PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK testiä, joita käytetään Autostainer Link 48 -laitteen kanssa

PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK005 50 testiä, joita käytetään Autostainer Link 48 -laitteen kanssa Sisällysluettelo 1. Käyttötarkoitus...2 2. Yhteenveto ja selitys...2 2.1 Ei-levyepiteeliperäinen NSCLC...2 2.2 Pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpä (SCCHN)...2 2.3 Uroteelikarsinooma...2 2.4 Melanooma...2 3. Menetelmän periaate...2 4. Mukana toimitetut materiaalit...3 5. Tarvittavat materiaalit, jotka eivät sisälly toimitukseen...4 6. Varotoimenpiteet...4 7. Säilytys...5 8. Näytteen valmistelu...5 8.1 Parafiiniin valetut näytteet...5 8.2 Dekalsifioitujen kudosten käyttö...5 8.3 Leikkeiden säilytystä koskevat suositukset...5 9. Reagenssin valmistelu...5 10. Värjääminen Autostainer Link 48 -laitteella...6 11. Laadun valvonta...6 12. Testin verifiointi...6 13. Värjäyksen tulkinta...6 13.1 Värjäyksen tulkinta: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC...7 13.2 Värjäyksen tulkinta: pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpä (SCCHN)...7 13.3 Värjäyksen tulkinta: uroteelikarsinooma...7 13.4 Värjäyksen tulkinta: melanooma...8 14. Aluslasien arviointi...8 15. Rajoitukset...9 15.1 Yleiset rajoitukset...9 15.2 Tuotekohtaiset rajoitukset...10 16. Ei-kliininen tulosten arviointi...10 16.1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n analyyttinen spesifisyys...10 16.2 Normaalit ja neoplastiset kudokset...10 17. Toimivuuden arviointi...12 17.1 Toimivuuden arviointi: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC...12 17.2 Toimivuuden arviointi: SCCHN...16 17.3 Toimivuuden arviointi: UC...17 17.4 Toimivuuden arviointi: melanooma...19 18. Ongelmatilanteet...22 19. Viitteet...22 P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 1/23

1. Käyttötarkoitus In vitro -diagnostiikkaan. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx on kvalitatiivinen immunohistokemiallinen testi, jossa vasta-aineena on Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8. Testi on tarkoitettu PD-L1-proteiinin tunnistamiseen formaliinifiksoidusta, parafiiniin valetusta (FFPE) ei-levyepiteeliperäisen ja eipienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC), pään ja kaulan alueen levyepiteelisyövän (SCCHN), uroteelikarsinooman (UC) ja melanooman kudoksesta käyttämällä Autostainer Link 48 -laitteen EnVision FLEX -visualisointijärjestelmää. PD-L1-proteiiniekspressio määritellään sellaisten arvioitavissa olevien kasvainsolujen osuudeksi, joissa on jonkin asteista osittaista tai täydellistä kalvon värjäytymistä, tietyn tuumorin indikaatioon liittyvien värjäytymisen tulkintaohjeiden mukaisesti. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testillä havaittu PD-L1-ekspressio voidaan liittää ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n ja SCCHN:n kohdalla kasvaneeseen eloonjäämiseen OPDIVO -lääkkeen (nivolumabi) ansiosta. PD-L1-ekspression tunnistus PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testillä voidaan liittää uroteelikarsinooman kohdalla parantuneeseen hoitovasteeseen OPDIVO (nivolumabi) -lääkkeen ansiosta. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testillä havaittua PD-L1-ekspressiota voidaan käyttää melanooman kohdalla apuna arvioitaessa potilaita, joiden kohdalla harkitaan OPDIVO (nivolumabi)- ja YERVOY (ipilimumabi) -yhdistelmähoitoa. 2. Yhteenveto ja selitys Kun PD-1-ligandit PD-L1 ja PD-L2 sidotaan T-solujen PD-1-reseptoriin, estetään T-solujen lisääntyminen ja sytokiinin tuotanto. Joissain tuumoreissa esiintyy PD-1-ligandien lisääntymistä, ja tämän signalointireitin avulla voidaan ehkäistä tuumorien T-solun aktiivisen immuniteetin säilymistä (1). OPDIVO (nivolumabi) on ihmisen immunoglobuliinin G4 (lgg4) monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu PD-1-reseptoriin ja estää sen vuorovaikutuksen PD-L1:n ja PD-L2:n kanssa ja vapauttaa PD-1:n reittivälitteisen immuunivasteen eston, mukaan lukien tuumorin kasvua ehkäisevä immuunivasteen esto (2). Syngeenisissä hiiren tuumorimalleissa PD-1-toiminnan estäminen johti vähentyneeseen tuumorin kasvuun (3). OPDIVO -valmisteen kliininen hyöty ja PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n kliininen käytettävyys on tutkittu NSCLC:n, SCCHN:n, UC:n ja melanooman hoidossa. 2.1 Ei-levyepiteeliperäinen NSCLC PD-L1-ekspression omaavien kasvainsolujen havaitseminen ei-levyepiteeliperäisen ja ei-pienisoluisen keuhkosyövän potilasnäytteestä voi viitata potilaan kasvaneeseen eloonjäämisen mahdollisuuteen OPDIVO (nivolumabi) -hoidon ansiosta. Bristol-Myers Squibbin sponsoroimiin kliinisiin OPDIVO -tutkimuksiin osallistuneiden potilaiden näytteet testattiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testillä. Kliinisessä tutkimuksessa CA209057 tutkittiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testin kliinistä kelpoisuutta PDL1-statuksen arvioinnissa eilevyepiteeliperäistä NSCLC:ää sairastavilla potilailla, joita hoidettiin OPDIVO -valmisteella (5,11). 2.2 Pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpä (SCCHN) PD-L1-ekspression omaavien kasvainsolujen havaitseminen SCCHN-potilasnäytteistä voi viitata potilaan kasvaneeseen eloonjäämisen mahdollisuuteen OPDIVO (nivolumabi) -hoidon ansiosta. Bristol-Myers Squibbin sponsoroimiin kliinisiin OPDIVO -tutkimuksiin osallistuneiden potilaiden näytteet testattiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testillä. Kliinisessä tutkimuksessa CA209141 tutkittiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testin kliinistä kelpoisuutta PDL1-statuksen arvioinnissa SCCHN-potilailla, joita hoidettiin OPDIVO -valmisteella (16). 2.3 Uroteelikarsinooma PD-L1-ekspression omaavien kasvainsolujen havaitseminen UC-potilasnäytteistä voi viitata potilaan parantuneeseen hoitovasteeseen OPDIVO (nivolumabi) -hoidon ansiosta. Bristol-Myers Squibbin sponsoroimiin kliinisiin OPDIVO -tutkimuksiin osallistuneiden potilaiden näytteet testattiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testillä. Kliinisessä tutkimuksessa CA209275 tutkittiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testin kliinistä kelpoisuutta PD-L1-statuksen arvioinnissa UC-potilailla, joita hoidettiin OPDIVO -valmisteella. 2.4 Melanooma Sytotoksinen T-lymfosyyttiin liittyvä antigeeni-4 (CTLA-4) on T-solujen toiminnan negatiivinen regulaattori. YERVOY (ipilimumabi) on monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu CTLA-4:ään ja estää CTLA-4:n vuorovaikutuksen ligandiensa CD80/CD86 kanssa. CTLA-4:n eston on osoitettu lisäävän T-solujen toimintaa ja lisääntymistä, mikä edesauttaa tuumorin kasvua ehkäisevän immuunivasteen yleistä kasvua (4). PD-1 ja CTLA-4 estävät tuumorin kasvua ehkäisevää immuniteettia täydentävien ja ei-redundanttien mekanismien ansiosta. OPDIVO - hoidon sekä OPDIVO - ja YERVOY -yhdistelmähoidon on osoitettu pidentävän etenemättömyysaikaa merkittävästi verrattuna pelkkään YERVOY -hoitoon potilailla, joilla on pitkälle edennyt melanooma ja joita ei ole hoidettu aiemmin (8-10). OPDIVO -valmisteella hoidettujen potilaiden melanoomakasvaimen kudosnäytteet testattiin Bristol-Myers Squibbin sponsoroimissa kliinisissä tutkimuksissa PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n avulla. Kliinisessä tutkimuksessa CA209067 tutkittiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n kliinistä kelpoisuutta PD-L1-ekspression arvioinnissa melanoomapotilailla, joita hoidettiin OPDIVO -valmisteella, OPDIVO - ja YERVOY -valmisteiden yhdistelmähoidolla sekä pelkällä YERVOY -valmisteella. OPDIVO ja YERVOY ovat Bristol-Myers Squibbin omistamia tavaramerkkejä. 3. Menetelmän periaate PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sisältää optimoidut reagenssit ja protokollan, jotka vaaditaan formaliinifiksoitujen, parafiiniin valettujen (FFPE) näytteiden IHC-värjäykseen Autostainer Link 48 -laitteen ja PT Link Pre-treatment Module -esikäsittelymoduulin avulla (6). Kun näytteet on inkuboitu primaarilla monoklonaalisella PD-L1-vasta-aineella tai Negative Control Reagent (NCR) -reagenssilla, ne inkuboidaan primaarivasta-aineen isäntälajeille ominaisella linkkerivasta-aineella ja sen jälkeen käyttövalmiilla visualisointireagenssilla, joka koostuu sekundaarisista vasta-ainemolekyyleistä ja piparjuuriperoksidaasimolekyyleistä yhdistettynä dekstraanipolymeerirunkoon. Myöhemmin lisätyn kromogeenin entsymaattinen muuttuminen saa aikaan näkyvän reaktiotuotteen saostumisen antigeenikohdassa. Kromogeenireaktion väriä muokataan kromogeenin vahvistusreagenssilla. Sen jälkeen näyte voidaan vastavärjätä ja peittää peitinlasilla. Tulokset tulkitaan valomikroskoopilla. Mukana toimitetaan värjäysten validointia varten Control Slide -aluslasit, joissa on kaksi formaliiinifiksoitua, parafiiniin valettua ihmisen solulinjaa. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 2/23

