KAUPUNKI-ILMAN PIENHIUKKASTEN JA MAATILAPÖLYN VAI- KUTUS LASTEN IMMUUNIVASTEIDEN SÄÄTELYMEKANISMEIHIN

Transkriptio

1 KAUPUNKI-ILMAN PIENHIUKKASTEN JA MAATILAPÖLYN VAI- KUTUS LASTEN IMMUUNIVASTEIDEN SÄÄTELYMEKANISMEIHIN Johannes Niiranen Kaupunki-ilman pienhiukkasten ja maatilapölyn vaikutus lasten immuunivasteiden säätelymekanismeihin Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos Marraskuu 2018

2 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristö- ja Biotieteiden laitos, Ympäristötieteen pääaine Johannes Niiranen: Kaupunki-ilman pienhiukkasten ja maatilapölyn vaikutus lasten immuunivasteiden säätelymekanismeihin Pro Gradu -tutkielma 64 sivua Tutkielman ohjaajat: Marjut Roponen (apulaisprofessori, FaT), Maria-Viola Martikainen (FM) Marraskuu 2018 Avainsanat: PBMC, CD80+, ILT4+, kaupunki-ilman pienhiukkaset, maatilapöly, allergia TIIVISTELMÄ Astma ja hengitysteissä alkunsa saavat allergiat ovat yleistyneet lapsilla varsinkin kehittyneissä maissa. Geneettiset tekijät ovat astman kehittymisessä ja vakavuusasteessa erittäin tärkeitä, mutta ne eivät voi yksinään selittää sairauksien lisääntymistä lapsilla. Ympäristötekijöistä muun muassa lasten altistumisen tupakansavulle ja sisäilman pölypunkeille on varmistettu aiheuttavan astmaa ja hengitystieallergioita. Ulkoilman hiukkasmaisten saasteiden on huomattu pahentavan jo puhjennutta astmaa, mutta sen rooli astman ja allergisten sairauksien aiheuttajana lapsilla on vielä epäselvä. Sitä vastoin maatilalla kasvaneiden lasten altistuminen erilaisille maatilaympäristössä tyypillisesti esiintyville antigeeneille on huomattu useissa epidemiologisissa tutkimuksissa vähentävän lasten herkkyyttä sairastua astmaan, heinänuhaan ja muihin allergisiin sairauksiin. Pro Gradu -tutkielmani tavoitteena oli selvittää, minkälaisia vaikutuksia altistuminen kaupunkiilman hiukkasille ja maatilapölylle aiheuttaa immuunivasteen säätelymekanismeihin. Pro Gradu -tutkielman kokeellisessa osassa suomalaisten lasten verinäytteistä eristettyjä PBMCsoluja altistettiin suomalaiselta maatilalta kerätylle maatilapölylle ja Kiinasta (Nanjing) kerätyille kaupunki-ilman pienhiukkasille. Altistetuista näytteistä tunnistettiin virtaussytometrianalyysillä dendriittisolut (mdc ja pdc), monosyytit ja B-solut sekä niiden pinnalla ilmentyvät CD80- ja ILT4-reseptorit. Pro Gradu -tutkielmani tulokset tukevat pääosin tieteellisessä kirjallisuudessa esitettyjä havaintoja. Altistuminen maatilapölylle aktivoi immuunijärjestelmää nostamalla immuunisolujen CD80-tasoja. Kaupunki-ilman pienhiukkasilla altistetuilla PBMC-soluilla havaittiin puolestaan CD80-tasojen laskevan, mikä viittaa immuunivasteen inhiboitumiseen. Tulokset vahvistavat osaltaan maatilaympäristön immuunivastetta aktivoivan vaikutuksen, joka saattaa näkyä allergioiden synnyltä suojaavana vaikutuksena. Kaupunki-ilman pienhiukkasten rooli allergioiden kehittymisessä vaatii lisätutkimuksia.

3 UNIVERSITY OF EASTER FINLAND, Faculty of Science and Forestry Department of Environmental and Biological Sciences, Environmental Science Johannes Niiranen: Impact of urban air small particles and farm dust on the mechanisms of immune response regulation in children Master s thesis 64 pages Supervisors: Marjut Roponen (PhD), Maria-Viola Martikainen (MSc) November 2018 Keywords: PBMC, CD80+, ILT4+, urban air particles, farm dust, allergy ABSTRACT Asthma and respiratory allergies have become more prevalent in children, especially in developed countries. Genetic factors are a main contributor in the development of asthma and its severity, but they can not alone explain the increase in prevalence in children. Environmental risk factors such as exposure to smoking and house dust mites have been associated with asthma and respiratory allergies in children. Outdoor particulate pollution has been found to exacerbate pre-existing asthma, but its causal role in asthma and allergic diseases in children is still uncertain. In contrast, several epidemiological studies have shown that the exposure to various types of antigens typically present in farming environment reduces the susceptibility of rural children to asthma, hay fever and other allergic diseases. The objective of my thesis was to study the effects of exposure to urban air particles and farm dust on the mechanisms of immune response regulation. In the experimental part of the thesis, PBMC-cells isolated from 4-year-old Finnish children s blood samples were exposed to farm dust collected from a farm in Finland and to urban air small particles collected from China (Nanjing). In the exposed samples, a flow cytometry analysis was used to identify dendritic cells (mdc and pdc), monocytes and B-cells, as well as before mentioned cells expressing CD80 and ILT4 receptors on their cell membranes. The results of my thesis generally support the observations made in the scientific literature. Exposure to farm dust activates the immune system by raising immune cell CD80 levels. CD 80 levels were decreased in PBMC cells exposed to urban air small particles. The decrease in CD80 levels inhibits possible immune reactions and inactivates the immune system. Further studies are needed to assess the link between urban air small particles and the development of allergies.

4 ESIPUHE Tämä opinnäytetyö on tehty Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen inhalaatiotoksikologian laboratorion tutkimusryhmässä. Opinnäytetyön ohjaajina toimivat apulaisprofessori Marjut Roponen ja filosofian maisteri Maria-Viola Martikainen. Haluan kiittää ohjaajiani ja kaikkia tutkimusryhmän jäseniä asiantuntevasta avusta. Erityisesti haluan kiittää ohjaajaani Maria-Viola Martikaista avusta ja neuvoista laboratoriokoevaiheessa. Lisäksi haluan kiittää kaikesta sydämestäni Hänärin poikia vertaisavusta. Lisäkiitokset tuesta ja kannustuksesta menevät perheelleni ja avopuoliso Sannille. Kuopiossa Johannes Niiranen

5 LYHENTEET JA MÄÄRITELMÄT PBMC-SOLUT pdc mdc ILT4+ Perifeerisen veren mononukleaariset solut Plasmasytoidiset dendriittisolut Myeloidiset dendriittisolut Immunoglobulin-like Transcript 4-reseptoreita solukalvoillaan ilmentävät solut CD80+ Cluster of differentiation-reseptoreita solukalvoillaan ilmentävät ilmentävät solut ANTIGEENI SYTOKIINI PATOGEENI MHC-PROTEIINIT Immuunivasteen aiheuttava molekyyli Proteiinirakenteinen solujen välisen viestinnän välittäjäaine Taudinaiheuttaja MHC-geenijoukon koodaamat solupinnan glykoproteiinit

