111 111111!11, 1111111 1111111111p21111111111111i

111 111111!11, 1111111 1111111111p21111111111111i (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI 105105 B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 15.06.2000 SUOMI - FINLAND (FI) (51) Kv.lk.7 - Int.kl.7 C12N 15/48, 15/49, 15/37, 15/86, A61K 39/21, 48/00, CO7H 21/04, CO7K 14/155, 14/16, 14/025 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 980463 PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 27.02.1998 (24) Alkupäiva - Löpdag 27.02.1998 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 28.08.1999 (73) Haltija - Innehavare 1 Oy Finnish immunotechnology Ltd, Pirkankatu 1 A 7, 33210 Tampere, SUOMI - FINLAND, (FI) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Tähtinen,Marja, Välitie 24, 36110 Ruutana, SUOMI - FINLAND, (FI) 2 Peterson,Pärt, Kaskitie 13 F, 33540 Tampere, SUOMI - FINLAND, (FI) 3 Krohn,Kai, Salmentaantie 751, 36450 Salmentaka, SUOMI - FINLAND, (FI) 4 Ranki,Päivi Annamari, Salmentaantie 751, 36450 Salmentaka, SUOMI - FINLAND, (FI) (74) Asiamies - Ombud: Kolster Oy Ab Iso Roobertinkatu 23, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:tä vastaan Självreplikerande DNA-vektor för immunisering mot HIV (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer JP A 8-198774 (A 61 K 39/12, Okuda Kenji, Terumo Corp.), WO A 97/24451 (C 12N 15/86, Estonian Biocentre), Vaccine 15 (8), 1997, 874-878, Hinkula, J. et al., Scand. J. Immunol. 46 (4), 1997, 326-330, Asakura, Y. et al., Nucleic Acids Research 26 (5), 1998, 1317-1323, Touze, A. ja Coursaget, P., AIDS Research and Human Retroviruses 11 (11) 1995, 1335-1342, Blazevic, V. et al. (57) Tiivistelmä - Sammandrag HIV:n säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia koodittava nukleotidisekvenssi sijoitetaan vektoriin, joka käsittää pitkäaikaisen säilymisen kannalta välttämättömiä ja riittäviä papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä. Tuloksena olevat vektorit ovat itsereplikoivia, ja niiden kopiolukumäärä on suuri. Ne ilmentävät HIV-geenejä suurina määrinä pitkäaikaisesti. Nämä vektorit herättävät sekä humoraalisen että soluvälitteisen immuunivasteen ja ovat siksi potentiaalisia HIV:n vastaisia DNA-immunisointirokotteita. Keksintö koskee mainittuja vektoreita ja rokotteita ja menetelmää näiden vektoreiden valmistamiseksi. Lisäksi keksintö koskee tätä vektoria käsittävää isäntäsolua, tämän vektorin käyttöä rokotteen valmistuksessa ja menetelmää HIV:n ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi. En nukleotidsekvens, som kodar det regulatoriska HIVproteinet NEF, REV eller TAT eller ett immunologiskt aktivt fragment därav, införs i en vektor som innhåller nukleotidsekvenser från papillomavirus vilka är nödvändiga och tillräckliga för ett långt fortbestånd. De resulterande vektorema är självreplikerande och har ett högt antal kopior. De uttrycker HIV-genema i stora mängder under en lång tid. Vektorema väcker både ett humoralt och ett av celler förmedlat immunsvar och utgör därför potentiella DNAimmunisationsvaccin mot HIV. Uppfinningen riktar sig på nämnda vektorer och vacciner och på ett förfarande för framställning av vektorema. Uppfinningen berör ytterligare en värdcell som innehåller vektom, användning av vektom vid framställning av ett vaccin, och ett förfarande för att förhindra eller behandla HIV.

1 105105 Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan Keksinnön alue Keksintö koskee itsereplikoivaa rekombinanttivektoria, joka on 5 käyttökelpoinen DNA-immunisoinnissa HIV:tä vastaan. Keksintö koskee myös mainittua vektoria käsittävää rokotetta, menetelmää vektorin valmistamiseksi ja sitä käsittävää isäntäsolua. Lisäksi keksintö koskee mainitun vektorin käyttöä HIV:n vastaisen rokotteen valmistamiseksi ja menetelmää HIV:n hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi. 10 Keksinnön tausta Selkärankaisten ja siten myös ihmisten vuorovaikutusta patogeenisten mikrobien, kuten bakteereiden, sienten ja virusten, kanssa säätelee selkärankaisen elimistön kyky muodostaa immuunivaste elimistöön tunkeutuvaa mikrobia vastaan. Tämä reaktio perustuu immuunijärjestelmän kykyyn erottaa 15 toisistaan oma ja vieras; normaalitilanteessa immuunivaste sietää elimistön omia rakenteita, soluja ja antigeenisiä molekyylejä, samalla kun se hyökkää elimistöön tunkeutuvissa mikrobeissa esiintyviä vieraita antigeenejä vastaan. Kun selkärankainen, kuten ihminen, saa mikrobi-infektion, immuunivaste auttaa selviytymään infektiosta tappamalla mikrobeja tai mikrobien infektoimia 20 soluja tai estämällä infektion leviämisen vaarattomaksi tekevien vasta-aineiden toiminnan kautta. Toisaalta, ja mikä on tärkeämpää, tunkeutuvaa organismia vastaan kerran syntyneellä immuunivasteella on luontainen muistimekanismi, ja siten yksilö, joka on kerran käynyt läpi jonkin määrätyn mikrobi-infektion, on usein immuuni eikä voi saada infektiota toista kertaa. 25 Tämä immunologinen muisti, jonka aiheuttaa luonnollisessa tilanteessa infektio, on perustana rokotteille, jotka jäljittelevät monin tavoin luonnollista infektiota. Ihanteellinen rokote ei aiheuta oireita tai aiheuttaa vain lieviä oireita rokotetuissa yksilöissä, mutta johtaa silti sellaisen immunologisen muistin indusoitumiseen, jolla on kyky muodostaa vahva ehkäisevä immuunivaste, 30 jos rokote joutuu vastakkain kyseisen mikrobin kanssa. Rokotteen suunnittelu jotakin määrättyä mikrobia vastaan riippuu mekanismista, jolla elimistö luonnollisen infektion ollessa kyseessä saattaa selvitä tästä määrätystä organismista ja estää myöhemmät infektiot. On olemassa muutamia tapoja, joilla immuunivaste voi herättää tämän suotuisan 35 toiminnan. Ensinnäkin B-Iymfosyyttien syntetisoimat ja erittämät vasta-aineet voivat sitoutua mikrobiin ja tuhota sen komplementtivälitteisen lyysin kautta.

