111 11111111 III IIII 1111111111111 11 11111 II III III

111 11111111 III IIII 1111111111111 11 11111 II III III F I 000B (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats 30.06.2000 SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.lk.7 - Int.kl.7 A61K 39/09, C12N 15/31 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 921111 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 13.03.1992 (24) Alkupäiva - Löpdag 14.09.1990 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 13.03.1992 (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/US90/05251 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 15.09.1989 US 408036 P (73) Haltija - Innehavare 1 The General Hospital Corporation, Fruit Street, Boston, MA 02114, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Brigham and Women's Hospital, 75 Francis Street, Boston, MA 02115, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Michel,James L., 196 Winslow Road, Waban, MA 02168, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 2 Kasper,Dennis L., 544 Ward Street, Newton Centre, MA 02159, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) 3 Ausubel,FrederIck M., 271 Lake Avenue, Newton, MA 02161, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab Iso Roobertinkatu 4-6 A, 00120 Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä konjugaattirokotteen valmistamiseksi B-ryhmän streptokokkeja vastaan Förfarande för framställning av konjugatvaccin mot streptokocker av typ B (83) Mikro-organismitalletus - Deposition av mikroorganism:40659 ATCC 40660 ATCC (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer USA 4673574 (A61K 39/02), USA 4356170 (A61K 39/385), USA 4830852 (CO7K 15/04), WO A 87/06267 (C12P 19/04), infection and Immunity vol. 55 (1987) nro 5, p. 1151-1155, The New England Joumal of Medicine vol. 319 (1988) nro 18, pp 1180-1185 (57) Tiivistelmä - Sammandrag Rokote, joka pystyy antamaan saajalleen suojan B-ryhmän Streptococcus-bakteerien aiheuttamaa infektiota vastaan. Rokote valmistetaan konjugoimalla (a) polysakkaridi (b) proteiiniin, jolloin sekä mainittu polysakkaridi että mainittu proteiini ovat B-ryhmän Streptococcus-bakteerin karakteristisia molekyylejä. Ett vaccin, som förmår ge mottagaren skydd mot infektion förorsakad av typ B Streptococcus bakterier. Vaccinet framställs genom att konjugera (a) en polysackarid med (b) ett protein, varvid både den nämnda polysackariden och det nämnda proteinet är karakteristiska molekyler för typ B Streptococcus bakterier.

Menetelmä konjugaattirokotteen valmistamiseksi B-ryhmän streptokokkeja vastaan - Förfarande för framställning av konjugatvaccin mot streptokocker av typ B 5 Keksinnön ala Tämä keksintö liittyy mikrobiologiaan ja rokotteisiin ja koskee menetelmää rokotteen valmistamiseksi, joka rokote 10 antaa immuunisuojan B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan. Keksinnön tausta 15 Streptococcus -suvun bakteerien on osoitettu aiheuttavan infektioita ihmisissä ja eläimissä. Streptococcus -bakteerit jaetaan immunologisiin ryhmiin niiden soluseinämässä esiintyvien spesifisten antigeenisten hiilihydraattien perusteella. Nykyisin jako suoritetaan ryhmiin A...0 20 (Davis, B.D. ym., Microbiology, 3. painos, s. 609, (Har- per & Row, 1980). Streptokokit ovat yleisimpiä ja tärkeimpiä sairauden aiheuttajia ihmiselle. Vaikka B-ryhmän Streptococcus -bakteerit aiheuttavat pää- 25 asiassa eläinkunnan sairauksia (esim. lehmän utaretulehduksia), Streptococcus agalactiae (eräs B-ryhmän streptokokki) on noussut yleisimmäksi vastasyntyneiden septisen yleismyrkytyksen syyksi Yhdysvalloissa ja sen arvioidaan aiheuttavan yli 6000 kuolemantapausta vuodessa (Hill, 30 H.R. ym., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, s. 397...407). B-ryhmän streptokokit ovat myös merkittävä patogeeni pikkulasten viivästyneessä aivokalvontulehduksessa, syntymän jälkeisessä kohdun limakalvon tulehduksessa ja immuunivasteeltaan heikentyneiden aikuisten saa- 35 missa infektioissa (Patterson, M.J. ym., Bact. Rev. 40:774...792 (1976)). Vaikka tämä mikro-organismi on herkkä antibiooteille, sen tarttuvuus on korkea ja sen aiheuttaman myrkytystilan nopea alku vastasyntyneissä ja

2 aivokalvotulehduksen nopea alku pikkulapsissa aiheuttaa sekä korkean sairastuvuuden (50 %) että kuolleisuuden (20 %) (Baker, C.J. ym., New Eng. J. Med. (pääkirj.) 314(26):1702...1704 (1986); Baker, C.J. ym., J. Infect. 5 Dis. 136:137...152 (1977)). B-ryhmän streptokokit ovat yleinen osa ihmisen normaalissa emättimen ja paksusuolen bakteerikannassa. Vaikka yleisin tarttumistapa vastasyntyneisiin on synnytyksen 10 aikainen infektoituminen emättimen bakteerikannasta, myös sairaalan sisäinen infektio vastasyntyneiden osastolla on kuvattu (Patterson, M.J. ym., Bact. Rev. 40:774...792 (1976)). Kuitenkin ainoastaan pieni osa pikkulapsista, jotka altistuvat B-ryhmän streptokokkien muodostamalle 15 bakteerikannalle, saa vakavan infektion. Alkuperäisen isännän ominaisuuksiin ja bakteerikannan virulenssiin liittyvien tekijöiden merkitystä bakteerikannan muuttumisessa infektion aiheuttajaksi ei tunneta tarkoin. 20 Useilla B-ryhmän streptokokkien proteiineilla on arveltu olevan merkitystä sekä virulenssin että immuniteetin kannalta (Ferrieri, P., Rev. Infect. Dis. 10:S363 (1988)). Vuonna 1975 Lancefield määritti B-ryhmän streptokokkien C-proteiinien kyvyn antaa suojaava immuniteetti (Lance- 25 field, R.C. ym., J. Exp. Med. 142:165...179 (1975)). Tämän proteiiniryhmän uskotaan sisältävän useita erilaisia polypeptidejä ja antigeenisia determinantteja. Yritykset B-ryhmän streptokokkien aiheuttamien infektioiden torjumiseksi ovat näiden tulosten pohjalta suuntautuneet en- 30 naltaehkäisevään antibioottihoitoon ja rokotteiden kehittämiseen B-ryhmän streptokokkeja vastaan (Baker, C.J. ym., Rev. of Infec. Dis. 7:458...467 (1985), Baker, C.J. ym. New Eng. J. Med. (pääkirj.) 314(26):1702...1704 (1986)). Polysakkaridi-tyyppisiä rokotteita B-ryhmän 35 streptokokkeja vastaan on kuvattu seuraavissa lähteissä: Kasper, D.L. (US patentti 4 207 414 ja US uusintapatentti RE31672 ja US patentit 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221,