6 SISÄLLYSLUETTELO 1. JOHDANTO KIRJALLISUUSKATSAUS IHMISEN IMMUUNIJÄRJESTELMÄN PERUSJAOTTELU IHMISEN IMMUUNIJÄRJESTELMÄN SOLUT Perusjaottelu Dendriittisolu ja sen esiasteet Dendriittisolujen tehtävät ihmisen immuunijärjestelmässä Dendriittisolujen rooli T-solujen aktivaatiossa B-lymfosyytit, niiden tehtävät ja muodostuminen ihmisen immuunijärjestelmässä B-solujen aktivaatio Monosyytit Monosyyttien kehittyminen ja luokittelu Monosyyttien tehtävät ihmisen immuunijärjestelmässä ALLERGIA JA ASTMA Allergia Astma Dendriittisolujen rooli astman ja allergioiden kehittymisessä Hygieniahypoteesi MAATILAYMPÄRISTÖN VAIKUTUS ASTMAAN JA ALLERGIOIHIN MAATILA-ALTISTUKSEN IMMUNOBIOLOGIA Maatila-altistuksen aikaansaamat immuunivasteet Maatila-altistuksen aikaansaamien immuunivasteiden solutason mekanismit KAUPUNKI-ILMAN PIENHIUKKASET KAUPUNKI-ILMAN PIENHIUKKASTEN TERVEYSVAIKUTUKSET Epidemiologia Lyhytaikaisvaikutukset Pitkäaikaisvaikutukset...35

7 2.7.4 Kaupunki-ilman pienhiukkasten yhteys lasten allergioihin ja astmaan Pienhiukkasten aiheuttamien terveysvaikutusten mekanismit Pienhiukkasten arvioidut vaikutusmekanismit allergioiden ja astman kehittymisessä TYÖN TAVOITTEET AINEISTO JA MENETELMÄT KÄYTETYT NÄYTTEET JA ALTISTEET PBMC-solut Altisteet KÄYTETTY MITTAUSLAITTEISTO Virtaussytometrian toimintaperiaate Virtaussytometrinen data-analyysi LABORATORIOKOKEET Yleistä PBMC-solujen sulatus Solujen laskenta Stimulaatiot Näytteiden valmistus virtaussytometrianalyysia varten Tulosten käsittely TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU MAATILAPÖLYALTISTETUT SOLUT KAUPUNKI-ILMAN HIUKKASMAISILLE EPÄPUHTAUKSILLE ALTISTETUT SOLUT PRO GRADU -TYÖN TULOKSIEN ARVIOINTI JOHTOPÄÄTÖKSET LÄHTEET...57

8 8 1. JOHDANTO Allergioiden ja erilaisten allergisten sairauksien, kuten astman esiintyvyys on noussut erityisesti länsimaissa. Kehittyvissä maissa näitä sairauksia esiintyy huomattavasti vähemmän, mikä on johtanut suureen kiinnostukseen tutkia ympäristötekijöiden roolia allergioiden ja astman kehittymisessä. Alkusysäyksenä tutkimukselle toimi hygieniahypoteesi ja allergisten sairauksien perustana olevan immunologisen tiedon parantuminen sekä lisääntyminen. Erityisesti kiinnostuksen kohteena on länsimaalaiseen elämäntapaan liittyvän urbanisaation ja maaseutuympäristön supistumisen merkitys astman ja muiden allergisten sairauksien esiintyvyyden nousulle. (Von Mutius ja Vercelli 2010, Eder et al ) Samaan aikaan, kun länsimaalaisissa maissa on havaittu allergioiden ja erilaisten allergisten sairauksien esiintyvyyden nousevan, ovat monet epidemiologiset tutkimukset todistaneet, että perinteisillä maatiloilla kasvaneilla lapsilla esiintyy vähemmän astmaa, heinänuhaa ja muita allergisia sairauksia. Varhaisessa lapsuudessa tapahtunut altistuminen maatilalla kasvatetulle karjalle ja karjan ravinnoksi tarkoitetulle rehulle yhdistettynä prosessoimattoman maidon kulutukselle ovat osoitettu tarjoavan suurimman suojan astman ja allergisten sairauksien kehittymiselle. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Tämän niin sanotun maatilaympäristön aikaansaaman immunologisen suojavaikutuksen tarkkoja solutason mekanismeja ei kuitenkaan vielä tunneta tarkasti (Schaub et al. 2009). Aihetta käsittelevät tutkimukset ovat kuitenkin yhtä mieltä siitä, että erityisen tärkeää maatilaympäristön aikaansaaman suojavaikutuksen syntymisessä on altistumisen ajoitus: raskaudenaikana ja varhaisessa lapsuudessa tapahtuva maatila-altistus on erityisen tehokas muovaamaan immuunijärjestelmän toimintaa allergioita ehkäisevällä tavalla (House et al. 2017, Von Mutius ja Vercelli 2010). Nämä löydökset ovat herättäneet tutkijat pohtimaan, mitkä tekijät maatilaympäristössä selittävät vähentynyttä allergioiden ja allergisten sairauksien esiintyvyyttä maatiloilla kasvaneilla ihmisillä. Myös kaupunki-ilman hiukkasmaisten epäpuhtauksien osuutta allergioiden ja allergisten sairauksien kehittymiseen on tutkittu. Pienhiukkasten tiedetään useiden epidemiologisten kokeiden perusteella olevan suoraan yhteydessä väestön sairastavuuteen ja kuolleisuuteen (Guarnieri ja Balmes 2014, Künzli et al. 2000). Kaupunki-ilman hiukkasmaisten epäpuhtauksien on todistettu olevan yhteydessä allergisiin sairauksiin, mutta aiheeseen liittyy tieteellisessä kirjallisuudessa ristiriitaisuuksia. Tämä johtuu siitä, että osissa tutkimuksista on löydetty positiivinen yhteys kaupunki-ilman hiukkasmaisten epäpuhtauksien ja allergisten sairauksien välille (Gehring

9 9 et al. 2010, Künzli et al. 2009, Jerrett et al. 2008), kun taas osissa tutkimuksia ei puolestaan ole löydetty minkäänlaista positiivista yhteyttä edellä mainittujen välille (Gruzieva et al. 2011, Nicolai et al. 2003, Hirsch et al. 1999). Haasteita tutkimukselle tuo pienhiukkasten erilainen kemiallinen koostumus ja useat eri kokoluokat. Lisäksi allergioihin vaikuttavat lukemattomat muut ympäristötekijät ja geneettiset tekijät. Opinnäytetyön tavoitteena on selvittää, minkälaisia vaikutuksia altistuminen kaupunki-ilman hiukkasille ja maatilapölylle aiheuttaa immuunivasteen säätelymekanismeihin ja tarkastella näiden vasteiden eroja. Opinnäytetyössä käytettiin suomalaisten lasten verinäytteistä eristettyjä PBMC-soluja (perifeerisen veren mononukleaarisia soluja), joita altistettiin suomalaiselta maatilalta kerätyille maatilapölynäytteille ja Kiinan Nanjingin kaupunki-ilmasta kerätyille pienhiukkasnäytteille. Tarkoituksena oli simuloida näiden kahden eri ympäristön vaikutusta immuunivasteen säätelyyn osallistuvien immuunisolujen toimintaan tarkastelemalla immuunisolujen CD80- ja ILT4-reseptorien ilmentymistä.

