudet muistuttavat mahdollisimman hyvin verisuonten luonnollisia olosuhteita. Verisuonet ja ympäröivä soluväliaine ovat pehmeää kudosta, joten käytettävien materiaalien on oltava pehmeitä, mutta myös tarpeeksi vahvoja kestääkseen verisuoniin kohdistuvan mekaanisen rasituksen. Lisäksi tärkeää on yhteensopivuus solujen kanssa. [2] Hydrogeelit soveltuvat pehmeiden kudosten valmistamiseen hyvin, sillä ne pystyvät varastoimaan rakenteensa sisään paljon vettä. Vesi mahdollistaa molekyylien diffuusion materiaalin läpi, aivan kuten soluväliaineessa. Hydrogeelit koostuvat ristisilloittuneista polymeereistä, jotka muodostavat verkkomaisen kolmiulotteisen rakenteen. Ristisiltojen sidostyypeistä riippuen hydrogeelien mekaaniset ominaisuudet vaihtelevat hieman, mutta yleisesti niitä voidaan kuvata viskoelastisiksi. Hydrogeelien ominaisuuksia voidaan räätälöidä käyttötarkoitukseen sopivaksi muokkaamalla ja yhdistelemällä polymeerejä, mikä mahdollistaa erilaisten valmistusmenetelmien käytön sekä yhteensopivuuden solujen kanssa. [2] Tässä kirjallisuuskatsauksessa perehdytään vaskulaaristen rakenteiden valmistusmenetelmiin eri hydrogeeleillä in vitro. Lisäksi tarkastellaan niiden

2 käyttökohteita sairauksien tutkimisessa ja lääkeaineiden kehityksessä. Tavoitteena on muodostaa hyvä yleiskuva erilaisista valmistusmenetelmistä ja niihin liittyvistä haasteista sekä ymmärtää vaskularisoitumisen rooli osana monimutkaisia kudosmalleja. Aluksi työssä käsitellään verisuonten rakennetta ja hydrogeelien yleisiä ominaisuuksia, jotta ymmärretään, mihin näiden mallien valmistuksessa pyritään ja miksi hydrogeelit soveltuvat tähän käyttötarkoitukseen. Tämän jälkeen käsitellään rakenteisiin käytettäviä polymeerejä ja solutyyppejä. Laajimmassa osuudessa käydään läpi erilaisia valmistusmenetelmiä esimerkkien kautta, alkaen yksinkertaisemmista valumenetelmistä ja päättyen uusimpiin 3D-bioprinttausmenetelmiin. Sitten perehdytään vaskularisoituneiden rakenteiden sovelluskohteisiin sairauksien mallinnuksessa ja lääkeaineiden kehityksessä. Viimeisenä pohditaan, mitä haasteita vaskularisoitujen rakenteiden valmistamisessa tällä hetkellä on ja minkälaisia mahdollisuuksia ne avaavat kudosteknologian tutkimukselle ja sovelluksille tulevaisuudessa.

3 2. VERISUONTEN ANATOMIA JA FYSIOLOGIA Verisuonisto mahdollistaa hapen ja ravinteiden kulkeutumisen kudoksiin solujen käyttöön ja kuona-aineiden kuljettamisen puhdistettavaksi ja eritettäväksi pois elimistöstä. Verisuonet voidaan jakaa sydämestä poispäin lähteviin valtimoihin, sydäntä kohti kulkeviin laskimoihin sekä laskimoiden ja valtimoiden välissä sijaitseviin kapillaarisuoniin, joissa tapahtuu ravinteiden vaihto kudosten ja veren välillä. Verisuonten koko, rakenne ja ominaisuudet vaihtelevat sijainnin ja ympäröivien olosuhteiden takia, mutta niissä on kuitenkin samankaltainen perusrakenne. [3] Verisuonen seinämä koostuu kolmesta kerroksesta, jotka ovat tunica intima, tunica media ja tunica adventitia, kuten kuva 1 havainnollistaa. Seinämän sisin kerros, tunica intima, koostuu tiiviin kerroksen muodostavista endoteelisoluista ja tyvikalvosta. Tunica intima ympäröi onteloa eli luumenia, jossa veri virtaa. Endoteelisolut ovat suorassa kontaktissa veren kanssa, ja ne osallistuvat muun muassa veren virtauksen säätelyyn, immuunivasteeseen, angiogeneesiin eli verisuonten uudismuodostukseen ja molekyylien kulkuun veren ja ympäröivän kudoksen välillä. Kapillaarisuonien rakenteessa on vain tämä ohut kerros, mikä mahdollistaa molekyylien nopean kulkeutumisen seinämien läpi. [3] Seinämän permeabiliteetti eli läpäisevyys riippuu endoteelisolujen tiiviydestä ja yleensä alle 40 kda kokoiset molekyylit voivat tihkua seinämän läpi, kun taas sitä suuremmat molekyylit vaativat aktiivista kuljetusta [4]. Tunica media on seinämän keskimmäinen kerros, ja se koostuu sileästä lihaskudoksesta sekä elastisesta sidekudoksesta. Keskimmäinen kerros on tärkeä erityisesti valtimoiden rakenteessa, ja valtimoissa se on huomattavasti paksumpi kuin laskimoissa. Lihaskudoksen ja elastisen sidekudoksen suhde vaihtelee eri valtimoissa sen mukaan, kuinka kaukana ne sijaitsevat sydämestä. Elastisempi rakenne kestää paremmin sydämen pumppaamisen aiheuttaman korkean verenpaineen, kun taas lihaksikkaampi rakenne mahdollistaa veren virtaamisen säätelyn ja ohjaamisen eri kudoksiin kauempana sydämestä. Sileiden lihassolujen supistumisen avulla säädellään verisuonten läpimittaa ja siten ohjataan verta sitä tarvitseviin kudoksiin sekä säädellään verenpainetta. [3] Ulommaisin kerros eli tunica adventitia koostuu pääosin kollageenipitoisesta sidekudoksesta, fibroblasteista ja hermoista. Uloin kerros kiinnittää verisuonen

4 ympäröivään kudokseen, ja suurissa laskimoissa ulommaisin kerros on usein paksuin. Suurissa verisuonissa ulommainen kerros sisältää myös pienempiä verisuonia, jotka tuovat happea ja ravinteita seinämän soluille. [3] Kuva 1. Verisuonen perusrakenne koostuu kolmesta kerroksesta, jotka ovat sisältä ulospäin tunica intima, tunica media ja tunica adventitia. Kerrosten paksuus ja koostumus vaihtelee hieman eri verisuonien välillä. Kuva muokattu lähteestä [3]. Kapillaarisuonet ovat kaikista pienimpiä suonia, ja niiden läpimitta on noin 4 10 μm [3]. Ne levittäytyvät kudoksiin ympäri elimistöä, ja niiden avulla yksittäiset solut saavat tarvitsemansa ravinteet. Kapillaarisuonien seinämä on hyvin ohut, joten ravinteiden siirtyminen sen läpi on nopeaa. Tutkimuksissa on huomattu, että solujen tulisi olla noin 100 200 μm:n päässä verisuonesta, jotta hapen diffuusio olisi riittävää [1]. Varsinkin paksummissa kudoksissa kapillaarien on siis levittäydyttävä hyvin laajalle alueelle, jotta solut eivät ajautuisi nekroosiin eli hallitsemattomaan solukuolemaan. Solujen kärsiessä hypoksiasta eli hapenpuutteesta ne alkavat erittää verisuonten endoteelisolujen kasvutekijää (VEGF), joka edistää angiogeneesiä. Angiogeneesissä uudet verisuonet muodostuvat olemassa olevista verisuonista endoteelisolujen alkaessa muodostaa uuttaa haaraa seinämään. Aikuisella angiogeneesiä tapahtuu luontaisesti esimerkiksi haavan paranemisen yhteydessä ja kasvaimien muodostumisessa. Vaskulogeneesissä verisuonet muodostuvat de novo, eli paikalla ei ole ennestään verisuonia, esimerkiksi alkionkehityksen aikana. Näitä mekanismeja hyödynnetään myös vaskulaaristen kudosmallien rakentamisessa. [5]

5 3. HYDROGEELIT KUDOSTEKNOLOGIASSA Hydrogeelit koostuvat ristisilloitetuista polymeereistä, jotka muodostavat kolmiulotteisen verkkomaisen rakenteen. Hydrofiilisten polymeerien ansiosta hydrogeelit kykenevät varastoimaan rakenteensa sisään suuria määriä vettä, mikä tekee niistä hyvin samankaltaisen ympäristön solujen luonnollisen ympäristön kanssa. Polymeerit antavat rakenteelle mekaanista tukea, mutta rakenne on kuitenkin joustava, mikä tekee hydrogeeleistä käyttökelpoisen materiaalin etenkin pehmeiden kudosmallien valmistamisessa. [6] 3.1 Hydrogeelien yleisiä ominaisuuksia Hydrogeelien geeliytyminen tapahtuu joko heikoilla vuorovaikutuksilla tai kovalenttisilla sidoksilla polymeeriketjujen välillä. Fysikaalinen, heikkoihin vuorovaikutuksiin perustuva ristisilloittuminen voi tapahtua itsestään oikeissa olosuhteissa, kuten esimerkiksi kollageenihydrogeeleissä, joissa liuenneet säikeet muodostavat kuitumaisen verkkorakenteen huoneenlämmössä [7]. Fysikaalinen sitoutuminen tapahtuu esimerkiksi vetysidoksilla, van der Waalsin voimilla, sähköisillä vuorovaikutuksilla, hydrofobisilla vuorovaikutuksilla tai polymeerien kietoutumisella toisiinsa [8]. Ristisilloitus voidaan aikaansaada ulkoisella ärsykkeellä esimerkiksi ph:n ja lämpötilan muutoksilla tai näkyvällä valolla. Polymeerejä voidaan myöskin muokata esimerkiksi funktionaalisilla ryhmillä, jolloin niiden laskostumiseen ja sidosten luonteeseen voidaan vaikuttaa ja siten muuttaa hydrogeelin ominaisuuksia. [6, 7] Geeliytyminen fysikaalisilla sidoksilla on yleensä varsin helppo toteuttaa ja ne ovat soluille melko turvallisia menetelmiä, sillä menetelmät eivät yleensä vaadi toksisia reagensseja. [6, 8] Kovalenttinen ristisilloittaminen voidaan tehdä usealla eri tavalla. Yleisiä menetelmiä ovat esimerkiksi kemialliset ristisilloittajat (crosslinkers), kuten glutaraldehydi, Michaeladditio, Diels-Alder-reaktio, entsymaattinen silloittaminen esimerkiksi piparjuuriperoksidaasilla tai transglutaminaasilla, imiinisidokset, UV-säteily ja hapetuspelkistysreaktiot. [8 11] Näillä menetelmillä saadaan muodostettua vahvoja ristisiltoja, mutta soluja sisältävien hydrogeelien kanssa rajoitukseksi muodostuu solujen sietokyky käytetylle menetelmälle ja reagensseille. [6, 8] Näin ollen geeliytymisajan on oltava tarpeeksi lyhyt ja reaktioiden mahdollisimman lempeitä soluille, jotta ne eivät vaurioidu liikaa ja selviävät elinkykyisinä geeliytymisestä. Käytettyjen reagenssien ja menetelmän lisäksi reaktioiden mahdolliset väli- ja lopputuotteet voivat olla soluille vaarallisia.