3 5 4 367 222 ja 4 367 223), Carlo, D.J. (US patentti 4 413 057, EP-patenttijulkaisu 38 265) ja Yavordios, U. ym. (EP-patenttijulkaisu 71 515), jotka kaikki referenssit on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi. Lukuunottamatta pientä pikkulasten aliryhmää, jonka kohdalla voidaan määrittää sekä äidin bakteerikannasta B- ryhmän Streptococcus -bakteerit että muut syntymän jälkeiset riskitekijät, ei ennaltaehkäisevä antibioottien 10 käyttö ole osoittautunut käyttökelpoiseksi eikä tehokkaaksi menetelmäksi estämään sairastumistapausten suurin- ta ryhmää (Boyer, K.M. ym., New Eng. J. Med. 314(26): 1665...1669 (1986)). Synnytyksen aikainen kemoprofylaksia ei ole saanut laajempaa hyväksymistä seuraavista syistä: 15 (1) B-ryhmän Streptococcus -bakteerien nopea, luotettava ja kustannuksiltaan edullinen tunnistus äidin bakteerikannasta ei ole ollut mandollista, (2) noin 40 % syntymän jälkeisistä infektiotapauksista sattuu pieniriskisiksi arvioiduissa olosuhteissa, (3) kaikkien potentiaalisten 20 riskiryhmään kuuluvien äitien ja pikkulasten seulonta ja/tai hoito ei ole osoittaunut mandolliseksi käytännössä, ja (4) ennalta ehkäisevä antibioottihoito ei ole pystynyt estämään viivästynyttä aivokalvotulehdusta (7200 tapausta/vuosi Yhdysvalloissa) eikä synnytyksen jälkeistä 25 kohdun limakalvon tulehdusta (45 000 tapausta vuodessa) (Baker, C.J. ym., New Eng. J. Med. (pääkirj.) 314:1702... 1704 (1986)). 30 Mikro-organismien talletus Plasmidin pux12 johdannaisina kehitetyt plasmidit pjms1 ja pjms23 sisältävät DNA-materiaalia, joka pystyy koodaamaan Streptococcus -bakteereille antigeenisia proteiineja, joita puolestaan käytetään tässä keksinnössä. Plasmi- 35 di pux12 on plasmidin puc12 johdannainen. Plasmidit pjms1 ja pjms23 on talletettu syyskuun 15. päivänä 1989 American Type Culture Collection -keskukseen, Rockville, MD.,

4 ja niiden tunnuksiksi on vastaavasti annettu ATCC 40659 ja ATCC 40660. Keksinnön yhteenveto 5 Streptococcus agalactiae -bakteerit aiheuttavat suurimman osan syntymänjälkeisistä septisistä myrkytystiloista Yhdysvalloissa ja johtavat 6000...10 000 kuolemantapaukseen vuodessa. Vaikka B-ryhmän Streptococcus -bakteerille omi- 10 nainen polysakkaridi-yhdisteistä muodostuva solukalvo toimii immunogeenisesti ja sisältää tärkeitä suojaavia antigeeneja, polysakkaridi-pohjaisten rokotteiden kliinisissä käyttökokeissa on saatu huono vaste (Baker, C.J. ym., New Eng. J. Med. 319:1180 (1980); Insel, R.A. ym., 15 New Eng. J. Med. (pääkirj.) 319(18):1219...1220 (1988)). Tämän keksinnön kohteena on konjugaattirokotteen valmistaminen B-ryhmän Streptococcus (erityisesti Streptococcus agalactiae) -bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan, 20 jossa rokotetteessa käytetään suojaavaa antigeeni-proteiinia, jota B-ryhmän Streptococcus -bakteerista kloonattu geeni ilmentää. Tämän uuden konjugaattirokotteen etuina ovat, että se antaa T-soluista riippuvan suojan, joka johtuu kantajaproteiinin suotuisasta lisävaikutuksesta, 25 ja että se myös sisältää lisäsuojana toimivia epitooppeja, jotka sisältyvät kloonattuun B-ryhmän Streptococcus 30 -bakteerin proteiiniin (Insel, R.A. ym., New Eng. J. Med. (pääkirj.) 319(18):1219...1220 (1988); Baker, C.J. ym., Rev. of Infec. Dis. 7:458...467 (1985)). Keksintö koskee erityisesti menetelmää konjugaattirokotteen valmistamiseksi, joka rokote pystyy antamaan saajalleen suojan, ts. antamaan isännälle immuniteetin B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttamaa infektiota vastaan 35 ja jonka muodostaa (a) polysakkaridi, joka on konjugoitu (b) proteiiniin, jolloin sekä mainittu polysakkaridi että mainittu proteiini ovat B-ryhmän Streptococcus -bakteerin

5 karakteristisia molekyyleja. Kuvioiden lyhyt selostus 5 Kuvio 1 esittää plasmidin puc12 muuntamisen plasmidiksi pux12. 10 Kuvio 2 esittää plasmidin pux12 restriktio- ja transkriptiokarttaa. Kuvio 3 esittää muutokset, joilla plasmidista pux12 saadaan +1-lukukehysplasmidi pux12+1 (A) ja vastaavasti -1-lukukehysplasmidi pux12-1 (C). Kaavio (B) esittää toisen rakenteen, joka myös pystyy tuottamaan -1-lukukehys- 15 plasmidin. Kuvio 4 esittää tulokset hiirillä suoritetuista rokotteen suojausvaikutuskokeista, joissa käytettiin kaniinista saatua antiseerumia, joka oli muodostettu Sl- ja S23-pro- 20 teiineja vastaan. Suojausvaikutus todettiin hiirissä, jotka oli rokotettu anti-sl-antiseerumilla (p<0,002) ja anti-s23-antiseerumilla (p<0,022). Koe-eläinten määrään suhteutettuna ei tämä ero Sl- ja S23-kokeissa havaittujen tilastollisten merkitsevyyksien välillä ole merkitsevä. 25 Kuviossa kunkin pylvään yläpuolella oleva suhdeluku on eloonjääneiden hiirien määrän suhde hiirien kokonaismäärään. 30 KEKSINNÖN EDULLISTEN SOVELLUSMUOTOJEN KUVAUS Merkitys ja kliiniset näkymät Äidin immunoprofylaktinen hoito B-ryhmän Streptococcus -bakteereita vastaan vaikuttavalla rokotteella on ollut 35 ehdolla eräänä potentiaalisena vaihtoehtona pyrittäessä suojaamaan sekä äiti että vastasyntynyt infektioilta synnytyksen jälkeistä vasta-aineiden siirtoa hyväksikäyttäen

(Baker, C.J. ym., New Eng. J. Med. (pääkirj.) 314(26): 1702...1704 (1986); Baker, C.J. ym., New Eng. J. Med. 319:1180 (1988); Baker, C.J. ym., J. Infect. Dis. 7:458 (1985)). Kuten muidenkin kapselirakenteisten bakteerien 5 kohdalla, infektioalttius korreloi tyyppispesifisen vasta-aineen puuttumisen kanssa (Kasper, D.L. ym., J. Clin. Invest. 72:260...269 (1983), Kasper, D.L. ym., Antibiot. Chemother. 35:90...100 (1985)). Opsonoivien tyyppispesifisten antikapsulaaristen B-ryhmän Streptococcus 10 -bakteereita vastaan vaikuttavien vasta-aineiden puuttuminen muodostaa riskitekijän niissä sairauksissa, jotka aiheutuvat B-ryhmän Streptococcus -bakteerien lisääntymisestä (Kasper, D.L. ym., J. Infec. Dis. 153:407...415 (1986)). 15 Eräs hoitomenetelmä on ollut rokottaminen puhdistetuilla tyyppispesifisillä polysakkarideilla, jotka on saatu bakteerin solukalvosta. Menetelmiä näiden rokotteiden valmistamiseksi ja niiden käyttämiseksi B-ryhmän Streptococ- 20 cus -bakteereita vastaan on kuvattu seuraavissa lähteissä: Kasper, D.L. (US patentti 4 207 414 ja US uusintapatentti RE31672 ja US patentit 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221, 4 367 222 ja 4 367 223), Carlo, D.J. (US patentti 4 413 057, EP-patenttijulkaisu 38 265) ja Yavor- 25 dios, D. ym. (EP-patenttijulkaisu 71 515), jotka kaikki referenssit on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi. 6 Vaikka B-ryhmän Streptococcus -bakteerien polysakkaridirakenteinen solukalvo on hyvin tunnettu ja sen on osoi- 30 tettu esittävän merkittävää osaa sekä bakteerin virulenssissa että bakteeria vastaan muodostuvassa immuniteetissa (Kasper, D.L., J. Infect. Dis. 153:407 (1986)), solukalvon osasten on todettu vaihtelevan immunogeenisiltä ominaisuuksiltaan sekä solukalvon erityisen rakenteen että 35 infektion kohteen oman immuunijärjestelmän mukaan (Baker, C.J. ym., Rev. of Infect. Dis. 7:458...467 (1985)). Äskettäin päättynyt kliininen kokeilu, jossa tutkittiin B-