4. Mukana toimitetut materiaalit PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (koodi SK005) Alla luetellut materiaalit riittävät 50 testiin (50 aluslasia inkuboidaan PD-L1:n Primary Antibody -vasta-aineella ja 50 aluslasia inkuboidaan vastaavalla Negative Control Reagent -reagenssilla, yhteensä 100 testialuslasia). Pakkaukseen kuuluu lisäksi PD-L1:n Additional Primary Antibody -vasta-aine, jolla värjätään 15 solulinjan kontrollialuslasia. Testien määrä perustuu siihen, että aluslasia kohden käytetään 2 x 150 µl reagenssia lukuun ottamatta DAB+-liuosta ja Target Retrieval Solution -liuosta. Pakkauksen materiaalit riittävät enintään 15 värjäyskertaan. Määrä Kuvaus 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Puskuroitu liuos sisältää vetyperoksidia, puhdistusainetta ja 0,015 mol/l natriumatsidia. 1 x 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Kanin monoklonaalinen PD-L1-vasta-aine puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja 0,015 mol/l natriumatsidia. 1 x 15 ml Negatiivinen kontrollireagenssi* NEGATIVE CONTROL REAGENT Kanin monoklonaalinen IgG-kontrollivasta-aine puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja 0,015 mol/l natriumatsidia. *Monoklonaalista kanin kontrolliainetta IgG myydään Cell Signaling Technologyn luvalla. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Hiiren sekundaarinen vasta-aine kanin immunoglobuliineille puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja 0,015 mol/l natriumatsidia. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dekstraani yhdistettynä peroksidaasimolekyyleihin ja vuohen sekundaarisiin vasta-ainemolekyyleihin kanin ja hiiren immunoglobuliineille puskuroidussa liuoksessa, sisältää stabiloivaa proteiinia ja antimikrobista ainetta. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Puskuroitu liuos, sisältää vetyperoksidia ja antimikrobista ainetta. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobentsidiini-tetrahydrokloridi orgaanisessa liuoksessa. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Kuparisulfaatti vedessä. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Puskuroitu liuos, ph 6,1, sisältää puhdistusainetta ja antimikrobista ainetta. 15 aluslasia PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Jokaisessa aluslasissa on kaksi pelletöityä, formaliinifiksoitua, parafiiniin valettua solulinjaa: NCI-H226**, jolla on positiivinen PD-L1-proteiiniekspressio (peräisin ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinoomasta, jolla positiivinen PD-L1- proteiiniekspressio) ja MCF-7, jolla on negatiivinen PD-L1-proteiiniekspressio (peräisin ihmisen rinnan adenokarsinoomasta, jolla negatiivinen PD-L1-proteiiniekspressio). P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 3/23

PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negatiivinen NCI-H226: PD-L1-positiivinen **Tohtori AF Gazdar ja tohtori JD Minna (NIH) tunnetaan työstään NCI-H226:n kehittämisessä (ATCC-numero: CRL-5826 ) (7) Huomautus: Kaikki toimitukseen kuuluvat reagenssit on suunniteltu erityisesti tätä sarjaa varten. Jotta testi toimii kuvatulla tavalla, ei saa käyttää muita korvaavia aineita kuin EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (koodi K8005) -liuosta. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx on suunniteltu käytettäväksi nimenomaan Autostainer Link 48 -laitteen kanssa. Lisätietoja on Autostainer Link 48- ja PT Link - käyttöoppaissa. 5. Tarvittavat materiaalit, jotka eivät sisälly toimitukseen PT Link Pre-treatment Module (koodi PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (koodi AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (koodi K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (koodi K8008) Tislattu tai deionisoitu vesi (reagenssilaatu) Ajastin Positiiviset ja negatiiviset kudokset, joita käytetään kontrolleina (katso Laadun valvonta ja taulukko 5) Mikroskooppialuslasit: Dako FLEX IHC Microscope Slides (koodi K8020) tai varatut Fisherbrand Superfrost Plus -aluslasit. Peitinlasit Pysyvä kiinnitysaine sekä apureagenssit peitelasien kiinnitykseen Valomikroskooppi (objektiivin suurennus 4x 40x) 6. Varotoimenpiteet 1. In vitro -diagnostiikkaan. 2. Ammattikäyttöön. 3. Tämä tuote sisältää natriumatsidia (NaN 3 ), joka on sellaisenaan erittäin myrkyllinen kemikaali. Tuotepitoisuuksilla NaN 3 :a ei ole luokiteltu vaaralliseksi, mutta se voi reagoida lyijy- ja kupariputkien kanssa ja muodostaa erittäin räjähdysherkkiä metalliatsidikertymiä. Tuote hävitetään huuhtelemalla runsaalla vedellä, jotta estetään metalliatsidien kertyminen putkiin (12). 4. Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker ja Visualization Reagent sisältävät eläinalkuperää olevaa materiaalia. 5. Näytteitä (ja kaikkia niille altistuvia materiaaleja) on käsiteltävä ennen kiinnitystä ja kiinnityksen jälkeen mahdollisina tartunnanlevittäjinä, ja niiden hävittämisessä on noudatettava asianmukaisia varotoimia (13). 6. Jos ilmoitettuja inkubointiaikoja, lämpötiloja tai menetelmiä ei noudateta, tulokset voivat olla virheellisiä. 7. Reagenssit on laimennettu sopiviksi. Niiden lisälaimennus voi hävittää antigeenin värjäyksen. 8. Visualization Reagent -reagenssin, Liquid DAB+ -kromogeenin ja valmistellun DAB+ Substrate-Chromogen -liuoksen ominaisuudet voivat heiketä, jos ne altistuvat liialliselle valolle. Järjestelmän osia ei saa säilyttää eikä värjäystä saa suorittaa voimakkaassa valossa, esim. suorassa auringonvalossa. 9. Parafiinijäämät voivat aiheuttaa virheellisen negatiivisen tuloksen. 10. Käytettäessä muita kuin suositeltuja reagenssimääriä näkyvä PD-L1-immunoreaktiivisuus voi hävitä. 11. Isot kudosleikkeet, jotka peittävät 2/3 aluslasista, voivat vaatia 3 x 150 µl reagenssia. 12. Yleisesti ottaen alle 18-vuotiaat eivät saa käsitellä tätä ainetta. Käyttäjät on huolellisesti perehdytettävä oikeisiin työmenetelmiin, tuotteen haitallisiin ominaisuuksiin ja tarvittaviin käyttöturvallisuutta koskeviin ohjeisiin. Lisätietoa saa käyttöturvallisuustiedotteesta (KTT). 13. Käytä asianmukaisia henkilönsuojaimia silmä- ja ihokosketuksen välttämiseksi. 14. Käyttämätön liuos on hävitettävä paikallisten, kansallisten ja kansainvälisten määräysten mukaisesti. 15. Käyttöturvallisuustiedote toimitetaan ammattikäyttäjille pyynnöstä. Vaara DAB+ Chromogen: 1 5 % bifenyyli-3,3',4,4'-tetryylitetra-ammonium-tetrakloridi H350 Voi aiheuttaa syöpää. H341 Epäillään aiheuttavan perimävaurioita. P201 Lue erityisohjeet ennen käyttöä. P202 Lue varoitukset huolellisesti ennen käsittelyä. P280 Käytä suojakäsineitä. Käytä silmiensuojainta/kasvonsuojainta. Käytä suojavaatetusta. P308 + P313 Altistumisen tapahduttua tai jos epäillään altistumista: Hakeudu lääkäriin. P405 Varastoi lukitussa tilassa. P501 Hävitä sisältö ja pakkaus paikallisten, alueellisten, kansallisten ja kansainvälisten määräysten mukaisesti. Varoitus EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5-prosenttinen sitruunahappo H319 Ärsyttää voimakkaasti silmiä. H411 Myrkyllistä vesieliöille, pitkäaikaisia haittavaikutuksia. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 4/23