2 105105 Toiseksi vasta-aineet voivat estää infektion leviämisen inhiboimalla mikrobin sitoutumista kohdesoluunsa. Kolmanneksi vasta-aineet voivat komplementin aktivaation yhteydessä tuhota infektoituneita soluja ja myös spesifiset sytotoksiset T-Iymfosyytit (CTL:t) voivat tappaa ja tuhota mikrobin infektoimia soluja. 5 Kaikkien näiden mekanismien on ajateltu olevan mukana immuunivasteessa, jonka herättää tyyppiä 1 ja 2 oleva ihmisen immuunikatovirus (HIV) (HIV-1 ja HIV-2). HIV:n infektoimien yksilöiden immuunivasteelle on kuitenkin tavallisesti tunnusomaista voimakas vasta-ainevaste ja vähemmän tehokas T- lymfosyyttivaste tai jopa sen puuttuminen [J. Gerstott et a/., J. Immunol. 22, 10 nro 5 (1985) 463 470; M. C. Re et al., J. Clinical Pathol. 42, nro 5 (1989) 282 283]. Tämä voi olla syynä siihen, miksi kerran HIV-infektion saaneissa yksilöissä on kehittynyt krooninen infektio huolimatta voimakkaasta vastaainevälitteisestä immuunivasteesta. Ehkäisevän immuunivasteen virusinfektiolle voivat yleisesti ottaen 15 välittää edellä kuvatut neljä immuunivastetyyppiä, mutta tiedetään, että CTLvaste, jolla on kyky tappaa viruksen infektoimia soluja, on tehokkain. Tästä syystä elävät heikennetyt virusrokotteet ovat yleisesti ottaen osoittautuneet tehokkaimmiksi. Itse asiassa ensimmäinen rokote, jonka Jenner kehitti yli 200 vuotta sitten, elävä lehmänrokkovirus, joka pystyy ehkäisemään isorokkoviru- 20 sinfektion, on esimerkki tästä periaatteesta. Kun yksilö rokotetaan elävällä heikennetyllä virusrokotteella, isäntäsolut infektoituvat ja syntetisoituu virusproteiineja. Joitakin virusproteiinimolekyyleistä käytetään viruspartikkelien tuotantoon, kun taas jotkut pilkkoutuvat proteolyyttisesti pieniksi peptideiksi, jotka sitoutuvat päähistokompatibiliteetti (MHC) -antigeeneihin (ihmisessä HLA luokat 25 1 ja II) ja ovat tarjolla T-lymfosyyteille infektoituneiden solujen pinnalla. Sen jälkeen T-lymfosyytit, joilla on asianmukainen T-solureseptori (TCR), tunnistavat HLA:han liittyneen vieraan peptidin ja joko ovat B-solujen apuna vasta-aineen tuottamiseksi (auttaja-/indusoija-t-solut; Th) tai tuhoavat infektoituneen solun (sytotoksinen T-lymfosyytti; CTL). 30 Huolimatta vuosikymmenen kestäneestä työstä tehokas rokote ihmisen immuunikatovirus (HIV) infektiota ja AIDSia vastaan puuttuu edelleen. Aiemmat yritykset ovat keskittyneet steriloivan immuniteetin aikaansaantiin HIV:n ulkovaipan glykoproteiinin, gp120/gp160:n, vastaisten vaarattomaksi tekevien vasta-aineiden avulla. Vaiheen 1/11 gp160/gp120-tutkimukset osoittavat 35 kuitenkin vain laboratoriokantojen vaarattomaksi tekemisen, mutta eivät onnistu tekemään kentältä eristettyjä kantoja vaarattomiksi.

3 1 05105 Sen sijaan heikennetyllä viruksella tehdyt kokeet ovat olleet menestyksellisiä apinan immuunikato (SIV) -mallissa. SIV, jossa on NEF- tai REV-geenideleetioita, käyttäytyy heikennettynä viruksena ja suojaa rokotetut eläimet sairauden kehittymistä muttei villin tyypin haastajaviruksen aiheutta- 5 maa infektoitumista vastaan. REV-virheen sisältävän viruksen ollessa kyseessä ainoa suojauksen kanssa korreloiva immunologinen tekijä oli soluvälitteinen immuunivaste (CMI-vaste) SIV:n säätelyproteiineja NEF ja TAT vastaan. Yksi tärkeä havainto tässä kokeessa oli, että rokotetut eläimet pystyivät jopa selviämään villin tyypin haastajaviruksen aiheuttamasta infektiosta. Viime aikoina 10 on raportoitu että myös HIV-infektiopotilaat saattavat satunnaisesti selvitä näkyvissä olevasta infektiosta. Ainoa merkitsevä suojauksen kanssa korreloiva tekijä näyttää näissä eläin- ja/tai ihmiskokeissa olevan soluvälitteinen immuunivaste HIV:tä vastaan. Tämäntyyppistä immuunivastetta ei yleensä saada aikaan proteiini- 15 immunisoinnilla. HIV:n ollessa kyseessä elävät heikennetyt rokotteet voisivat olla tehokkaita infektion ehkäisemiseksi, mutta ne ovat teoriassa vaarallisia useasta syystä. Yhdellä vähän aikaan sitten kuvatulla menetelmällä, geneettisellä immunisoinnilla (synonyymit: nukleiinihappoimmunisointi, DNAimmunisointi), on useita elävien heikennettyjen rokotteiden eduista muttei nii- 20 den potentiaalisesti vahingollisia haittavaikutuksia. DNA-rokote, joka on yhtä tai muutamaa virusproteiinia vastaavan geenin sisältävän eukaryoottisen ilmentämisvektorin muodossa, voi indusoida virusproteiinisynteesin, kun isäntäsolu on transfektoitu DNA-vektorilla. Kohdesolussa syntetisoituneet virusproteiinit joutuvat sitten proteolyyttisten entsyymien prosessoimiksi; muodos- 25 tuneet peptidit sitoutuvat MHC/HLA-molekyyleihin ja niitä esiintyy transfektoitujen solujen pinnalla. Tämä aiheuttaa CTL-välitteisen immunologisen muistin, joka siinä tapauksessa, että yksilö joutuu myöhemmin virulentin villin tyypin viruksen infektoimaksi, tappaa tehokkaasti viruksen infektoimia soluja välittömästi tartunnan jälkeen ja ehkäisee siten infektion. On osoitettu, että cdna:n. 30 suora lihaksen- tai ihonsisäisen injektointi eukaryoottisessa ilmentämisplasmi- dissa indusoi immuunivasteen [Wolff et al., Science 246 (1990) 1465-1468]. Vieraiden antigeenien ilmentäminen mainitunlaisin keinoin johtaa pääasiassa auttaja-t-solujen alaryhmä 1 (TH1) -tyyppisiin immuunivasteisiin, joihin liittyy voimakas sytotoksinen T-Iymfosyytti (CTL) -vaste ja joskus myös korkeatiitteri- 35 nen vasta-ainevaste [B. Wang et al., PNAS 90 (1993) 4156-4160; Wang et al., NY Acad. Sci 772 (1995) 186-197; Haynes et al., AIDS Res. Hum. Retro-