ryhmän Streptococcus -bakteerien solukalvon polysakkarideista tehdyn rokotteen tehoa, saatiin kokonaisvasteeksi 63 %, joten tällainen rokote ei vielä edusta optimaalista immunogeenista ratkaisua (Baker, C.J. ym., New Eng. J. 5 Med. 319(18):1180...1185 (1988)). 7 Vaihteluita immunogeenisyydessä on havaittu myös muiden bakteerien solukalvojen polysakkaridien yhteydessä. Esimerkiksi, C-ryhmän meningokokkien solukalvosta tehdyt ro- 10 kotteet ovat olleet hyvin tehokkaita, kun taas B-ryhmän meningokokkien polysakkaridi-rokote ei ole immunogeeninen (Kasper, D.L. ym., J. Infec. Dis. 153:407...415 (1986)). Infektion saajan T-soluista riippumaton immuunivaste on usein tarpeen, jotta vasta-aineisiin perustuva vaste syn- 15 tyisi polysakkaridi-antigeeneille. T-soluista riippumattoman immuunivasteen puuttuminen polysakkaridi-antigeeneja vastaan voi olla syynä siihen alhaiseen B-ryhmän Streptococcus -bakteerien vasta-ainetasoon, joka on todettavissa äideissä, joiden lapset myöhemmin saavat B- 20 ryhmän streptokokki-infektion. Tämän lisäksi on lapsissa ennen 18...24 kuukauden ikää heikosti kehittynyt immuunivaste T-soluista riippumattomille antigeeneille. B-ryhmän Streptococcus -bakteerien virulenssiin ja im- 25 muuniteettiin liittyvät tekijät B-ryhmän Streptococcus -bakteereista esiintyy viisi serotyyppiä, joilla on yhteinen ryhmäspesifinen polysakkaridi-antigeeni. Tälle ryhmäantigeenille muodostuva vasta- 30 aine ei kuitenkaan ole tehokas eläinkokeissa. Lancefield luokitteli ensimmäisenä B-ryhmän Streptococcus -bakteerit neljään serotyyppiluokkaan (Ia, Ib, II ja III) käyttäen presipitiini-tekniikkaa. Näiden erilaisten, kullekin serotyypille ominaisten solukalvon polysakkaridien koostu- 35 mus ja rakenne määritettiin myöhemmin (Jennings, H.J. ym., Biochem. 22:1258...1264 (1983); Kasper, D.L. ym., J. Infec. Dis. 153:407...415 (1986); Wessels, M.R. ym.,

8 Trans. Assoc. Amer. Phys. 98: 384...391 (1985)). Wilkinson määritteli vielä viidennen serotyypin, Ic, tunnistamalla proteiini-antigeenin (jota aluksi kutsuttiin Ibcproteiiniksi), joka esiintyy kaikissa serotyypin Ib bak- 5 teerikannoissa ja myös joissakin tyypin Ia solukalvon omaavissa bakteerikannoissa (Wilkinson, H.W. ym., J. Bacteriol. 97:629...634 (1969); Wilkinson, H.W. ym., Infec. and Immun. 4:596...604 (1971)). Tämän proteiinin todettiin myöhemmin esiintyvän vaihtelevassa määrin B-ryhmän 10 Streptococcus -bakteerien eri kannoissa mutta puuttuvan serotyypin Ia kannan bakteereista (Johnson, D.R. ym. J. Clin. Microbiol. 19:509...510 (1984)). Nimikkeistöä on äskettäin muutettu siten, että B-ryhmän 15 Streptococcus -bakteerit luokitellaan yksinomaan niiden solukalvotyypille ominaisten polysakkaridien mukaan, jolloin on myös kuvattu viides solukalvotyyppi (tyyppi IV) (Pritchard D.G. ym., Rev. Infec. Dis. 10(8):5367...5371 (1988)). Näin ollen, B-ryhmän Streptococcus -bakteerien 20 tyypitys ei enää perustu antigeeniseen Ibc-proteiiniin, jonka nimitys nykyään on C-proteiini. Tyypin Ic bakteerikanta on luokiteltu uudelleen serotyypiksi Ia sen solukalvon polysakkaridikoostumuksen perusteella, jolloin on 25 myös todettu sen sisältävän C-proteiinia. Nykyinen immunologinen, epidemiologinen ja geneettinen tietämys sallii olettaa, että tyyppispesifisellä kapselirakenteella on tärkeä merkitys, kun elimistö muodostaa immuniteetin B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheut- 30 tamia infektioita vastaan. Kapselin tyyppispesifisten polysakkaridien koostumus ja rakenne sekä niiden merkitys bakteerin virulenssin ja immuniteettikäyttäytymisen kannalta on ollut tiiviin tutkimuksen kohteena (Ferrieri, P. ym., Infec. Immun. 27:1023...1032 (1980), Krause, R.M. 35 ym., J. Exp. Med. 142:165...179 (1975), Levy, N.J. ym., J. Infec. Dis. 149:851...860 (1984), Wagner, B. ym., J. Gen. Microbiol. 118:95...105 (1980), Wessels, M.R. ym.,

9 Trans. Assoc. Amer. Phys. 98:384...391 (1985)). Ristiriitaisia mielipiteitä on esiintynyt tyyppispesifisten ja B-ryhmän streptokokkien polysakkaridien rakenteel- 5 lisesta sijainnista solukalvon ulkopinnalla, immunologisesti merkityksellisten determinanttien sijainnista polysakkaridin sisällä ja B-ryhmän Streptococcus -bakteerien kapselin määräämästä bakteerin virulenssista (Kasper, D.L. ym., J. Infec. Dis. 153:407...415 (1986)). Tutkies- 10 saan kapselin osuutta bakteerin virulenssiin Rubens on työtovereineen käyttänyt transposonien mutageenisuutta luodessaan kapselittoman muunnoksen serotyypin III B-ryhmän Streptococcus -bakteerikannasta (Rubens, C.E. ym., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7208...7212 (1987)). Työ- 15 ryhmä osoitti, että kapselin poistaminen johtaa merkittä- vään virulenssin alenemiseen kokeissa, joissa kohde-eläimenä ovat vastasyntyneet rotat. Silti on todettu, että vastaavalla kapselirakenteella varustettujen kliinisistä olosuhteista eristettyjen bakteerikantojen virulenssissa 20 esiintyy laajoja vaihteluja. Tämän perusteella on syytä olettaa, että kapselin lisäksi bakteerin virulenssiin vaikuttaa muitakin tekijöitä, joilla on osuutensa B-ryhmän Streptococcus -bakteerien patogeneesissa. 25 B-ryhmän Streptococcus -bakteereille on kuvattu joukko proteiineja ja muita bakteerin osia, joiden merkitystä virulenssiin ja immuniteettiin ei ole vielä vahvistettu, kuten CAMP (Christine Atkins-Much Peterson) -tekijä, pigmentti (mandollisesti karotenoidi), R-antigeeni, X-anti- 30 geeni, antifagosyyttiset tekijät ja heikosti määritetyt "hengityselimiin vaikuttavat toksiinit" (Ferrieri, P. ym., J. Exp. Med. 151:56...68 (1980), (Ferrieri, P. ym., Rev. Inf. Dis. 10(2)1004...1071 (1988), Hill, H.R. ym., Sexually Transmitted Diseases, McGraw-Hill, s. 397... 35 407). C-proteiinien merkitys on kuvattu seuraavassa tekstissä.