P280 P273 P264 P305 + P351 + P338 P337 + P313 P501 Käytä silmiensuojainta/kasvonsuojainta. Vältettävä päästämistä ympäristöön. Pese kädet huolellisesti käsittelyn jälkeen. JOS KEMIKAALIA JOUTUU SILMIIN: Huuhdo huolellisesti vedellä usean minuutin ajan. Poista piilolinssit, jos sen voi tehdä helposti. Jatka huuhtomista. Jos silmä-ärsytys jatkuu: Hakeudu lääkäriin. Hävitä sisältö ja pakkaus paikallisten, alueellisten, kansallisten ja kansainvälisten määräysten mukaisesti. 7. Säilytys Säilytä kaikki PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -komponentit, myös kontrollialuslasit, alkuperäispakkauksessa, pimeässä, 2 8 C:ssa, kun ne eivät ole käytössä Autostainer Link 48 -laitteella. Tuotetta ei saa käyttää pakkaukseen painetun viimeisen käyttöpäivän jälkeen. Mikäli reagensseja säilytetään muissa kuin tässä pakkausselosteessa kuvatuissa olosuhteissa, käyttäjän on varmistettava niiden käyttökelpoisuus. Selviä merkkejä tuotteen käyttökelvottomuudesta ei ole, joten positiiviset ja negatiiviset kontrollit tulee suorittaa samanaikaisesti potilasnäytteiden kanssa. 8. Näytteen valmistelu Näytteet on käsiteltävä kudoksen säilyttämiseksi IHC-värjäystä varten. Kaikilla näytteillä tulee noudattaa kudoksen käsittelyn vakiomenetelmiä. 8.1 Parafiiniin valetut näytteet Käyttöön soveltuvat formaliinifiksoidut, parafiiniin valetut kudokset. Suositellut käsittelytoimenpiteet: iskemia-aika < 30 min ennen upotusta fiksatiiviin ja kiinnitys 24 48 tuntia 10 % neutraalilla puskuroidulla formaliinilla. Muita fiksatiiveja ei ole validoitu, ja ne voivat antaa virheellisiä tuloksia. Näytteet tulee lohkoa 3 4 mm paksuuteen, kiinnittää 10 % neutraalilla puskuroidulla formaliinilla, kuivata ja puhdistaa alkoholilla ja ksyleenillä, ja sen jälkeen infiltroida sulalla parafiinilla. Parafiinin lämpötila ei saa olla yli 60 C. 8.2 Dekalsifioitujen kudosten käyttö PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testin käyttöä dekalsifioiduilla kudoksilla ei ole validoitu eikä käyttöä suositella. 8.3 Leikkeiden säilytystä koskevat suositukset Kudosnäytteet leikataan 4 5 µm:n kokoisiksi paloiksi. Paloittelun jälkeen kudokset kiinnitetään varatuille Fisherbrand Superfrost Plus - aluslaseille tai Dako FLEX IHC Microscope Slides -aluslaseille (koodi K8020) ja asetetaan 1 tunniksi uuniin 58 ± 2 C:een. Antigeenisyyden säilyttämiseksi aluslasille kiinnitetyt kudosnäytteet säilytetään pimeässä, 2-8 C:n tai korkeintaan 25 C:n huonelämpötilassa ja värjätään 4 kk kuluessa paloittelusta. Aluslaseja ei saa säilyttää tai käsitellä yli 25 C:n lämpötilassa missään vaiheessa kiinnityksen jälkeen, jotta varmistetaan kudoksen eheys ja antigeenisyys. 9. Reagenssin valmistelu Seuraavat reagenssit on valmisteltava ennen värjäystä: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Valmistele riittävä määrä 1x Target Retrieval Solution, Low ph -liuosta laimentamalla Target Retrieval Solution, Low ph (50x) -liuos suhteessa 1:50 reagenssilaatuisella vedellä; 1x Target Retrieval Solution -liuoksen ph:n tulee olla 6,1 ± 0,2. Yhdestä 30 ml:n pullosta Target Retrieval Solution, Low ph (50x) -liuosta laimennussuhteella 1:50 saadaan 1,5 l 1x reagenssia, joka riittää yhden PT Link -säiliön täyttämiseen, ja jolla voidaan käsitellä enintään 24 aluslasia yhdellä käyttökerralla. Hävitä 1x Target Retrieval Solution kolmen käytön jälkeen ja viimeistään 5 päivän kuluessa laimentamisesta. Lisää EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) -liuosta on saatavilla tarvittaessa koodilla K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Valmistele riittävä määrä Wash Buffer -pesupuskuria laimentamalla Wash Buffer (20x) suhteessa 1:20 reagenssilaatuisella vedellä pesuvaiheita varten. Käyttämätöntä 1x liuosta saa säilyttää 2 8 ºC:ssa enintään kuukauden ajan. Hävitä puskuri, jos se näyttää samealta. Katso lisätietoja Autostainer Link 48 -laitteen käyttöohjeesta. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) -pesupuskuria on saatavilla koodilla K8007. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Liuos on sekoitettava hyvin ennen käyttöä. Liuoksen mahdollinen saostuminen ei vaikuta värjäyksen laatuun. Valmistele DAB+ Substrate-Chromogen Solution lisäämällä 1 tippa Liquid DAB+ Chromogen -kromogeenia 1 ml:aan DAB+ Substrate Buffer -puskuria ja sekoita. Valmisteltu Substrate-Chromogen säilyy 5 päivää pimeässä ja 2 8 C:ssa. Tärkeitä huomioita: Jos DAB+ Substrate Buffer -pullo käytetään kokonaan, lisätään 9 tippaa DAB+-kromogeenia. Vaikka etiketissä mainitaan 7,2 ml, tämä on käytettävissä oleva määrä, joka ei sisällä pullon kuollutta tilavuutta. Liquid DAB+ Chromogen -kromogeenin väri pullossa voi vaihdella kirkkaasta vaaleaan purppuraan ja ruskeaan. Tämä ei vaikuta tuotteen ominaisuuksiin. Laimenna edellä annettujen ohjeiden mukaan. Jos Liquid DAB+ Chromogen -kromogeenia lisätään liikaa DAB+ Substrate Buffer -puskuriin, positiivinen signaali häviää. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 5/23

