Laskuharjoitus 3 palautus 11. 11. 2003 mennessä Tehtävä 1: Entsyymikinetiikkaa Entsyymillä on seuraavanlainen reaktiomekanismi (katso oheista kuvaa): 1. A:n sitoutuminen saa konformaatiossa aikaan muutoksen, joka mahdollistaa B:n sitoutumisen. 2. A:n sitouduttua B voi sitoutua ja sitoutuu. 3. A ja B muuttuvat entsyymin katalysoimassa reaktiossa P:ksi ja Q:ksi. 4. P ja Q irtoavat entsyymistä. Koska entsyymi katalysoi kahden substraatin reaktiota, ei se kaikissa oloissa noudata Michaelisin ja Mentenin kinetiikkaa. Kuitenkin pitämällä A:n konsentraatiota vakiona ja vaihtelemalla B:n konsentraatiota voimme approksimaationa käyttää Michaelisin ja Mentenin yhtälöä v 0 [ S] 0 [ S] 0 = vmax, K M + kun asetamme, että [S]=[B]. a) Edellä mainitussa mittausjärjestelyssä saimme seuraavat tulokset: [B] 0 /mm 1/[B] 0 /mm -1 v 0 /(mms -1 ) 1/v 0 /(mm -1 s) 1,0 1,0 4,9 0,204 1,5 0,67 6,5 0,154 2,0 0,50 8,5 0,118 3,0 0,33 11,9 0,084 5,0 0,20 16,5 0,061 10 0,10 23,7 0,042 20 0,05 30,8 0,032 Määritä K M ja v max. b) Kun inhibiittoria I oli läsnä vakiokonsentraatio [I], niin saatiin seuraavat tulokset: [B] 0 /mm 1/[B] 0 /mm -1 v 0 /(mms -1 ) 1/v 0 /(mm -1 s) 1,0 1,0 3,2 0,313 1,5 0,67 4,5 0,222 2,0 0,50 5,9 0,169 3,0 0,33 8,2 0,122 5,0 0,20 12,1 0,083 10 0,10 18,8 0,053 20 0,05 25,6 0,039
Onko inhibitio kilpailevaa, kilpailematonta (eli sekamuotoista) vai entsyymin ja substraatin kompleksiin kohdistuvaa? c) Olisiko inhibitiomekanismi sama, jos meillä olisi mittauksessamme vakiokonsentraatio B:tä ja vaihtelisimme A:n konsentraatiota (siis olisi [S]=[A]) ja jos käyttäisimme samaa inhibiittoria I? Mikä se olisi ellei se olisi sama ja miksi? d) Mikä inhibitiomekanismi tulisi c-kohdan tapauksessa kyseeseen, jos reaktion kulussa tai reaktiomekanismissa A:n ja B:n sitoutumisjärjestyksellä ei olisi väliä? Miksi? Tehtävä 2: Lipidikaksoiskalvon potentiaaliprofiilit Lipidikaksoiskalvossa on useita ryhmiä, joilla on varauksia tai osittaisvarauksia. Niinpä kalvon sähköistä potentiaalia kuvaava käyrä on melko monimutkainen. Oheisessa kuvassa on esitetty karkea malli kalvon eri potentiaalista. Tärkein potentiaaleista lienee transmembraanipotentiaali, johon usein viitataankin pelkällä membraani- tai kalvopotentiaalinimityksellä. Transmembraanipotentiaali aiheutuu ionien erilaisesta jakautumisesta solun sisä- ja ulkopuolen välillä ja on siis ulko- ja sisätilavuuksien potentiaalien välinen erotus. Lisäksi kalvon pinnalla voi olla varautuneita ryhmiä esim. negatiivisesti varautuneiden ryhmien vuoksi tähän viitataan pintapotentiaalinimityksellä. Nuo negatiiviset ryhmät myös rikastavat kationeja kalvon läheisyyteen, joten kauempana kalvon pinnasta ovat kationit näennäisesti neutraloineet varauksen. Koska rasvahappoketjut, esterisidokset, lipidien pääryhmät ja lipidin ja veden rajapinnan vesimolekyylit ovat kaksoiskalvoksi järjestäymisen vuoksi joutuneet eisatunnaiseen orientaatioon, on kalvolla myös ns. dipolipotentiaali, jonka muutos tapahtuu lähinnä juuri rajapinnassa. Keskimäärin kalvossa on yleensä enemmän dipolien positiivisia osittaisvarauksia suuntautuneena kalvon hydrofobiseen osaan päin ja enemmän dipolien negatiivisia osittaisvarauksia suuntautuneena vesifaasiin päin. Hahmottele karkea potentiaaliprofiili seuraavissa tapauksissa. 1) Alkutila pintapotentiaali ja dipolipotentiaali kalvon eri puolilla on sama sisäpuoli on negatiivisesti varautunut eli transmembraanipotentiaali negatiivinen 2) Transmembraanipotentiaalin neutraloituminen pintapotentiaali ja dipolipotentiaali kalvon eri puolilla on sama transmembraanipotentiaali = 0 (vastaa karkeasti esim. aktiopotentiaalitilanteen yhtä vaihetta) 3) Ulkopuolelle lisätty dipoli: pian lisäyksen jälkeen pintapotentiaali on kalvon eri puolilla sama transmembraanipotentiaali sama kuin tilanteessa 1)