10 10 2. KIRJALLISUUSKATSAUS 2.1 IHMISEN IMMUUNIJÄRJESTELMÄN PERUSJAOTTELU Karkeasti ihmisen immuunijärjestelmä jaotellaan synnynnäiseen immuniteettiin ja hankittuun (adaptiiviseen) immuniteettiin. Synnynnäisen immuniteetin kokonaisuuteen luetaan kudosten yleisluonteiset puolustusmekanismit, joita ovat esimerkiksi kudoksia suojaavat pintarakenteet ja limakalvot, eritteet, erilaiset entsyymit sekä mikrobien elinkykyä haittaavat kemialliset tekijät, kuten matala ph-arvo. Synnynnäiseen immuniteettiin luetaan myös molekyylit, jotka osallistuvat immuunijärjestelmän toimintaan. Näitä molekyylejä ovat muun muassa mikrobeja tuhoavat peptidit, erilaiset tunnistinmolekyylit, tulehduksen välittäjäaineet (sytokiinit) ja monet viestittäjämolekyylit. Synnynnäisen immuniteetin luonteenomaisena piirteenä on nopea reagointikyky mikrobialtistuksen sattuessa. Tämä on välttämätöntä, koska synnynnäinen immuniteetti toimii elimistön ensimmäisenä puolustusjärjestelmänä. Toisaalta nopeasta reagointikyvystään huolimatta synnynnäisellä immuniteetilla on vain rajallinen kyky tunnistaa elimistöön päätyneen vieraan mikrobin kohderakenteita. Kohderakenteiksi kutsutaan ihmisen elimistölle vieraita mikrobirakenteita, joita ovat esimerkiksi bakteerien soluseinärakenteet ja lipopolysakkaridit sekä tietyt sokerirakenteet (esimerkiksi mannaani). Tunnistaessaan elimistölle vieraat kohderakenteet, synnynnäinen immuunijärjestelmä pyrkii tuhoamaan taudinaiheuttajat nopeasti. Tunnistamistaan ja tuhoamistaan taudinaiheuttajista ei jää synnynnäisessä immuunijärjestelmässä muistijälkeä ja näin immuunireaktiot tapahtuvat aina samalla tavalla uuden kohderakenteen tunnistamisen jälkeen. (Meri 2011, luku Johdanto immunologiaan.) Synnynnäisen immuunijärjestelmän lisäksi ihmisille ja muille selkärankaisille eläimille on kehittynyt patogeenispesifinen hankittu eli adaptiivinen immuunijärjestelmä. Adaptiivisen immuniteetin muodostavat pääosin B-lymfosyyteistä muodostuneiden plasmasolujen tuottamat vasta-aineet sekä T-lymfosyytit. T-lymfosyyttien solukalvon pinnalla on T-solureseptoreita, jotka tunnistavat spesifisiä antigeenin peptidejä. Ensimmäisessä antigeenin kohtaamisessa tämän immuunivasteen kehittyminen on suhteellisen hidasta ja saattaa kestää jopa 1-2 viikkoa. Immuunivasteen reaktiot ovat kuitenkin huomattavasti nopeampia ja voimakkaampia ensimmäisen antigeenikontaktin jälkeen. Tähän perustuu adaptiivinen immuniteetti ja sen aikaansaama suojavaikutus saman antigeenin uudelleen aiheuttamaa infektiota vastaan. Antigeenit ja

11 11 T-solut muodostavat ajan kuluessa hyvin monimuotoisen ja yksilöllisen tunnistusverkoston. Adaptiivinen immuunijärjestelmä on luonteeltaan monimuotoinen, spesifinen ja kykeneväinen muistamaan kohtaamansa antigeenit. (Meri 2011, luku Johdanto immunologiaan.) Vaikka luontainen ja adaptiivinen immuunijärjestelmä eroavat toisistaan varsin suuresti, eivät ne kuitenkaan toimi toisistaan erillään. Luontainen immuniteetti toimii yleensä elimistön puolustusjärjestelmän ensimmäisenä osana, johon elimistöön tunkeutunut antigeeni törmää. Antigeenirakenteet käsitellään soluissa ja kuljetetaan imusuoniston kautta imusolmukkeisiin, joissa tapahtuu antigeenin esittely lymfosyyteille. Adaptiivinen immuunijärjestelmä aktivoituu tunnistaessaan niille esitellyt antigeenit. Tällöin syntyy antigeeneille spesifisiä vasta-aineita ja T- soluja sekä tapahtuu myös luontaisen immuunijärjestelmän aktivoituminen. Tulehdusreaktio kuuluu olennaisena osana immuunireaktioiden käynnistymiseen ja ylläpitoon. Luontaisen immuunijärjestelmän aiheuttama nopeasti aktivoituva tulehdusreaktio vaaditaan immuunireaktion käynnistymiseen ja tulehdusreaktio on yksi immuunijärjestelmän aktivoitumisen tärkeimmistä seurauksista. (Meri 2011, luku Johdanto immunologiaan.) 2.2 IHMISEN IMMUUNIJÄRJESTELMÄN SOLUT Perusjaottelu Ihmisen immuunijärjestelmän ylläpitoon osallistuu useita erilaisia solutyyppejä kudoksissa ja verenkierrossa. Immuunijärjestelmän soluista tärkeimmät ovat valkosolut eli leukosyytit. Ne ovatkin immuunijärjestelmän tärkeimpiä puolustussoluja. Valkosolut jaetaan yhteensä neljään pääryhmään, joilla kullakin on omat tärkeät tehtävänsä. Nämä pääryhmät ovat fagosyytit eli syöjäsolut, dendriittisolut, lymfosyytit eli imusolut ja tulehdusreaktioon osallistuvat solut (basofiilit ja syöttösolut) (Salmi ja Meri 2011, luku Immuunijärjestelmän solut ja niiden kehitys.) Dendriittisolu ja sen esiasteet Dendriittisolut ovat ns. antigeeniä esitteleviä soluja (APC-soluja). Dendriittisolut eroavat toisistaan varsin paljon sekä ulkoisesti että toiminnallisesti ja ovatkin näin hyvin monimuotoinen soluryhmä. (Gaurav ja Agrawal 2013, Thomson 2009, Hänninen ja Vakkila 2003.)