10. Värjääminen Autostainer Link 48 -laitteella Menetelmään liittyviä huomautuksia Ennen käyttöä on luettava nämä ohjeet huolellisesti ja perehdyttävä kaikkiin osiin ja instrumentteihin (katso Varotoimet). Kaikkien reagenssien on annettava tasaantua huonelämpötilaan (20 25 C) ennen immunovärjäystä. Myös kaikki inkuboinnit on suoritettava huonelämpötilassa. Kudosnäytteet eivät saa kuivua värjäyksen aikana. Kuivuneissa kudosnäytteissä voi näkyä enemmän epäspesifistä värjäytymistä. Vaaditut värjäysvaiheet ja inkubointiajat on esiohjelmoitu Dako Link -ohjelmistoon. Lisätietoja protokollien ohjelmoinnista sekä aluslasien ja reagenssien latauksesta löytyy Autostainer Link 48- ja PT Link -käyttöoppaista. Huom. Tämän järjestelmän mukana toimitetut reagenssit ja ohjeet on suunniteltu toimimaan optimaalisesti, kun niitä käytetään suositeltujen reagenssien ja materiaalien kanssa. Reagenssien lisälaimennus tai inkubointiaikojen tai lämpötilojen muuttaminen voivat aiheuttaa virheellisiä tai ristiriitaisia tuloksia. Värjäysmenetelmä Valitse DakoLink-alasvetovalikosta PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -värjäysprotokolla. Vaaditut värjäysvaiheet ja inkubointiajat on esiohjelmoitu DakoLink -ohjelmistoon. Jos asianomaisia PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - protokollia ei löydy palvelimeltasi, ota yhteys paikalliseen huoltoedustajaan. Vaihe 1: Parafiinin poisto, rehydraatio ja kohteen paljastus (3-in-1) Suositellut toimenpiteet: Katso lisätietoja PT Link -käyttöoppaasta. Aseta PT Linkin (koodi PT100/PT101/PT200) esilämmitys ja jäähdytys 65 C:een. Aseta lämpö 97 C:seen 20 minuutiksi. Täytä jokaiseen PT Link -säiliöön 1,5 l Target Retrieval Solution, Low ph -liuosta, 1x työliuos, jotta kudosnäytteet peittyvät. Esilämmitä Target Retrieval Solution 65 C:seen. Upota Autostainer-kelkat, joihin FFPE-kudosnäytteet on kiinnitetty, esilämmitettyyn Target Retrieval Solution, Low ph -liuokseen (1x työliuos) PT Link -säiliöön. Inkuboi 20 minuuttia 97 C:ssa. Kun kohteen paljastuksen inkubointi on tehty ja lämpötila on laskenut 65 C:seen, poista Autostainer-aluslasikelkat aluslaseineen PT Link -säiliöstä ja aseta Autostainer-kelkka aluslaseineen välittömästi säiliöön (esim. PT Link Rinse Station, koodi PT109), jossa on laimennettua, huonelämpötilassa olevaa Wash Buffer -pesupuskuria (koodi K8007). Anna aluslasien olla laimennetussa, huonelämpötilassa olevassa Wash Buffer -pesupuskurissa 5 minuutin ajan. Vaihe 2: Värjääminen Parafiinin poisto-, rehydraatio- ja kohteen paljastustoimenpiteiden (3-in-1) jälkeen Autostainer-kelkat aluslaseineen asetetaan Autostainer Link 48 -laitteeseen. Varmista, että aluslasit pysyvät märkinä puskurissa latauksen aikana ja ennen laitteen käynnistystä. Laite suorittaa värjäyksen käyttäen asianmukaista reagenssia, valvoo inkubointiaikaa ja huuhtelee aluslasit reagenssien välillä. Reagenssiajat on esiohjelmoitu Dako Link -ohjelmistoon. Vaihe 3: Vastavärjäys Aluslaseja vastavärjätään 7 minuutin ajan. Käytettävä aine: Envision FLEX Hematoxylin (Link) (koodi K8008). Hematoksyliinin inkubointiaika on esiohjelmoitu protokollaan. Vaihe 4: Kiinnitys Vaaditaan vedetön ja pysyvä kiinnitysaine. Huomautus: Värjätyt aluslasit voivat haalistua ajan myötä eri syistä, esimerkiksi vastavärjäyksen, kiinnitysaineiden ja -menetelmien sekä aluslasien säilytyksen takia. Haalistumisen ehkäisemiseksi aluslaseja on säilytettävä pimeässä ja huonelämpötilassa (20 25 C). 11. Laadun valvonta PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -reagenssien laadunvalvonta perustuu immunohistokemiaan ja edellä kuvattuihin kohteen paljastus- ja värjäystoimenpiteisiin. Poikkeaminen suositelluista toimenpiteistä kudoksen kiinnityksessä, käsittelyssä ja valamisessa käyttäjän laboratoriossa voi aiheuttaa merkittävää tulosten vaihtelua. Laadunvalvonnasta tulee huolehtia jokaisen värjäyskerran yhteydessä. Laadunvalvontamateriaalit kuvataan taulukossa 5, ja niitä ovat: H&E-värjätty potilaskudosnäyte, laboratorion toimittamat positiiviset ja negatiiviset kontrollikudokset sekä Dakon toimittama kontrollialuslasi (15). Yhdysvalloissa ohjeita laadunvalvontaan tarjoaa College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry; lisätietoja löytyy myös oppaasta CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (14). 12. Testin verifiointi Ennen värjäysjärjestelmän ensimmäistä käyttöä diagnostiseen tarkoitukseen käyttäjän on varmistettava testin toimivuus laboratorion toimittamilla kudoksilla, joilla on tunnetut IHC-ominaisuudet ja jotka edustavat tunnettuja positiivisia ja negatiivisia kudoksia. Perehdy edellä tässä tuoteselosteessa esiteltyihin laadunvalvonnan toimenpiteisiin. Nämä laadunvalvontatoimet on toistettava jokaisen uuden pakkauksen kohdalla tai aina kun testiparametrit muuttuvat. Mahdollisten ongelmien määritys, syyt ja ehdotetut korjaustoimet ilmenevät taulukosta 22. 13. Värjäyksen tulkinta Aluslevyjen arvioinnin suorittaa patologi valomikroskoopin avulla. PD-L1:n immunohistokemiallisen värjäytymisen ja lukeman määrityksessä voidaan käyttää aluksi 4x objektiivin suurennusta koko näytteen arviointiin ja sen jälkeen 10 20x objektiiveja lukeman määritykseen (tarvittaessa tulos voidaan vahvistaa 40x objektiivilla). PD-L1-värjäytymisen ilmaisee ruskea (3,3 -diaminobentsidiini, DAB) reaktiotuote. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 6/23

PD-L1-positiivista värjäytymistä kuvaa kasvainsolujen plasmakalvon jonkin asteinen värjäytyminen kehältä ja/tai osittain lineaarisesti. Näyte on arvioitava kokonaisuudessaan. Kaikki elinkelpoiset tuumorisolut koko PD-L1-värjätyllä potilaan aluslasilla on arvioitava ja otettava mukaan PD-L1-lukeman määritykseen. PD-L1-värjätyssä potilaan aluslasissa on oltava vähintään 100 elinkelpoista kasvainsolua, jotta värjäytyneiden solujen osuus voidaan määrittää. Katso lisäohjeita tämän asiakirjan värjäytymisen tulkintaa koskevista osioista eri indikaatioiden kohdalta. Mahdollista sytoplasmista värjäytymistä ei oteta huomioon lukeman määrityksessä. PD-L1 voi värjätä myös ei-malignit solut ja immuunisolut (esim. infiltroivat lymfosyytit tai makrofagit), mutta näitä ei tule ottaa huomioon lukeman määrityksessä PD-L1- positivisuuden selvittämiseksi. Aluslasit on tarkistettava jokaisella värjäyskerralla taulukossa 5 kuvatussa järjestyksessä, jotta varmistetaan värjäyksen kelpoisuus ja mahdollistetaan näytekudoksen värjäyksen arviointi. Lisäohjeita PD-L1-lukeman määrityksestä on tämän asiakirjan eri indikaatioita koskevissa värjäyksen tulkinta -taulukoissa sekä jokaisen indikaation kohdalla PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Interpretation Manual -oppaassa. 13.1 Värjäyksen tulkinta: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC Näyte on arvioitava kokonaisuudessaan. Kaikki elinkelpoiset tuumorisolut koko PD-L1-värjätyllä potilaan aluslasilla on arvioitava ja otettava mukaan PD-L1-lukeman määritykseen. PD-L1-värjätyssä potilaan aluslasissa on oltava vähintään 100 elinkelpoista kasvainsolua, jotta värjäytyneiden solujen osuus voidaan määrittää. Merkitse ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytteiden kohdalla ylös sellaisten elinkelpoisten kasvainsolujen osuus, joissa esiintyy jonkin asteista PD-L1-värjäytymistä kehällä ja/tai osittain lineaarisesti. Taulukko 1: Värjäyksen tulkinta ei-levyepiteeliperäinen NSCLC Lukeman määritykseen vaadittujen Ei-malignit ja Indikaatio elinkelpoisten immuunisolut kasvainsolujen vähimmäismäärä Sytoplasminen värjäytyminen, strooma, nekroottiset solut ja solujäte Muut osat Ei-levyepiteeliperäinen NSCLC 100 Ei mukana lukeman määrityksessä Ei oteta huomioon lukeman määrityksessä NA 13.2 Värjäyksen tulkinta: pään ja kaulan alueen levyepiteelisyöpä (SCCHN) Tämä testi on validoitu invasiivisille SCCHN-kudosnäytteille, ei leesioille, joissa on dysplasia- tai in situ -karsinooman alueita. Jokaisen PD-L1-värjätyn näytteen kanssa on käytettävä H&E-värjättyjä aluslaseja, jotta kunnollinen invasiivisen karsinooman, in situ -karsinooman ja viereisen normaalin epiteelin arviointi on mahdollista. Näyte on arvioitava kokonaisuudessaan. Kaikki elinkelpoiset tuumorisolut koko PD-L1-värjätyllä potilaan aluslasilla on otettava mukaan PD-L1-lukeman määritykseen. PD-L1-värjätyssä potilaan aluslasissa on oltava vähintään 100 elinkelpoista kasvainsolua, jotta värjäytyneiden solujen osuus voidaan määrittää. Merkitse SCCHN-näytteiden kohdalla ylös sellaisten elinkelpoisten kasvainsolujen osuus, joissa esiintyy jonkin asteista PD-L1-värjäytymistä kehällä ja/tai osittain lineaarisesti. Taulukko 2: Värjäyksen tulkinta SCCHN Lukeman määritykseen vaadittujen Indikaatio elinkelpoisten kasvainsolujen vähimmäismäärä Ei-malignit ja immuunisolut Sytoplasminen värjäytyminen, strooma, nekroottiset solut ja solujäte Muut osat Soluja, jotka ovat dysplasia- ja in situ -karsinooman alueella, ei oteta huomioon lukeman määrityksessä. Mukana tulevat H&Ealuslasit mahdollistavat invasiivisen karsinooman, in situ -karsinooman ja viereisen normaalin epiteelin kunnollisen arvioimisen. SCCHN 100 Ei mukana lukeman määrityksessä Ei oteta huomioon lukeman määrityksessä 13.3 Värjäyksen tulkinta: uroteelikarsinooma Tämä testi on validoitu invasiivisille UC-kudosnäytteille, ei leesioille, joissa on dysplasia- tai in situ -karsinooman alueita. Jokaisen PD-L1-värjätyn näytteen kanssa on käytettävä H&E-värjättyjä aluslaseja, jotta kunnollinen invasiivisen karsinooman, in situ -karsinooman ja viereisen normaalin epiteelin arviointi on mahdollista. Näyte on arvioitava kokonaisuudessaan. Kaikki elinkelpoiset tuumorisolut koko PD-L1-värjätyllä potilaan aluslasilla on otettava mukaan PD-L1-lukeman määritykseen. PD-L1-värjätyssä potilaan aluslasissa on oltava vähintään 100 elinkelpoista kasvainsolua, jotta värjäytyneiden solujen osuus voidaan määrittää. Merkitse UC-näytteiden kohdalla ylös sellaisten elinkelpoisten kasvainsolujen osuus, joissa esiintyy jonkin asteista PD-L1-värjäytymistä kehällä ja/tai osittain lineaarisesti. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 7/23