1 0 B-ryhmän Streptococcus -bakteerien isogeeniset kannat, joissa ei ole hemolysiinia, eivät osoita virulenssin vähenemistä vastasyntyneissä rotissa koeolosuhteissa (Weiser, J.N. ym., Infec. and Immun. 55:2314...2316 (1987)). 5 Kliinisistä olosuhteista eristettyjen, infektioita aihe- uttavien bakteerikantojen kohdalla ei aina ole löydetty hemolysiinia tai neuramidaasia. CAMP-tekijä on B-ryhmän Streptococcus -bakteerien solun ulkopinnan proteiini, jonka molekyylipaino on 23,5 kd ja joka stafylokokkien 10 betatoksiinin (eräs sfingomyelinaasi) läsnäollessa aiheuttaa erytrosyyttien solukalvojen hajoamisen. CAMP-tekijän muodostumista ohjaava geeni B-ryhmän Streptococcus -bakteereissa on äskettäin kloonattu ja ilmennetty E. coli -bakteereissa (Schneewind, 0. ym., Infec. and Immun. 15 56:2174...2179 (1988)). Miten paljon, jos lainkaan, sellaiset vaikuttajat kuten CAMP-tekijä, X- ja R-antigeenit ja muut edellä esitetyt osallistuvat B-ryhmän Streptococcus -bakteerien patogeneesiin, ei käy ilmi tunnetuista lähteistä (Fehrenbach, F.J. ym., teoksessa: Bacterial 20 Protein Toxins, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1988), Hill, H.R. ym., Sexually Transmitted Diseases, McGraw- Hill, NY, s. 397...407 (1984)). C-proteiinit ovat ryhmä B-ryhmän Streptococcus -baktee- 25 rien solukalvoon liittyviä antigeeniproteiineja, joiden ensimmäisen eristämisen B-ryhmän streptokokeista suoritti Wilkinson työtovereineen (Wilkinson, H.W. ym., J. Bacteriol. 97:629...634 (1969), Wilkinson, H.W. ym., Infec. and Immun. 4:596...604 (1971)). Työryhmä käytti kuumaa 30 kloorivetyhappoa (HC1) solukalvon irrottamiseen ja trikloorietikkahappoa (TCA) antigeeniproteiinien saostamiseen. C-proteiineista on kuvattu kaksi antigeenisesti erilaista ryhmää: (1) Pepsiinillä mutta ei trypsiinillä hajoavat proteiinit eli TR (trypsiiniresistentit) prote- 35 iinit eli a-proteiinit. (2) Toinen ryhmä muodostuu B-ryhmän Streptococcus -bakteerien proteiineista, jotka hajoavat sekä pepsiinillä että trypsiinillä, ja se tunnetaan

1 1 TS- (trypsiiniherkkä) eli P-proteiinien ryhmänä (Bevanger, L. ym., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 87: 51...54 (1979), Bevanger, L. ym., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 89:205...209 (1981), Bevanger, L. ym., 5 Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 91:231...234 (1983), Bevanger, L. ym., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 93:113...119 (1985), Bevanger, L. ym., Acta Path. Microbio. Immunol. Scand. Sect. B. 93:121...124 (1985), Johnson, D.R. ym., J. Clin. Microbiol. 19:506...510 (1984), 10 Russell-Jones, G.J. ym., J. Exp. Med. 160:1476...1484 (1984)). Vuonna 1975 Lancefield työtovereineen suoritti hiirten immunisointitutkimuksia käyttäen kaniineissa muodostettua 15 antiseerumia, jolla hän määritti C-proteiinien funktio- naalisen kyvyn antaa immuniteetti sellaisia B-ryhmän Streptococcus -bakteerikantoja vastaan, joissa on samanlaisia antigeeniproteiineja (Lancefield, R.C. ym., J. Exp. Med. 142:165...179 (1975)). Useat tutkijat ovat val- 20 mistaneet epäpuhtaita preparaatteja B-ryhmän Streptococcus -bakteerien antigeeniproteiineista, joita he ovat kutsuneet C-proteiineiksi, käyttäen kloorivetyhappoa (HC1) tai pintajännityksen alentajia proteiinien uuttamiseen soluseinämästä (Bevanger, L. ym., Acta Path. Micro- 25 bio. Scand. Sect. B. 89:205...209 (1981), Bevanger, L. ym., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 93:113...119 35 (1985), Russell-Jones, G.J. ym., J. Exp. Med. 160:1476... 1484 (1984), Valtonen, M.V. ym., Microb. Path. 1:191... 204 (1986), Wilkinson, H.W. ym., Infec. and Immun. 4: 30 596...604 (1971)). Näin saatujen antigeeniproteiinien koot ovat vaihdelleet välillä 10...190 kd ja mikään näistä työryhmistä ei ole eristänyt tai karakterisoinut preparaateista yhtä erillistä proteiinia (Ferrieri, P. ym., Rev. Inf. Dis. 10(2):1004...1071 (1988)). Suoritettaessa seulontaa suojaavan antiseerumin avulla on voitu todeta C-proteiinien esiintyminen noin 60 %:ssa

12 I' niistä B-ryhmän Streptococcus -bakteerikannoista, jotka on eristetty kliinisissä olosuhteissa ja esiintyminen on havaittavissa kaikissa bakteerin serotyypeissä mutta vaihtelevalla esiintymistiheydellä (Johson, D.R. ym., J. 5 Clin. Microbiol. 19:506...510 (1984)). Yksittäisissä eristetyissä B-ryhmän Streptococcus -bakteerikannoissa voi esiintyä sekä TR- että TS-tyyppisiä antigeenejä yhdessä, erikseen tai ei lainkaan. Näiden antigeenien patogeenista osuutta ei ole tutkittu koeputkiolosuhteissa 10 lukuunottamatta tutkimuksia, joissa on mitattu osittain puhdistettujen antigeenien kykyä antaa suojaava immuniteetti. C-ryhmän proteiineja sisältävän B-ryhmän Streptococcus -bakteerien in vivö-tutkimukset antavat joitakin viitteitä C-proteiinien osuudesta opsonisaatio- 15 resistenssin syntymiseen (Payne, N.R. ym., J. Infec. Dis. 151:672...681 (1985)) ja C-proteiinien kyvystä estää B- ryhmän Streptococcus -bakteerien tappaminen fagosytoosin suorittaneen solun sisällä (Payne, N.R. ym., Infec. and Immun. 55:1243...1251 (1987)). On osoitettu, että C-pro- 20 teiineja sisältävät serotyypin II kannat B-ryhmän Streptococcus -bakteereista ovat virulentimpia, kun sepsiskokeissa käytetään koe-eläiminä vastasyntyneitä rottia (Ferrieri, P. ym., Infec. Immun. 27:1023...1032 (1980), Ferrieri, P. ym., Rev. Inf. Dis. 10(2):1004...1071 25 (1988)). Koska C-proteiineista ei ole saatavissa geneettistä tietoa, ei tutkimuksia C-proteiineja sisältämättömistä isogeenisista bakteerikannoista ole aikaisemmin suoritettu. Todisteita on olemassa siitä, että jokin TSeli P-tyyppisistä C-proteiineista pystyy sitoutumaan IgA- 30 immunoglobuliiniin (Russell-Jones, G.J. ym., J. Exp Med. 160:1476...1484 (1984)). Tutkimustuloksia virulenssin mandollisesta muuttumisesta, kun C-proteiinit sitoutuvat IgA-immunoglobuliiniin, ei kuitenkaan ole julkaistu. 35 Vuonna 1986 Valtonen työtovereineen eristi B-ryhmän Streptococcus -bakteerien viljelmän supernatantista proteiineja, joilla oli suojaava vaikutus hiirikokeissa