6 Esimerkiksi UV-säteilyn avulla tapahtuva silloittaminen voi tuottaa vapaita radikaaleja, jotka ovat soluille vaarallisia [8]. Hydrogeeliverkon koko kertoo kuinka tiheästi polymeerit ovat muodostaneet sidoksia eli rakenteen huokoisuus riippuu ristisilloittumisen asteesta. Huokoisuus vaikuttaa molekyylien kulkeutumiseen rakenteessa ja verkon koko on yhteydessä myös hydrogeelin mekaanisiin ominaisuuksiin ja turpoamiskykyyn, sillä tiheä verkko jäykistää rakennetta. [7, 12] Hydrogeelien turpoamiskyky kertoo niiden kyvystä varastoida vettä rakenteeseensa. Tämä ominaisuus riippuu polymeerien konsentraatiosta, hydrofiilisyydestä ja ristisilloittumisen asteesta, sillä jäykempi rakenne kykenee yleensä turpoamaan vähemmän. Turpoamiskyky voidaan määritellä antamalla materiaalin imeä itsensä täyteen vettä, jonka jälkeen kappale punnitaan ja määritetään kuivapainon ja märkäpainon suhde. Rakenteessa oleva vesi mahdollistaa vesiliukoisten molekyylien diffuusion hydrogeelin läpi, mikä on tärkeää jäljiteltäessä in vivo olosuhteita, jossa molekyylit siirtyvät soluväliaineen läpi verenkierrosta soluille. [2] Mekaanisilta ominaisuuksiltaan hydrogeelit ovat viskoelastisia ja ominaisuudet riippuvat käytettävistä polymeereistä, niiden konsentraatiosta, sidosten luonteesta (kovalenttinen/ei-kovalenttinen) sekä ristisilloittumisen asteesta. Eri materiaaleilla ja materiaaleja muokkaamalla hydrogeelien mekaanisia ominaisuuksia voidaan räätälöidä erilaisiin käyttötarkoituksiin. Kovalenttiset sidokset ovat vahvoja ja varsin pysyviä, joten ne lisäävät hydrogeelin elastisuutta, kun taas heikot sidokset hajoavat ja muodostavat uusia sidoksia, lisäten materiaalin viskoelastista luonnetta. Vaskularisoitavissa rakenteissa hydrogeelien on oltava tarpeeksi vahvoja, jotta ne pystyvät tukemaan onttoja rakenteita eivätkä romahda omasta painostaan, mutta myös tarpeeksi elastisia jäljitelläkseen verisuonten luonnollista elastisuutta [2]. Veren virtaus aiheuttaa verisuonten seinämiin leikkausvoiman, joten hydrogeelien on kestettävä myös kasvatusliuoksen virtauksesta aiheutuva leikkausvoima rakenteen seinämiin [13]. Hydrogeelien jäykkyys vaikuttaa myös solujen käyttäytymiseen, sillä ne aistivat ympäristöstään mekaanisia signaaleja, jotka voivat aiheuttaa soluissa vasteen ja vaikuttaa esimerkiksi niiden erilaistumiseen. Tätä ilmiötä kutsutaan mekanotransduktioksi. [6]

7 3.2 Hydrogeelien yhteensopivuus ja vuorovaikutus solujen kanssa Materiaalien yhteensopivuutta elävien solujen kanssa in vitro -olosuhteissa kutsutaan sytokompatibiliteetiksi. Käytettävät polymeerit ja niiden hajoamistuotteet eivät saa olla toksisia, sillä ne voivat aiheuttaa soluihin ei-toivottuja muutoksia tai jopa solujen kuoleman. Polymeereillä, joita löytyy luontaisesti soluväliaineesta, on hyvä sytokompatibiliteetti, mutta etenkin synteettisten polymeerien kanssa toksisuus voi olla ongelma ja rajoittaa materiaalivalintoja. Sen lisäksi, että itse hydrogeelin tulee olla yhteensopiva solujen kanssa, myös valmistusmenetelmän on oltava tarkoitukseen sopiva. Mikäli solut lisätään hydrogeeliin ennen geeliytymistä, se rajoittaa esimerkiksi valmistuksessa käytettäviä lämpötiloja ja säteilyn määrää. [10] Hydrogeelit ja solut vuorovaikuttavat keskenään esimerkiksi mekaanisten voimien ja molekyylien välityksellä. Luonnon polymeereissä on usein solujen adheesiota parantavia ligandeja, jotka edistävät solujen kiinnittymistä ja levittäytymistä rakenteeseen. Esimerkiksi Arg-Gly-Asp (RGD) -peptidi, joka löytyy esimerkiksi fibrinogeenin rakenteesta, edistää solujen adheesiota ja tällä peptidillä voidaan muokata myös synteettisiä, bioinerttejä hydrogeelejä soluja sitoviksi. [10] Ligandien avulla voidaan adheesion lisäksi vaikuttaa muun muassa solujen järjestäytymiseen ja erilaistumiseen. Hydrogeeleihin voidaan liittää erilaisia signalointimolekyylejä, esimerkiksi kasvutekijöitä, joilla ohjataan solujen toimintaa haluttuun suuntaan. [6] Mekaaniset signaalit vaikuttavat myös solujen käyttäytymiseen, ja hydrogeelien jäykkyyden on todettu olevan tärkeä tekijä vuorovaikutuksessa solujen kanssa [14]. Solut voivat muokata myös hydrogeelien koostumusta vaikuttamalla polymeeriverkoston sidosten uudelleenjärjestymiseen tai hajottamalla hydrogeeliä ja tuottamalla tilalle uutta soluväliainetta. Hydrogeelin koostumuksen muuttuessa myös sen mekaaniset ominaisuudet yleensä muuttuvat. [6] 3.3 Hydrogeelien hajoaminen Useissa sovelluksissa tarvitaan biohajoavia hydrogeelejä mikrokanavien valmistamiseen tai halutaan hydrogeelin hajoavan kokonaan tietyn ajan kuluessa. Hydrogeelien hajoaminen tapahtuu hydrolyysillä tai entsymaattisesti solujen avulla. Hydrolyyttistä hajoamista tapahtuu joka puolella materiaalia, kun taas entsymaattinen hajoaminen on paikallista solujen läheisyydessä. Solujen tuottamien entsyymien avulla on mahdollista ohjata hydrogeelin hajoamista halutusta kohdasta. Polymeereihin

8 voidaan liittää esimerkiksi entsyymien tunnistussignaaleja, kuten peptidejä, joihin entsyymi kykenee sitoutumaan ja näin hajottamaan kyseisen polymeerin. [6, 10] Vaskularisoiduissa kudosmalleissa hydrogeelin hajoamisella luodaan tilaa soluille kasvaa ja levittäytyä rakenteeseen. Hajoaminen ei saa kuitenkaan olla liian nopeaa, jotta solut ehtivät tuottaa soluväliainetta hajotetun hydrogeelin tilalle. Hajoamisnopeus täytyy räätälöidä käyttötarkoitukseen sopivaksi, jotta rakenteella on jatkuvasti riittävä mekaaninen tuki eikä se romahda. Liian hidas hajoaminen voi puolestaan heikentää solujen kasvua ja levittäytymistä. [10]

9 4. VASKULARISOITUNEISSA HYDROGEELIRAKENTEISSA MATERIAALEJA KÄYTETTÄVIÄ Hydrogeelit soveltuvat hyvin vaskularisoitavien rakenteiden valmistukseen, sillä ne tarjoavat korkean vesipitoisuuden takia soluille hyvin samankaltaisen ympäristön kuin kudokset in vivo ja mahdollistavat hapen ja ravinteiden diffuusion materiaalin läpi soluille. Hydrogeelejä voidaan valmistaa useista polymeereistä, joista osa on luonnon polymeerejä ja osa synteettisiä. Eri alkuperää olevia polymeerejä voidaan myös yhdistää, jolloin saadaan hyödynnettyä niiden ominaisuuksia monipuolisemmin. Vaskularisoitavissa rakenteissa tarvitaan myös erilaisia soluja, jotta rakenteella voitaisiin mallintaa verisuonia ja niiden toimintaa mahdollisimman tarkasti. [2, 6, 7] 4.1 Luonnon hydrogeelit Luonnon hydrogeelit koostuvat solujen tuottamista polymeereistä, joita löytyy esimerkiksi soluväliaineesta. Polymeerit voivat olla proteiineja, polysakkarideja tai niiden yhdistelmiä. Vaskularisoitavissa rakenteissa yleisimmin käytetyt proteiinit ovat kollageeni (tyypin I), gelatiini ja fibriini. Tyypin I kollageeni on hyvin yleinen proteiini soluväliaineessa ja sitä onkin käytetty paljon hydrogeeleissä, koska sillä on hyvä solujen adheesiokyky. Tyypin I kollageenin rakenne on kolmoiskierteinen heliksi, jolla on hyvä vetolujuus. Kollageenista löytyy paljon integriinien sitoutumiskohtia, joiden avulla solut kykenevät sitoutumaan kollageenisäikeisiin eikä se aiheuta tulehdusvastetta soluissa. Kollageeni muodostaa geelin huoneenlämmössä, eikä se liukene uudestaan viilentämällä, joten geeliytymätöntä kollageeniliuosta täytyy käsitellä kylmässä valmistamisen ajan. [2, 10] Gelatiini on puolestaan kollageenista hydrolyysillä saatava polymeeri, jossa on joitakin solujen sitoutumiskohtia jäljellä, esimerkiksi RGD-sekvenssi, mikä parantaa solujen adheesiota. Gelatiinin geeliytyminen tapahtuu lämmittämällä liuosta ja sen jälkeen jäähdyttämällä se, jolloin gelatiini jähmettyy geeliksi. Gelatiinista valmistettua hydrogeeliä voidaan muokata uudestaan kuumentamalla ja jäähdyttämällä. [2, 15] Gelatiini hajotetaan soluväliaineesta pääsääntöisesti metalloproteinaasien (matrix metalloproteinase, MMP) avulla [3]. Fibriini on tärkeä proteiini veren hyytymisessä ja se muodostuu fibrinogeenistä trombiinin vaikutuksella. Fibriini muodostaa verihyytymään verkkomaisen tukirangan ja samaa