12 12 Dendriittisolut tunnistavat elimistöön päässeen antigeenin ja esittelevät tunnistetun antigeenin T-lymfosyyteille (Gaurav ja Agrawal 2013). Dendriittisolut kehittyvät luuytimen myeloidisista ja lymfaattisista kantasoluista ja vaeltavat sieltä verenkiertoon, jossa ne esiintyvät usein kypsymättöminä esiasteina. Verenkierrosta dendriittisolut siirtyvät kudoksiin, joissa ne muuntuvat niin sanotuiksi epäkypsiksi dendriittisoluiksi ja aktivoituvat lopulta patogeenin (taudinaiheuttajan) läsnä ollessa. (Hänninen ja Vakkila 2003, Liu 2001.) Immuunijärjestelmän ollessa normaalitilassa dendriittisolujen siirtymisnopeus verestä kudoksiin ja kudoksista imusolmukkeisiin on pieni, jolloin suurin osa dendriittisoluista pysyvät kudoksissa epäkypsässä olomuodossa odottaen patogeenin läsnäolon aiheuttamaa immuunijärjestelmän aktivaatiota (patogeeniaktivaatio). (Lambrecht ja Hammad 2010, Lanzavecchia ja Sallusto 1999.) Luuytimen lymfaattisesta ja myeloidisesta kantasolusta muodostuu dendriittisolujen esiasteet CLP (lymfaattinen prekursorisolu) ja CMP (myeloidinen prekursorisolu). CMP:stä muodostuu puolestaan veressä Langerhansin solun esiaste, interstitiaalisen dendriittisolun esiaste tai monosyytti. Langerhansin solun esiasteesta kehittyy lopulta Langerhansin solu, jolla tarkoitetaan epidermiksen dendriittisolua. Interstitiaalisen dendriittisolun esiasteesta kehittyy interstitiaalinen dendriittisolu, joka on kudoksissa normaali dendriittisolu. Monsoyytistä muodostuu myeloidinen dendriittisolu (mdc), joka esiintyy imukudoksissa ilman immunisaatiota. CLP:stä kehittyy dendriittisolun esiasteeksi veressä ns. plasmasytoidinen solu, joka vastaa erityisesti interferonin tuotosta virusinfektion puhjetessa. Plasmasytoidisesta solusta kehittyy lopulta lymfoidinen dendriittisolu, joka esiintyy imukudoksissa. Dendriittisolun kypsyminen on seurausta patogeeniaktivaatiosta ja tulehdusvälittäjäaineista (kuva 1.). (Lambrecht ja Hammad 2010, Hänninen ja Vakkila 2003.)

13 13 Kuva 1. Dendriittisolujen kypsyminen ja erilaistuminen. Dendriittisolujen kypsyminen ja erilaistuminen luuytimen lymfaattisesta ja myeloidisesta kantasolusta. Kuvassa on esitetty myös antigeeniriippuvainen dendriittisolun kypsyminen (Liu 2001, muokattu) Dendriittisolujen tehtävät ihmisen immuunijärjestelmässä Dendriittisoluilla on ihmisen immuunijärjestelmässä useita tehtäviä. Dendriittisolut toimivat keskeisessä roolissa adaptiivisen eli hankitun immuunivasteen kehittymisessä. Dendriittisolut antavat ohjeita adaptiivisesta immuunivasteesta vastaavien B- ja T-lymfosyyttien toiminnalle. (Liu 2001, Hänninen ja Vakkila 2003.) Dendriittisolut ovat ensimmäisiä immuunijärjestelmän soluja, jotka ovat kosketuksissa ihon ja limakalvojen epiteelissä sekä näitä alempana olevissa kudoksissa elimistöön päässeiden patogeenien kanssa. Ensikosketuksen jälkeen dendriittisolut välittävät viestin pintareseptoreilla tunnistamastansa patogeenistä imusolmukkeisiin, joista immuunivasteen kehittyminen alkaa. (Hänninen ja Vakkila 2003.)

14 Dendriittisolujen rooli T-solujen aktivaatiossa Dendriittisolut vastaavat erityisesti T-solujen aktivaatiosta esittelemällä T-soluille elimistöön tunkeutuneen antigeenin. T-solujen aktivaatiossa antigeenin tunnistaneet ja tässä prosessissa aktiivisiksi muuttuneet dendriittisolut siirtyvät kudoksista imusuonia pitkin tai suoraan verenkierrosta (erityisesti plasmasytoidit dendriittisolut) imusolmukkeisiin, jossa ne aktivoivat kyseiselle antigeenille herkät T-solut (kuva 2.). T-solujen aktivaatiossa dendriittisolun esittelemälle antigeenille spesifisesti herkät T-solut muodostavat ns. immunologisen synapsin kyseisen dendriittisolun kanssa. (Hänninen 2011, luku Lymfosyyttien aktivaatio.) Immunologisella synapsilla tarkoitetaan tässä asiayhteydessä T-solun ja dendriittisolun kosketuspinnalle muodostuvaa aluetta, jonka reunaosissa sijaitsevat solujen adheesiosta (toisiinsa tarttumisesta) vastaavat integriinireseptorit ja keskiosassa puolestaan solun aktivaatiosta ja spesifisyydestä huolehtivat antigeenireseptorit. Immunologinen synapsi toimii T-solussa aktivaatioon johtavien tapahtumien aktivaattorina. (Dustin ja Cooper 2000.) Antigeeniä esittelevät dendriittisolut käyttävät antigeenispesifisten T-solujen aktivointiin niin sanottuja kontaktivälitteisiä signaaleja. T- solureseptorin kautta välittyvässä antigeenin aikaansaamassa signaalissa MHC-molekyyliin (molekyyli, joka toimii alustana tunnistettavan antigeenin esittelemiselle) sitoutuu T-solun koreseptori CD4:ään tai CD8:aan riippuen MHC-molekyylin luokasta. Tämän solureseptorivälitteisen signaalin lisäksi T-solujen aktivaatioon tarvitaan kostimulatoristen reseptorien välittämää signaalia. T-solussa kostimulatorisen signaalin vastaanottavina reseptoreina toimivat CD28, ICOS (inducible costimulator) ja CD40L (CD40:n ligandi). Jotta T-solun aktivoituminen on mahdollista, tulee viimeksi mainittujen reseptorien ligandien (vastinparien) esiintyä antigeeniä esittelevän dendriittisolun pinnalla. Näitä antigeeniä esittelevän aktivoidun dendriittisolun pinnalla esiintyviä ligandeja ovat mm. CD80, CD86, CD40, OX40L ja B7RP1. Lisäksi dendriittisolut erittävät sytokiineja, jotka osaltaan ohjaavat aktivoituneen T-solun erilaistumista. (Immunologia 2011f.) Dendriittisolun aktivoima T-solu erilaistuu dendriittisolun antamien signaalien mukaisesti joko CD4-auttaja-T-soluksi, CD8-tappaja-T-soluksi tai vaihtoehtoisesti regulatoriseksi T-soluksi (kuva 3.). (Lanzavecchia ja Sallusto 2001.)