4 1051 0,E viruses 10, nro 2 (1994) 43-45]. Lisäksi on raportoitu antigeenispesifisestä CTL:stä ja suojauksesta käytettäessä influenssa A -viruksen nukleoproteiiniantigeenia [Ulmer et al., Science 259 (1993) 1745-1749]. Lisäksi on saatu aikaan hiirissä suojaus mykoplasmainfektiota vastaan käyttämällä DNA- 5 immunisointia [Barry et al., Nature 377, nro 6550 (1995) 632-635; Lai et al., DNA Cell. Biol. 14, nro 7 (1995) 643-651] ja ihmisen papilloomavirusta vastaan kaniinimallissa [Donnelly et al., J. Inf. Dis. 173, nro 2 (1996) 314-320]. DNA-immunisointia on käytetty myös sytotoksisten lymfosyyttien välittämän kasvaintenvastaisen immuniteetin indusointiin [Bohm et al., Cancer Immunol. 10 lmmunother. 44, nro 4 (1997) 230-238]. DNA-immunisoinnilla on useita etuja verrattuna eläviin heikennettyihin virusrokotteisiin. Koska infektoivaa virusta ei muodostu, isäntäorganismiin indusoidut virusgeenit pysyvät ainoastaan alun perin transfektoiduissa soluissa, eikä virusinfektion oireita esiinny. HIV:n ollessa kyseessä tärkein teoreetti- 15 nen haittavaikutus elävän heikennetyn viruksen kohdalla olisi mutaatioiden aiheuttama palautuminen virulentiksi villin tyypin virukseksi. DNA-immunisoinnin yhteydessä voidaan lisäksi käyttää vain niitä virusgeenejä tai niiden osia, joiden tiedetään olevan tehokkaita ehkäisevän immuunivasteen indusoinnissa. Tehokkaan CTL-vasteen kannalta olisi tärkeää, että sytotoksiset T- 20 solut tuhoaisivat infektoituneet solut ennen rakenneproteiinien muodostumista ja valmiiden viruspartikkelien vapautumista. Immuunivaste virussyklin varhaisia proteiineja vastaan olisi siksi suotuisa. HIV:n replikaatiota säätelevät sen omat säätelygeenit ja -proteiinit. HIV-genomi koodittaa kolmea säätelevää eirakenneproteiinia (NEF, TAT, REV), jotka ovat korvaamattomia viruksen repii- 25 kaation kannalta in vivo. REV kuljettaa genomi-rna:n sytoplasmaan, TAT edistää viruksen transkriptiota, ja NEF saa aikaan replikaation lepotilassa olevissa soluissa. SIV-kokeet osoittavat, että virukset, joista puuttuu yhden tällaisen säätelygeenin toiminta, eivät ehkä pysty indusoimaan sairautta viruksen riittämättömän replikaation vuoksi. Näitä kolmea proteiinia ilmenee tilapäisesti 30 ja pieninä määrinä virusinfektiosyklin ensimmäisten tuntien aikana [Ranki et al., Arch. Viro!. 139 (1994) 365-378]. Vain pienellä osalla HIV-infektion saaneista yksilöistä esiintyy humoraalinen ja/tai soluvaste näihin proteiineihin, ja tämä vaste korreloi suotuista kliinisen taudinkulun kanssa. NEF:n, TAT:n ja REV:n vastaisia CTL-vasteita on tutkittu laajasti. 35 NEF-spesifiset CTL ja Th (T-auttajasolu) -vasteet korreloivat suotuisan kliinisen ennusteen kanssa. REV-virheen sisältävän SIV-rokotteen ollessa kysees-

5 105105 sä immuunivasteet NEF:iin ja TAT:iin olivat suojaavia. TAT- ja REVproteiineissa olevat Th- ja CTL-epitoopit, jotka HIV-1-infektion saaneet yksilöt tunnistavat ja jotka korreloivat kliinisesti, on identifioitu [Blazevic et al., J AIDS 6 (1993) 881-890; Blazevic et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11 (1995) 5 1335-1341]. Kokonaisuutena tarkasteltuina nämä tulokset osoittavat, että sairaudelta suojaamiseksi saattaa olla välttämätöntä viruksen kohtuullinen repiikaatio (heikennetty kasvu) yhdistettynä spesifisiin immuunivasteisiin viruksen repiikaation tukemiseen osallistuvia säätelyproteiineja vastaan. DNA-immunisoinnissa voidaan käyttää useita eukaryoottisia ilmen- 10 tämisvektoreita, mutta niiden teho vaihtelee. Jotkut parametreistä, jotka säätelevät jonkin määrätyn ilmentämisvektorin tehoa immuunivasteen indusoinnissa, ovat tuntemattomia, mutta antigeenisen proteiinin korkea ilmentymistaso olisi ilmeisesti edullista. Ajanjaksolla, jona soluun viety vektori voi ilmentää vierasta antigeenistä virusproteiinia, voi myös olla merkitystä. Ilmentämisvek- 15 torit, jotka indusoivat tietyntasoisen soluvaurion, voivat myös olla edullisia, koska on tunnettua, että kudostuho vahvistaa immuunivastetta muutamien biologisesti aktiivisten molekyylien, kuten sytokiinien, lymfokiinien ja kemokiinien, kautta, joita antigeenista proteiinia ilmentävä solu erittää. Tämä on todennäköisesti yksi lisäsyy siihen, miksi elävä heikennetty virus, joka aiheuttaa 20 tietyntasoisen kudos- ja solutuhon, on niin tehokas immuniteetin indusoinnissa, ja siksi elävää heikennettyä rokotetta jäljittelevä DNA-vektori olisi edullinen. Epäspesifiset tekijät, kuten sytokiinit ja lymfokiinit, voivat myös säädellä virusten repiikaatiota ja immuunivasteita HIV-1-infektiossa. Clerici ja Shearer [Immunology Today 14, nro 3 (1993) 107 111] ja muut ovat osoitta- 25 neet tehtävän, joka on auttajasolujen Th1/Th2-tasapainolla, jota heijastaa näille kandelle T-solupopulaatiolle spesifisten lymfokiinien tuotanto. Liukoiset tekijät, joita tuottavat CD8-solut ja joilla on kyky vähentää HIV-1:n infektoimien CD4-solujen virustuotantoa, on vähän aikaa sitten identifioitu RANTESiksi, MIP1-a:ksi ja MIP1-6:ksi [Cocchi et ei., Science 270, nro 5243 (1995) 1811-30 1815]. On mandollista, että sytokiinit, joiden tuotanto joko lisääntyy tai vähenee HIV-1-infektiossa, säätelevät viruksen transkriptiota. Aiemmat DNA-immunisaatiotutkimukset, joissa on käytetty HIVsäätelyproteiinia NEF koodittavaa geeniä, ovat osoittaneet T-solujen prolife-. raatiovasteet [Hinkula et al., Vaccine 15, nro 8 (1997) 874 878 ja Hinkula et 35 al., J. Virol. 71, nro 7 (heinäkuu 1997) 5528 5539]. Positiivinen vaikutuskor-

6 105 105 relaatio suotuisan kliinisen taudinkulun kanssa on kuitenkin nimenomaan CTLvasteella. Yksi esillä olevan keksinnön päätavoitteista on siksi saada aikaan DNA-immunisointirokote, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia ja jolla on kyky 5 herättää CTL-vaste HIV:n infektoimia soluja vastaan infektiosyklien varhaisessa vaiheessa, ennen uusien valmiiden infektoivien viruspartikkelien vapautumista. Keksinnön yhtenä toisena tavoitteena on saada aikaan rokote, joka lisäksi herättää humoraalisen vasteen HIV:tä vastaan. 10 Keksinnön yhtenä lisätavoitteena on saada aikaan HIV-rokote, joka on turvallinen käyttää, koska se ei altista vastaanottajaa HIV:n rakennegeeneille tai -proteiineille. Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on saada aikaan itsereplikoiva vektori, joka aiheuttaa pitkäaikaisen ja korkean HIV-säätelyproteiini- 15 ilmentymistason ja tietynasteisen solutuhon, mikä edelleen stimuloi immuunivastetta. Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on vielä saada aikaan HIVsäätelyproteiineja ilmentävä itsereplikoiva rekombinattivektori, joka antaa tulokseksi pitkäaikaisen stabiilin ylläpidon ja suuren kopioluvun trasfektoiduissa 20 soluissa, nisäkässolut mukaan luettuina. Keksinnön yhtenä lisätavoitteena on saada aikaan mainittua vektoria käsittävä isäntäsolu. Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on vielä saada aikaan menetelmä edellä mainitun itsereplikoivan vektorin valmistamiseksi. 25 Esillä oleva keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön menetelmä HIV:n hoi- tamiseksi tai ehkäisemiseksi. Keksinnön yhtenä muuna tavoitteena on vielä mainitun vektorin käyttö HIV:n vastaisen DNA-immunisointirokotteen valmistamiseksi. Keksinnön yhteenveto 30 Tämän keksinnön tavoitteet voidaan saavuttaa sisällyttämällä hete- - rologinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia, vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen El-geenin ja E2-geenin, papilloomaviruksen minimaalisen replikonin ja papilloomaviruksen minikromosomaalisen ylläpitoelementin.