10 polymerisoitumismekanismia käytetään hyväksi hydrogeelin valmistamisessa. Fibriinisäikeet voivat sitoa monia solujen adheesiota ja vaskularisoitumista edistäviä molekyylejä, kuten fibronektiinia ja verisuonten endoteelin kasvutekijää (VEGF). [10] Polysakkarideista käytetyimpiä ovat hyaluronihappo (HA), agaroosi, alginaatti ja kitosaani. Hyaluronihappo on soluväliaineessa yleinen lineaarinen polysakkaridi ja se hajotetaan kehossa nopeasti hyaluronidaasin avulla. Se on mekaanisilta ominaisuuksiltaan varsin heikko materiaali, mutta ominaisuuksia pystytään kuitenkin muokkaamaan kemiallisesti paremmin hydrogeeleihin sopiviksi. [8, 11] Agaroosia on käytetty biomateriaalina useissa kudosteknologian sovelluksissa ja se sopii myös vaskulaaristen mallien valmistamiseen. Se on merilevästä saatava lämpötilan muutoksiin reagoiva polysakkaridi. Materiaali ei tue solujen adheesiota, mutta sitoutumiskohtia liittämällä mahdollistetaan solujen sitoutuminen agaroosipohjaisiin hydrogeeleihin. [16] Alginaatti on ruskolevästä saatava polysakkaridi, joka muodostaa ristisiltoja ionisidoksilla. Alginaatti ei pysty sitomaan soluja, joten sitä muokataan usein liittämällä siihen soluihin sitoutuvia molekyylejä [7]. Kitiinistä saatavaa kitosaania on myös käytetty hydrogeeleissä hyvän sytokompatibiliteetin ja hajoamisen vuoksi [2]. 4.2 Synteettiset hydrogeelit Vaikka luonnon hydrogeeleillä on hyvä sytokompatibiliteetti ja solut pystyvät sitoutumaan niihin hyvin, niiden mekaaniset ominaisuudet eivät aina ole riittäviä vaskularisoitavien materiaalien valmistamiseen eikä niiden ominaisuuksia pystytä kontrolloimaan tarkasti. Synteettisten polymeerien ominaisuuksia pystytään muokkaamaan ja kontrolloimaan tarkemmin, jolloin solujen ympäristöä pystytään hallitsemaan ja säätämään tarkemmin ja tutkimuksista saadaan myös toistettavampia. [2] Polyetyleeniglykoli (PEG) on yksi yleisimmin käytetyistä synteettisistä hydrogeeleistä. PEG ei aiheuta immuunivastetta soluissa, mutta sillä on huono solujen adheesiokyky, jonka vuoksi sitä täytyy usein muokata esimerkiksi funktionaalisilla ryhmillä tai liittämällä siihen proteiineja. Diakryloiminen on yleinen modifikaatio, jolloin saadaan valon avulla ristisilloitettavissa olevia PEG diakrylaatteja (PEGDA). [17] Polylaktidia (PLA) ja sen stereoisomeerejä, erityisesti poly-l-laktidia (PLLA) on käytetty mikrokanavien valmistamiseen. Se on hydrofobinen polyesteri, joka on bioyhteensopiva ja hitaasti hajoava polymeeri. Hydrofobisuutensa vuoksi se täytyy yhdistää jonkun muun hydrofiilisen polymeerin kanssa, jotta saadaan muodostettua tarpeeksi vesipitoinen

11 hydrogeeli soluja varten. PLA hydrogeelejä pystytään muokkaamaan lämmön avulla ja sitä on helposti saatavilla. [18] Polyglykolidi (PGA) on polylaktidin tapaan hydrofobinen polyesteri, joka hajoaa hydrolyyttisesti. Hajoaminen on hieman nopeampaa kuin PLA:n, koska PGA ei ole niin hydrofobinen. Nämä polymeerit voidaan myös yhdistää, jolloin saadaan poly(laktidi-ko-gykolidi) (PLGA), joka on bioyhteensopiva ja jonka hajoamisnopeutta pystytään säätämään esimerkiksi molekyylipainoa muuttamalla. [19] Polyakryyliamidi (PAM) on kovalenttisesti ristisilloitettu hydrogeeli, jolla on hyvät mekaaniset ominaisuudet. Polymeeriketjun pituutta muuttamalla polyakryyliamidin mekaanisia ominaisuuksia pystytään räätälöimään tarkasti. Sitä käytetäänkin usein hybridihydrogeeleissä tuomaan rakenteelle halutut mekaaniset ominaisuudet. [20] Polyvinyylialkoholia (PVA) käytetään usein uhrimateriaalina vaskularisoitavien rakenteiden valmistamisessa, sillä se liukenee veteen. Polymeerien väliset ristisillat muodostuvat vetysidoksilla, joten se ei ole mekaanisesti yhtä vahva kuin esimerkiksi polyakryyliamideista valmistetut hydrogeelit. [9] 4.3 Hybridihydrogeelit Synteettisten hydrogeelien vahvuutena on ominaisuuksien parempi kontrollointi ja muokattavuus, kun taas luonnon hydrogeelit tukevat paremmin solujen adheesiota, niillä on hyvä sytokompatibiliteetti ja bioaktiivisia ominaisuuksia, kuten osallistuminen solujen signalointiin. Yhdistämällä luonnon polymeerejä synteettisten kanssa saadaan hyödynnettyä molempien ominaisuuksia. [10] Esimerkiksi PEG hydrogeelien mekaanisia ominaisuuksia pystytään muokkaamaan helposti, mutta solujen sitoutuminen on huonoa, minkä vuoksi fibrinogeeniä on käytetty parantamaan solujen adheesiota. Tällaisia, niin kutsuttuja PEGyloituja fibrinogeenejä, on käytetty mikrokanavien valmistamiseen ja niillä on todettu olevan hyvät mekaaniset ominaisuudet ja hyvä solujen adheesio [21]. Toinen esimerkki on gelatiinin ja PLLA:n yhdistäminen, jolloin solujen adheesio hydrogeeliin paranee verrattuna pelkkään PLLA:sta valmistettuun hydrogeeliin [22]. Myös luonnon polymeerejä voidaan muokata synteettisillä menetelmillä. Normaalisti gelatiini geeliytyy huoneenlämmössä, mutta korvaamalla gelatiinin aminoryhmät metakryyliryhmillä saadaan fotopolymerisoitavissa oleva hydrogeeli (GelMA), mikä antaa enemmän vaihtoehtoja valmistusmenetelmän valintaan [10]. Proteiineista ja polysakkarideista muokataan usein myös komposiittihydrogeelejä. Tällöin toinen

12 polymeeri antaa hydrogeelille esimerkiksi paremmat mekaaniset ominaisuudet ja toinen voi sitoa hyvin soluja, esimerkkinä kollageeni/ha ja fibriini/alginaatti -hydrogeelit. [10] 4.4 Solutyypit Pelkät hydrogeelistä valmistetut mikrokanavat eivät riitä mallintamaan verisuonia, joten rakenteisiin täytyy lisätä myös soluja. Verisuonien sisäpinnan muodostavat endoteelisolut ovat tärkeimmässä roolissa, sillä yksinkertaisimmillaan kapillaarisuonet koostuvat vain endoteelikerroksesta [3]. Rakenteeseen lisätään kuitenkin usein myös muita, rakennetta tukevia soluja, jolloin valmistettava kudosmalli vastaa paremmin luonnollista kudosta. Valmistusmenetelmästä riippuen solut voidaan lisätä hydrogeeliin ennen geeliytymistä, jolloin ne ovat upotettuina hydrogeelin sisään tai ne voidaan lisätä vasta geeliytymisen jälkeen. Silloin ne tarttuvat hydrogeelin pintoihin ja levittäytyvät pinnalta syvemmälle rakenteeseen. [2, 10] 4.4.1 Endoteelisolut Endoteelisolut ovat peräisin endoteelisista progenitorisoluista. Ne muodostuvat vaskulogeneesissä alkionkehityksen aikana mesodermaalisesta kerroksesta ja kypsyessään muuttuvat endoteelisoluiksi. Ne muodostavat verisuonen sisäpinnalla tiiviitä solu-solu-liitoksia, joiden ansiosta veri ei tihku seinämän läpi ja molekyylien siirtymistä verenkierron ja kudosten pystytään säätelemään. Endoteelikerros muodostaakin selektiivisesti läpäisevän esteen veren ja kudosten välille. Seinämiin kohdistuva leikkausvoima aiheuttaa endoteelisolujen muodon muuttumisen litteäksi ja veren virtaus aiheuttaa pitkulaisen muodon ja järjestymisen virtaussuunnan mukaiseksi, näin seinämästä saadaan sileä ja tiivis. [3, 23] Terveessä verisuonessa endoteelisolut erittävät erilaisia molekyylejä, jotka vuorovaikuttavat sekä veren että muiden verisuonen seinämien solujen ja proteiinien kanssa. Typpioksidi (NO) on yksi tärkeimmistä endoteelisolujen erittämistä molekyyleistä, sillä se muun muassa edistää verisuonten laajentumista eli vasodilaatiota ja toimii anti-inflammatorisena eli tulehdusta estävänä aineena [24]. Veren virtauksen kannalta tärkeä molekyyli on trombomoduliini, joka toimii antikoagulanttina estäen veren hyytymistä. Mikäli verisuoneen tulee vaurio, endoteelisolut alkavat erittää adhesiivisia proteiineja ja trombomoduliinin eritys vähenee, jolloin veren proteiinit ja solut alkavat hyytyä ja saattavat tukkia suonen. [3, 24] Vaskularisoitavissa rakenteissa tätä pyritään välttämään, jotta rakenteessa pysyy jatkuva perfuusio eli läpivirtaus [23].