15 15 Kuva 2. Dendriittisolujen rooli ihmisen immuunijärjestelmässä. Kuvassa on esitetty yksinkertaistetusti dendriittisolujen perustehtävät ihmisen immuunijärjestelmässä patogeenin tunkeutuessa kudokseen. Epäkypsä dendriittisolu saapuu verenkierrosta kudokseen, tunnistaa patogeenin sille ominaisten pintarakenteiden kautta ja aktivoituu. Samalla tapahtuu tulehdusreaktio, jolloin vapautuu erilaisia välittäjäaineita (sytokiineja ja kemokiineja). Aktivoitunut antigeeniin sitoutunut dendriittisolu liikkuu imunesteen mukana imusolmukkeeseen, jossa tapahtuu T- lymfosyyttien aktivaatio antigeeniesittelyn kautta. Aktivoituneet T-solut synnyttävät immuunireaktion. (Hänninen ja Vakkila 2003.) T-solujen aktivaation ja immuunivasteen käynnistäjän roolin lisäksi dendriittisoluilla on myös tärkeä tehtävä immunologisen toleranssin ylläpitäjänä (Hänninen ja Vakkila 2003). Immunologisella toleranssilla tarkoitetaan elimistön immuunijärjestelmän kykyä tunnistaa elimistölle vaarattomat allergeenit ja omat rakenteet sekä olla reagoimatta niihin (Pekkarinen 2015). Dendriittisolun ohjaamassa immunologisessa toleranssissa aktivoituneessa T-solussa tapahtuu ns. anergia, jolloin T-solu menettää toiminnallisuutensa tai ohjelmoituu kuolemaan. Vaihtoehtoisesti dendriittisolun toimesta tapahtunut antigeenin esittely voi johtaa myös niin sanotun regulatorisen T-solun muodostumiseen. (Hänninen ja Vakkila 2003.) Nimensä mukaisesti regulatoriset T-solut säätelevät aktiivisesti immuunivastetta ja osallistuvat näin immunologisen toleranssin ylläpitämiseen. Regulatoristen T-solujen sääntelyvaikutus perustuu siihen, että ne hillitsevät elimistön immuunivasteita ja näin vaimentavat immuunivasteen kehittymistä elimistön omia tai elimistölle vaarattomia rakenteita kohtaan. (Miyara ja Sakaguchi 2007.)

16 16 Antigeenin esittelystä syntyvät T-soluvasteet ovat erittäin monimutkaisia, eikä kaikkia näihin vasteisiin johtavia mekanismeja tunneta vielä tarkasti. Dendriittisolu vaatii kuitenkin patogeeniaktivaation ja sen aikaansaaman tulehdusprosessin välittäjäaineiden tuottamia signaaleja antaakseen T-lymfosyyteille spesifisen aktivaation, mikä johtaa lopulta immuunivasteen kehittymiseen. Ilman näitä aktivaatiotekijöitä dendriittisolu toimii todennäköisesti immuunivastetta hillitsevänä säätelijänä, jolloin T-lymfosyytit eivät saa täyttä aktivaatiota. Tämä johtaa T-lymfosyyttien anergiaan tai muuntumiseen regulatoriseksi T-soluiksi ja näin immuunivasteen heikentymiseen. (Hänninen ja Vakkila 2003.) Kuva 3. T-solujen kehitys kateenkorvassa. Kehittyvä T-solu (DP) sitoutuu T-solureseptoreillaan (TCR) MHC-molekyyliin. Sitoutuminen MHC-1-molekyyliin ohjaa solun kehittymään CD8-positiiviseksi tappaja-t-soluksi, kun taas sitoutuminen MHC-2-molekyyliin ohjaa solun kehittymään CD4-positiiviseksi auttaja-t-soluksi. Osa CD4-positiivisista soluista ohjautuu tässä vaiheessa erilaistumaan regulatorisiksi-t-soluiksi (Treg). Erittäin voimakas sitoutuminen MHC-kompleksiin johtaa kehittyvän T-solun apoptoosiin ja negatiiviseen selektioon. Lopputuotteina ovat kypsät CD4-positiiviset auttaja-t-solut ja regulatoriset T-solut sekä CD8-positiiviset tappaja-t-solut. (Pekkarinen 2015.)

17 B-lymfosyytit, niiden tehtävät ja muodostuminen ihmisen immuunijärjestelmässä B-solut (B-lymfosyytit) kuuluvat lymfosyytteihin eli immuunijärjestelmän soluihin. B-lymfosyytit määritellään solujen joukoksi, jotka ilmentävät solukalvollaan erilaisia immunoglobuliinireseptoreita. Immunoglobuliinireseptorit eli antigeenireseptorit tunnistavat spesifisiä antigeenejä näille antigeeneille tyypillisten pintarakenteiden kautta. B-lymfosyytit huolehtivat siis osana muuta immuunijärjestelmää humoraalisesta eli vasta-ainevälitteisestä immuniteetistä. (LeBien ja Tedder 2008.) B-solut jaetaan kehittymispaikkansa perusteella kahteen ryhmään. B1-tyypin solut kehittyvät sikiön maksassa tai sieltä peräisin olevista kantasoluista suolistossa, kun taas B2-tyypin solut kehittyvät luuytimen kantasoluista. B2-tyypin solut kehittyvät imukudosten follikkeleissa sijaitsevista B-soluista (follikulaariset B-solut) tai pernan sinusten marginaalialueella kiertävistä B-soluista. Luuytimestä kehittyvien B2-tyypin solujen lopullinen maturaatio tapahtuu pernassa. B-solut ovat antigeenispesifisiä, eli ne tunnistavat vain tiettyjä antigeenejä näille spesifisten antigeenireseptorien välityksellä. B-soluille ominainen antigeenispesifisyys kehittyy B-solureseptorin muodostuessa eri geenien vaikutuksesta. Tällöin syntyy suuri joukko erilaisia antigeenejä tunnistavia B-soluja. (Jokiranta ja Seppälä 2011, luku Vasta-ainevälitteinen immuniteetti.) B-solun muodostuminen alkaa antigeenispesifisen B-solureseptorin muodostumisesta. Tätä reseptoria koodaa ryhmä erilaisia geenisegmenttejä. Niin sanotussa raskaassa ketjussa (H-ketju) on neljä segmenttiä ja kevyessä ketjussa (L-ketju) on kolme segmenttiä. Niin sanotussa Pro-B -soluvaiheessa H-ketjua koodaavat V-, D-, ja J-alueiden segmentit uudelleenjärjestäytyvät VDJ-kompleksiksi. Seuraavassa vaiheessa, pre-b-soluvaiheessa, pre-b-solujen pinnalle muodostuu igm-molekyyli ja H-ketju muodostuu lopulliseen muotoonsa. Tässä vaiheessa solut, jotka ovat tuottaneet onnistuneet H-ketjun, kutsutaan epäkypsiksi B-soluiksi. Epäkypsät B-solut tuottavat L-ketjua. Lopulta kypsä B-solu saa vielä igm-tyypin reseptorin lisäksi igd-tyypin reseptorin, joka tunnistaa saman antigeenin kuin igm-tyypin reseptori. Tämän jälkeen kypsä B- solu siirtyy luuytimestä verenkierron mukana pernaan ja imusolmukkeisiin, joissa se antigeenin kohdatessaan aktivoituu. (Pieper et al. 2013, Jokiranta ja Seppälä 2011, luku Vasta-ainevälitteinen immuniteetti, Nagasawa 2006.)