7 105105 Keksintö koskee toisin sanoen itsereplikoivaa rekombinanttivektoria, joka käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennaisesti (i) papilloomaviruksen E1-geenistä ja E2-geenistä, 5 (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja ja (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementistä, heterologisen nukleotidisekvenssin, joka koodittaa HIV- säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista frag- 10 menttia. Keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön HIV:n vastaiseen DNAimmunisointiin tarkoitetun rokotteen, joka käsittää mainittua vektoria, mainitun vektorin käytön HIV:n vastaisen rokotteen valmistamiseksi ja menetelmän HIV:n hoitamiseksi tai ehkäisemiseksi, jossa annetaan tämän tarpeessa ole- 15 valle henkilölle vaikuttava määrä itsereplikoivaa vektoria ja saatetaan NEF-, REV- tai TAT-proteiini tai niiden immunologisesti aktiivinen fragmentti ilmentymään mainitussa henkilössä. Keksintö tarjoaa vielä käyttöön menetelmän itsereplikoivan vektorin valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavaa: 20 A) insertoidaan heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia, vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennaisesti - (i) papilloomaviruksen E1-geenistä ja E2-geenistä, 25 - (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja tä, ja - (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementis- B) transformoidaan isäntäsolu tuloksena olevalla itsereplikoivalla rekombinattivektorilla, 30 C) viljellään isäntäsolua ja D) otetaan talteen mainittu vektori. täsolun. Keksintö tarjoaa käyttöön myös mainittua vektoria käsittävän isän- Piirustusten lyhyt kuvaus 35 Kuvio 1A esittää sukkulavektoria pue83. Kuvio 1B esittää sukkulavektoria pnp177.

8 105 105 Kuvio 2 esittää keksinnön mukaista pbntkrev-plasmidia. Kuvio 3 esittää keksinnön mukaista pbnsratat-plasmidia. Kuvio 4 esittää keksinnön mukaista pbnsranef-plasmidia. Kuvio 5 esittää NEF-ilmentymistä pbnsranef:ilä transfektoiduissa 5 COS-7-soluissa. Western blot -näytteet on otettu 72 tunnin kuluttua transfektiosta ja tehty näkyviksi ECL:11ä. Kuvio 6 esittää anti-nef-vasta-aineita pbnsranef:ilä immunisoitujen hiirten seerumissa detektoituina Western blot -menetelmällä. Näytteet 1-4 otettiin 2 viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista ja näytteet 5-8 otettiin 4 10 viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista. Kuvio 7 esittää pbnsranef-vektorilla immunisoitujen hiirten CTLvasteita. Kuvio 7A esittää CTL-vasteita, ilmaistuina kohdesolujen prosentuaalisena spesifisenä lyysinä, neljässä hiiressä, jotka testattiin kanden viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista. Kuvio 7B esittää näitä arvoja neljän viikon 15 kuluttua viimeisestä immunisoinnista. Spesifistä lyysiä >4 % pidetään positiivisena tuloksena. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Heterologinen HIV-nukleotidisekvenssi insertoidaan keksinnön mukaisesti vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen El-geenin ja E2-geenin, 20 papilloomaviruksen minimaalisen replikonin (MO) ja papilloomaviruksen minikromosomaalisen ylläpitoelementin (MME). Tätä E1/E2/MO/MME:n käsittävää vektoria kutsutaan tästedes pbn:ksi, ja sitä on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa WO 97/24 451, johon viitataan. Mainittu patenttijulkaisu perustuu siihen havaintoon, ettei MO:sta käsin tapahtuva DNA-replikaatio sinänsä riitä 25 papilloomaviruksissa stabiiliin pitkäaikaiseen säilymiseen vaan tarvitaan toista virussekvenssiä MME ja että parhaat tulokset saadaan, kun vektori käsittää lisäksi papilloomaviruksen E1- ja E2-geenit. "Papilloomavirus" tarkoitta tässä käytettynä mitä tahansa papilloomavirusryhmän jäsentä. Keksinnön yhteydessä käytettävä papilloomavirus on 30 edullisesti naudan papilloomavirus (BPV) tai ihmisen papilloomavirus (HPV). " ja "E2" ovat papilloomavirusten säätelyproteiineja, jotka replikoivat MO:n kautta ja ovat välttämättömiä replikaatiolle. "Minimaalinen replikoni" ("minimal origin of replication", MO) on papilloomaviruksen hyvin pieni sekvenssi, joka on välttämätön DNA-synteesin 35 käynnistymiselle.

9 105 105 "Minikromosomaalinen ylläpitoelementti" ("minichromosomal maintenance element", MME) tarkoittaa papilloomavirusgenomin aluetta, johon sitoutuu papilloomaviruksen replikaatiolle välttämättömiä virus- tai ihmisproteiineja. MME on välttämätön papilloomavirus-mo:n stabiilille episomaaliselle yl- 5 läpidolle isännässä. MME käsittää edullisesti useita sitoutumiskohtia transkriptioaktivaattoriproteiinille E2. "Itsereplikoiva vektori" tarkoittaa tässä hakemuksessa käytettynä vektoriplasmidia, joka kykenee autonomiseen replikaation eukaryoottisessa isäntäsolussa. 10 "Heterologinen" tarkoittaa vierasta. Esimerkeiksi keksinnön mu- kaisten vektoreiden suhteen heterologinen nukleotidisekvenssi tarkoittaa eipapilloomasekvenssiä. "Immunologisesti aktiivinen fragmentti" tarkoittaa fragmenttia, jolla on kyky herättää immunologinen vaste vastaanottajassa. 15 "Papilloomaviruksen nukleotidisekvenssit, jotka koostuvat olennai- sesti" tarkoittaa, että vektori käsittää papilloomanukleotidisekvenssit, jotka ovat välttämättömiä ja riittäviä vektorin pitkäaikaiselle säilymiselle ja replikaatiolle. Tämä tarkoittaa esimerkiksi sitä, että ylimääräiset sekvenssit, kuten kaikki papilloomaviruksessa kooditettuina olevat onkogeeniset sekvenssit, on poistettu 20 tämän keksinnön yhteydessä käytetyistä pbn-vektoreista. El- ja E2-geenien, MO:n, MME:n ja NEF-, REV- tai TAT-geenin lisäksi keksinnön mukaiset vektorit käsittävät promoottoreja kooditettuja proteiineja varten samoin kuin lisäksi säätelysekvenssejä, polyadenylaatiosekvenssejä ja introneja. Vektorit sisältävät edullisesti myös bakteeri-isäntäsolun repii- 25 konin ja yhden tai useamman valikointimarkkerigeenin vektori-dna:n valmistamiseksi bakteeri-isäntäsolussa. Yksi pbn-vektoreiden olennainen piirre on, että ne eivät ole isäntäsoluspesifisiä. Tämä johtuu siitä, että El- ja E2-proteiinien ilmentymistä säätelevät promoottorit, jotka eivät ole luontaisia, ts. ovat heterologisia. Mai- 30 nitut promoottorit ovat joko toimivia laajasti nisäkässoluissa tai -kudoksissa tai solu- tai kudosspesifisiä. Esillä olevan keksinnön mukaisissa vektoreissa El-geeni on edullisesti sr-a-promoottorin tai tymidiinikinaasipromoottorin (tk) ohjauksessa ja E2- geeni on edullisesti LTR-gag-promoottorin ohjauksessa. NEF-, REV- tai TAT- 35 geeni voi olla CMV-promoottorin tai RSV-LTR-promoottorin ohjauksessa. Vektori voi käsittää lisäksi SV40:n varhaisen promoottorin antibioottivalikoinnin