13 Angiogeneesissä endoteelisolut alkavat kuroutumaan olemassa olevista kapillaareista ja alkavat muodostaa uuttaa haaraa. Tätä indusoi esimerkiksi kudosten hypoksia ja sen aiheuttama kasvutekijöiden, kuten VEGF:n erittäminen. [3] Jotta endoteelisoluilla on tilaa levitä ja muodostaa uusia verisuonia, soluväliainetta täytyy hajottaa niiden tieltä. Tämän vuoksi myös hydrogeelien hajoaminen on tärkeä ominaisuus. Endoteelisoluilla on taipumus muodostaa itsestään putkimaisia rakenteita ja yhdistettynä hydrogeeleistä valmistettuihin mikrokanaviin, endoteelisolujen organisoitumista putkimaisiksi rakenteiksi voidaan ohjata valmiin arkkitehtuurin avulla haluttuun suuntaan. [23, 25] Vaskularisoitavissa rakenteissa käytetään usein ihmisen napanuorasta kerättyjä endoteelisoluja (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) [26 28]. Myös sepelvaltimoista kerättyjä (human coronary artery endothelial cells, HCAECs) sekä indusoiduista pluripotenteista kantasoluista erilaistettuja (ipsc-ecs) endoteelisoluja on käytetty [29, 30]. Myös eläinperäisiä soluja on käytetty, esimerkiksi naudan kaulavaltimon endoteelisoluja [31]. 4.4.2 Rakennetta tukevat solut Sileitä lihassoluja on verisuonten keskimmäisessä kerroksessa ja ne säätelevät supistumisellaan verisuonten läpimittaa. Ne ovat hyvin herkkiä venytykselle ja venytyksen suunta myös vaikuttaa niiden orientoitumiseen. Ne järjestyvät verisuonen ympärille muodostaen rengasmaisen rakenteen. Sileät lihassolut muodostavat useamman solukerroksen, jonka paksuus vaihtelee eri verisuonissa. [3] Perisyytit ympäröivät kapillaarisuonia ja pienimpiä laskimoita antaen verisuonille tukea. Perisyytit eivät muodosta tasaista ja jatkuvaa kerrosta kapillaarien ympärille, vaan niitä on epäsäännöllisesti kapillaarisuonien pinnalla tyvikalvoon kiinnittyneinä. Ne kykenevät supistumaan endoteelisolujen tuottaman typpioksidin vaikutuksesta ja ne vuorovaikuttavat endoteelisolujen kanssa kemiallisten ja fysikaalisten signaalien välityksellä. [3] Fibroblastit ovat yleisin solutyyppi verisuonten uloimmassa kerroksessa ja ne tuottavat runsaasti kollageenipitoista soluväliainetta [3]. Vaskularisoitavissa rakenteissa fibroblastien tuottama soluväliaine korvaa hajoavaa hydrogeeliä ja ylläpitää rakenteen mekaanista vahvuutta [23].

14 5. VASKULARISOITUNEIDEN HYDROGEELIRAKENTEIDEN VALMISTUSMENETELMIÄ Vaskularisoitavien hydrogeelirakenteiden valmistuksessa on hyödynnetty muista mikrosysteemeistä tuttuja menetelmiä, kuten valamista ja pehmeää litografiaa. Rakenteeseen lisättävät solut tuovat valmistukseen kuitenkin rajoitteita, jotka on sovitettava yhteen hydrogeelien vaatimien valmistusolosuhteiden kanssa. In vitro käytössä vaskulaariset mallit on myös pystyttävä liittämään pumppuun, jolla kasvatusliuoksen virtaus kanavissa saadaan aikaiseksi. Kanavan halkaisijan on oltava tarpeeksi suuri liitoskohdassa, joten kaikista pienimpiä kapillaarisuonia vastaavia rakenteita valmistettaessa täytyy myös huomioida kuinka rakenteen perfuusio saadaan järjestettyä. [32] 5.1 Mikrokanavien muodostaminen kiinteillä objekteilla Valaminen on yleinen ja yksinkertainen tapa valmistaa vaskularisoitavia mikrokanavia. Kuvassa 2 esitetään, kuinka nestemäinen hydrogeeli kaadetaan kammioon, jossa on esimerkiksi mikroneula tai vaijeri kiinnitettynä. Tämän jälkeen nestemäinen hydrogeeli geeliytetään ja sen sisään valettu neula poistetaan varovasti. Jäljelle jää neulan jättämä, molemmista päistä avoin kanava, joka voidaan perfusoida endoteelisoluja sisältävällä kasvatusliuoksella. Endoteelisolut muodostavat kerroksen kanavan sisäpinnalle, jolloin kanava muistuttaa kapillaarisuonen rakennetta. [10, 23] Kuva 2. Perfusoitavan mikrokanavan muodostaminen kiinteän neulan ja nailonkuitujen avulla. Muokattu lähteestä [10].

15 Kuvassa 3 on kuvattu Sadr et al. käyttämää menetelmää, jossa kultatanko (halkaisija 600 μm) päällystettiin oligopeptideillä. HUVEC-solut kykenivät kiinnittymään kultatankoon oligopeptidien välityksellä ja muodostamaan sen pinnalle solukerroksen. Solut muodostivat 3-4 päivän viljelyn jälkeen tasaisen endoteelikerroksen tangon ympärille, jonka jälkeen tanko kastettiin fibroblasteja (3T3) sisältävään GelMA-liuokseen. GelMA polymerisoitiin välittömästi kastamisen jälkeen valon avulla, jonka jälkeen ohuella fibroblasti- ja endoteelikerroksella päällystetty tanko valettiin kammiossa GelMAhydrogeeliin. Kultatanko irrotettiin oligopeptideistä sähkövirran avulla, jonka jälkeen tanko poistettiin rakenteesta vetämällä. Muodostunut kanava liitettiin pumppuun, jolla rakennetta perfusoitiin 15 päivän ajan. Rakenteen geometria pysyi stabiilina ja solut pysyivät kiinnittyneenä kanavan seinämässä. Solut eivät kuitenkaan levittäytyneet hydrogeelin sisään, vaan muodostivat kerroksen sen pinnalle. [33] Kuva 3. Perfusoitavan kanavan valmistaminen HUVEC- ja fibroblastisolukerroksella päällystetyn kultatangon avulla. HUVEC-solut on kuvattu vihreällä ja fibroblastit punaisella värillä. Muokattu lähteestä [33]. Kanavien muodostaminen valamalla hydrogeeli kiinteiden objektien päälle on varsin helppoa ja suoraviivaista, mutta menetelmällä pystytään valmistamaan vain hyvin yksinkertaisia suoria rakenteita. Koska mikroneula tai vaijeri joudutaan poistamaan hydrogeelistä vetämällä, rakenteesta ei voida tehdä haarautuvaa. Suurempien rakenteiden vaskularisoiminen tällä menetelmällä vaatisi useiden rinnakkaisten kanavien muodostamista ja merkitsisi myös sisään- ja ulostulojen määrän suurta kasvua, mikä ei ole ideaalia käytännön työn kannalta. [10, 23, 32] 5.2 Uhrimateriaalin käyttäminen Uhrimateriaali toimii rakenteen valmistusvaiheessa muottina kanavan kolmiulotteiselle muodolle, mutta lopullisesta rakenteesta se hajotetaan pois. Uhrimateriaalina toimivaa hydrogeeliä voidaan muokata haluttuun muotoon, ja koska se poistetaan hajottamalla, sen arkkitehtuuri voi olla kaareutuva ja haarautuva. Kiinteisiin objekteihin, kuten

16 mikroneuloihin, verrattuna uhrimateriaali mahdollistaa monipuolisemman kanavaverkoston rakentamisen. [32] Yksi tapa hyödyntää uhrimateriaalia on upottaa endoteelisolut uhrimateriaaliin, jolloin niitä ei tarvitse lisätä enää myöhemmässä vaiheessa. Takei et al. valmisti kalsiumalginaattihydrogeelistä naudan endoteelisoluja sisältäviä kuituja (halkaisija noin 500 μm), jotka valettiin kollageenista valmistettuun hydrogeeliin. Kuidut valmistettiin endoteelisoluja sisältävästä natrium-alginaatti-liuoksesta sekä CaCl 2-liuoksesta, jotka puristettiin yhtäaikaisesti vierekkäisistä suuttimista. Muodostunut endoteelisoluja sisältävä kalsium-alginaattikuitu kiinnitettiin kammioon ja päälle valettiin tyypin I kollageenista tehty hydrogeeli, joka sisälsi myös alginaattilyaasia. Kuidun asettelua muutettiin manuaalisesti pinsettien avulla, jonka jälkeen kollageeni geeliytettiin inkuboimalla. Inkubointia jatkettiin, kunnes lyaasi oli hajottanut alginaattikuidun. Kuidun sisältämät endoteelisolut kiinnittyivät muodostuneen kanavan seinämiin muodostaen tasaisen endoteelikerroksen ja kanava voitiin perfusoida. Kuitujen erilaisia kolmiulotteisia muotoja on nähtävissä kuvassa 4. [31] Kuva 4. (a) Vaihekontrastimikroskoopilla kuvattu kalsium-alginaattikuitu, joka sisältää endoteelisoluja. Mittapalkki on 500 μm. (b-d) Muodostettujen kanavien erilaisia muotoja kollageenissa 6 päivän inkuboimisen jälkeen. Nuolet osoittavat kanavia. Mittapalkit ovat 5 mm. [31] Kun rakennetta oli inkuboitu 6 päivän ajan, kollageenin päälle kaadettiin kasvatusliuosta, joka sisälsi fibroblastien kasvutekijää (basic fibroblast growth factor, bfgf). Kasvutekijä edisti endoteelisolujen leviämistä kanavan pinnalta ympäröivään hydrogeeliin ja solujen huomattiin muodostavan kapillaareja muistuttavia rakenteita. Endoteelisolut levisivät

17 viikon tarkastelujakson aikana keskimäärin 300 500 μm:n päähän kanavasta, kun taas ilman kasvutekijää vastaava matka oli alle 100 μm. Tutkimuksen perusteella kapillaarirakenteiden valmistaminen ja liittäminen suurempiin kanaviin perfuusiota varten on mahdollista hyödyntämällä endoteelisolujen luontaisia vaskularisoitumisen mekanismeja. Vaikka tutkimuksessa käytetyt kuidut mahdollistivat kaareutuvien kanavien valmistamisen, niiden avulla ei kuitenkaan pystytä rakentamaan haarautuvia kanavia. [31] Uudemmassa tutkimuksessa uhrimateriaalina käytettiin glukoosiherkkää itsekorjautuvaa hydrogeeliä, jonka avulla pyrittiin valmistamaan vaskularisoitua hermokudosta. Itsekorjautuvat hydrogeelit pystyvät muodostaman hajonneita sidoksia uudestaan, jolloin ne kykenevät palauttamaan alkuperäisen muotonsa, mikäli ne vaurioituvat. Uhrina toimiva glukoosiherkkä hydrogeeli valmistettiin PEGDA:sta ja ditiotreitolista (DTT) booraksin (natriumtetraboraattidekahydraatti) katalysoimana Michael-additiolla. Kuvassa 5 esitetään kanavan valmistusmenetelmä, jossa uhrihydrogeeli pursotettiin haarautuvaksi rakenteeksi hermokantasoluja (neural stem cells, NSCs) sisältävän kitosaanihydrogeelin päälle. Kitosaani valikoitui materiaaliksi, sillä sen jäykkyys vastaa hyvin luontaisen hermokudoksen jäykkyyttä. Sen jälkeen uhrihydrogeeli peitettiin kerroksella NSC-kitosaanihydrogeeliä. Valmistettu rakenne upotettiin glukoosipitoiseen kasvatusliuokseen, jolloin glukoosiherkkä uhrihydrogeeli liukeni pois ja jäljelle jäi haarautunut kanavarakenne (halkaisija noin 350 μm), jossa viljeltiin naudan endoteelisoluja. [34] Endoteelisolut levittäytyivät kanavan pinnalta syvemmälle hydrogeeliin kolmen vuorokauden viljelyn jälkeen ja 14 vuorokauden jälkeen rakenteessa oli havaittavissa kapillaareja muistuttavia rakenteita. Kanavan halkaisijan huomattiin myös kasvaneen noin 450 μm:iin, minkä oletettiin johtuvan kitosaanihydrogeelin hajoamisesta. Erityistä tutkimuksessa oli se, että endoteelisolujen geeniekspressiota tutkittaessa angiogeneesiin liitettyjen geenien aktiivisuus lisääntyi silloin, kun kitosaani sisälsi hermokantasoluja. Myös hermokantasoluissa ilmennettiin enemmän kypsien neuronien markkerigeeniä (mature neuron marker gene, Map2) ja VEGF-geeniä verrattuna rakenteeseen, jossa ei ollut endoteelisoluja. Map2-geenin lisääntyneen ilmentämisen lisäksi huomattiin myös muita hermosolujen erilaistumiseen viittavia geeniekspression muutoksia. Nämä löydökset vahvistavat käsitystä siitä, että eri solutyypit keskustelevat toistensa kanssa ja niiden välisellä kommunikaatiolla on varsin suuri merkitys kudosten muodostumisessa. [34]