18 B-solujen aktivaatio Kuten aikaisemmin todettiin, B-solut huolehtivat osaltaan vasta-ainevälitteisestä immuniteetistä (humoraalinen immuniteetti). B-solujen aktivaatio ja maturaatio vasta-aineita erittäväksi plasmasoluksi vaatii antigeenin läsnäolon. Yleensä B-solun aktivaatioon tarvitaan myös auttaja-t-solun ohjausta (Th2-CD-4-T-solutyyppi tai jotkin Th1-T-solutyypit). (Swanson 2002, luku B-cell development.) B-solujen aktivaation kannalta on siis olennaista, että B-solu kohtaa solukalvonsa pintareseptoreille spesifisen antigeenin ja sitoutuu tähän. Tämän vuoksi B- solut sijaitsevat imukudoksissa, joissa on suurin antigeenikonsentraatio. Antigeeni voi päätyä B-solun solureseptoriin imunesteen mukana tai dendriittisolun välityksellä. B-solun aktivoituminen voi tapahtua joko T-solujen avulla tai itsenäisesti ilman T-solujen kanssa tapahtuvaa vuorovaikutusta. Dendriittisolut ohjaavat täten välillisesti myös B-solujen aktivoitumista, koska B-solujen aktivaatioon tarvittavat T-solut ovat saaneet oman aktivaationsa dendriittisolujen kautta. (Jokiranta ja Seppälä 2011, luku Vasta-ainevälitteinen immuniteetti.) Antigeeni sitoutuu antigeenille spesifiseen B-solureseptoriin ja siirtyy käsiteltäväksi solun sisään, jossa se hajoaa peptideiksi. Peptidit sitoutuvat MHC 2-molekyyliin (muodostuu MHCkompleksi), josta se siirtyy takaisin B-solun pinnalle. Antigeenispesifinen auttaja-t-solu tunnistaa MHC-kompleksin esittelemät antigeenistä peräisin olevat peptidit ja sitoutuu CD40Lreseptorilla B-solun CD40-reseptoriin. B-solu toimii täten antigeeniä esittelevänä APC-soluna T-soluille. Tämän vuorovaikutuksen seurauksena B-solu alkaa jakaantua ja sen jälkeläiset erikoistuvat vasta-ainetta erittäviksi soluiksi. T-solun ja B-solun vuorovaikutuksessa syntyvät vasta-ainetta erittävät solut tuottavat vasta-aineita, jotka reagoivat tarkasti tietynlaisiin proteiineihin ja tuottavat näin immuunivasteen monenlaisiin antigeeneihin. (Parker 1993). B-solu voi reagoida joihinkin antigeeneihin myös suoraan B-solureseptorin kautta ilman auttaja-t-solun apua. Tämä antaa nopean immuunivasteen monille antigeeneille. Vasta-aineet, jotka muodostuvat ilman T-solujen apua ovat kuitenkin vähemmän toiminnallisesti sekä rakenteellisesti monimuotoisia. (Swanson 2002, luku B-cell development ) Monosyytit Monosyyttien kehittyminen ja luokittelu Monosyytit ovat ihmisen immuunijärjestelmän suurimpia valkosoluja, jotka kehittyvät punaisessa luuytimessä myeloidisesta kantasolusta. Kypsät monosyytit siirtyvät luuytimestä

19 19 verenkiertoon, josta ne puolestaan siirtyvät kudoksiin eri puolille elimistöä muuntuen samalla makrofageiksi. Kudoksiin siirtyneet makrofagit ovat pitkäikäisiä, eivätkä ne pysty enää palautumaan verenkiertoon. Makrofageja pystytään erottelemaan ja nimeämään olinpaikkansa mukaan (esimerkiksi keuhkojen alveolaariset makrofagit, keskushermoston mikrogliasolut ja maksan Kupfferrin solut). Monosyytit luokitellaankin usein eräänlaiseksi välimuodoksi luuytimen esivaiheen solujen ja loppuun asti kypsyneiden ja kudoksiin siirtyneiden makrofagien välillä. (Saeed et al. 2014, Salmi ja Meri 2011, luku Immuunijärjestelmän solut ja niiden kehitys.) Fenotyypiltään monosyytit ovat heterogeenisiä. Monosyyttien ilmentämät pintamarkkerit, metabolinen aktivaatio ja morfologia vaihtelevat. Monosyytit ilmentävät CD14 molekyyliä ja jotkin solut monosyytti/makrofagipopulaatiosta ilmentävät CD16 molekyyliä. Monosyytit luokitellaankin kolmeen alaryhmään: klassisiin- (CD14 ++ CD16 ), ei-klassisiin- (CD14dimCD16 ++ ) ja välimuotoisiin (CD14 ++ CD16 + ) monosyytteihin. Monosyyteillä on lisäksi tulehdusreaktioon osallistuvia ige-reseptoreita solukalvollaan. (Ziegler-Heitbrock et al ) Monosyyttien tehtävät ihmisen immuunijärjestelmässä Monosyytit ja makrofagit osallistuvat tulehdusreaktion säätelyyn ja omaavat tärkeän osan synnynnäisen immuunireaktion synnyssä. Patogeeniaktivaation aikaansaama tulehdusreaktio saa veressä kiertävät monosyytit aktivoitumaan. Osa monosyyteistä siirtyy tällöin tulehtuneeseen kudokseen ja kypsyvät makrofageiksi. Makrofagit tappavat solunsisäisiä mikrobeja ja osallistuvat soluvälitteiseen immuunipuolustukseen toimimalla antigeeneja esittelevinä soluina. Elimistölle haitallisten mikrobien tuhoamisen lisäksi makrofageilla on tärkeä rooli myös erinäisissä elimistön puhtaanapitotehtävissä (esimerkiksi poistamalla keuhkoihin ulkoilmasta kertyneitä pienhiukkasia) ja elimistön omien vaurioituneiden solujen eliminaatiossa. (Geissmann et al ) Verenkierrossa pysyvillä monosyyteillä on myös tärkeä rooli ihmisen immuunipuolustuksessa. Monosyytit pystyvät erilaistumaan dendriittisoluiksi, joilla on keskeinen rooli immuunijärjestelmän toiminnassa. Monosyyteillä osallistuvat täten välillisesti myös adaptatiivisen immuniteetin säätelyyn muuntumalla T-solujen toimintaa sääteleviksi dendriittisoluiksi. (Serbina et al )