10 105 105 (neomysiini tai kanamysiini) mandollistavan geenin ilmentymisen käynnistämiseksi. Isäntäsolun replikoni on keksinnön mukaisissa vektoreissa edulli- sesti puc-ori ja käytetyt valikointimarkkerit ovat esimerkiksi kanamysiini- 5 ja/tai neomysiinimarkkereita. lntroni on edullisesti beeta-globiini-ivs. TK-promoottoripohjaisissa plasmideissa esiintyvä oktasekvenssi on oktameerisen proteiinin koodittamaton sekvenssi. Sillä ei ole toiminnallista tarkoitusta plasmidissa, mutta sitä tarvittiin sopivien restriktiokohtien luomiseksi lopullisten plasmidien valmistamista varten. 10 Plasmidiin pbn insertoitavat NEF-, REV- tai TAT-geenit voidaan saada useista kaupallisista lähteistä, kuten plasmidista pkp59, jota on saatavissa tallennuspaikasta AIDS Reagent Project MHC. Mainitut geenit ovat yleisesti tunnettuja, ja ne on sekventoitu täydellisesti [Wain-Hobson et al., Cell 40 (1985) 9-17]. On tietenkin myös mandollista insertoida vain mainittujen HIV- 15 proteiinien immunologisesti aktiivista fragmenttia koodittava sekvenssi. NEF-, REV- tai TAT-geenit tai niiden fragmentit insertoidaan ensin sopiviin sukkulavektoreihin. Nämä vektorit voivat sisältää MO-alueen tai olla sisältämättä sitä. Esimerkeissä valaistaan kahta sukkulavektoria: pnp177:ää, joka ei sisällä MO:ta, ja pue83:a, joka sisältää MO:n. On tietenkin mandollista 20 käyttää muitakin sukkulavektoreita. Sekä sukkulavektoreita että tuloksena olevia keksinnön mukaisia vektoreita lisätään edullisesti Escherichia colissa. Esimerkkejä tuloksena olevista esillä olevan keksinnön mukaisista pbn-nef-, pbn-rev- tai pbn-tat-vektoreista esitetään kuvioissa 2, 3 ja 4. Keksinnön mukaiset vektorit ovat stabiileja ja itsereplikoivia suurina kopiomäärinä. Euka- 25 ryootti-isäntäsolun trasfektoinnin jälkeen vektori (plasmidi) monistuu ja tuottaa 100-1000 -kertaisen määrän uusia plasmideja, joista kukin pystyy ilmentämään haluttua HIV-proteiinia. Tämän keksinnön patenttivaatimusten mukainen isäntäsolu voi olla joko vektorilla transfektoitu eukaryoottisolu tai vektorilla transformoitu prokary- 30 oottisolu. Eukaryoottisolu on edullisesti nisäkässolu ja prokaryoottisolu on edullisesti bakteerisolu, erityisesti E. coli. Tuloksena olevien esillä olevan keksinnön mukaisten plasmidivekto- rien HIV-NEF:n, -REV:n ja -TAT:n ilmentymistä testattiin sekä transfektoiduis- sa COS-7-soluissa että mainituilla plasmideilla immunisoiduissa hiirissä. HIV- 35 proteiinien voimakas ilmentyminen oli osoitettavissa COS-7-soluissa, ja immu- nisoiduissa hiirissä esiintyi huomattava humoraalinen ja soluvälitteinen (CTL)

11 1 05105 immuunivaste. Nämä tulokset osoittavat, että keksinnön mukaisilla vektoreilla on potentiaalisesti käyttöä tehokkaina HIV:n vastaisina rokotteina. Esillä olevaa keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä. Esimerkit kuvaavat yksityiskohtaisesti keksinnön joitakin suoritusmuo- 5 toja, mutta niiden ei tulisi tulkita rajoittavan keksintöä, jonka määrittelevät oheiset patenttivaatimukset. Esimerkki 1 HIV-1-geenien REV ja TAT kloonaaminen itserepiikoiviin pbnsr-a- ja pbntk-plasmideihin 10 pbntkrev:n ja pbnsratat:n tuottaminen Vaihe 1: Eristetystä kannasta BRU, jota kutsutaan myös LAI:ksi, peräisin olevia HIV-1:n REV- ja TAT-geenejä [Wain-Hobson et al., Cell 40 (1985) 9-17] monistettiin pcrev- ja pctat-vektoreista käsin [Arya et al. Science 229 15 (1985) 69-73] käyttämällä Dynazyme Taq -DNA-polymeraasia (Finnzymes, Suomi) ja seuraavia alukkeita, joissa on restriktioentsyymikohdat entsyymejä Xhol ja Xbal varten: REV: 5'-TTTTTCTAGAACCATGGCAGGAAGAAGCGGA-3' 20 5'-TTTTCTCGAGCTATTCMAGTTCCTGG-3' TAT: 5'-11111CTAGAACCATGGAGCCAGTAGATCCT-3' 5'-TTTTCTC GAG CTAATCGAACG GATCTG C-3' 25 Monistettuja geenejä ja sukkulavektoria pue83 (kuvio 1) pilkottiin lämpötilassa +37 C Xbal:llä ja Xhol:Ilä (New England Biolabs, USA) yön yli yhteensopivien päiden aikaansaamiseksi. Pilkotut DNA-fragmentit analysoitiin 1,5-prosenttisilla agaroosigeeleillä ja jatkopuhdistettiin käyttämällä Band Prep 30 Kit -välineistöä (Pharmacia Biotech, Ruotsi). Kukin geeni ligatoitiin vektoriin erikseen käyttämällä T4-DNA-ligaasia (New England Biolabs, USA) tehden inkubointi yön yli lämpötilassa +16 C. Ligaatiotuotteilla transformoitiin kompetentit E. coli solut (One Shot Kit; Invitrogen, Alankomaat), jotka siirrostettiin LB-maljoille, jotka sisälsivät kanamysiiiniä valikointia varten. Kasvavista kloo- 35 neista tehtiin miniprep-preparaatit ja kloonattujen geenien läsnäolo analysoitiin pilkkomalla Xhol:llä ja Xbal:llä. Kloonattujen geenien läsnäolo varmistettiin

12 1 05105 myös PCR:11ä, joka tehtiin miniprep-preparaatista lähtien käyttämällä edellä mainittuja alukkeita. Oikean geenin sisältäviä klooneja massaviljeltiin ja piasmidit puhdistettiin käyttämällä Megaprep-pylväitä (Qiagen, Saksa). Vaihe 2: 5 DNA-fragmentti, joka sisälsi BPVori:n, RSV-LTR-promoottorin, REV- tai TAT-geenin ja b-globiini-ivs-poly(a):n pilkottiin irti sukkulavektorista Hind111:11a (New England Biolabs, USA) ja puhdistettiin käyttämällä 1- prosenttista agaroosigeeliä ja Band Prep Kit -välineistöä. Ligaatio Hind111- pilkottuun ja defosforyloituun (alkalinen fosfataasi, CIP, Promega, USA) plas- 10 midiin pbnsra tai pbntk, solujen transformointi, kloonatun geenin läsnäolon tarkistus ja plasmidin puhdistus tehtiin kuten vaiheessa 1. Tuloksena olevia plasmideja kutsutaan pbntkrev:ksi ja pbnsratat:ksi ja ne esitetään kuvioissa 2 ja 3. Esimerkki 2 15 HIV-1:n NEF: n kloonaaminen itsereplikoivaan pbnsraplasmidiin pbnsranef:n tuottaminen Vaihe 1: HIV-1:n NEF-geeni saatiin plasmidi pcnef vektorista, joka sisälsi 20 LAI-isolaatin NEF-geenin insertoituna pctat-vektoriin, josta puuttuu TATgeeni. Jatkokloonaukseen käytetty NEF-geeni saatiin 1,3 ke:n fragmenttina pcnef:stä Spel- ja Hind111-pilkonnalla. Jotta eliminoidaan Hindlll-kohdan uudelleenmuodostuminen ligaatiossa, fragmentti käsiteltiin HindIII-pilkkomisen jälkeen Klenow-entsyymillä ja nukleotidien datp, dctp ja dgtp seoksella, 25 minkä jälkeen tehtiin Spel-pilkkominen. Saadut fragmentit erotettiin elektroforeettisesti 1-prosenttisella agaroosigeelillä standardikokomarkkerien rinnalla. Kooltaan oikeat vyöhykkeet leikattiin irti ja DNA otettiin talteen käyttämällä Sephaglas Bandprep Kit välineistöä (Pharmacia Biotech) valmistajan ohjeen mukaan. 30 Kuvion 1B mukainen sukkulavektori pnp177 pilkottiin ensin Xhol:11ä, käsiteltiin sitten Klenow-entsyymillä ja dntp-seoksella ja pilkottiin lopuksi Xbal:11ä. Vektori käsiteltiin myös vasikan suoliston alkalisella fosfataasilla (CIP). NEF-geenin sisältävä fragmentti ligatoitiin pilkotun pnp177-vektorin 35 kanssa käyttämällä T4-ligaasia lämpötilassa +14 C yön yli. Transformointiin käytettiin kompetenttia E. colia (One Shot; lnvitrogen). Positiiviset kloonit iden-