18 Kuva 5. Haarautuneen kanavan muodostaminen glukoosiherkän itsekorjautuvan uhrihydrogeelin avulla. Muokattu lähteestä [34]. Uhrihydrogeelin koostumusta muuttamalla pystytiin vaikuttamaan sen mekaanisiin ominaisuuksiin, jolloin siitä saatiin riittävän vahvaa kanavan geometrian ylläpitoon. Myös glukoosiherkkyyttä kyettiin muuttamaan ja siten vaikuttamaan uhrimateriaalin liuotusnopeuteen. Glukoosipitoiseen kasvatusliuokseen upottaminen mahdollisti myös kitosaanissa olleiden kantasolujen hyvän selviämisen uhrimateriaalin liuotuksen aikana. Uhrimateriaalin käyttö mahdollistaa monimutkaisempien kanavarakenteiden valmistamisen verrattuna tavallisiin valumenetelmiin. Uhrihydrogeeleillä valmistettujen kanavien halkaisijat ovat kuitenkin melko suuria, joten pienempien kanavarakenteiden valmistamiseksi tarvitaan muita menetelmiä. 5.3 Mikrokanavien muodostaminen litografisilla menetelmillä Litografia perustuu valoherkkien materiaalien käyttöön. Menetelmää voidaan hyödyntää valumuottien valmistamiseen tai valmistaa kanavat suoraan hydrogeeliin. Yleisin materiaali muottien valmistuksessa on polydimetyylisiloksaani (PDMS), joka valetaan useimmiten piikiekolle fotolitografialla valmistetun masterin päälle. Fotolitografian hyödyntämistä pehmeisiin materiaaleihin, kuten hydrogeeleihin, kutsutaan pehmeäksi litografiaksi. Siinä geeliytymätön hydrogeeliliuos altistetaan valolle maskin läpi, jolloin valolle altistuneet osat muodostavat ristisiltoja ja geeliytyvät, kun taas maskin takana olleet osat pysyvät nestemäisenä. Näin maskin kuvio saadaan siirrettyä hydrogeelirakenteeseen. [2]

19 Nikkhah et al. tekemässä tutkimuksessa tarkasteltiin fotolitografialla valmistettujen mikrorakenteiden geometrian vaikutusta endoteelisolujen käyttäytymiseen. Tähän käytettiin GelMA-hydrogeelia ja HUVEC-soluja, joiden seos polymerisoitiin valomaskilla haluttuun arkkitehtuuriin. Ensimmäiseksi 1 cm x 1 cm kokoinen lasilevy pinnoitettiin polyhema:lla (poly-2-hydroksietyyli metakrylaatti), joka estää solujen adheesiota lasiin. Tämän jälkeen valmistettiin GelMA-liuos ja lisättiin joukkoon HUVEC-soluja, jonka jälkeen 15 μl:n kokoinen pisara tätä seosta pudotettiin alustalle kahden tuen väliin, joiden korkeus oli ennalta määritetty, joko 50 μm, 100 μm tai 150 μm. Käytettävä valomaski suunniteltiin AutoCAD-ohjelmalla (computer aided design). Maskiin tehtiin useita rinnakkaisia, suorakaiteen (8 mm x 50 μm) muotoisia kuvioita, joiden väliin jätettiin 1 mm levyinen kuvioimaton alue. Lasilevyn polyhema-päällystetty puoli asetettiin GelMA- HUVEC pisaran päälle ja valomaski asetettiin päällystämättömän puolen päälle. Tämän jälkeen GelMA altistettiin 30 sekunnin ajan UV-valolle, joka polymerisoi hydrogeelin. Näin saatiin valmistettua suorakulmion muotoisia GelMA rakenteita, jotka sisälsivät endoteelisoluja. Koko rakennetta reunusti 1 mm levyinen alue, joka polymerisoitui, mutta jota ei kuvioitu. Valmistusprosessia havainnollistetaan kuvassa 6. [35] Kuva 6. A) Lasilevyn päällystäminen polyhema-kerroksella. B) Pisara HUVEC-GelMA seosta tiputetaan alustalle (vihreä) kahden tuen väliin, joiden korkeus on ennalta määritetty (H). GelMA altistetaan UV-valolle valomaskin läpi, jolloin hydrogeeli polymerisoituu ja maskin kuvio siirtyy hydrogeeliin. C) Rakenne huuhdellaan, jotta maskin alla ollut polymerisoimaton GelMA saadaan poistettua ja suunniteltu rakenne paljastuu. Muokattu lähteestä [35].

20 Rakenteessa olevien solujen elinkykyisyyttä arvioitiin live/dead -analyysillä ja viiden ensimmäisen päivän jälkeen yli 90 % soluista oli selviytynyt polymerisoinnista. Kun tarkastelujaksoa pidennettiin, reunojen kuvioimattomalla alueella solujen elinkykyisyys laski hieman niissä rakenteissa, joissa rakenteen korkeus H oli 150 μm. Tämän perusteella UV-altistuksella ja polymerisointiin käytetyllä fotoinitiaattorilla ei ollut merkittävää vaikutusta solujen elinkykyyn. Solujen muoto oli polymerisoinnin jälkeen pyöreä, mutta 5 päivän viljelyn jälkeen muoto oli muuttunut pitkulaisemmaksi ja ne olivat järjestäytyneet mikrorakenteen suuntaisesti muodostaen verkostoja keskenään (kuva 7). Soluliitosten muodostumista tarkasteltiin CD31:n, VE-kadheriinin (vascular endothelial cadherin) ja aktiinin avulla. Nämä ovat proteiineja, jotka osallistuvat solujenvälisiin liitoksiin ja ovat osa solujen sisäistä tukirankaa. Proteiinien värjääminen paljasti solujen verkoston, joka muodosti putkimaisen rakenteen. Siinä ei kuitenkaan ollut onttoa luumenia havaittavissa. Tämä johtui käytetyn GelMA-hydrogeelin korkeasta metakrylaatioasteesta, mikä hidasti hydrogeelin hajoamista. Reunan kuvioimattomalla osalla solut olivat levittäytyneet sattumanvaraisesti eivätkä ne muodostaneet selkeitä ja yhtenäisiä verkostoja (kuva 7, alarivi). [35] Kuva 7. Fluoresenssikuvat (musta-vihreät) ja vaihekontrastikuvat (harmaat) solujen levittäytymisestä ja organisoitumisesta GelMA-hydrogeelissä päivinä 1, 3 ja 5. Mittapalkit ovat 100 μm. Muokattu lähteestä [35]. Tutkimus vahvisti käsitystä siitä, että mikrorakenteen geometrialla on vaikutusta endoteelisolujen organisoitumiseen putkimaisiksi rakenteiksi. Hydrogeelin hajoamista ja luumenin muodostumista voitaisiin todennäköisesti nopeuttaa viljelemällä muita soluja,

21 kuten fibroblasteja, yhdessä endoteelisolujen kanssa. Näin saataisiin perfusoitavissa olevia rakenteita, joilla voitaisiin tutkia myös nesteen virtauksen vaikutuksia kanavien muodostumiseen. [35] Toinen tapa hyödyntää fotolitografiaa on käyttää sitä masterin eli muotin valmistukseen ja valaa hydrogeeli masterille. Substraattina toimii piikiekko, jonka pinnassa on kerros piidioksidia (SiO 2). Piidioksidi pinnoitetaan valoresistillä, jonka päälle asetetaan kuvioitu valomaski. Valomaski altistetaan UV-valolle, jolloin maskin kuvio siirtyy valoresistiin. Valottunut resisti kehitetään liuottamalla pois joko valottunut (positiivinen) tai valottamaton (negatiivinen) alue, riippuen siitä mikä resisti on kyseessä. Liuottamisen jälkeen kuvio siirretään piidioksidikerrokseen etsaamalla, jonka jälkeen loppu valoresisti poistetaan ja jäljelle jää kuvioitu masteri (kuva 8). [36] Kuva 8. Piikiekolle valmistettavan masterin fotolitografinen prosessi. Muokattu lähteestä [36]. Kim et al. tutki angiogeneesiä ja vaskulogeneesiä fotolitografialla valmistetun PDMSlaitteen avulla. Ryhmä valmisti ensin positiivisen masterin piikiekolle, jonka jälkeen masterin päälle valettiin PDMS-liuos. PDMS-muotti irrotettiin masterista ja hydrogeelin injektioportit sekä kasvatusliuoksen varastot leikattiin pois tylpän neulan ja biopsiaan tarkoitetun pyöreän terän avulla. PDMS-muotin keskellä olleista viidestä rinnakkaisesta kanavasta kolmeen valettiin fibriinistä valmistettu hydrogeeli, jossa oli mukana myös pieni määrä tyypin I kollageenia (2,5 mg/ml fibrinogeenia ja 0,2 mg/ml kollageenia).