Taulukko 3: Värjäyksen tulkinta UC Lukeman määritykseen vaadittujen Indikaatio elinkelpoisten kasvainsolujen vähimmäismäärä Ei-malignit ja immuunisolut Sytoplasminen värjäytyminen, strooma, nekroottiset solut ja solujäte Muut osat Soluja, jotka ovat dysplasia- ja in situ -karsinooman alueella, ei oteta huomioon lukeman määrityksessä. UC 100 Ei mukana lukeman määrityksessä Ei oteta huomioon lukeman määrityksessä Mukana tulevat H&Ealuslasit mahdollistavat invasiivisen karsinooman, in situ -karsinooman ja viereisen normaalin epiteelin kunnollisen arvioimisen. 13.4 Värjäyksen tulkinta: melanooma Näyte on arvioitava kokonaisuudessaan. Kaikki elinkelpoiset tuumorisolut koko PD-L1-värjätyllä potilaan aluslasilla on arvioitava ja otettava mukaan PD-L1-lukeman määritykseen. PD-L1-värjätyssä potilaan aluslasissa on oltava vähintään 100 elinkelpoista kasvainsolua, jotta värjäytyneiden solujen osuus voidaan määrittää. Näytteet määritetään PD-L1-positiivisiksi, jos 1 %:ssa melanoomasoluista esiintyy kasvainsolujen plasmakalvon jonkin asteista värjäytymistä kehältä ja/tai osittain lineaarisesti. Näytteet määritetään PD-L1-negatiivisiksi, jos < 1 %:ssa melanoomasoluista esiintyy kasvainsolujen plasmakalvon jonkin asteista värjäytymistä kehältä ja/tai osittain lineaarisesti. HUOMAUTUS: Melanoomapotilaiden näytteissä voi esiintyä ruskeaa melaniinipigmenttiä. Melaniinia ei tule ottaa huomioon määritettäessä plasmakalvon värjäytymisen lukemaa; melaniinipitoisuuden tunnistamiseksi ja poissulkemiseksi voidaan käyttää vertailua NCR-värjättyyn peräkkäiseen aluslasiin. Jos korkea melaniinitaso estää kasvainsolujen plasmakalvon värjäytymisen lukeman määrityksen, näyte voidaan jättää pois tulkinnasta ja luokitella selvittämättömäksi. Taulukko 4: Värjäyksen tulkinta melanooma Lukeman määritykseen vaadittujen Indikaatio elinkelpoisten kasvainsolujen vähimmäismäärä Melanooma 100 Ei-malignit ja immuunisolut Ei mukana lukeman määrityksessä Sytoplasminen värjäytyminen, strooma, nekroottiset solut ja solujäte Ei oteta huomioon lukeman määrityksessä Muut osat Melaniinia ei oteta huomioon plasmakalvon värjäytymisastetta määritettäessä. Melaniinipitoisuuden tunnistamisessa ja poissulkemisessa voi käyttää apuna vertailua NCR-värjättyyn peräkkäiseen aluslasiin. 14. Aluslasien arviointi Taulukko 5: Suositeltu aluslasien arviointijärjestys Näytteet Perustelu Vaatimukset 1. H&E (Laboratorion toimittama) 2. Kontrollialuslasi (Dakon toimittama) Kudosnäytteen hematoksyyli- ja eosiinivärjäys (H&E) arvioidaan ensin, jotta saadaan selville kudoksen histologia ja säilyvyys. PD-L1-primaarivasta-aineella värjätty PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n kontrollialuslasi tutkitaan sen varmistamiseksi, että kaikki reagenssit toimivat oikein. Control Slide -aluslasissa on PD- L1-positiivinen solulinjapelletti ja PD-L1-negatiivinen solulinjapelletti. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx- ja H&E-värjäys suoritetaan näytteen samasta parafiinilohkosta peräisin oleville leikesarjoille. Kudosnäytteiden tulee olla vahingoittumattomia, hyvin säilyneitä ja niiden on vahvistettava tuumori-indikaatio. Jokaisella värjäyskerralla värjätään yksi kontrollialuslasi PD-L1-primaarivastaaineella. NCI-H226:n (PD-L1-positiivinen kontrollisolulinja, joka on peräisin ihmisen keuhkon levyepiteelikarsinoomasta, jolla on positiivinen PD-L1- proteiiniekspressio) hyväksymiskriteerit: Plasmakalvon värjäytyminen 80 % soluista, keskimääräinen värjäyksen voimakkuus 2+. Epäspesifisen värjäyksen voimakkuus < 1+. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 8/23

3. Positiivisen kontrollikudoksen aluslasit (Laboratorion toimittama) 4. Negatiivisen kontrollikudoksen aluslasit (Laboratorion toimittama) 5. Negatiivisella kontrollireagenssilla värjätty potilaskudosaluslasi 6. PD-L1- primaarivastaaineella värjätty potilaskudosaluslasi Seuraavaksi tutkitaan positiivisen kontrollikudoksen aluslasit, jotka on värjätty sekä PD-L1- primaarivasta-aineella että Negative Control Reagent - reagenssilla. Näillä aluslaseilla varmistetaan, että kiinnitysmenetelmä ja kohteen paljastusmenetelmä toimivat. Tunnettuja positiivisen kudoksen kontrolleja saa käyttää vain käsiteltyjen kudosten ja testireagenssien oikean toimivuuden seurantaan, EI diagnoosin tekemiseen potilasnäytteistä. Negatiivisen kontrollikudoksen aluslasit (eli PD-L1-negatiiviset), jotka on värjätty sekä PD-L1- primaarivasta-aineella että Negative Control Reagent - reagenssilla, tutkitaan seuraavaksi, jotta voidaan varmistaa kohdeantigeenin merkitseminen primaarivastaaineella. Vaihtoehtoisesti positiivisen kontrollikudoksen negatiiviset alueet voivat toimia negatiivisena kontrollikudoksena, mutta käyttäjän on varmistettava tämä. Tutki potilasnäytteet, jotka on värjätty PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n Negative Control Reagent -reagenssilla. Negative Control Reagent -reagenssia käytetään primaarivasta-aineen sijaan apuna antigeenikohdan spesifisen värjäyksen tulkinnassa. Tutki viimeksi kokonaan potilasnäytealuslasi, joka on värjätty PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n PD-L1-primaarivastaaineella. Lisätietoja PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n immunoreaktiivisuudesta on kohdissa Yhteenveto ja selitys, Rajoitukset sekä Ei-kliininen tulosten arviointi. MCF-7:n (PD-L1-negatiivinen kontrollisolulinja, joka on peräisin ihmisen rinnan adenokarsinoomasta, jolla on negatiivinen PD-L1-proteeiniekspressio) hyväksymiskriteerit: Epäspesifinen värjäys. Epäspesifisen värjäyksen voimakkuus < 1+. Huomaa, että toisinaan voidaan havaita joidenkin MCF-7-solupelletin solujen värjäytymistä. Käytetyt hyväksymiskriteerit: 10 kokonaista solua, erillinen plasmakalvon värjäytyminen tai sytoplasminen värjäytyminen 1+ voimakkuudella MCF-7- solupelletin rajoissa hyväksytään. Jos kumpikaan kontrollisolulinja ei täytä näitä kriteerejä, kaikki potilasnäytteen tulokset katsotaan kelpaamattomiksi. Kontrollien tulee olla kirurgisia tai biopsianäytteitä samasta tuumoriindikaatiosta kuin potilaan näyte, kiinnitettynä, käsiteltynä ja valettuna mahdollisimman pian samalla tavalla kuin potilaan näytteet. Värjäystulosten tulkinnassa on käytettävä vahingoittumattomia näytteitä, sillä nekroottiset tai degeneroituneet solut värjäytyvät usein epäspesifisesti. Positiivisiksi kudoskontrolleiksi valittujen kudosten on tuotettava heikko tai kohtalainen positiivinen värjäytyminen PD-L1-värjäyksessä, jotta niistä on apua hienoisten muutosten havaitsemiseksi testiherkkyydessä. Jokaisella testauskerralla tulee käyttää kaksi positiivisen kudoskontrollin aluslasia. PD-L1-värjätty aluslasi: Voidaan havaita ruskea plasmakalvon värjäytyminen. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Negatiivisella kontrollireagenssilla värjätty aluslasi: Ei kalvon värjäytymistä. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Jos positiiviset kudoskontrollit eivät pysty osoittamaan riittävää positiivista värjäystä, testinäytteillä saatuja tuloksia ei kelpuuteta. Kontrollien tulee olla kirurgisia tai biopsianäytteitä samasta tuumoriindikaatiosta kuin potilaan näyte, kiinnitettynä, käsiteltynä ja valettuna mahdollisimman pian samalla tavalla kuin potilaan näytteet. Jokaisella värjäyskerralla tulee käyttää kaksi negatiivisen kudoskontrollin aluslasia. PD-L1:llä värjätty aluslasi: Ei kalvon värjäytymistä tuumorisoluissa. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Negatiivisella kontrollireagenssilla värjätty aluslasi: Ei kalvon värjäytymistä. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Jos negatiivisen kontrollikudoksen aluslaseissa ilmenee spesifistä plasmakalvon värjäytymistä, potilasnäytteen tuloksia ei kelpuuteta. Plasmakalvon värjäytymisen puuttuminen osoittaa PD-L1-primaarivastaaineen merkinneen kohdeantigeenin spesifisesti. Epäspesifisen värjäytymisen tulee olla 1+. Positiivisen värjäyksen voimakkuus tulee arvioida suhteessa epäspesifiseen taustavärjäykseen, jota havaitaan Negative Control Reagent -reagenssin aluslasilla samalla värjäyskerralla. Kuten kaikissa immunohistokemiallisissa testeissä negatiivinen tulos tarkoittaa, että antigeeniä ei ole havaittu, mutta ei välttämättä sitä, että testatuissa soluissa tai kudoksessa ei ole antigeeniä. Värjäyksen tulkintaohjeet, katso luku 13. 15. Rajoitukset 15.1 Yleiset rajoitukset 1. Immunohistokemia tarkoittaa monivaiheista diagnosointia, ja se edellyttää erityiskoulutusta sopivien reagenssien valintaa, kudoksen valintaa, kiinnitystä ja käsittelyä, immunohistokemiallisen aluslasin valmistelua sekä värjäystulosten tulkintaa varten. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 9/23