13 105 105 tifioitiin käyttämällä restriktioentsyymipilkkomisia ja elektroforeesia. Plasmidi- DNA:ta monistettiin edelleen E. colissa ja se puhdistettiin laajassa mitassa Qiagen-kolonneilla. Tuloksena oleva lopullinen piasmidi nimettiin pnp177chivnef:ksi. 5 Vaihe 2: Sukkulavektori pnp177 on suunniteltu sisältämään vain kaksi HindIII-kohtaa, joiden väliin voidaan kloonata insertti. Plasmidin HindIII-pilkonta antaa siten tulokseksi fragmentin, joka voidaan kloonata edelleen. pnp177chivnef:n Hindlll-fragmentti kloonattiin pbnsra:aan. Tämä vektori 10 pilkottiin Hind111:11a ja käsiteltiin CIP:11ä. Käytettiin samoja vyöhykkeidenerotus-, ligaatio- ja transformointimenetelmiä kuin ensimmäisessä vaiheessa ja insertin oikea orientaatio varmistettiin restriktioanalyysillä. Lopullinen piasmidi nimettiin pbnsranef:ksi ja se esitetään kuviossa 4. Esimerkki 3 15 HIV-Nef-ilmentymisen osoittaminen in vitro 3A. Transfektiot Esimerkkien 1 ja 2 pbn-konstruktioiden ilmentymisen testaamiseksi niillä transfektoitiin COS-7-solut käyttämällä elektroporaatiota. 10 gg vertailuplasmidia pbni3-gal ja 10 i.tg plasmidia pbn-nef kotransfektoituna 11.1g:n 20 kanssa plasmidia pcmvf3-gal siirrettiin kukin elektroporaatiolla kolmeen miljoonaan soluun. Käytettiin lohenmaitikantaja-dna:ta. Elektroporaatio tehtiin kapasitanssilla 960 mf ja jännitteellä 260 V. Tehtiin proteiinipitoisuus- ja p-galaktiivisuusmittauksia transfektiotehokkuuden kontrolloimiseksi ja lysaattien määrän kalibroimiseksi Western blot -määrityksessä. 25 3B. Immuunihistokemia ja Western blot -määritys Talteen otetut pbn -konstruktioilla transfektoidut solut lysoitiin käytettäviksi Western blot -määrityksessä. Lyysin jälkeen proteiininäytteet keitettiin näytepuskurissa, käsiteltiin 12-prosenttisessa SDSpolyakryyliamidigeelissä ja siirrettiin sitten 2 grn:n nitroselluloosasuodattimelle, 30 joka suojattiin liuoksella, joka sisälsi 5 % maitoa TBS:ssä. Primaarisena vastaaineena käytettiin hiiren monoklonaalisten anti-nef:ien seosta [V. Ovod et al., AIDS 6 (1992) 25 34], joista kukin laimennettiin suhteessa 1:1000. Sekundaarinen vasta-aine oli biotinyloitu hiiren vastainen vasta-aine laimennettuna suhteessa 1:500. 35 COS-7-solujen transfektoinnin jälkeen vektorit saivat aikaan voi- makkaan tilapäisen HIV-säätelyproteiini-ilmentymisen detektoituna lysoitujen

14 1 05105 solujen Western blot määrityksellä 72 tunnin kuluttua. Plasmidilla pbnsranef saadut tulokset esitetään kuviossa 5. Transfektoitujen solujen pitkäaikaisviljelyissä NEF-ilmentyminen kesti 7 viikkoon asti itsereplikoivalla pbnvektorilla transfektoiduissa soluissa. 5 NEF-transfektoituja soluja käytettiin myös sytospin-preparaattien valmistukseen, ne värjättiin hematoksyliinillä ja käytettiin monoklonaalista NEF:n vastaista vasta-ainetta, jota seurasi sekundaarinen biotinyloitu hiiren vastainen vasta-aine, immuunihistokemiallisessa tutkimuksessa Ovodin et al. (supra) kuvaamalla tavalla. Sytospin-levyt osoittivat ilmentymistä, koska positiivinen värjäytyminen nähtiin suuressa määrässä soluja solun sytoplasman täyttävinä jyväsinä. Osassa NEF:ää ilmentävistä soluista esiintyi morfologisia merkkejä solutuhosta, mikä on osoitus apoptoosista. Ilmentymistaso oli silti korkea, vaikka solujen tila oli huononemassa. Esimerkki 4 15 pbnsra- ja pbntk-vektorin HIV-Nef-, HIV-Tat- tai HIV-Revilmentymisen immunogeenisyyden osoittaminen in vivo 4A. Geenitykki DNA saostettiin 1 pm:n kultahiukkasille käyttämällä spermidiiniä ja CaCl 2:a noudattaen käyttöohjeessa Helios Gene Gun Instruction Manual (Bio- 20 Rad Laboratories) esitettyä menettelyä. Kukin patruuna tehtiin 0,5 gg kultaa ja 1 gg DNA:ta sisältäväksi. DNA:n määrää kontrolloitiin spektrofotometrisesti käyttöohjeessa neuvotulla tavalla. lnokuloinnit tehtiin käyttämällä Helios Gene Gun System -järjestelmää (Bio-Rad Laboratories). Heliumpurkauspaine DNA:n viemiseksi kohteeseen säädettiin arvoon 2070 kpa (300 psi). Optimoides- 25 samme pommitusolosuhteita havaitsimme, että 2070 kpa (300 psi) riittää sinkoamaan kultahiukkaset ihoon. 4B. Immunisoinnit Käytettiin 6-8 viikon ikäisiä balb/c-naarashiiriä. Hiiret nukutettiin ja vatsapuolelta poistettiin karvat ennen immunisointeja. 30 Inokuloinnit tehtiin 8 hiiren vatsan iholle päivinä 1, 2, 3, 10, 1 1 ja 12 käyttämällä edellä kuvattua geenitykkiä ja noudattamalla valmistajan ohjeita. Annettiin yhteensä 6 gg pbn-nef:ää hiirtä kohden. Kummastakin ryhmästä lopetettiin neljä hiirtä kanden viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista ja loput neljä hiirtä neljän viikon kuluttua viimeisestä immunisoinnista.. Otettiin see- 35 ruminäytteet Western blot määritystä varten ja kerättiin splenosyyttejä CTLmääritystä varten. Kaikilla kandeksalla hiirellä, jotka oli immunisoitu pbn-nef-