22 Kanavia erottavat seinämät koostuivat pylväistä, joiden välit mahdollistivat molekyylien siirtymisen kanavasta toiseen ja muodostuvien verisuonien liittymisen eli anastomoosin virtauskanavaan. [37] Vaskulogeneesiä mallintavassa kokeessa keskimmäiseen kanavaan (C) valettiin hydrogeelin sekaan HUVEC-soluja ja molempien reunojen ulommaisiin kanaviin (LO ja RO) hydrogeelia ja fibroblasteja (human lung fibroblasts, LF). Angiogeneesin mallissa keskimmäiseen kanavaan valettiin pelkkää hydrogeeliä. Reunimmaisiin kanaviin valettiin hydrogeeli, mutta vain oikeanpuoleiseen (RO) sekoitettiin LF-soluja. Asetelmaa on havainnollistettu kuvassa 9. Hydrogeelin polymerisointi tehtiin trombiinin lisäyksellä, jonka jälkeen kasvatusliuoksen sisääntulosäiliöt täytettiin ja nesteen virtaus aikaansaatiin ulostulojen vakuumin avulla. Angiogeneesin mallissa vasemmanpuoleisen kanavan (LI, kauempana LF-soluista ollut kanava) kasvatusliuokseen lisättiin HUVECsoluja ja PDMS-muotti käännettiin 90 astetta kyljelleen. Muottia inkuboitiin 30 minuuttia, jonka jälkeen HUVEC-solut olivat kiinnittyneet kasvatusliuoskanavan ja keskimmäisen hydrogeelikanavan rajapintaan. [37] Vaskulogeneesin mallissa keskuskanava oli 1000 μm leveä ja 250 μm korkea, kun taas angiogeneesin mallissa leveys oli 700 μm ja korkeus 100 μm. Angiogeneesin mallista tehtiin toinen rinnakkainen koe, jossa keskuskanavaan (C) lisättiin fibriinin joukkoon perisyyttejä. Vaskulogeneesiä tutkittaessa tehtiin myös rinnakkainen koe, jossa sekä HUVEC-soluja että LF-soluja viljeltiin keskuskanavassa (C) sen sijaan että fibroblastit olisivat erillään ulommaisissa kanavissa (LO ja RO). [37] Vaskulogeneesin tutkimuksessa endoteelisolut olivat muuttuneet pitkulaisen mallisiksi yhden vuorokauden viljelyn jälkeen ja kahden vuorokauden jälkeen ne alkoivat muodostaa putkimaisia rakenteita, joihin alkoi kehittyä ontto luumen. 4 5 vuorokauden jälkeen solut muodostivat yhtenäisen verkoston, joka oli anastomoitunut eli muodostuneet kanavat olivat liittyneet virtauskanaviin ja pystyttiin perfusoimaan (kuva 10). Mielenkiintoinen havainto oli, että rinnakkaisessa kokeessa, jossa fibroblastit olivat endoteelisolujen kanssa samassa keskuskanavassa, muodostui myös yhtenäinen verkosto, mutta joka ei anastomoitunut virtauskanaviin eikä näin ollen ollut perfusoitavissa. Mikäli fibroblastit puuttuivat kokonaan kaikista kanavista, endoteelisolut eivät kyenneet muodostamaan yhtenäistä verkostoa. [37]

23 Kuva 9. PDMS-laitteen kokoonpano. A) Valokuva valmiista PDMS-laitteesta, jossa fibriinistä valmistetut hydrogeelikanavat on värjätty. B) Piirroskuva kanavista. Keskimmäinen kanava sinisellä (C), kasvatusliuoksen virtauskanavat violetilla (vasen LI ja oikea RI) ja ulommaiset kanavat vihreällä (vasen LO ja oikea RO). C-D) Vaskulogeneesi-tutkimuksen asetelma. E-F) Angiogeneesi-tutkimuksen asetelma. Punaiset nuolet havainnollistavat HUVEC-soluja, mustat nuolet LF-soluja ja valkoiset nuolet mediumin virtausta. Muokattu lähteestä [37]. Kokeessa, jossa tutkittiin angiogeneesiä, endoteelisolut alkoivat muodostaa orastuvia verkostoja hydrogeelin vuorokauden viljelyn jälkeen ja kahden vuorokauden kuluessa oli havaittavissa putkimaisia rakenteita. Luumenit alkoivat muodostua orastuvien verisuonten juurilla kolmen päivän jälkeen ja neljän vuorokauden kuluessa kärkisolut olivat saavuttaneet vastakkaisen virtauskanavan (RI) 700 μm:n päässä ja liittivät muodostuvan verkoston kanavaan (kuva 10). Kokeissa, joissa fibroblasteja ei ollut rakenteessa lainkaan tai jossa niitä viljeltiin saman puoleisessa kanavassa (LO) HUVECsolujen kanssa, ei havaittu endoteelisolujen orastumista keskimmäiseen kanavaan. Tulos viittaa siihen, että fibroblastien erittämät kasvutekijät ja niiden gradientit hydrogeelissä ovat oleellisia tekijöitä angiogeneesissä. VEGF:n keinotekoisella lisäyksellä fibriiniin eri pitoisuuksina mallinnettiin fibroblastien aikaansaamaa gradienttia, mikä paransi endoteelisolujen orastumista keskuskanavaan. Se ei ollut kuitenkaan yhtä voimakasta kuin tilanteessa, jossa fibroblasteja viljeltiin RO-kanavassa. Tulosten perusteella fibroblastien läsnäololla on merkittävä vaikutus verisuonien muodostumiseen sekä vaskulogeneesissä että angiogeneesissä, eikä niiden puutetta voida täysin korvata kasvutekijöiden lisäämisellä viljelmään. Endoteelisolujen viljely perisyyttien kanssa ei vaikuttanut verisuoniverkoston orastumisen nopeuteen eikä luumenien kehittymiseen.

24 Perisyytit kuitenkin selkeästi vuorovaikuttivat endoteelisolujen kanssa ja peittivät endoteelikerroksen ulkopintaa. Perisyytit kiinnittyivät tyvikalvoon, joka koostui endoteelisolujen valmistamasta tyypin IV kollageenista ja laminiinista. [37] Kuva 10. Konfokaalikuvat fibriinihydrogeeliin muodostuneista A) vaskulogeneesin ja B) angiogeneesin kokonaisrakenteista päivänä 4, mittapalkit 100 μm. C) Angiogeneettisen verkoston rakenne päivänä 2, mittapalkki 50 μm. D) Suurennos angiogeneettisten kärkisolujen filopodioihin, joissa on runsaasti F-aktiinia, mittapalkki 20 μm. E) Pitkittäinen poikkileikkaus verisuonesta, johon on muodostunut luumen, mittapalkki 10 μm. F) Soluliitoksiin osallistuvat proteiinit VE-kadheriini ja β-kateniini värjätty verkostosta, mittapalkki 50 μm. G) Pitkittäinen poikkileikkaus verisuonesta, josta on värjätty leukosyyttien adheesioproteiini ICAM-1 ja kollageeni IV, mittapalkki 10 μm. H-I) Tyvikalvon tärkeimmät proteiinit laminiini ja kollageeni IV värjättynä verisuonista, mittapalkki 20 μm. Muokattu lähteestä [37]. Muodostuneiden verisuonten perfuusiokykyä tarkasteltiin fluoresoivien, polystyreenistä valmistettujen mikrojyvästen avulla (halkaisija 7 μm). Jyvästen liikettä verkostossa seuraamalla pystyttiin todentamaan, että verisolut mahtuisivat luumeniin eivätkä ne tukkisi verkostoa. Verisuonien seinämien permeabiliteettia tarkasteltiin lisäämällä perfuusioliuokseen fluoresoivalla väriaineella värjättyjä 70 kda dekstraani-partikkeleita (FITC-Dextran). Partikkelit pysyivät verisuonien sisällä, eivätkä vuotaneet seinämien läpi ympäröivään hydrogeeliin. [37]

25 Nesteen virtauksen vaikutusta verisuonten seinämiin seurattiin kuvaamalla solujen tukirangan organisoitumista ja typpioksidin (NO) eritystä endoteelisoluissa staattisessa tilanteessa ja virtauksen alaisena. Kahden tunnin perfuusion jälkeen virtaus lisäsi F- aktiinin tuotantoa soluissa ja aiheutti säikeiden organisoidumman suuntautumisen virtaussuunnan mukaiseksi, mikä vahvisti seinämän rakennetta. Typpioksidin tuotanto lisääntyi merkittävästi tunnin perfuusion jälkeen. Funktionaalisten verisuonien kasvattamisessa nämä ovat hyviä tuloksia, sillä verisuonet reagoisivat veren virtaukseen näillä mekanismeilla myös in vivo. [37] 5.4 Vaskulaaristen rakenteiden modulaarinen valmistaminen Hydrogeelirakennetta ei ole välttämätöntä rakentaa vain yhdestä yhtenäisestä hydrogeelimassasta, vaan valmistamisessa voidaan hyödyntää pienempiä rakenneosia, jotka liitetään valmistusprosessissa yhteen. Rakenneosien arkkitehtuuri voi olla hyvinkin yksinkertaista, mutta yhdistämällä osat voidaan muodostaa monimutkaisempia kolmiulotteisia rakenteita. Modulaarisessa kokoamisessa haasteena on hydrogeelilevyjen yhteen liittäminen niin, että ne muodostaisivat tasaisen massan eikä liitosalue jäisi mekaanisesti heikommaksi kohdaksi rakenteessa. [38] Yksi metodi on ristisilloittaa komposiittihydrogeelistä valmistettujen levyjen komponentit erikseen. Kuvassa 11 kuvataan Nie et al. käyttämää menetelmää, jossa kahdesta eri polymeeristä valmistettu komposiittihydrogeeli valettiin kahteen identtiseen muottiin. Valmistus koostui kolmesta vaiheesta, jotka olivat valaminen, muotin irrotus ja puolikkaiden yhteen liittäminen. Valamisessa molemmat komponentit olivat ristisilloittamattomia ja liuos valettiin kahteen identtiseen muottiin, jotka vastasivat halutun kanavarakenteen puolikkaita. Muotin irrotuksessa toinen komponenteista ristisilloitettiin ja näin saatiin muodostettua kaksi hydrogeelilevyä, joista toinen vastasi kanavarakenteen yläpuolta ja toinen alapuolta. Puolikkaiden yhteen liittäminen tapahtui toisen komponentin ristisilloituksella, jolloin muodostut hydrogeelirakenne oli samaa massaa, eikä liitoskohtaa pystynyt erottamaan rakenteesta. Rakenteen valmistamisen jälkeen kanavissa viljeltiin HUVEC-soluja endoteelikerroksen muodostamiseksi. [38]