20 ALLERGIA JA ASTMA Allergia Allergiassa elimistön immuunijärjestelmä on herkistynyt ympäristössä normaalisti esiintyvälle aineelle, jota kutsutaan antigeeniksi. Esimerkiksi ilmassa erityisesti keväisin esiintyvä koivun siitepöly ei itsessään ole kykeneväinen aiheuttamaan elimistössä minkäänlaista vauriota. Siitepölylle herkistyneen immuunijärjestelmä kuitenkin aktivoituu ja käynnistyvät puolustusreaktiot aiheuttavat allergiaoireet. Ympäristössä esiintyvät yliherkkyysreaktioita aiheuttavat aineet ovat kooltaan pieniä, koska niiden tulee päästä kosketuksiin elimistön immuunijärjestelmän kanssa. Yliherkkyysreaktion tyyppi puolestaan riippuu siitä, minkälaisia vasta-aineita immuunijärjestelmän solut tuottavat antigeenille. Kaupunki-ilman pienhiukkaset (esimerkiksi katupölyhiukkaset) voivat toimia antigeeneinä ajautuessaan hengitysilman sisällä keuhkojen alempiin osiin, joissa esiintyy runsaasti immuunivastesoluja. Immuunijärjestelmä aktivoituu pölyn ollessa kosketuksissa immuunivastesolujen kanssa käynnistäen normaalin puolustusreaktion. (Nairn ja Helbert 2002, luku Hypersensitivity reactions.) Allergian kehittymisessä on erotettavissa kolme vaihetta. Ensimmäinen vaihe on allerginen herkistyminen, jossa allergeenia kohtaan muodostuu solutason mekanismien kautta niin sanottu auttaja-t-solu-tyyppi 2 (Th2) painotteinen immuunivaste. Tämä immuunivaste johtaa IgEvasta-aineiden vapautumiseen allergeenia kohtaan. Toinen vaihe on allerginen reaktio, joka johtaa allergialle tyypillisiin oireisiin. Välitön allerginen reaktio syntyy minuuteissa allergisen henkilön altistuessa allergeenille esimerkiksi ruuan kautta. Tällöin basofiilisistä granulosyyteistä ja syöttösoluista vapautuu erilaisia välittäjäaineita synnyttäen allergisen reaktion. Viimeisenä vaiheena allergian kehittymisessä on altistuksen jatkuessa syntyvän allergisen tulehduksen kroonistuminen, joka johtaa yleensä kudostason muutoksiin kohde-elimissä. Esimerkiksi astma on tällainen krooninen tulehdus. (Virtanen ja Savolainen 2011, luku Allergian mekanismit.) Astma Astmalla tarkoitetaan hengitysteissä esiintyvää kroonista tulehdusta, jolle on tyypillistä allergislähtöinen tulehdus, normaalia suurempi hengitysteiden limaneritys ja keuhkoputkien ärsytysoireet. Astman esiintyvyys on epidemiologisten tutkimusten mukaan maailmanlaajuisesti

21 21 nousussa. (Anandan et al ) Astmalle tyypilliset oireet johtuvat tulehduksesta hengitysteissä. Tulehdusta ohjaavat Th 2-solut erittävät sytokiineja (interleukiini-4, interleukiini-5 ja interleukiini-13), jotka aktivoivat mm. kemokiinituotannon kautta tulehdusreaktion. Tulehdusreaktio puolestaan aktivoi immuunijärjestelmän ja aiheuttaa esimerkiksi hengitysteiden sileiden lihasten reagoinnin epäspesifisiin stimulantteihin, kuten kylmään ilmaan. (Lambrecht ja Hammad 2003.) Dendriittisolujen rooli astman ja allergioiden kehittymisessä Dendriittisolut ovat astman kehittymisen kannalta tärkeän allergisen herkistymisen ja hengitystietulehduksen ohjaajia. Hengitysteissä sijaitsevat dendriittisolut, niin sanotut RDTC-solut (respiratory tract dendritic cells) muodostavat tiheän verkoston hengitysteiden limakalvolle ja sen alapuoliseen kudokseen, jossa ne ovat vuorovaikutuksessa hengitysilman mukana hengitysteihin saapuvien allergeenien ja pienhiukkasten kanssa. Esimerkiksi allergisessa keuhkotulehduksessa dendriittisolut ohjaavat allergisessa herkistymisessä muodostuvien auttaja-t-solu-tyyppi 2: ien (Th 2-solujen) muodostumista ja toimintoja. Th 2-solujen tuotanto tapahtuu imusolmukkeissa naiviin T-solun ja tähän sitoutuneen antigeeniä esittelevän dendriittisolun vuorovaikutuksessa. (Ettmayer et al ) Astmaatikkojen hengitysteistä onkin löydetty suurempia määriä dendriittisoluja kuin ei-astmaatikkojen hengitysteistä (Lambrecht 2001). Dendriittisolut eivät täten ainoastaan ohjaa allergisen astman kehittymisen kannalta välttämätöntä herkistymistä hengitysilman mukana hengitysteihin ajautuneita allergeenejä kohtaan, vaan niillä on myös tärkeä rooli hengitysteissä tapahtuvan tulehduksen puhkeamisessa. Dendriittisoluilla on näin allergisen astman kehittymisessä suurempi rooli kuin klassisilla APC-soluilla, kuten alveorisilla makrofageilla ja B-soluilla. (Lambrecht ja Hammad 2003.) Hygieniahypoteesi Termi hygieniahypoteesi esiteltiin ensimmäisen kerran tiedeyhteisölle vuonna 1989 ja sillä pyrittiin tarjoamaan selitys varsinkin länsimaalaisissa ja teollistuneissa maissa parantuneen yleisen hygieniatason ja astman sekä allergisten sairauksien esiintyvyyden nousun väliselle korrelaatiolle (Strachen 1989). Strachenin mukaan teollistuneissa maissa hygieniatason nousu on johtanut astman ja allergisten sairauksien nousuun, kun elinympäristön sterilisoituminen on vähentänyt ihmisten altistumista erilaisille bakteeri-, virus- ja sieniyhdisteille (Strachen 1989).