13 (Valtonen, M.V. ym., Microb. Path. 1:191...204 (1986)). Työryhmä määritti ja osittain puhdisti trypsiiniresistentin B-ryhmän Streptococcus -bakteerien proteiinin, jonka molekyylipaino oli 14 kd. Kun hiiret rokotettiin tälle 5 proteiinille kaniineissa muodostetulla antiseerumilla, saatiin B-ryhmän Streptococcus -bakteereilla tämän jälkeen suoritettua altistusta vastaan suojaus (89 % suojausvaikutus). Tämä proteiini on siis Lancefieldin määritelmän mukaisesti C-proteiini. Kuitenkin, kun tälle pro- 10 teiinille muodostettua antiseerumia käytettiin immuunisaostukseen B-ryhmän Streptococcus -bakteerien antigeeneista muodostetussa uutteessa, osa korkeamman molekyylipainon proteiineista todettiin kykeneviksi reagoimaan. Näin ollen voidaan olettaa, että 14 kd molekyylipainoinen 15 proteiini saattaa edustaa useampaa B-ryhmän Streptococcus -bakteerien proteiinien epitooppia, tai vaihtoehtoisesti että se on B-ryhmän Streptococcus -bakteerien viljelmien supernatantissa esiintyvä hajoamistuote. Kokovaihtelu, joka esiintyy toisaalta bakteerisoluista ja toisaalta 20 niiden supernatantista eristettyjen C-proteiinien välil- 25 lä, antaa aiheen olettaa, että C-proteiinit saattavat edustaa geeniperhettä, jonka tarkoituksena on säilyttää antigeeninen monimuotoisuus, jonka tehtävänä on antaa suojaus immuunijärjestelmää vastaan. Laaja julkaistujen molekyylipainojen vaihtelualue ja vaikeudet eristettyjen C-proteiinien puhdistamisessa ovat samankaltaisia kuin mitä monet tutkijat kohtasivat eristettäessä A-ryhmän Streptococcus -bakteerien M-proteii- 30 neja (Dale, J.B. ym., Infec. and Immun. 46(1):267...269 (1984), Fischetti, V.A. ym., J. Exp Med. 144:32...53 (1976), Fischetti, V.A. ym., J. Exp Med. 146:1108...1123 (1977)). M-proteiinia koodaava geeni on nyttemmin kloonattu ja sekvensoitu, jolloin sen on todettu sisältävän 35 joukon toistuvia DNA-sekvenssejä (Hollingshead, S.K. ym., J. Biol. Chem. 261:1677...1686 (1986), Scott, J.R. ym., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1822...1826 (1986), Scott,

14 J.R. ym., Infec. and Immun. 52:609...612 (1986)). Nämä toistuvat sekvenssit voivat olla syynä siihen transkription jälkeiseen prosessiin, jonka tuloksena syntyy suuri vaihtelu M-proteiinien molekyylipainoissa. Tämän ilmiön 5 syytä ei tunneta. B-ryhmän Streptococcus -bakteerien C- proteiinien molekyylipainojen vaihtelu voi olla vastaavan prosessin tulos. Cleat työtovereineen on yrittänyt kloonata C-proteiineja 10 käyttäen kahta, Bevangerin valmistamaa, B-ryhmän Streptococcus -bakteereita vastaan kohdennettua antiseerumi-preparaattia (a ja tarkoituksenaan seuloa B-ryhmän Streptococcus -bakteerien DNA-kirjastoa E. coli -bakteereissa (Bevanger, L. ym., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. 15 Sect. B. 93:113...119 (1985), Cleat, P.H. ym., Infec. and Immun. 55(5):1151...1155 (1987), jotka molemmat lähteet on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). Nämä tutkijat ovat kuvanneet kaksi kloonia, jotka tuottavat antistreptokokkaalisia vasta-aineita sitovia proteiineja. Nämä 20 tutkijat eivät kuitenkaan pystyneet määrittämään sitä, pystyikö kumpikaan näistä kloonatuista proteiineista käynnistämään suojaavan vasta-aineen tuotantoa vai korreloiko näiden geenien hallitseva osuus B-ryhmän Streptococcus -bakteerien C-proteiineja sisältävien kantojen 25 esiintymisen kanssa. Kloonattujen geenisekvenssien osuutta B-ryhmän Streptococcus -bakteerien virulenssiin ei tutkittu. Koska C-proteiinit määritellään niiden vastaaineiden tuotantoa käynnistävän tehon mukaan, edellämainittu tutkimus ei onnistunut selvittämään, pystyikö kum- 30 pikaan kloonatuista geeneistä koodaamaan C-proteiinia. Keksinnön mukainen konjugaattirokote Tämä keksintö pyrkii poistamaan tunnettujen B-ryhmän 35 Streptococcus -bakteeri-infektioita vastaan valmistettujen rokotteiden heikkoudet uudella konjugaattirokotteella, jossa kapsulaariset polysakkaridit on liitetty kova-

15 lenttisidoksilla proteiinirunkoon. Tämä menettely vahvistaa T-soluissa tapahtuvaa vasta-ainemuodostusta, jolla elimistö reagoi kapsulaarisiin polysakkaridi-antigeeneihin, ja ohittaa T-soluista riippumattomat vasta-aineiden 5 muodostusmekanismit (Baker, C.J. ym., Rev. of Infec. Dis. 7:458...467 (1985), Kasper, D.L. ym., J. Infec. Dis. 153:407...415 (1986), jotka lähteet on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). 10 Konjugaattirokotteessa antigeeninen molekyyli kuten B- ryhmän Streptococcus -bakteerin kapsulaarinen polysakkaridi (kuvattu yllä) liittyy kovalenttisidoksella "kantaja"proteiiniin tai johonkin polypeptidiin. Tämä sidos vahvistaa konjugoidun molekyylin antigeenista vaikutusta. 15 Konjugaattirokotteiden muodostaminen antigeeniseta molekyylistä ja kantajaproteiinista tai polypeptidistä on ennestään tunnettu ( Jacob, C.O. ym., Eur. J. Immun. 16: 1057...1062 (1986), Parker, J.M.R. ym., teoksessa: Modern Approaches to Vaccines, Chanock, R.M. ym. (toimittajat), 20 s. 133...138, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983), Zurawski, V.R. ym, J. Immunol. 121: 122...129 (1978), Klipstein, F.A. ym, Infect. Immun. 37:550...557 (1982), Bessler, W.G., Immunobiol. 170: 239...244 (1985), Posnett, D.N. ym, J. Biol. Chem. 263: 25 1719...1725 (1988), Ghose, A.C. ym, Molec. Immunol. 25: 223...230 (1988), jotka kaikki lähteet on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). Konjugaattirokotteiden valmistamiseen sopiva prototyyppi- 30 malli on kehitetty Hemophilus influenzae -bakteereita vastaan (Anderson, P., Infec. and Immun. 39:223...238 (1983), Chu, C. ym, Infect. Immun. 40:245...256 (1983), Lepow, M., Pediat. Infect. Dis. J. 6:804...807 (1987), jotka lähteet on tässä mainittu vertailukohdan saamisek- 35 si), ja tätä mallia voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisen uuden rokotteen valmistamiseen. Muita menetelmiä mainitun konjugaattirokotteen valmistamiseksi ovat esit-

16 täneet Anderson, P.W. ym., EP-patenttijulkaisu 245 045, Anderson, P.W. ym., US-patentit 4 673 574 ja 4 761 283, Frank, R. ym., US-patentit 4 789 735, EP-patenttijulkaisu 206 852, Gordon, L.K., US-patentti 4 619 828 ja Beachey, 5 E.H., US-patentti 4 284 537, jotka kaikki lähteet on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). Proteiinirunkona konjugaattirokotteissa kuten Hemopnilus influenzae -bakteereista kehitetyssä rokotteessa on käy- 10 tetty proteiineja, joilla ei ole sen kohdeorganismin antigeenisia ominaisuuksia, josta bakteerin kapsulaariset polysakkaridit on saatu (Ward, J. ym, In: Vaccines, Plotkin, S.A. ym. (toimittajat), Saunders, Philadelphia, s. 300 (1988)). 15 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetussa konjugaattirokotteessa sitävastoin käytetään B-ryhmän Streptococcus -bakteerin immunogeenisia proteiineja konjugaattirokotteen runkona. Tämän ratkaisun uskotaan johtavan tehok- 20 kaampiin rokotteisiin (Insel, R.A. ym., New Eng. J. Med. (pääkirj.) 319(18):1219...1220 (1988)). Tämän keksinnön mukaisen, proteiini-polysakkaridi-tyyppisen rokotteen yhteydessä karakterisoidaan ensimmäisen kerran sellaiset B-ryhmän Streptococcus -bakteerien proteiinit, joita voi- 25 daan käyttää konjugaattirokotteessa. Mitä tahansa B-ryhmän Streptococcus -bakteereille karakteristista proteiinia voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa rokotteessa. Edullisesti tähän tarkoitukseen käytetään kuitenkin B-ryhmän Streptococcus -bakteerien C-proteiinia. Kuten 30 myöhemmin kuvataan tarkemmin, plasmidit pjms1 ja pjms23 sisältävät DNA-materiaalia, joka koodaa Streptococcus -bakteerien C-proteiinia. Edullisimmat C-proteiinit saadaan ilmentämällä tätä DNA-materiaalia bakteereissa. 35 Kuten yllä on esitetty, tämä keksintö koskee sellaisten geenien kloonausta ja ilmentämistä, jotka koodittavat B- ryhmän Streptococcus -bakteerien suojavaikutuksen omaavia