15 10510 5 vektorilla, ilmeni vasta-ainevaste 2 ja 4 viikon kuluttua (kuvio 6). Reaktion intensiteetti vaihteli Westem blot määrityksessä. 4C. Sytotoksisen T-soluaktiivisuuden mittaaminen immunisoi duissa hiirissä 5 4C1. Efektorisolujen stimulaatio Poistettiin aseptisesti pemat immunisoiduista hiiristä kanden (16 hiirtä) ja neljän viikon (16 hiirtä) kuluttua immunisoinnista. Ne rikottiin Hanksliuoksessa, suodatettiin harson läpi ja poistettiin erytrosyytit. Soluja suspendoitiin sitten 5.10 6/ml seuraavaan kasvualustaan: RPMI-alusta, joka sisältää 10 10 % naudan sikiöseerumia (FCS; GibcoBRL), 1 % glutamiinia, 100 yksikköä penisilliiniä/ml, 100 (pg streptomysiiniä/ml ja 5.10-6 mo1/1 2-merkaptoetanolia. Reagoivia soluja (5.106) viljeltiin 25 ml:n soluviljelypullossa 5 ml:ssa kasvualustaa yhdessä 4.10 6 solun kanssa, joilla esiintyy antigeeniä (APC:t; katso jäljempänä) viisi vuorokautta. Soluihin lisättiin ensimmäisenä päivänä 10 yk- 1 5 sikköä/ml rekombinatti-interleukiini-2:a (ril-2) [J. Hiserodt et al., J. Immunol. 135, nro 1 (heinäkuu 1985) 53-59; M. Lagranderie et al., J. Virol. 71, nro 3 (maaliskuu 1997) 2303 2309; T. Tsuji et al., Immunology 90, nro 1 (tammikuu 1997) 1-6; H. L. Vahlsing et al., Joumal of lmmunological Methods 175 (1994) 11-22; K. Varkila et al., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. 20 Sect. C 95 (1987) 141-148]. 4C2. Solut, joilla esiintyy antigeeniä Infektoitiin syngeneeisiä P815-mastosytooma (H-2d) soluja muun- netulla lehmänrokkoviruksella Ankara (MVA), joka oli muunnettu ilmentämään HIV-1 LAI:n NEF-geeni (MVA-HIVNEF). MVA on voimakkaasti heikennetty, 25 replikaation suhteen puutteellinen lehmänrokkovirus, joka voi toimi tehokkaana vektorina heterologisten geenien ilmentämiseksi ja tarjoaa poikkeuksellisen korkean biologisen turvallisuustason [G. Sutter et al., J. Virol 68, nro 7 (heinäkuu 1994) 4109-4116; Sutter et al., Vaccine 12, nro 11 (1994) 1032-1039; I. Drexler et al., J. Gen. Virol. 79 (1998) 347-352; G. Sutter et al., Proc. 30 Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10847-10851]. Infektoinnit MVA-HIVNEF:Ilä tehtiin infektointikertoimella (MOI) 5 24-syvennyksisissä kuoppalevyissä (1.10 6 soluja inkuboitiin 15 tuntia lämpötilassa +37 C [A. Carmichael et al., Journal of Virology 70 (1996) 8468-8476]. Solut pestiin infektoinnin jälkeen kandesti 35 PBS:Ilä (fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella), joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja suspendoitiin tähän liuokseen pitoisuudeksi 5.10 6 solua/mi. Sitten solua/syvennys). Kun virus oli absorboitunut 1 tunnin lämpötilassa +37 C,

16 10 5 1 05 solut gammasäteilytettiin annoksella 5000 rad ja pestiin kasvualustalla ennen lisäämistä reagoiviin soluihin. 4C3. Sytotoksisuusmääritykset CTL-aktiivisuus testattiin 'Cr-vapautusmäärityksellä [J. Hiserodt et 5 al., J. Immunol. 135, nro 1 (heinäkuu 1985) 53-59; M. Lagranderie et a/., J. Virol. 71, nro 3 ( maaliskuu 1997) 2303 2309; K. Varkila et al., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 95 (1987) 141 148; C. Van Baalen et al., AIDS 7 (1993) 781 786]. Lyhyesti esitettynä 2.10 6 P-815-solua infektoitiin MVA-HIVNEF:11ä, kuten kuvattiin edellä solujen yhteydessä, joilla esiintyy anti- 10 geeniä. Solut pestiin infektoinnin jälkeen kerran seerumittomalla kasvualustalla. Kohdesolut suspendoitiin sitten 200 gl:aan seerumitonta kasvualustaa ja lisättiin 100 gci 51 Crä (Amersham)/1.10 6 solua 1 tunnin ajaksi lämpötilassa 37 C. Kohdesolut pestiin sitten neljästi alustassa ja suspendoitiin pitoisuudeksi 5.10 4 solua/ml. Stimuloidut efektorisolut pestiin kerran kasvualustassa en- 15 nen lisäämistään kohdesoluihin. Kohdesoluja siirrostettiin u-pohjaiseen 96- syvennyksiseen kuoppalevyyn 100111 (5.10 3) syvennystä kohden ja efektorisoluja lisättiin kolmena rinnakkaisnäytteenä 100 gl:ssa alustaa käyttäen efektori:kohde-suhteita 50, 25 ja 12,5. Spontaania vapautusta varten kohdesoluja siirrostettiin kuuteen syvennykseen 1001.11:ssa alustaa ja maksimivapautusta 20 varten kuuteen syvennykseen 2,5-prosenttisessa Triton-X-100-liuoksessa. Levyjä sentrifugoitiin lyhyesti, inkuboitiin 4 tuntia lämpötilassa 37 C ja tehtiin supernatanteille laskenta gammalaskurissa. Kohdesolujen prosentuaalinen spesifinen lyysi laskettiin kaavalla (testi- 51 Cr-vapautus - spontaani vapautus)/(maksimivapautus - spontaani vapautus) 100. Prosentuaalisen spesifisen 25 lyysin % katsottiin olevan positiivinen. Yksi esimerkki, joka osoittaa CTL-aktiivisuuden kuudessa kandeksasta pbnsranef:llä immunisoidusta hiirestä, esitetään kuviossa 7. D. Humoraalinen immuunivaste immunisoiduissa hiirissä Jotta saataisiin testatuksi HIV-1:n NEF:n vastaisten vasta-aineiden 30 esiintyminen immunisoitujen hiirten seerumissa, NEF-proteiini käsiteltiin elektroforeettisesti PAGE:11a, siirrettiin nitroselluloosasuodattimille ja detektoitiin vasta-ainereaktiivisuus edellä kuvatulla tavalla. Yhteenveto tuloksista Transfektio- ja immunisointitestien tulokset on koottu taulukkoon 1. 35 Immunisoiduissa hiirissä esiintyvä immuunivaste arvioitiin immuunitäplämäärityksellä (WB) humoraalisen ja sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) määrityk-

17 105105 sellä soluvälitteisen immuniteetin ollessa kyseessä. Kuten taulukosta nähdään, kaikissa kandeksassa NEF:ää ilmentävällä vektorilla immunisoidussa hiiressä esiintyi sekä humoraalinen että soluvälitteinen immuunivaste. Taulukko 1 5 HIV-1:n NEF-, TAT- ja REV-proteiinien ilmentymisen osoittaminen mainituilla vektoreilla transfektoiduissa COS-7-soluissa immuunitäpiämäärityksellä (Western blotting, WB) tai immuunihistokemiallisesti ja humoraalisen ja soluvälitteisen immuunivasteen indusoitumisen osoittaminen yhdellä vektoreista, pbnsranef:llä, immunisoiduissa hiirissä 10 Transfektio Immunisointi WB Immuunihistokemia WB CTL pbnsratat ND ++ 6/8 6/8 pbntkrev ++ 7/8 7/8 pbnsranef ++ ND 6/8 6/8 Osoitamme tässä tutkimuksessa, että DNA-immunisointi käyttämällä kuvatun kaltaista itsereplikoivaa ilmentämisvektoria voi indusoida selvästi havaittavissa olevan CTL-vasteen hiirissä. Lisäksi saavutettiin humoraa- 15 linen immuunivaste. Edellä esitettyjen tulosten valossa on mandollista olettaa, että pbn-nef-, pbn-rev- ja pbn-tat-plasmidit ilmentävät NEF-, REV- ja TAT-proteiineja in vivo määrinä, jotka riittävät indusoimaan sekä humoraalisen että soluvälitteisen immuunivasteen, joka on välttämätön HIV:n ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi.