26 Kuva 11. a) Gelatiini-GelMA-komposiittihydrogeelin valmistuksen vaiheet. Hydrogeelirakenne valetaan kahdesta erillisestä palasta, jotka yhdistetään, jolloin muodostuu perfusoitava kanavarakenne. b) I-II) Valokuvat valmistetusta yksitasoisesta rakenteesta, joka ovat perfusoitu musteella ja fluoresoivalla väriaineella. III-IV) Valokuva kaksitasoisesta kanavarakenteesta, jossa on yhdyskanava eri tasossa olevien kanavien välissä. c) I) Poikkileikkaus hydrogeelikanavasta. II) Poikkileikkaus kanavasta, jonka seinämä HUVEC-solujen peitossa. III) SEM-kuva poikkileikkauksesta, jossa kanavaan muodostunut endoteelikerros (200x suurennos). IV) SEM-kuva seinämän HUVECsoluista (800x suurennos). d) Optiset ja konfokaalikuvat endoteelisolujen muodostamista kanavista. Muokattu lähteestä [38]. Ryhmä kokeili eri polymeerien yhdistelmiä, joista gelatiini-gelma osoittautui parhaaksi vaihtoehdoksi solujen hyvän adheesion vuoksi. Muotin irrottamisessa gelatiini ristisilloitettiin 4 C lämpötilassa ja puolikkaiden yhteen liittäminen tapahtui GelMApolymeerien ristisilloittamisella UV-altistuksen avulla. Liitoskohdan vahvuutta arvioitiin vertaamalla rakenteen mekaanisia ominaisuuksia vastaavaan hydrogeeliin, joka oli valettu yhtenä palana. Yhtenä palana valettujen hydrogeelien murtovenymä oli noin 240 %, kun kahdesta palasta muodostetuilla hydrogeeleillä se oli noin 230-240 %. Vastaavat murtolujuudet olivat 117 kpa ja 115 kpa, joten rakenteiden mekaanisilla ominaisuuksilla ei ollut merkittävää eroa. Huomattavaa oli, että kahdesta palasta muodostuneiden rakenteiden havaittiin hajoavan testeissä muualta kuin liitospinnoilta, joten tätä hydrogeelirakenteiden yhteen liittämisen menetelmää voidaan pitää käyttökelpoisena. [38] Menetelmällä pystyttiin valmistamaan useita erilaisia kanavarakenteita käyttäen hyväksi CAD-ohjelmistolla suunniteltuja valumuotteja. Myös päällekkäisiä kanavia kyettiin

27 valmistamaan kerrostamalla kaksi yhdessä tasossa olevaa kanavarakennetta päällekkäin. HUVEC-solut kiinnittyivät ja muodostivat tasaisen endoteelikerroksen parhaiten kanavissa, joiden halkaisijat olivat 300 ja 500 μm. Tätä suuremmissa kanavissa (1000 ja 1500 μm) solut kasaantuivat kanavien keskelle, eivätkä kyenneet muodostamaan endoteelikerrosta. Pienempi halkaisija (160 μm) taas vaikeutti viskoosin solususpension injektoimista kanavaan, joten tasaisen solukerroksen muodostaminen ei onnistunut tarpeeksi hyvin. [38] HUVEC-solujen viljelyä jatkettiin kanavissa, joiden halkaisijat olivat 300 ja 500 μm. 10 päivän viljelyn aikana solujen elinkykyisyys pysyi korkeana (>98 %) ja endoteelikerros piti hyvin muotonsa. F-aktiinin, CD31:n ja VE-kadheriinin runsas ilmentäminen osoittivat, että endoteelisolut muodostivat tiiviitä solu-solu-liitoksia, mikä johti vahvan endoteelikerroksen muodostumiseen luumenin ja hydrogeelin välille. Endoteelikerroksen permeabiliteettia testattiin 48 tunnin viljelyn jälkeen 10 ja 40 kda FITC-dekstraanin avulla. Tulokset osoittivat, että HUVEC-soluja sisältävien kanavien permeabiliteetti oli noin puolet vastaavien kanavien arvoista, joissa ei ollut soluja. Endoteelikerros siis hidasti huomattavasti molekyylien diffuusiota kanavista ympäröivään rakenteeseen, vaikka molekyylien koon perusteella olikin odotettavaa, että ne läpäisisivät seinämän. [38] Sen sijaan, että hydrogeeli kasattaisiin osista, voidaan ottaa myös päinvastainen lähestymistapa ja lisätä soluja erissä valmiin hydrogeelirakenteen päälle. Solulevytekniikalla (cell sheet engineering) rakennettavan kudosmallin paksuutta voidaan lisätä kerros kerrokselta. Sakaguchi et al. hyödynsi tätä tekniikkaa vaskularisoituneen sydänlihaskudoksen valmistamisessa. Tyypin I kollageenista valmistettiin hydrogeeli, joka valettiin muottiin kiinnitettyjen teräsvaijereiden päälle. Geeliytymisen jälkeen vaijerit poistettiin ja hydrogeeliin muodostui rinnakkaisia suoria mikrokanavia (halkaisijat 300 μm). Tätä ennen rotan sydänlihassoluja oli viljelty yhdessä endoteelisolujen kanssa staattisesti niin, että ne muodostivat kolmikerroksisen solulevyn. Tämä solulevy siirrettiin geeliytyvän hydrogeelin päälle ja kokonaisuutta inkuboitiin tunnin ajan ennen sen siirtämistä bioreaktoriin. Bioreaktorissa mikrokanavat liitettiin pumppuun, jolla perfusoitiin kanavia kasvatusliuoksella, joka sisälsi fibroblastien kasvutekijää (bfgf) ja endoteelisolujen kasvutekijää (VEGF). Etäisyys mikrokanavista solulevyyn oli noin 500 μm. Rakennetta viljeltiin 5 päivää, jonka aikana endoteelisolut muodostivat kapillaareja solulevystä kohti perfusoituja mikrokanavia. Kapillaarit anastomoituivat mikrokanaviin, jolloin kasvatusliuos pääsi virtaamaan solulevykerrokseen (paksuus 24 μm, solukerrosten määrä n=3). Tämän jälkeen toinen

28 kolmikerroksinen solulevy lisättiin edellisen päälle ja jälleen rakennetta viljeltiin 5 päivää, jonka aikana kapillaariverkosto kasvoi lisättyyn solulevykerrokseen ja muodostui yhtenäinen paksumpi kudosrakenne (paksuus 35 μm, n=6) (kuva 12). Toisen solulevyn lisäyksen jälkeen sydänlihasolujen havaittiin sykkivän synkronoidusti, mikä antaa viitteitä siitä, että paksummissakin kudosrakenteissa voidaan säilyttää solujen ja kudosten luontainen toiminnallisuus. Kolmikerroksisten solulevyjen lisäämistä jatkettiin 5 päivän välein, kunnes solulevyjä oli lisätty yhteensä 4 kerrosta (paksuus 110 μm, solukerroksia n=12). [39] Kuva 12. a) Kolmikerroksinen solulevy kollageenihydrogeelin päällä, hydrogeelissä perfusoitavissa olevat mikrokanavat. b) Mikrokanavia on perfusoitu 5 päivää, jonka aikana endoteelisolut muodostavat kapillaareja kohti kanavia. c) Kapillaarit yhdistyvät kanaviin ja kasvatusliuos virtaa solukerroksiin. d) Uuden kolmikerroksisen solulevyn lisääminen. e) Uusi kerros yhdistyy vanhaan ja kapillaariverkosto kasvaa uuteen levyyn. Muokattu lähteestä [39]. Kapillaariverkoston toiminnallisuutta testattiin perfusoimalla mikrokanavat rotan punasoluilla. Histologisten näytteiden perusteella punasolujen havaittiin kulkeutuneen kaikkialle solulevykerrokseen, mikä kertoo kapillaarisuonien onnistuneesta anastomoosista mikrokanaviin sekä siitä, että kapillaarien rakenne on riittävän iso punasoluille. 12-kerroksisen rakenteen histologisessa HE-värjäyksessä (hematoksyliinieosiini-värjäys) ei havaittu nekroottista kudosta, mutta live/dead -määrityksessä rakenteen keskiosassa havaittiin pieni määrä kuolleita soluja. [39] Solujen kuolleisuus on voinut johtua puutteellisesta kapillaariverkoston muodostumisesta tai solut ovat voineet olla kuolleita jo solulevykerrosta lisättäessä. Kasvattamalla solukerrosten määrää 12:ta suuremmaksi saataisiin tarkempaa tietoa, miten kapillaariverkoston

29 muodostuminen muuttuu kudoksen paksuuden kasvaessa. Menetelmä antoi kuitenkin lupaavia tuloksia vaskularisoituneen ja toiminnallisen sydänlihaskudoksen kasvattamisesta in vitro. 5.5 3D- ja 4D-bioprinttaus 3D-printtaus on nostanut suosiotaan hyvin monella alalla ja sitä on alettu hyödyntää entistä enemmän myös kudosteknologiassa. 3D-bioprinttaus yhdistää 3Dprinttaustekniikat, biomateriaalit ja solut yhteen. Bioprinttauksen avulla voidaan valmistaa monimutkaisia 3D-rakenteita tarkasti ja nopeasti, mikä vaskulaaristen rakenteiden tapauksessa mahdollistaa perfuusion käynnistämisen nopeammin. Solut voidaan lisätä hydrogeelin sekaan, jolloin muodostunut biomuste voidaan printata suoraan haluttuun muotoon. 3D-printtausta on käytetty aikaisemminkin hyväksi vaskulaaristen rakenteiden valmistamisessa, mutta sovellukset ovat yleensä perustuneet epäsuoraan menetelmään, jossa haluttu kanavarakenne printataan uhrimateriaalista, joka myöhemmin valetaan hydrogeelin sisään ja liuotetaan pois. Solut lisätään kanaviin vasta jälkikäteen uhrimateriaalin poistamisen jälkeen, jolloin kestää kauemmin ennen kuin solut ovat levittäytyneet koko rakenteeseen. Suorassa menetelmässä solut ovat printattavan hydrogeelin joukossa, jolloin myös solujen sijaintiin hydrogeelirakenteessa voidaan vaikuttaa tarkemmin. Suora menetelmä tuo toisaalta enemmän vaatimuksia printtausolosuhteille, sillä solujen täytyy selvitä printtauksesta hengissä samalla kun hydrogeelin on oltava tarpeeksi nestemäistä printtaukseen, mutta myös tarpeeksi geelimäistä printatun rakenteen muodon ylläpitämiseksi. [40] 3D-printtauksessa on käytössä erilaisia suuttimia, joilla printtausjälkeä voidaan muuttaa. Yksinkertaisemmat suuttimet ovat onttoja kanavia, joista biomuste voidaan printata ulos pisaroina (droplet-based) tai yhtenäisenä kuituna (extrusion-based). Hieman monimutkaisemmat koaksiaalisuuttimet mahdollistavat sen, että kuituna suuttimesta ulos tuleva biomuste on heti putkimaisessa muodossa. Koaksiaalisuuttimen rakenne koostuu sylinterin muotoisesta keskuskappaleesta, jota ympäröi kuorikerros. Biomuste puristetaan kuorikerroksen ja keskussylinterin välistä, jolloin printtausjälkenä on ontto kuitu. [40 42] 3D-bioprinttaus voi perustua myös stereolitografiaan, jossa hydrogeeli ristisilloitetaan laserin avulla [43]. Tässä luvussa tutustutaan 3D- ja 4D-bioprinttaukseen koaksiaalisuuttimilla ja ontoilla suuttimilla.