17 antigeeniproteiineja. Tällaisia proteiineja käytetään mieluiten proteiinirunkona, johon B-ryhmän Streptococcus -bakteerien kapsulaariset polysakkaridit voidaan konjugoida, jolloin saadaan konjugaattirokote näitä baktee- 5 reita vastaan. Lisäksi näiden proteiinien osuutta B-ryhmän Streptococcus -bakteerien virulenssiin ja immuniteettiin voidaan käyttää hyväksi kehitettäessä lisähoitomenetelmiä B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan. Näiden bakteeriperäisten geenien 10 eristäminen ja karakterisointi tekee mandolliseksi geenituotteiden manipuloinnin konjugaattirokotteen polypeptidirungon/kantajan sekä adjuvantti- että antigeeniominaisuuksien optimoimiseksi. 15 C-proteiinien geneettiset tutkimukset Tämä keksintö koskee siis B-ryhmän Streptococcus -bakteerien C-pröteiinien kloonausta, niiden osuutta bakteerin virulenssiin ja immuniteettikäyttäytymiseen ja niiden 20 kykyä toimia B-ryhmän Streptococcus -bakteereita vastaan kehitettyjen konjugaattirokotteiden immunogeeneina. Vaikka kirjallisuudessa on löydettävissä useita viitteitä useiden streptokokkiryhmien kloonaukseen, vain vähäinen 25 määrä viitteitä on olemassa B-ryhmän Streptococcus -bakteerien geenitekniikkaan (Macrina, F.L. ym, Ann. Rev. Microbiol. 38:193...219 (1984), Wanger, A.R. ym, Infec. and Immun. 55:1170...1175 (1987)). Eniten käytetty tekniikka B-ryhmän Streptococcus -bakteerien kohdalla perus- 30 tuu Tn916-geenin kehittämiseen ja sen käyttöön transposoni-mutageneesissa (Rubens, C.E. ym., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7208...7212 (1987), Wanger, A.R. ym., Res. Vet. Sci. 38:202...208 (1985)). Koska kuitenkin näyttää siltä, että useampi kuin yksi geeni koodaa C-proteiineja 35 ja että suojaava antiseerumi sitoo useampia proteiineja, C-proteiineja koodaavien geenien seulonta transposonimutageneesilla on epäkäytännöllistä.

18 Tässä keksinnössä C-proteiinien (ja muiden B-ryhmän Streptococcus -bakteerien virulenssiin tai B-ryhmän Streptococcus -bakteerien isäntäimmuniteettiin liittyvien proteiinien) kloonaus toteutetaan uudentyyppisellä plas- 5 midivektorilla. Tähän tarkoitukseen käytetään edullisesti kloonausvektoria, joka voidaan nopeasti seuloa sellaisten proteiinien ilmentymisen suhteen, jotka sitoutuvat B-ryhmän Streptococcus -bakteereita vastaan luonnostaan syntyviin vasta-aineisiin. Koska tällaiset vasta-aineet ovat 10 heterologisia polykionaalisia vasta-aineita eivätkä monoklonaalisia vasta-aineita, osoittautui välttämättömäksi kehittää vektori, jota voidaan helposti käyttää seulomaan useita positiivisia klooneja kiinnostavien geenien tunnistamiseksi. 15 Käytettävissä on ollut useita menetelmiä, joilla voidaan seuloa klooneja spesifistä antiseerumia sitovien antigeenien ilmentymisen suhteen (Aruffo, A. ym., Proc. Acad. Sci. USA 84:8573...8577 (1987)). Yleisimmin käytetyn 20 ÅGT11-menetelmän ovat kehittäneet Young ja Davis (Huynh, T.V. ym., teoksessa: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol. 1 (Glover, D.M. (toimittaja), IRL Press, Washington s. 49...78 (1985), Wong, W.W. ym., J. Immunol. Methods. 82:303...313 (1985), jotka lähteet on tässä mainittu ver- 25 tailukohdan saamiseksi). Tämä tekniikka mandollistaa sellaisten kloonien nopean seulonnan, jotka ilmenevät lysogeenisessa faagissa, joka purkaa sisältönsä faagin hajotessa. Tämän menettelyn yleisiä ongelmia ovat se, että DNA-fragmentit joudutaan alikloonaamaan plasmidivektorei- 30 hin, jotta saataisiin tarkka endonukleaasi-restriktiokartta ja saataisiin koettimien valmistus ja DNA-materiaalin sekvensointi onnistumaan. DNA:n valmistaminen faagikirjastoista on lisäksi hankalaa ja rajoittaa niiden mandollisesti positiivisten kloonien määrää, joka voidaan 35 tutkia tehokkaasti. Lopuksi, raakaproteiiniuutteiden valmistaminen kloonatuista geeneistä lähtien on ongelmallista faagivektori-isännissä.

19 Näiden ongelmien välttämiseksi on tässä keksinnössä kehitetty plasmidivektori, jolla voidaan seuloa kloonattua bakteerin kromosomaalista DNA:ta virulenssiin ja/tai immuniteettiin liittyvien proteiinien ilmentymisen suhteen. 5 Keksintö siis koskee edelleen sellaisen tehokkaan kloonausvektorin kehittämistä ja käyttöä, joka voidaan nopeasti seuloa sellaisten proteiinien ilmentymisen suhteen, jotka sitoutuvat B-ryhmän Streptococcus -bakteereita vastaan luonnostaan syntyviin vasta-aineisiin. Tällai- 10 nen vektori on valmistettu muuntamalla yleisesti tunnettua plasmidikloonausvektoria puc12 (Messing, J. ym., Gene 19:269...276 (1982), Norrander, J. ym., Gene 26:101...106 (1983), Vieira, J. ym., Gene 19:259...268 (1982), jotka lähteet on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). 15 Keksintö koskee seuraavaksi kuvattavaa vektoria ja sen funktionaalisia ekvivalentteja. Tässä esitetyn menetelmän avulla voidaan helposti muokata plasmidiklooneja, kartoittaa restriktioendonukleaasien ja 20 niiden DNA-materiaaliin sijoitettujen inserttien sekvenssien avulla, valmistaa koettimia ja tutkia geenituotteita ilman alakloonausta. Vektori puc12 on 2,73 kiloemäksen kokoinen, suuren kopioluvun omaava plasmidi, joka sisältää ColEl:n replikaation aloituskohtana, ampisilliinire- 25 sistenssin ja polylinkkerin lacz-geenissä (Ausubel, F.M. ym., Current Topics in Molecular Biology, Greene Publ. Assn./ Wiley Interscience, NY (1987), joka lähde on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). 30 puc12:n polylinkkeriin on tehty useita muutoksia (Aruffo, A. ym., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573...8577 (1987), joka lähde on tässä mainittu vertailukohdan saamiseksi). Yleissuunnitelma puc12:n muuntamiseksi oli se, että polylinkkeriä muunnettaisiin sijoittamalla identtisiä mutta 35 ei-kohesiivisia BstXl-kohtia kloonausta varten, sitten lisäämällä "täyte"pala helpottamaan irrottamista lineaarisesta isäntäplasmidista ja tekemään mandolliseksi lac-