2. Kudoksen värjäytymiseen vaikuttaa kudoksen käsittely ja prosessointi ennen värjäystä. Epäasianmukainen kiinnitys, jäädytys, sulatus, pesu, kuivaus, lämmitys, paloittelu tai muiden kudosten tai nesteiden aiheuttama kontaminaatio voi aiheuttaa vääristymiä, vasta-aineen sitomista tai vääriä negatiivisia tuloksia. Ristiriitaiset tulokset voivat johtua kiinnitys- ja upotusmenetelmien vaihteluista tai kudoksen poikkeamista. 3. Liiallinen tai puutteellinen vastavärjäys voi vaarantaa tulosten oikean tulkinnan. 4. Positiivisen värjäyksen tai sen puuttumisen kliininen tulkinta on tehtävä kliinisen presentaation, morfologian tai muiden histopatologisten kriteerien perusteella. Värjäyksen tai sen puuttumisen kliininen tulkinta on tehtävä morfologisissa tutkimuksissa ja oikeilla kontrolleilla sekä muilla diagnostisilla testeillä. Värjätyn aluslasin tulkinnasta vastaa pätevä patologi, joka tuntee käytetyt vasta-aineet, reagenssit ja menetelmät. Värjäys on suoritettava sertifioidussa, lisensoidussa laboratoriossa, ja sitä valvoo patologi, joka vastaa värjättyjen aluslasien tarkastuksesta ja varmistaa positiivisten ja negatiivisten kontrollien riittävyyden. 5. B-hepatiittivirustartunnan saaneiden henkilöiden kudoksissa, jotka sisältävät B-hepatiitin pinta-antigeeniä (HBsAg), voi ilmetä epäspesifistä värjäytymistä johtuen piparjuuriperoksidaasista (17). 6. Odottamattomia reaktioita ei voida sulkea kokonaan pois testattujen kudosten kohdalla, mikä johtuu antigeeni-ilmentymisen biologisesta vaihtelusta neoplasmoissa tai muissa patologisissa kudoksissa. Mikäli odottamattomia reaktioita dokumentoidaan, ota yhteyttä Dakon tekniseen tukeen. 7. Väärät positiiviset tulokset voivat johtua proteiinien ei-immunologisesta sitomisesta tai substraattireaktiotuotteista. Ne voivat johtua myös pseudoperoksidaasin toiminnasta (erytrosyytit) ja endogeenisesta peroksidaasin toiminnasta (sytokromi c) (14). 8. Tämän järjestelmän mukana toimitetut reagenssit ja ohjeet on suunniteltu toimimaan mahdollisimman hyvin. Reagenssien lisälaimennus tai inkubointiaikojen tai lämpötilojen muuttaminen voivat aiheuttaa virheellisiä tai ristiriitaisia tuloksia. 15.2 Tuotekohtaiset rajoitukset 1. Väärät negatiiviset tulokset voivat johtua antigeenin degradaatiosta kudoksessa ajan myötä. Aluslasille kiinnitetyt kudosnäytteet säilytetään pimeässä, 2-8 C:n tai korkeintaan 25 C:n huonelämpötilassa ja värjätään 4 kk kuluessa paloittelusta. Aluslaseja ei saa säilyttää tai käsitellä yli 25 C:n lämpötilassa missään vaiheessa kiinnityksen jälkeen, jotta varmistetaan kudoksen eheys ja antigeenisyys. 2. Optimaalisten ja toistettavien tulosten takaamiseksi PD-L1-proteiini vaatii esikäsittelyn kohteen paljastamiseksi, kun kudokset kiinnitetään normaalisti (neutraalilla puskuroidulla formaliinilla) ja valetaan parafiiniin. 3. Reagensseja ei saa korvata tämän tuotteen muun eränumeron omaavilla reagensseilla tai muiden valmistajien tuotteilla. Ainoa poikkeus on EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), joka on tarvittaessa saatavissa koodilla K8005. 4. Värjättyjä kontrollisolulinjoja tulee käyttää vain värjäyksen validointiin, ei värjäysreaktion lukeman määritykseen kudosnäytteissä. 5. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n käyttöä kudoksiin muilla fiksatiiveilla kuin 10 % neutraalilla puskuroidulla formaliinilla ei ole validoitu. 6. Kliinisissä kokeissa, joissa käytettiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testiä, hyväksyttyjä näytetyyppejä olivat leikkaus-, viilto-, stanssi- tai paksuneulabiopsiat. Ohutneula-aspiraatiot tai muut sytologiset näytteet eivät kelvanneet biomarkkerianalyysiin eikä niitä otettu mukaan kliinisiin kokeisiin, joissa käytettiin PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testiä. 16. Ei-kliininen tulosten arviointi 16.1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n analyyttinen spesifisyys PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n primaarivasta-aine on kanin monoklonaalinen anti-humaani PD-L1-vasta-aine, klooni 28-8. Vasta-aineen valmistuksessa käytetty immunogeeni on puhdistettu rekombinantti ihmisen PD-L1, joka sisältää ihmisen PD-L1:n solun ulkopuolisen domeenin (Phe19-Thr239). IHC-värjäyksessä PD-L1-primaarivasta-aineella ei ilmennyt ristireaktiota PD-L2:n suhteen, jota on ilmennyt eksogeenisesti kiinalaisen hamsterin munasoluissa (CHO). PD-L1 IHC 28-8 pharmdx havaitsee erityisesti PD-L1-kalvoproteiinin, jota ilmenee FFPE-kudosten kasvainsoluissa, ja joka voidaan hävittää kokonaan lisäämällä PD-L1-antigeeniä. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ei havaitse PD-L1-kalvoproteiinia PD-L1-knock-out - kasvainsoluissa, joista PD-L1-geeni on poistettu geneettisesti. 16.2 Normaalit ja neoplastiset kudokset Taulukossa 6 on yhteenveto Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 -vasta-aineen immunoreaktiivisuudesta suositellussa normaalien kudosten paneelissa. Taulukossa 7 on yhteenveto Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 vasta-aineen immunoreaktiivisuudesta neoplastisten kudosten kohdalla usean kasvainkudoksen dna-siruissa. Kaikki kudokset oli fiksoitu formaliinilla, valettu parafiiniin ja värjätty PD-L1 IHC 28-8 phrmdx:llä tämän pakkausselosteen ohjeiden mukaan. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx havaitsi PD-L1-proteiinin sellaisten solutyyppien plasmakalvosta, joiden tiedetään ilmentävän PD-L1-antigeeniä, kuten immuunisolut ja pääasiassa epiteeliperäiset kasvainsolut. Taulukko 6: Yhteenveto PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n normaalikudoksen reaktiivisuudesta Kudostyyppi Positiivinen plasmakalvon värjäys: Positiivinen sytoplasminen värjäys: (testattu määrä) Kudoksen osat Kudoksen osat Aivolisäke (3) 1/3 Aivolisäkkeen etulohko 1/3 Aivolisäkkeen etulohko 3/3 Aivolisäkkeen takalohko Eturauhanen (2) 0/2 0/2 Haima (3) 3/3 Epiteeli (pääasiassa saarekesolut) 3/3 Epiteeli (pääasiassa saarekesolut) Hermo, ääreis (3) 0/3 0/3 Iho (3) 0/3 1/3 Epiteeli Isotaivot (3) 0/3 0/3 Kateenkorva (3) 3/3 Ydinepiteeli 0/3 Keuhko (3) 3/3 Alveolaariset makrofagit 0/3 Kilpirauhanen (3) 0/3 0/3 Kives (3) 0/3 1/3 Leydigin solut Kohdunkaula (3) 1/3 Epiteeli 1/3 Epiteeli Kohtu (3) 0/3 0/3 P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 10/23