kalvon ulkopuolelle on lisätty ainetta, joka sitoutuu nopeasti kaksoiskalvon ulkopuoliseen lehdykkään, muttei vielä ole ehtinyt flip-flopin kautta tasapainottua kalvon eri lehdyköihin; tämä aine alentaa tehokkaasti dipolipotentiaalia sillä puolella kalvoa, jolla se on 4) Ulkopuolelle lisätty dipoli: kauan aikaa lisäyksen jälkeen pintapotentiaali on kalvon eri puolilla sama transmembraanipotentiaali sama kuin tilanteessa 1) tilanteen 3) dipolipotentiaalia alentavan aineen pitoisuus kaksoiskalvon lehdyköissä on ehtinyt tasapainottua Olisiko piirtämiesi kuvien perusteella mielestäsi mahdollista, että joidenkin jänniteherkkien kanavien jännitesensorit saattaisivat aktivoitua myös tilanteessa 3? Jos olisi, niin miksi? [Kuvapohjat piirtämisen helpottamiseksi.] 1) 2) 3) 4)
Tehtävä 3: Peptidiantibiootin kalvovuorovaikutukset Mene sivulle http://us.expasy.org/ ja valitse Databases: Swiss-Prot and TrEMBL. Kirjoita hakusanaksi "magainin" kohtaan Search Swiss-Prot and TrEMBL for. Hakutulokseksi saat afrikkalaisen kynsisammakon tuottaman polypeptidin, josta sen ihon puolustukseen osallistuvia antibioottisia peptideitä pilkotaan. Vastaavia antibioottisia peptideitä on useimmilla ellei kaikilla eläimillä antibioottipeptideitä löytyy esimerkiksi ihmisen syljestä ja kyynelnesteestä. Valitse näytöltä "Magainin II copy A" ja saat antibioottipeptidi magainin II:lle kuuluvan sekvenssin väritettyä punaiseksi koko sekvenssin joukosta. Poimi sekvenssi talteen esimerkiksi Notepadiin. Toimi vastaavasti kolmikirjainlyhenteille merkityn sekvenssin osalta. Imuroi koneelle ohjelma WinPep osoitteesta http://www.ipw.agrl.ethz.ch/~lhennig/winpep.html ja asenna se. Asennettuasi valitse "File" "New" ja liitä Notepadista (yksikirjaiminen) aminohapposekvenssi avautuvaan sekvenssi-ikkunaan. Valitse "Analyze" ja "Physicochemical properties". Mikä on sekvenssin perusteella arvioitu isoelektrinen piste? Mitä se kertoo peptidin varauksesta ph:ssa 7,35? Hae osoitteesta http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl haluamamme hydropaattisuusasteikko. Kyseessä on Raon ja Argosin v. 1986 julkaisema asteikko, joka kuvaa sitä, miten usein kyseisiä aminohappoja suhteellisesti esiintyy integraalisten membraaniproteiinien membraaniin hautautuneissa osissa. Kokeile tehdä ProtScale-ohjelman ikkunassa ko. sekvenssistä transmembraaniheeliksin etsinnässä käytetty lasku, valitse esim. Window size = 5 sivun alalaidasta. Paina "Submit". Tryptofaanin 1.0 kuvaa suunnilleen arvoa, jolla aminohappo tyypillisesti esiintyy lipidin ja veden välisessä rajavyöhykkeessä. Membraaniympäristössä magainin II:n tiedetään muodostavan a-heeliksin. Kun otetaan huomioon, että kalvon paksuus on n. 20 aminohapon muodostaman a-heeliksin verran, niin miten todennäköiseksi # arvioisit tuloksen perusteella sen, että yksittäinen magainin II -peptidin muodostama a-heeliksi kulkee kalvon puolelta toiselle transmembraaniheeliksinä? Palaa nyt WinPepiin. Valitse "Options" "Preferences" "Helical Wheel Options". Valitse Raon ja Argosin asteikon arvojen perusteella aminohapoille värit: punainen (hydrofobinen) arvoilla >1, violetti arvoilla 0,5 1,0 ja sininen arvoilla <0,5. Valitse sitten "Analyze" "Helical Wheel". Lisäpisteitä voit saada tekemällä esimerkiksi Excelillä seuraavat laskut. Keskimäärin aminohappojen kulma a- heeliksissä (akselin suunnasta katsottuna) on n. 100 eli n. 3,6 aminohappoa/kierros. Tee taulukko esimerkiksi seuraavan sivun esimerkin tavalla käyttäen magainin II:n aminohapposekvenssiä ja Raon ja Argosin hydropaattisuusasteikkoa. Tee uusi sarake, jossa olet vähentänyt kokonaiset kierrokset eli kaikki kulmat palautettu välille 0 360 astetta (nimeksi esim. "reduced angle"). Huomaa, että 0 =360. [Taulukon bulk angle -arvot kannattaa kirjoittaa käsin tai sitten laskea kaavalla, mutta valita sen jälkeen "copy", "paste special" ja "values" ja kopioida ne pelkkinä