20 promoottorin ilmentämisen kaikissa kolmessa translatorisessa lukukehyksessä. Jotta vieraan DNA-materiaalin insertiolle saataisiin hy- 5 väliä tehokkuudella sopiva paikka ja jotta plasmidin itseligaation mandollisuus pienenisi, polylinkkeriin lii- tettiin invertoidut ei-kohesiiviset BstXl päät. Kuten kuvasta 1 ilmenee, puc12 katkaistiin aluksi BamHl:n avulla (Vaihe 1) ja plasmidi sekoitettiin kanden synteettisen 10 oligonukleotidisovittimen kanssa, joiden rakenne on osittain komplementaarinen: nimittäin 15-mer (GATCCATTGTG- CTGG) ja 11-mer (GTAACACGACC) (Vaihe 2). Kun sovittimet ligatoidaan puc12:een, syntyy kaksi uutta BstX1-kohtaa mutta alkuperäiset BamH1-kohdat säilyvät edelleen (Vaihe 15 3). Seuraavaksi plasmidi käsiteltiin polynukleotidikinaasilla ja ligatoitiin, jolloin siitä muodostui suljettu rengasmainen plasmidi (Vaihe 4). Kun tämä plasmidi käsitellään BstXl:llä, syntyvät päät ovat identtisiä ja eikohesiivisia (molemmissa päissä on GTGT-häntä) (Vaihe 5). 20 Polylinkkerin toinen muunnos suoritettiin, jotta lineaarinen plasmidi saatiin kloonausta varten ilman epäpuhtauksien vaaraa puhdistetuksi osittain leikatusta plasmidista, joka voi itseligatoitua. Tylppäpäinen FnuD2-frag- 25 mentti, jossa on 365 emäsparia, saatiin plasmidista pcdm. Tämä kasetti- eli "täyte"fragmentti, joka ei sisällä BstXl-kohtaa, ligatoitiin tylppäpäisenä kahteen synteettiseen oligonukleotidiin, jotka ovat osittain komplementaarisia: nimittäin, 12-mer (ACACGAGATTTC) ja 8-mer 30 (CTCTAAAG) (Vaihe 6). Näin syntyvällä sovittimet sisältävällä fragmentilla on neljän emäsparin hännät (ACAC), jotka ovat komplementaarisia vaiheessa 5 muunnetun puc12- plasmidin päiden suhteen. Muunnettu puc12-plasmidi liga- toitiin pcdm-inserttiin sovittimilla ja näin syntynyt 35 rakenne puxi2 on esitetty kuvassa 2. Tämä pux12-plasmidi voidaan luoda uudelleen plasmideista pjms1 tai pjms23 leikkaamalla niihin tuodut B-ryhmän Streptococcus -bak-

21 teerin DNA-sekvenssit irti. Se voidaan myös vaihtoehtoisesti muodostaa rekombinaatiomenetelmillä (tai homologisella rekombinaatiolla) plasmidin puc12 avulla. 5 Koska pux12:a tullaan käyttämään ilmentämisvektorina, on edullista edelleen muuntaa polylinkkeriä siten, että se sisältää kaikki kolme mandollista lac-promoottorin lukukehystä. Nämä muutokset tekevät mandolliseksi oikean translationaalisen lukukehyksen kloonatuille geenifrag- 10 menteille, joiden toistumistaajuus on 1:6. Kloonattu fragmentti voidaan esimerkiksi insertoida vektoriin jommassa kummassa kandesta mandollisesta orientaatiosta ja yhdessä kolmesta mandollisesta lukukehyksestä. +1-lukukehyksen muodostamiseksi pux12-plasmidi katkaistiin rest- 15 riktioentsyymillä EcoRl, joka katkaisee sen tietystä polylinkkerin kohdasta. Yksisäikeinen tarttuva 5'-pää täytettiin T4 DNA-polymeraasin 5'-3' polymeraasiaktiviteetin avulla ja kaksi tylppää päätä ligatoitiin. Tämä johti EcoRl-kohdan häviämiseen ja uuden Xmnl-kohdan syntymiseen 20 (Kuva 3A). Tämä rakenne varmistettiin todistamalla EcoRlkohdan häviäminen ja uuden Xmnl-kohdan syntyminen polylinkkeriin. Lisäksi kaksisäikeisen DNA:n sekvensointi +1- modifioidussa pux12-plasmidissa suoritettiin käyttäen tavanomaisia sekvensointialukkeita (Ausubel, F. M. ym., 25 Current Topics in Molecular Biology, Greene Publ. Assn./ Wiley Interscience, NY (1987)). DNA-sekvenssi osoitti neljän emäsparin liittymisen polylinkkeriin ja vahvisti pux12-plasmidin muuttumisen +1-lukukehykseksi. Tämä plasmidi on nimeltään pux12+1. 30-1-lukukehyksen muodostamiseksi katkaistiin pux12-vektori restriktioentsyymillä Sacl, jonka katkaisu kohdistuu pux12-polylinkkerin tiettyyn kohtaan. Yksisäikeiset tarttuvat 3'-päät lyhennetään tylpiksi päiksi käyttäen T4 35 polymeraasin 3'-5'-eksonukleaasiaktiviteettia ja syntyvät tylpät päät ligatoidaan. Näin syntyvästä sekvenssistä pitäisi Sacl-kohdan poistua samalla kuin syntyy uusi

22 FnuD2-kohta (kuva 3B). pux12-1-plasmidin restriktiokartta osoitti kuitenkin, että vaikka Sacl-kohta puuttui, yhtään FnuD2-kohtaa ei esiintynyt. Tämän lisäksi myös Smal/Xmalkohdat olivat hävinneet polylinkkeristä. Useita mandolli- 5 sia pux12-1-rakenteita sekvensoitiin "miniprep"illä käsitellystä kaksisäikeisestä DNA:sta. Kuudesta modifioidusta plasmidisekvenssistä vain yhdessä havaittiin kymmenen nukleotidin puuttuvan, jolloin siitä muodostuu -1-lukukehys (Kuva 3C). Tämä antaa aiheen olettaa, että T4 DNA 10 -polymeraasissa on ylimääräistä eksonukleaasiaktiviteettia, jolloin se voi lyhentää pois ylimääräisiä kaksisäikeisiä osia polylinkkeristä. Tuloksena saadussa plasmidissa oli joka tapauksessa -1-lukukehys. Tämä plasmidi on 15 nimeltään pux12-1. pux12-vektorien käyttöä B-ryhmän Streptococcus -bakteerien antigeenisten proteiinien kloonauksessa selostetaan seuraavissa esimerkeissä tarkemmin. Pääpiirteissään kloonaus suoritetaan siten, että B-ryhmän Streptococcus -bak- 20 teereista saatu DNA tai sellaisen DNA-materiaalin komplementaarinen muoto sijoitetaan pux12-, pux12+1- tai pux12-1-vektoreihin ja transformoidaan E. coli -bakteereihin. Kloonattu DNA ilmennetään E. coli -bakteerissa ja siitä saatu solulysaatti testataan sen määrittämiseksi, sisäl- 25 tyykö siihen proteiineja, jotka voivat sitoutua B-ryhmän Streptococcus -bakteereita vastaan valmistettuun antiseerumiin. pux12-plasmidista on olemassa joukko potentiaalisesti 30 kiinnostavia muunnoksia, jotka lisäävät sen käyttökelpoisuutta. Esimerkiksi lac-promoottori voidaan korvata toisella promoottorilla, replikaation alkukohta voidaan muuttaa, jolloin saadaan alhaisemman kopioluvun omaava vektori ja myös lääkeresistenssimarkkeri voidaan vaihtaa. 35 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan rokote, joka muodostuu polysakkaridista (kuten kapsulaarinen poly-