Kudostyyppi (testattu määrä) Positiivinen plasmakalvon värjäys: Kudoksen osat Positiivinen sytoplasminen värjäys: Kudoksen osat Koolon (3) 2/3 Makrofagit 0/3 Lihas, poikkijuovainen (3) 0/2 0/2 Lihas, sydän (3) 0/2 0/2 Lisäkilpirauhanen (3) 3/3 Epiteeli 0/3 Lisämunuainen (3) 3/3 Ydinsolut 3/3 Ydinsolut Luuydin (3) 3/3 Megakaryosyytit 3/3 Megakaryosyytit Maksa (3) 2/3 Immuunisolut 2/3 Immuunisolut Mesoteelisolut (3) 0/3 0/3 Munasarja (3) 0/3 0/3 Munuainen (3) 3/3 Tubulaariepiteeli 3/3 Tubulaariepiteeli Ohutsuoli (2) 0/2 0/2 Perna (3) 1/3 Makrofagit 0/3 3/3 Laskimosinusoideja reunustavat solut (litoraalisolut) Pikkuaivot (3) 0/3 0/3 Rinta (3) 0/3 0/3 Ruokatorvi (3) 0/3 0/3 Sylkirauhanen (3) 0/3 0/3 Tonsilla (3) 3/3 Kryptaepiteeli 0/3 3/3 Germinaalikeskus (immuunisolut) Vatsa (3) 0/3 0/3 Taulukko 7: Yhteenveto PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n neoplastisen kudoksen reaktiivisuudesta Kasvaintyyppi Sijainti/elin PD-L1-positiivinen / kokonaismäärä (N = 162) Bronkoalveolaarikarsinooma, keuhko 0/1 Eturauhanen 2/4 GI, etäpesäke keuhkoon 0/1 Haima 1/2 Haima, duktaalinen 0/3 Keuhko 2/5 Kilpirauhanen, follikulaarinen 0/1 Kilpirauhanen, follikulaarinen-papillaarinen 0/1 Kilpirauhanen, papillaarinen 0/3 Kohdunkaula, endoservikaalinen tyyppi 0/1 Kohtu, endometriumi 1/3 Kohtu, kirkas solu 1/1 Koolon 2/5 Koolon, etäpesäke maksaan 1/1 Koolon, musiini 0/1 Munasarja 0/1 Adenokarsinooma Munasarja, endometrioidi 0/1 Munasarja, musiini 0/1 Munasarja, seroosa 0/1 Ohutsuoli 0/2 Peräsuoli 2/4 Pää ja kaula, kova kitalaki 0/1 Rinta, DCIS 0/2 Rinta, invasiivinen duktaalinen 3/7 Rinta, invasiivinen duktaalinen - etäpesäke imusolmukkeeseen 1/1 Ruokatorvi 1/1 Sappirakko 2/4 Sylki-/korvasylkirauhanen 0/2 Umpilisäke 1/1 Vatsa 1/6 Vatsa, musiini 0/1 Adrenokortikaalinen karsinooma Lisämunuainen 0/1 Astrosytooma Isot aivot 0/3 Embryonaalinen karsinooma Kives 0/1 Ependymooma Aivot 0/1 Glioblastooma Aivot 0/1 Hepatoblastooma Maksa 0/1 Hepatosellulaarinen karsinooma Maksa 1/5 Koolon 0/1 Interstitiaalinen Ohutsuoli 0/1 Peräsuoli 0/1 Karsinooma Nenänielu, NPC 0/1 Kordooma Lantio-ontelo 0/1 P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 11/23

Kasvaintyyppi Sijainti/elin PD-L1-positiivinen / kokonaismäärä (N = 162) Liposarkooma Vatsaontelo, musinoosinen 0/1 Lymfooma Anaplastinen suurisoluinen Imusolmuke 1/1 Diffuusi B-solu Imusolmuke 2/4 Hodgkin Imusolmuke 2/2 Non-Hodgkin Imusolmuke 1/1 Medullaarinen karsinoma Kilpirauhanen 0/1 Medulloblastooma Aivot 0/1 Nenäontelo 0/1 Melanooma Peräsuoli 0/1 Meningeooma Aivot 0/2 Mesoteliooma Vatsakalvo 0/1 Munuaissyöpä Kirkas solu Munuainen 0/6 Papillaarinen Munuainen 0/1 Neuroblastooma Retroperitoneumi 0/1 Neurofibrooma Pehmytkudos, alaselkä 0/1 Iho 1/2 Keuhko 1/3 Okasolusyöpä Kohdunkaula 2/4 Kohtu 1/1 Pää ja kaula 0/2 Ruokatorven okasolusyöpä, etäpesäke imusolmukkeeseen 1/1 Ruokatorvi 4/7 Pienisoluinen karsinooma Keuhko 1/2 Primitiivinen neuroektodermaalinen Retroperitoneumi 0/1 Saarekesolukarsinooma Haima 0/1 Sarkooma Kirkas solu Vatsanseinämä 0/1 Kondrosarkooma Luu 0/1 Leiomyosarkooma Pehmytkudos, rinnan seinämä 0/1 Virtsarakko 0/1 Liposarkooma Vatsaontelo, musinoosinen 0/1 Osteosarkooma Luu 0/2 Rabdomyosarkooma Eturauhanen 0/1 Pehmytkudos, embryonaalinen 0/1 Retroperitoneumi 0/1 Synoviaalisarkooma Lantio-ontelo 0/1 Seminooma Kives 0/2 Sinettisolukarsinooma Koolon 0/1 Koolonin sinettisolukarsinooma, etäpesäke munasarjaan 0/1 Spermatosytooma Kives 0/2 Suurisolukarsinooma Keuhko 1/1 Tymooma Välikarsina 1/1 Tyvisolusyöpä Iho 0/1 Virtsarakon syöpä Munuainen 0/1 Virtsarakko 3/6 17. Toimivuuden arviointi 17.1 Toimivuuden arviointi: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC 17.1.1 Analyyttinen herkkyys: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testin analyyttinen herkkyys testattiin 112 yksittäisen ei-levyepiteeliperäisen keuhkosyövän (NSCLC) kohdalla levinneisyysasteen I IV FFPE-näytteillä käyttäen valmistettua tuotantoerää. PD-L1-ilmentymisen arvioinnissa havaittiin värjäytymistä 0 100 % positiivisen tuumorisolun alueella värjäysvoimakkuuden ollessa 0 3. 17.1.2 Toistettavuus/ulkoinen toistettavuus: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -testin toistettavuus ja ulkoinen toistettavuus arvioitiin Dakolla ja kolmessa ulkopuolisessa testauskohteessa. Saadut tulokset ilmenevät taulukoista 8 ja 9. Jokaiselle arvioidulle PD-L1-ilmentymistasolle määritettiin testien riippumattoman parittaisen vertailun negatiivinen yhtäpitävyysprosentti (NPA), positiivinen yhtäpitävyysprosentti (PPA) ja yleinen yhtäpitävyysprosentti (OA). Tiheimmin esiintyvää havaintoa käytettiin viitteenä NPA:n, PPA:n, OA:n ja vastaavien 95 % Wilson Score -luottamusvälien laskennassa, mistä johtuen yksi havaintotulos jätettiin pois parittaisista vertailuista. P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 12/23