arvoina.] Valitse nyt otsikkoineen kokoalue taulukossa, jossa tietosi ovat. Valitse "Data", "Sort", "Sort by:" reduced angle, ascending. Näin saat aminohapot järjestykseen. Laske keskiarvo ±20 kulmista joka kulmalle, jolla on jokin aminohappo. Tee sitten kuvaaja, jossa kuvaat hydropaattisuusarvon kulman funktiona ("Insert", "Chart", "XY Scatter"). Jälleen arvo 1,0 kuvaa n. suunnilleen veden ja lipidin rajapinnalle tyypillistä arvoa, suuremmat hydrofobisia ja pienemmät hydrofiilisiä. Mitä arvioisit ns. helical wheel -kuvaajan ja mahdollisesti tekemäsi Excel-kuvaajan perusteella peptidin muodostaman a-heeliksin orientaatiosta ja sijainnista lipidikaksoiskalvossa? # Tarkkuudeksi riittää ihan hyvin mikä tahansa Stetson Harrison -menetelmän* antama tulos. *Sama kuin Stetson-menetelmä eli hatusta vetäminen, mutta Harrisonin nimi antaa lisää uskottavuutta.
Olisiko muunlainen orientaatio/järjestäytyminen kenties mahdollinen, jos kalvossa on paljon peptideitä? Miten tällainen järjestäytyminen saattaisi selittää peptidin soluja tappavan vaikutuksen? amino acid number amino acid amino acid hydropathicity bulk angle 1 G Gly 1.09 0 2 I Ile 1.44 100 3 G Gly 1.09 200 4 K Lys 0.09 300 5 F Phe 1.57 400 6 L Leu 1.47 500 7 H His 0.68 600 8 S Ser 0.97 700 9 A Ala 1.36 800 jne. jne. jne. jne. jne. Tehtävä 4: Aineiden kuljetus solukalvon puolelta toiselle Yksi solukalvon keskeisistä rooleista on diffuusion esteenä toimiminen eli solun rajaaminen. Joitakin aineita halutaan kuitenkin päästää solun kalvon läpi. Niinpä solukalvossa on mm. passiivisia kanavaproteiineja, jotka päästävät valikoivasti aineita soluun, ja aktiivisia pumppuja, jotka kemiallista sidosenergiaa hyödyntäen synnyttävät pitoisuusgradientteja. (Lue esim. Lehningerin luvut 12 ja 14.) Pumppuja voi periaatteessa tarkastella entsyymeinä, jotka kytkevät energeettisesti hyvin epäedullisen reaktion (eli nettosiirtymisen pitoisuusgradienttia vastaan) energeettisesti hyvin edulliseen reaktioon (esim. ATP:n hydrolyysi ADP:ksi ja PO 4 3- -ioniksi) ja tehden kokonaisreaktiosta näin energeettisesti edullisen. Ajatellaan seuraavaksi pelkästään aineen siirtymistä kalvon puolelta toiselle. Lehningerissä annetaan reaktioiden yleiseksi vapaaenergian muutokseksi G= G' +RTln([P]/[S]), missä G' on standardiolojen vapaaenergian ero tuotteelle ja lähtöaineelle, R on yleinen kaasuvakio, T on lämpötila absoluuttisella asteikolla ja [P] ja [S] ovat tuotteen ja lähtöaineen pitoisuudet tässä järjestyksessä. Koska kalvon puolelta toiselle pumppaamisessa ei itse molekyyli muutu (eivätkä tietenkään määritellyt standardiolosuhteet muutu) ja ennen kaikkea koska siis K=1, on G' =0. Toisaalta reaktion tuote on esimerkiksi aineita soluun sisään kuljetettaessa sisällä oleva molekyyli ja lähtöaine ulkona oleva molekyyli. Näin ollen päästään varauksettomien molekyylien tapauksessa Lehningerissä (ja muissa biokemian kirjoissa) mainittuun muotoon G=RTln(c s /c u ). a) Miten suuri konsentraatiosuhde olisi mahdollista saavuttaa 100 %:n hyötysuhteella pumpulle, joka pumppaa yhden varauksettoman molekyylin solun sisään yhden ATP:n fosfodiesterisidoksen hydrolyysienergiaa hyödyntäen? ATP:n hydrolyysille tyypillisissä solunsisäisissä olosuhteissa G = -51,8 kj/mol, kuten Lehningerissä kerrotaan. Entä mikä olisi tulos 20 %:n hyötysuhteella? Jos kyseessä on varauksellinen yhdiste, niin asia on monimutkaisempi. Lukiossa fysiikkaa ja/tai kemiaa lukeneille lienee tuttua, että varauksellisen yhdisteen siirtyessä potentiaalista toiseen siirtymiseen liittyy energian muutos. Toisaalta varaukset luovat ympärilleen potentiaalienergiakentän. Potentiaali V=E p /Q eli potentiaalienergia jaettuna varauksella. Jotta saataisiin ionien potentiaalista toiseen liittyvä energia, täytyy siis potentiaaliero kertoa siirtyvällä varauksella, joka yleensä lasketaan moolia kohti, ts.