23 sakkaridi), joka on karakteristinen B-ryhmän Streptococcus -bakteereille, konjugoituna proteiiniin, joka myös on karakteristinen B-ryhmän Streptococcus -bakteereille. Tällaisen konjugaattirokotteen "polysakkaridi" ja "pro- 5 teiini" voivat olla identtisiä sellaisen molekyylin kanssa, joka on karakteristinen B-ryhmän Streptococcus -bakteereille, tai ne voivat olla tällaisten molekyylien funktionaalisia johdannaisia. Esimerkkeinä funktionaalisista johdannaisista voidaan mainita luonnollisen prote- 10 iinin osat ja/tai luonnollisen proteiinin muunnokset (kuten proteiinit, joissa on muutoksia aminohapposekvenssissä, mutta jotka oleellisesti säilyttävät samat immunogeeniset, virulentit tai antigeeniset ominaisuudet kuin alkuperäinen luonnollinen molekyyli). Tämän keksinnön ta- 15 voitteiden saavuttamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa polysakkaridia, joka nisäkkään (eläin tai ihminen) elimistöön joutuessaan kehittää vasta-aineita, jotka pystyvät reagoimaan B-ryhmän Streptococcus -bakteerien kanssa. Esimerkkeinä edullisista tämän keksinnön mukaisista poly- 20 sakkarideista ovat B-ryhmän Streptococcus -bakteerien kapsulaariset polysakkaridit tai niiden ekvivalentit. Tämän keksinnön tavoitteiden saavuttamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa proteiinia, joka nisäkkään (eläin tai ihminen) elimistöön joutuessaan kehittää vasta- 25 aineita, jotka joko pystyvät reagoimaan B-ryhmän Streptococcus -bakteerien kanssa tai jotka lisäävät polysakkaridin immunogeenisyyttä kehittämään vasta-aineita B-ryhmän Streptococcus -bakteerin polysakkaridille. Esimerkkeinä edullisista tämän keksinnön mukaisista proteiineista ovat 30 B-ryhmän Streptococcus -bakteerien C-proteiinit tai niiden ekvivalentit. Tämän keksinnön puitteissa on bakteerin polysakkaridi tai proteiini tulkittava "karakteristiseksi", jos sillä on 35 oleellisesti samanlainen rakenne tai sekvenssi kuin molekyylillä, joka luonnostaan liittyy bakteeriin. Tällä käsitteellä tarkoitetaan sekä organismille spesifisiä moly-

24 kyylejä että molekyylejä, vaikka esiintyvät toisissa organismeissa, jotka liittyvät mainitun bakteerin ihmistai eläinisännässä aiheuttamaan virulenssiin tai antigeeniseen aktiviteettiin. 5 Keksinnön mukaisesti valmistettu rokote pystyy antamaan vastustuskyvyn B-ryhmän Streptococcus -bakteereille joko passiivisen tai aktiivisen immunisaation kautta. Eräässä passiivisen immunisaation toteutuksessa annetaan rokotet- 10 ta vapaaehtoiselle isännälle (ihminen tai imettäväinen eläin) ja näin syntynyt antiseerumi otetaan talteen ja siirretään suoraan vastaanottajaan, jonka uskotaan saaneen B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttaman infektion. 15 Mandollisuus leimata vasta-aineita tai vasta-aineiden osia toksiinileimoilla tarjoaa lisämandollisuuden B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttamien infektioiden hoitamiseksi, kun käytetään tämän tyyppistä passiivista 20 immunisaatiota. Tässä sovelluksessa leimataan ne vastaaineet tai vasta-aineen osat, jotka pystyvät tunnistamaan B-ryhmän Streptococcus -bakteerien antigeenit, sopivilla toksiinimolekyyleillä ennen niiden antamista potilaalle. Kun tällaisella toksiinilla muunnettu molekyyli sitoutuu 25 B-ryhmän Streptococcus -bakteerin soluun, toksiiniosa aiheuttaa bakteerisolun kuoleman. Toisessa sovelluksessa annetaan rokotetta naispuoliselle henkilölle (joko raskauden tai synnytyksen aikana tai 30 ennen sitä) riittävän ajan ja riittävässä määrin, jolloin saadaan aikaan antiseerumin muodostus, joka suojaa sekä naishenkilön että sikiön tai vastasyntyneen (vasta-aineiden siirtyessä passiivisesti istukan läpi). 35 Valmistettu rokote tarjoaa mandollisuuden estää tai heikentää B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttamia infektioita tai sellaisten organismien aiheuttamia infek-

25 tioita, joissa on antigeeneja, jotka voidaan tunnistaa ja sitoa antiseerumilla, joka on muodostettu tämän konjugoidun rokotteen polysakkaridien ja/tai proteiinien avulla. Tässä yhteydessä katsotaan rokotteen pystyvän estämään 5 tai heikentämään sairautta, jos sen antaminen kohdehenkilölle johtaa joko sairauden oireiden tai sairaustilan täydelliseen tai osittaiseen heikentymiseen (tai häviämiseen), tai vaihtoehtoisesti, täydellisen tai osittaisen immuniteetin syntymiseen mainittua sairautta kohtaan 10 kohdehenkilössä. Rokotteen (tai sen synnyttämän antiseerumin) antaminen voi tapahtua joko profylaktisessa tai terapeuttisessa tarkoituksessa. Annettaessa rokotetta profylaktisesti, 15 yhdiste(et) annetaan ennen B-ryhmän Streptococcus -bakteerien aiheuttaman infektion oireiden esiintymistä. Yhdisteen tai yhdisteiden profylaktinen antaminen pyrkii estämään tai heikentämään odotettavissa olevan infektion vaikutuksia. Terapeuttisesti annettuna yhdiste(et) anne- 20 taan vasta infektion todellisten oireiden esiintyessä. Yhdisteen tai yhdisteiden terapeuttisella antamisella pyritään vaimentamaan syntynyttä infektiota. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut tulehdusta torju- 25 vat aineet voidaan antaa ennen infektion syntymistä (odotettavissa olevan infektion estämiseksi tai heikentämiseksi) tai havaitun infektion alkamisen jälkeen. Yhdisteen sanotaan olevan "farmakologisesti hyväksyttä- 30 vä", jos sen saava potilas sietää sen. Tällaista ainetta sanotaan annettavan "terapeuttisesti tehokas" annos, jos annettu annos on fysiologisesti merkittävä. Aine on fysiologisesti merkittävä, jos sen läsnäolo aikaansaa havaittavan muutoksen vastaanottavan potilaan fysiologias- 35 sa. Alan tuntevalle henkilölle on itsestään selvää, että kun

26 tämän keksinnön mukaista rokotetta annetaan kohdehenkilölle, se voi olla koostumuksena, jossa voi olla suoloja, puskureita, adjuvantteja tai muita aineita, joiden halutaan parantavan aineen tehokkuutta. Adjuvantit ovat ai- 5 neita, joita voidaan käyttää erityisesti tehostamaan spesifistä immuunivastetta. Normaalisti adjuvantti ja varsi- nainen koostumus sekoitetaan ennen niiden saattamista immuunijärjestelmän piiriin tai ne annetaan erikseen mutta samaan kohdepaikkaan immunisoitavassa eläimessä. Adju- 10 vantit voidaan väljästi jakaa useampaan ryhmään niiden koostumuksen perusteella. Tällaisia ryhmiä ovat öljymäiset adjuvantit (esimerkiksi Freundin täydellinen ja epätäydellinen), epäorgaaniset suolat (esim. A1K(S0,) Al- Na (S0,) A1N11,(S0,), silika, kaoliini ja hiili), polynuk- 15 leotidit (esim. poly IC ja poly AU -hapot) ja tietyt luonnon aineet (esim. Mycobacterium tuberculosis -bakteerien erittämä vaha D sekä Corynebacterium parvum tai Bordetella pertussis -bakteerien ja tiettyjen Brucella -suvun lajien erittämät aineet). Näiden adjuvantteina 20 käytettävien aineiden joukossa erityisen käyttökelpoisia ovat saponiinit kuten esim. Quil A. (Superfos A/S, Tanska). Esimerkkejä rokotteisiin sopivista aineista on lähteessä Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A., Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, s. 1324...1341 25 (1980), joka lähde on tässä mainittu vertailukohdan saa- miseksi). Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut terapeuttiset koostumukset voidaan antaa parenteraalisesti injektiona, 30 nopealla infuusiolla, nenä-nielun kautta tapahtuvana absorptiona (intranasofaryngeaalisesti), ihon läpi tapahtuvana imeytymisenä tai suun kautta. Rokoteaineet voidaan myöskin antaa lihaksen sisäisesti tai laskimoon. Parenteraaliseen antamiseen sopivat koostumukset voivat 35 olla steriilejä vesi- tai ei-vesipohjaisia liuoksia, suspensioita tai emulsioita. Esimerkkejä ei-vesipohjaisista liuottimista ovat propyleeniglykoli, polyetyleeni-