18 Patenttivaatimukset 1. Itsereplikoiva rekombinanttivektori, tunnettu siitä, että se käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennai- 5 sesti ja (i) papilloomaviruksen El-geenistä ja E2-geenistä, (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementistä, 10 heterologisen nukleotidisekvenssin, joka koodittaa HIV- säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen itsereplikoiva vektori, t u n - nettu siitä, että papilloomavirus on naudan papilloomavirus (BPV). 15 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen itsereplikoiva vektori, tunnettu siitä, että heterologinen nukleotidisekvenssi koodittaa HIV-1:n NEF-proteiinia. 4. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen itsereplikoiva vektori, tunnettu siitä, että E1 on sra-promoottorin tai tymidiiniki- 20 naasipromoottorin ohjauksessa. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen itsereplikoiva vektori, t u n - nettu siitä, että se on kuviossa 2, 3 tai 4 esitetyn kaltainen pbntkrev, pbnsratat tai pbnsranef. 6. Rokote HIV:n vastaista DNA-immunisointia varten, tunnettu 25 siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaista itsereplikoivaa vektoria. 7. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen itserepiikoivan vektorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavaa: 30 A) insertoidaan heterologinen nukleotidisekvenssi, joka koodittaa HIV-säätelyproteiinia NEF, REV tai TAT tai niiden immunologisesti aktiivista fragmenttia, vektoriin, joka käsittää papilloomaviruksen nukleotidisekvenssejä, jotka koostuvat olennaisesti - (i) papilloomaviruksen El-geenistä ja E2-geenistä, 35 - (ii) papilloomaviruksen minimaalisesta replikonista ja

19 1 05105 - (iii) papilloomaviruksen minikromosomaalisesta ylläpitoelementistä, ja B) transformoidaan isäntäsolu tuloksena olevalla itsereplikoivalla rekombinattivektorilla, 5 C) viljellään isäntäsolua ja D) otetaan talteen mainittu vektori. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että isäntäsolu on E. coli -solu. 9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen itsereplikoi- 113 van vektorin käyttö HIV:n vastaisen DNA-immunisointirokotteen valmistamiseksi. 10. Isäntäsolu, t u n n ettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukaista itserepiikoivaa vektoria. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntäsolu, t u n n e t t u 15 siitä, että se on bakteerisolu tai nisäkässolu.

20 105 705 Patentkrav 5 av 1. Självreplikerande rekombinant vektor, kännetecknad av att den innehåller papillomavirus nukleotidsekvenser, vilka väsentiigen består och (i) en papilloma-virus E1 gen och E2 gen, (ii) en minimal repiikon av papillomavirus och (iii) ett minikromosomait upprätthållningselement av papillomavirus, 10 en heterolog nukleotidsekvens, som kodar det regulatoriska protei- net NEF, REV eller TAT eller immunologiskt aktiva fragment därav. 2. Självreplikerande vektor enligt patentkrav 1, känneteckn a d av att papillomaviruset är papillomavirus av nöt (BPV). 3. Sjävreplikerande vektor enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e- 15 t e c k n a d av att den heterologa nukleotidsekvensen kodar NEF-proteinet av HIV-1. 4. Självreplikerande vektor enligt vilket som helst av de föregående patentkraven, kännetecknad av att E1 kontrolleras av sra-promotorn eller tymidinkinaspromotorn. 20 5. Självreplikerande vektor enligt patentkrav 4, k ä n n et e c k- n a d av att den är den i figur 2, 3 eller 4 angivna pbntkrev, pbnsratat eller pbnsranef. att 6. Vaccin för DNA-immunisation mot HIV, kännetecknat av 25 det innehåller en självreplikerande vektor enligt vilket som helst av patentkraven 1-5. 7. Förfarande för framställning av en självreplikerande vektor enligt vilket som helst av patentkraven 1-5, kännetecknat av att förfarandet omfattar följande: 30 A) en heterolog nukleotidsekvens, som kodar det regulatoriska proteinet NEF, REV eller TAT eller immunologiskt aktiva fragment därav, sätts in i en vektor som innehåller papillomavirus nukleotidsekvenser som väsentiigen består av - (i) en papilloma-virus E1 gen och E2 gen, 35 - (ii) en minimal repiikon av papillomavirus och

21 105105 - (iii) ett minikromosomalt upprätthållningselement av papillomavirus, och B) en värdcell transformeras med den resulterande självreplikerande rekombinanta vektorn, 5 C) värdcellen odias, och D) vektorn tas tillvara. 8. Förfarande enligt patentkrav 7, k ä n n e t e c k n a t av att värdcellen är en E.co/i-cell. 9. Användning av en självreplikerande vektor enligt vilket som helst 10 av patentkraven 1-5 för framställning av ett DNA-immunisationsvaccin mot HIV. 10. Värdcell, kännetecknad av att den innehåller en självreplikerande vektor enligt vilket som helst av patentkraven 1-5. 11. Värdcell enligt patentkrav 10, kännetecknad av att den 15 är en bakteriecell eller en däggdjurscell.

105 '105 Kuvio la,hindm.233 BPVI URR.XbaI, 1236 S,Sa11,1310 AmpR RSV LTR.Sa11,1901 S,Xbal,.1907 am.t1l 1923 7005,Kpal 6999,HindM 6993,KpnI: Y r pue83 9423 ep beetagalaktosidaasi beeta-globiiniintroni 4983,XboT

105105 Kuvio 1B del 0.18 I I 0.25 cor 1 0.40 ac I :0.40 ind III 0,41 Bgl 1 7.5 Ap Hind III 6.16 Sph 16.16 Pst I 6.15 Sai 1 6.14 ORI RSV LTR pnp1 77 8.40 ke beeta-globiini- IVS-p(A) Xho 1 2.31 EcoR 12.51 beeta-gal Sai 14.96 Xba 1 4.91 BamH 1 4,89 Sac 1 3.51

Kuvio 2 105705 H/nd III TK BPV ORI RSV LTR EiFtv Ei Xba I HIV Rev CDNA Xho 1 poiy (A) beeta-globiini-ivs-poly)a) LTR puc ORI Neo / Ken R s v 4 0 varhainen BPV E2 LTR / 9 3 9 Hlnd 111

Kuvio 3 105 105 /nd III sr -alfa BPV ORI RSV LTR Xba 1 BPv Ei HIV Tat oona Xha 1 beeta-globiini-ivs-poly(a) oct seq HInd II I poly (A) LTR / gag LTR puc ORI Neo / Ken FI S V 4 o varhainen BPV E2

Kuvio 4 105'105 SR-alfa-prom. MInd III 191 RSV LTR CMV prom. HIV N I cona sac I 0 stel BPV Ei sam HI 123110) beeta-globiini-ivs-p(a) p(a) BPV ORI p(a) LTR hired III 1*320) LTR 1;1 11 9 BPV E2 SV4 varhainen prom. puc ORI Neo / Ken R

LC) CZ).11.ek,N '0</. 00 111 et M O 1. II

Kuvio 7 105 705 A 20,, 18-0 te. 1L 0 12-5, 10 ") e Ei 474 4 e 1 t0 25 60 elektori/kohde - suhteet B 20 18 - New 6') 14 12 10 cn e o tr-:: 4 a) 2 CL. r.$) 0 1Z6 ZG CO elektori/kohde - suhteet