Taulukko 8: PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n toistettavuus ei-levyepiteeliperäinen NSCLC Toistettavuus Menetelmä 1 %:n ekspressiotaso Laitteiden välinen Kaikki 10 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC -ekpressiota, NPA 100 (82,4, 100) testattiin kolmessa toistossa kullakin PPA 100 (91,6, 100) kolmesta Autostainer Link 48 -laitteesta. OA 100 (94,0, 100) Testissä suoritettiin yhteensä 60 riippumatonta parittaista vertailua. Analyytikoiden välinen Päivien välinen Erien välinen Toimenpiteen sisäinen Kolme analyytikkoa testasi kaikki 12 eilevyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC - ekpressiota, kolmessa toistossa yhdellä Autostainer Link 48 -laitteella. Testissä suoritettiin yhteensä 72 riippumatonta parittaista vertailua. Kaikki 10 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC -ekpressiota, testattiin kolmessa toistossa viitenä eiperäkkäisenä päivänä Autostainer Link 48 -laitteella. Testissä suoritettiin yhteensä 80 riippumatonta parittaista vertailua. Kaikki 20 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC -ekpressiota, testattiin kahdessa toistossa jokaisen viiden reagenssierän kohdalla Autostainer Link 48 -laitteella. Testissä suoritettiin yhteensä 160 riippumatonta parittaista vertailua. Kaikki 10 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC -ekpressiota, testattiin kahdeksassa toistossa yhden ajon aikana Autostainer Link 48 - laitteella. Testissä suoritettiin yhteensä 70 riippumatonta parittaista vertailua. NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) % yhtäpitävyys (95 % CI) 5 %:n ekspressiotaso NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) 10 %:n ekspressiotaso NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Taulukko 9: PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n toistettavuus ei-levyepiteeliperäinen NSCLC, testattu kolmessa ulkopuolisessa testauskohteessa % yhtäpitävyys (95 % CI) Toistettavuus Menetelmä 1 %:n ekspressiotaso 5 %:n ekspressiotaso Kohteiden välinen testi (kolme kohdetta) Kohteen sisäinen testi Havainnoijien välinen (yksi havainnoija kussakin kolmesta kohteesta) Havainnoijien sisäinen (yksi havainnoija kussakin kolmesta kohteesta) Kaikki 10 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC -ekpressiota, testattiin viitenä eiperäkkäisenä päivänä. Kohteiden välinen analyysi suoritettiin kolmen kohteen välillä yhteensä 140 riippumattomalle parittaiselle vertailulle. Kaikki 10 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC:n näytettä, joissa oli jonkinasteista PD-L1 IHC -ekpressiota, testattiin viitenä eiperäkkäisenä päivänä kaikissa kolmessa tutkimuskohteessa. Kohteen sisäinen analyysi suoritettiin kolmessa kohteessa yhteensä 120 riippumattomalle parittaiselle vertailulle. 15 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC-näytteen, joilla oli erilaisia PD-L1 IHC -ekspressioita PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - värjäyksellä, lukeman määrittivät kolme patologia, yksi kussakin kolmesta kohteesta, kolmena ei-peräkkäisenä päivänä. Havainnoijien välinen analyysi suoritettiin kolmen kohteen välillä yhteensä 120 riippumattomalle parittaiselle vertailulle. 15 ei-levyepiteeliperäisen NSCLC-näytteen, joilla oli erilaisia PD-L1 IHC -ekspressioita PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - värjäyksellä, lukeman määrittivät kolme patologia, yksi kussakin kolmesta kohteesta, kolmena ei-peräkkäisenä päivänä. Havainnoijien sisäinen analyysi suoritettiin kolmessa kohteessa yhteensä 90 riippumattomalle parittaiselle vertailulle. NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 13/23

17.1.3 Kliinisen toimivuuden arviointi: ei-levyepiteeliperäinen NSCLC PD-L1 IHC 28-8 pharmdx:n kliininen hyöty arvioitiin CA209057-tutkimuksessa, joka on vaiheen 3 satunnaistettu, avoin nivolumabi vs. dosetakseli -tutkimus aikuisilla ( 18-vuotiailla) potilailla, joilla on edennyt tai metastaattinen ei-levyepiteeliperäinen NSCLC, ja aiempi platinum-doubletpohjainen kemoterapia on epäonnistunut. Yhteensä 582 potilasta satunnaistettiin 112 kohteessa 22 maassa (Argentiina, Australia, Itävalta, Brasilia, Kanada, Chile, Tsekin tasavalta, Ranska, Saksa, Hong Kong, Unkari, Italia, Meksiko, Norja, Peru, Puola, Romania, Venäjä, Singapore, Espanja, Sveitsi ja Yhdysvallat). Potilaat satunnaistettiin suhteessa 1:1 ja ositettiin käyttäen perusteena 1) aiempaa ylläpitohoitoa vs. ei ylläpitohoitoa ja 2) toisen linjan vs. kolmannen linjan hoitoa. Tutkimusta edeltävät (perustason) kasvainkudosnäytteet kerättiin ennen satunnaistamista ja ennen ensimmäistä hoitoa, jotta voitiin suorittaa esisuunniteltu tehon analysointi ennalta määritettyjen perustason PD-L1-ilmentymistasojen mukaisesti (toissijainen tavoite). Ensisijainen päätetapahtuma oli kokonaiselinaika (OS). Toissijaisia päätetapahtumia olivat objektiivisesti arvioitu hoitovaste (ORR), etenemättömyysaika (PFS) ja sairauteen liittyvien oireiden paraneminen 12 viikon aikana LCSS-mittarilla (Lung Cancer Symptom Scale) mitattuna. Demografiset ja perusominaisuudet olivat samalla tavalla tasapainossa nivomulabi- ja dosetakseliryhmien satunnaistetuilla potilailla. Keski-ikä oli 62 vuotta (ikäväli: 21 85), 34 % oli 65-vuotiaita ja 7 % oli 75-vuotiaita. Suurin osa potilaista oli valkoisia (92 %) ja miehiä (55 %); ECOG-toimintakykyluokka oli 0 (31 %) tai 1 (69 %). 79 % potilaista oli tupakoinut aiemmin tai tupakoi tällä hetkellä. Kasvainnäytteet otettiin ei-levyepiteeliperäisistä NSCLC-kasvaimista tutkimuksen mukaanottovaatimusten mukaisesti. Kaikkien CA209057-tutkimuksen satunnaistettujen potilaiden PD-L1-ekspressioiden esiintymistiheydet kullakin esimääritetyllä perusekspressiotasolla esitellään taulukossa 10. Taulukko 10: Tutkimusta edeltävien PD-L1-ilmentymisten esiintymistaajuus kaikilla satunnaistetuilla potilailla, joilla on eilevyepiteeliperäinen NSCLC CA209057 Populaation PD-L1-ekspressioluokka Nivolumabi 3 mg/kg Dosetakseli Yhteensä Kaikkiaan 292 290 582 Perustason PD-L1 määritettävissä, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Perustason PD-L1-ekspressio 1 % 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Perustason PD-L1-ekspressio < 1 % 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Perustason PD-L1-ekspressio 5 % 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Perustason PD-L1-ekspressio < 5 % 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Perustason PD-L1-ekspressio 10 % 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Perustason PD-L1-ekspressio < 10 % 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 ei määritettävissä, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) OPDIVO -ryhmän potilaisiin, joilla oli PD-L1-ilmentyminen kaikilla esimääritetyillä ilmentymistasoilla, voitiin liittää suurentunut eloonjäämisen mahdollisuus verrattuna dosetakseliin, kun taas niillä potilailla, joilla ei ollut PD-L1-ilmentymistä, eloonjäämisessä ei ollut eroja dosetakseliin verrattuna. Merkittäviä eroja keskimääräisessä kokonaiselinajassa (OS) havaittiin nivolumabi- ja dosetakselialaryhmien välillä analysoitaessa PD-L1-ilmentymistason mukaan. Keskimääräinen kokonaiselinaika (OS) oli nivolumabipotilailla 17,1, 18,2, ja 19,4 kuukautta ja dosetakselipotilailla 9,0, 8,1, ja 8,0 kuukautta, kun PD-L1-ilmentymistasot olivat vastaavasti 1 %, 5 % ja 10 %. Hoitoryhmien välillä ei esiintynyt OS-eroja potilailla, joiden ilmentymistaso oli < 1 %, < 5 % ja < 10 %, keskimääräinen kokonaiselinaika oli 9,7 10,4 kuukautta nivolumabilla ja 10,1 10,3 kuukautta dosetakselilla. Osittamattomat riskitiheyssuhteet (HR) ja keskimääräinen kokonaiselinaika (OS) ilmenevät kuvasta 1. PD-L1-ilmentymistasojen alaryhmien Kaplan- Meier-käyrä PD-L1 on esitetty kuvissa 2 ja 3. Kuva 1: Metsikkökuvio PD-L1-ekspressioon perustuva kokonaiselinaika (OS) potilailla, joilla on ei-levyepiteeliperäinen NSCLC CA209057 Keskimääräinen OS (kuukautta) PD-L1-ilmentymätaso Osittamaton HR OPDIVO Dosetakseli 1 % (n = 246) 0,59 17,1 9,0 < 1 % (n = 209) 0,90 10,4 10,1 5 % (n = 181) 0,43 18,2 8,1 < 5 % (n = 274) 1,01 9,7 10,1 10 % (n = 165) < 10 % (n = 290) 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 0,25 0,5 1,0 2,0 Suosii OPDIVOA P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 14/23

Huom. Osittamaton riskitiheyssuhde ja vastaava 95 % CI arvioitiin Coxin suhteellisen riskin mallin avulla käyttäen satunnaistettua haaraa yksittäisenä kovariaattina. Kuva 2: Kokonaiselinaika potilaat, joilla on ei-levyepiteeliperäinen NSCLC ja 1 %:n PD-L1-ekspressio CA209057 Eloonjäämisen todennäköisyys 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Dosetakseli 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Kokonaiselossaoloaika (kuukautta) Riskipotilasmäärä OPDIVO 123 98 86 77 73 65 27 13 5 0 Dosetakseli 123 102 80 61 44 36 13 4 3 0 Kuva 3: Kokonaiselinaika potilaat, joilla on ei-levyepiteeliperäinen NSCLC ja < 1 %:n PD-L1-ekspressio CA209057 1,0 0,9 0,8 Eloonjäämisen todennäköisyys 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Dosetakseli 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Kokonaiselossaoloaika (kuukautta) Riskipotilasmäärä OPDIVO 108 82 70 60 48 39 26 17 4 0 Dosetakseli 101 87 69 53 38 30 13 5 2 0 P03914FI_04/SK00521-2/2017-05 s. 15/23