30 Jia et al. käyttivät monikerroksisia koaksiaalisuuttimia ja kolmesta polymeeristä koostuvaa hydrogeeliä valmistaakseen kolmiulotteisen vaskulaarisen verkoston. Monikerroksinen suutin mahdollisti halkaisijaltaan erikokoisten putkien valmistamisen. Soluina käytettiin HUVEC-soluja ja ihmisen mesenkymaalisia kantasoluja (mesenchymal stem cells, MSC). Kantasolujen haluttiin erilaistuvan sileiksi lihassoluiksi, joten kasvatusliuokseen lisättiin TGF-β1-kasvutekijää erilaistumisen edistämiseksi. Hydrogeeli koostui GelMA:sta, natriumalginaatista ja PEG-tetra-akrylaatista (PEGTA). Natriumalginaatti mahdollistaa hydrogeelin nopean ristisilloituksen ionisidoksilla CaCl 2 - liuoksessa, jolloin seoksesta saadaan riittävän geelimäistä printtausta varten ja printattu rakenne pysyy väliaikaisesti koossa. PEGTA antaa lopulliselle hydrogeelirakenteelle mekaanista vahvuutta ja GelMA:n hyvät biologiset ominaisuudet mahdollistavat solujen hyvän adheesion ja levittäytymisen rakenteeseen. [42] Solut lisättiin hydrogeeliliuokseen juuri ennen printtausta. Koaksiaalisuuttimen keskiosan sylinteristä ruiskutettiin CaCl 2 -liuosta samanaikaisesti, kun biomuste pursotettiin ulos (kuva 13). Syntyvää onttoa kuitua ruiskutettiin myös ulkopuolelta CaCl 2 -liuoksella, jolloin alginaatti geeliytyi ja antoi syntyneelle rakenteelle väliaikaisesti tukea. Tämän jälkeen GelMA ja PEGTA ristisilloitettiin kovalenttisesti UV-valon avulla, mitä seurasi koko rakenteen upottaminen etyleenidiamiinitetraetikkahappo-liuokseen (EDTA). EDTA sitoi rakenteesta Ca 2+ -ionit, jolloin alginaatin ristisilloitus purkautui ja alginaatti voitiin huuhtoa pois. Lopulliseen rakenteeseen jäi siis GelMA ja PEGTA kovalenttisesti ristisilloittuneena, sekä hydrogeeli-liuokseen lisätyt solut. [42] Kolmikerroksista koaksiaalisuutinta käytettäessä biomuste puristettiin toisen ja kolmannen vaipan välistä. Vaihtamalla pursotusreittiä ulomman ja sisemmän vaipan välillä, pystyttiin valmistamaan hydrogeeliputkia, joiden halkaisija vaihteli. Halkaisijaa pystyttiin muuttamaan printtauksen aikana myös muuttamalla hydrogeeliluoksen virtausnopeutta suuttimessa tai muuttamalla nopeutta, jolla suutinta liikutettiin. Vaipan paksuutta muuttamalla puolestaan pystyttiin säätämään valmistuvan kanavan seinämän paksuutta. Valmistettujen kanavien ulkohalkaisija vaihteli välillä 500 1500 μm, sisähalkaisija välillä 400 1000 μm ja seinämän paksuus välillä 60 280 μm. Menetelmä mahdollistaa erikokoisten kanavien valmistamisen yhtenäiseksi verkostoksi, jolloin päästään lähemmäs verisuoniverkoston in vivo rakennetta, jossa eri kokoiset verisuonet yhdistyvät saumattomaksi kokonaisuudeksi. [42] Solut levittäytyivät seinämissä koko hydrogeelin alueelle 21 päivän aikana ja ne järjestäytyivät pitkittäin kanavan suunnan mukaisesti. Kanavat pystyttiin perfusoimaan ja

31 nesteen virtausta luumenissa seurattiin fluoresoivien väriaineiden avulla (kuva 14). HUVEC-solut muodostivat endoteelikerroksen luumenin sisäpinnalle ja MSC-solut näyttivät merkkejä erilaistumisesta sileiksi lihassoluiksi. Endoteelikerroksen muodostumista seurattiin CD31-proteiinin värjäämisellä ja kantasolujen erilaistumista α- SMA-proteiinin värjäämisellä. α-sma on aktiinin muoto, jota ilmennetään sileissä lihasoluissa. [42] Kuva 13. A) Polymeerien ristisilloittamisen vaiheet. Alginaatti ristisilloitetaan ensimmäisenä Ca 2+ -ionien avulla, jonka jälkeen GelMA ja PEGTA ristisilloitetaan kovalenttisesti UV-altistuksella. B) 3D-bioprinttauksen vaiheet, jossa soluja sisältävä biomuste pursotetaan koaksiaalisuuttimella putkimaiseen muotoon ja alustava vaskulaarinen rakenne muodostuu. C) Kaksi- ja kolmikerroksisia koaksiaalisuuttimia. Kolmikerroksisella suuttimella voidaan muuttaa printattavan putken halkaisijaa printtauksen aikana. Muokattu lähteestä [42]. Vaikka rakenne pysyi hyvin kasassa printtauksen jälkeen ja solut lähtivät leviämään ja erilaistumaan toivotulla tavalla, rakenteen puristuslujuus heikkeni kuitenkin merkittävästi 21 päivän jälkeen, kun GelMA oli hajonnut pois rakenteesta. Kanavia ei pystytty 21 päivän jälkeen enää perfusoimaan kunnolla, sillä rakenteen seinämät eivät kestäneet mekaanista rasitusta. Eri polymeerien suhteiden optimoimisella ongelma olisi ehkä ratkaistavissa, mutta ratkaisuna voi olla myös polymeerien muokkaus tai muiden polymeerien lisääminen hydrogeeliin. [42] Fibroblastien lisääminen rakenteeseen

32 saattaisi myös nopeuttaa uuden soluväliaineen muodostumista hajoavan GelMA:n tilalle, jotta seinämät pysyisivät riittävän vahvoina. Kuva 14. GelMA-PEGTA-hydrogeelistä valmistettuja rakenteita. A) Kaavakuvat ja fluoresenssikuvat muodostuneesta verkostosta eri kuvakulmista. B) 10-kerroksisen rakenteen fluoresenssikuvat, jossa seinämät näkyvät virheällä ja perfuusioneste punaisella. C) Fluoresenssikuvat kaksikerroksisesta kanavarakenteesta ennen perfuusiota fluoresoivalla punaisella väriaineella ja sen jälkeen. Muokattu lähteestä [42]. 3D-bioprinttauksesta on kehitetty myös menetelmä, jossa neljäntenä ulottuvuutena on aika. Tätä kutsutaan 4D-bioprinttaukseksi ja ideana siinä on printatut rakenteet, jotka kykenevät printtauksen jälkeen muuttamaan muotoaan tai funktiotaan ulkoisesta ärsykkeestä. Menetelmää on hyödynnetty myös vaskulaaristen rakenteiden valmistamisessa. [44] Yhdessä tutkimuksessa metakryloidusta alginaatista (AA-MA) valmistettiin hydrogeeli, joka printattiin onttoa suutinta käyttäen suorakulmion muotoisiksi levyiksi lasilevyn tai polystyreenilevyn päälle (kuva 15). Metakryloinnin ansiosta hydrogeelilevyt voitiin ristisilloittaa vihreän valon avulla, jonka jälkeen geelilevyjä kuivattiin hieman. Kuivaamisen jälkeen levyt voitiin upottaa joko veteen, PBS-liuokseen (fosfaattipuskuroitu suolaliuos) tai kasvatusliuokseen, joissa levyt taittuivat välittömästi (sekunneissa) ontoiksi putkiksi turpoamisen seurauksena. Kuivaamattomat levyt taittuivat vain osittain tai eivät lainkaan. Muodostuneiden putkien ulkohalkaisijat vaihtelivat 70 350 μm:n välillä ja sisähalkaisijat 20 150 μm:n välillä, riippuen printatun levyn koosta. [45]

33 Kuva 15. a) Metakryloidun alginaatin (AA-MA) printtaaminen lasille tai polystyreenilevylle. Soluja sisältävä hydrogeeli printattiin samalla tavalla. b) Hydrogeeli ristisilloitettiin valolla ja kuivattiin kevyesti. c) Hydrogeelilevyjen upottaminen veteen, PBS-liuokseen tai kasvatusliuokseen sai ne taittumaan ontoksi putkeksi. Muokattu lähteestä [45]. Solutesteissä hydrogeelin joukkoon sekoitettiin multipotentteja kantasoluja (D1, hiiren luuytimen kantasoluja) ja hydrogeeli printattiin samalla menetelmällä kuin soluton hydrogeeli. Ristisilloituksen ja kuivauksen jälkeen levyt upotettiin kasvatusliuokseen, jossa ne taittuivat ontoiksi putkiksi. Solut oli värjätty fluoresoivalla väriaineella ennen lisäystä hydrogeeliin ja putkien muodostamisen jälkeen niiden todettiin olevan tasaisesti jakautuneena koko rakenteeseen. Solujen lisääminen hydrogeeliin ei muuttanut putkien taittumista eivätkä niiden halkaisijat muuttuneet solujen vaikutuksesta verrattuna soluttomiin rakenteisiin. Soluja viljeltiin 7 vuorokautta ja niiden elinkykyisyys pysyi hyvin korkeana (>95 %) koko viljelyjakson ajan. Solujen ei havaittu leviävän rakenteessa viljelyn aikana, minkä tutkijat olettivat johtuvan rajallisesta määrästä RGDsitoutumissekvenssejä alginaattihydrogeelissä. [45] Käytetyllä menetelmällä kyetään valmistamaan suurella tarkkuudella onttoja putkirakenteita, pienimpien sisähalkaisijoiden ollessa vain 20 μm, joka vastaa pienimpien verisuonien halkaisijoita. Näin pienien rakenteiden valmistaminen hydrogeeleistä on ollut suuri haaste, mutta 4D-bioprinttaus on osoittautunut potentiaaliseksi menetelmäksi kaikista pienimpien vaskulaaristen rakenteiden valmistamiseen. Yllä esitelty menetelmä sopii soluja sisältävien hydrogeelien bioprinttaukseen, mutta se vaatii kuitenkin vielä paljon tutkimusta ja eri solutyyppien lisäämistä rakenteeseen, ennen kuin sillä voitaisiin mallintaa kunnolla verisuonia. [45]