E p =VQ=zFV, missä z=ionin valenssi ja F on Faradayn vakio 96485,31 C/mol (eli N A alkeisvarausta). Näin ollen saadaan ionin siirtymiselle kalvon puolelta toiselle G=RTln(c s /c u )+zfv, missä V on potentiaaliero sisä- ja ulkopuolen välillä. Mainittakoon, että tasapainossa tietenkin G=0 ja niinpä tasapainossa zfv=-rt ln(c s /c u )=RT ln(c u /c s ) eli V = RT zf c ln c u s Tämä on Nernstin yhtälö, jota käytetään huomattavan paljon membraanipotentiaalin yhteydessä, koska tietenkin membraanipotentiaali=v. Tästä enemmän fysiologian tai sähkökemian kursseilla. Karkeana solukalvon mallina voidaan toisaalta pitää levykapasitaattoria, jossa kapasitaattorin pinta-ala on solun pinta-ala ja kalvon hiilivedylle ε r =2. Levykondensaattorin kapasitanssi C on C=ε 0 ε r A/d, missä A siis on solun pinta-ala ja d on solukalvon paksuus. Laskua varten ajattele solu palloksi, jonka säde r=5 µm. Solukalvon paksuudeksi d voidaan ottaa esim. 3 nm. Ulkopuolen tilavuuden voi olettaa niin suureksi, ettei sen ionikonsentraatio muutu. Siis c u =vakio. Olkoot ionit monovalentteja eli z=1. Kondensaattorille C=Q/V, missä V on jälleen potentiaaliero, Q on varaus ja C=kapasitanssi. Varaus Q=(c s -c u )zft, missä T=solun tilavuus. b) Johda näitä yksinkertaistavia likiarvoistuksia käyttäen lauseke vapaaenergian muutokselle sisällä olevan ionipitoisuuden funktiona. Kannattaa laskea välivaiheet numeerisesti (esim. kapasitanssilla arvo). Yhtälö on edelleen melko hankalaa muotoa suoraan ratkaistavaksi, joten voit tehdä esim. Excelillä kuvaajan, jossa kuvaat G:n c s /c u :n funktiona sopivin välein. Ellet osaa kopioida lausekkeita Excelissä ja luoda c s :lle arvoja Excelin kaavojen avulla (esim. arvo sarakkeessa A2=A1+1), niin pyydä apua esim. osoitteesta jmalakos@cc.helsinki.fi. Määritä piirtämältäsi kuvaajalta, millä arvolla nyt saavutetaan a-kohdan 20 ja 100 %:n hyötysuhdetta vastaava arvo. Kannattaa tehdä kaavat, joihin voit helposti muuttaa c u :n arvoa. 1º Olkoon c u =10-2 M. 2º Olkoon c u =10-7 M. Ensimmäinen vastaa lähinnä solunulkoisen K + :n ja jälkimmäinen [H + ]:n (tai [H 3 O + ]:n) pitoisuutta. Miten arvioisit eri pumppujen kykyä synnyttää gradientteja tällaisissa oloissa? Entä mikä on c s -c u näille tilanteille? Miten selität eron? c) Mitä tapahtuu, jos ioneja pumppaava pumppu joutuu (kaikkien pumpun kannalta olennaisten reaktanttien ollessa läsnä) ionigradienttiin, joka vastaa suurempaa energiaa kuin ATP? ADP+P i reaktion vapaaenergia?