22 22 Tällaisissa olosuhteissa vähentynyt altistuminen potentiaalisilta allergioilta suojaavilta mikrobiologisilta yhdisteiltä voi johtaa immuunijärjestelmän heikentymiseen ja tätä kautta allergisten sairauksien yleistymiseen väestössä (Clough 2011, Garn ja Renz 2007). Strachen tiivistääkin tutkimuksensa lopussa: Viime vuosisadan aikana pienentynyt perhekoko, parantunut kotitaloudenhoito ja korkeammat standardit henkilökohtaisessa siisteydessä ovat vähentäneet infektioiden leviämistä nuorissa perheissä. Tämä on voinut johtaa laajemmalle levinneeseen atooppisten sairauksien esiintyvyyteen erityisesti varakkaammilla ihmisillä, kuten heinänuhan kohdalla on huomattu (Strachen 1898). Hygieniahypoteesi on siten innoittanut useita allergiatutkimuksia. Ensimmäisiä hygieniahypoteesin innoittamia tutkimuksia oli tutkimus (Nowak et al. 1996), jossa vertailtiin allergioiden esiintyvyyksiä entisessä Itä- ja Länsi-Saksassa. Vaikka kummatkin populaatiot olivat muodostuneet vain 40 vuoden sisällä ja omasivat identtisen geenipohjan, löydettiin silti merkittäviä eroavaisuuksia allergisten sairauksien esiintyvyydessä. Itä-Saksassa astman, hengenahdistuksen ja allergisen nuhan esiintyvyys oli merkittävästi matalampi kuin Länsi-Saksassa. (Nowak et al ) Hygieniahypoteesin esittämisen jälkeen ilmiötä on tutkittu laajasti erilaisissa epidemiologisissa ja kokeellisissa tutkimuksissa, ja niistä on saatu pääasiassa hypoteesia tukevia tuloksia. Tieteelliseltä merkittävyydeltään suurimmat hygieniahypoteesia tukevat epidemiologiset tutkimukset käsittelivät allergisten sairauksien esiintyvyyttä maaseutualueilla syntyneillä ja kasvaneilla lapsilla verrattuna lapsiin, jotka olivat syntyneet ja varttuneet kaupunkialueilla. Useat tutkimukset (muun muassa sveitsiläinen SCARPOL-tutkimus ja saksalainen ALEX-tutkimus) osoittivat vahvan yhteyden maatiloilla monipuolisessa mikrobiympäristössä kasvaneiden lasten ja vähentyneiden allergiasairauksien välillä verrattuna lapsiin, jotka olivat kasvaneet suhteellisen mikrobiköyhässä kaupunkiympäristössä. (Garn ja Renz 2007.) Maatila-altistuksen ja ympäristöerojen lisäksi myös elämäntavoilla on huomattu olevan merkitystä allergisten sairauksien kehittymisen kannalta. Esimerkiksi lemmikeiden omistamisen on osoitettu olevan yhteydessä allergisten sairauksien pienempään esiintyvyyteen. Kouluikäisillä lapsilla tehdyn ruotsalaisen tutkimuksen mukaan lemmikeille (kissa tai koira) altistuminen ensimmäisten elinvuosien aikana vähentää astman ja allergisen nuhan esiintyvyyttä (Hesselmar et al. 1999). Lisäksi ruokavaliolla ja erilaisten antibioottien käytöllä on osoitettu olevan vaikutusta allergisten sairauksien kehittymiseen. Antroposofiseen elämäntapaan kuuluvat fermentoituja vihanneksia runsaasti sisältävä ruokavalio ja antibioottien välttely tai jopa kokonaan

23 23 käyttämättä jättäminen on yhdistetty mahdollisesti atopian pienempään esiintyvyyteen. (Alm et al ) 2.4 MAATILAYMPÄRISTÖN VAIKUTUS ASTMAAN JA ALLERGIOIHIN Astman ja muiden allergisten sairauksien esiintyvyys on noussut varsinkin länsimaissa. Kehittyvissä maissa näitä sairauksia esiintyy huomattavasti vähemmän, mikä on johtanut suureen kiinnostukseen tutkia ympäristötekijöiden roolia astman ja erilaisten allergisten sairauksien kehittymisessä. Alkusysäyksenä toimi erityisesti aikaisemmassa kappaleessa käsitelty hygieniahypoteesi ja allergisten sairauksien perustana olevan immunologisen tiedon parantuminen sekä lisääntyminen. Erityisesti kiinnostuksen kohteena on länsimaalaiseen elämäntapaan liittyvän urbanisaation ja näin maaseutuympäristön supistumisen merkitys astman ja muiden allergisten sairauksien esiintyvyyden nousuun. (Von Mutius ja Vercelli 2010, Eder et al ) Monet epidemiologiset tutkimukset ovat todistaneet, että perinteisillä maatiloilla kasvaneilla lapsilla on vähemmän astmaa, heinänuhaa ja muita allergisia sairauksia. Varhaisessa lapsuudessa tapahtunut altistuminen maatilalla kasvatetulla karjalle ja karjan ravinnoksi tarkoitetulle rehulle sekä prosessoimattoman maidon kulutus ovat osoitettu tarjoavan suurimman suojan astman ja allergisten sairauksien kehittymisessä. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Taulukkoon 1. on koottu tutkimuksia, jotka käsittelevät lapsuusajan maatila-altistusta ja sen vaikutuksia astman, heinänuhan ja muiden allergisten sairauksien kehittymiseen länsimaalaisissa kehittyneissä maissa. Taulukosta 1. nähdään selvästi asuinmaasta riippumaton maatila-altistuksen aikaansaama suojavaikutus, jossa lapsuudessa tapahtunut altistus suojaa astman ja allergioiden kehittymiseltä. Maatilaympäristöissä kasvaneilla lapsilla riski sairastua näihin sairauksiin on huomattavasti pienentynyt. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Kiinnostavasti maatila-altistuksen astmalta ja allergioilta suojaava vaikutus vaihtelee huomattavasti jo suhteellisen pienellä alueella. Lapsuudessa puhkeavan astman, heinänuhan ja atooppisen herkistymisen esiintyvyyden on huomattu vaihtelevan merkittävästi jo maaseutualueiden sisällä. Useissa tutkimuksissa on huomattu, että maatiloilla kasvaneilla lapsilla on huomattavasti pienempi riski sairastua näihin sairauksiin kuin muualla maaseudulla kasvaneilla lapsilla. (Riedler et al. 2001, Von Mutius ja Vercelli 2010.) Tämä maatila-altistuksen aikaansaaman

24 24 suojavaikutuksen astman ja allergioiden kehittymiseen on havaittu myös jatkuvan aikuisiällä (Lampi et al. 2015). Varhaisessa lapsuudessa tapahtuvan maatila-altistuksen tarjoama suojaava vaikutus astmaan ja erilaisiin allergisiin sairauksiin sairastumisessa on siis yleisesti todistettu useissa tieteellisissä julkaisuissa. Suurin epävarmuus puolestaan liittyy yksittäisiin altisteisiin, jotka aikaansaavat tämän suojavaikutuksen ilmenemisen. Tutkimuksissa on huomattu, että varhaisessa lapsuudessa tai ennen syntymää äidin kautta tapahtunut altistuminen tiloilla kasvatetuille eläimille (pääasiassa karjalle, sioille ja siipikarjalle), eläimille tarkoitetulle ravinnolle (heinä, jyvät, säilörehu ja olki) sekä prosessoimattomalle maidolle tuottaa vahvimman suojavaikutuksen astman ja erilaisten allergisten sairauksien kehittymiselle. (Ege et al. 2007, Von Mutius ja Vercelli 2010.) Yksittäisen altisteen osuutta suojavaikutuksen kehittymisessä on vaikea määrittää tarkasti. On kuitenkin huomattu, että suojavaikutus on sitä vahvempi mitä suuremmalle määrälle näitä maatilaympäristölle tyypillisiä altisteita lapsi altistuu. (Ege et al ) Lisäksi suojavaikutuksen synnyssä altistumisen ajoitus on erittäin tärkeää. Suojavaikutus on suurin, kun altistus on tapahtunut ennen syntymää kohdussa tai lapsen ensimmäisten elinvuosien aikana (Riedler et al. 2001, Ege et al. 2006). Maatilaympäristön aikaansaamaa allergiasuojavaikutusta käsittelevässä tutkimuksessa (House et al. 2017) huomattiin, että erityisesti äidin raskaudenaikainen altistuminen maatilaympäristölle tyypillisille antigeeneille oli yhteydessä lapsen vähentyneeseen riskiin sairastua allergisiin sairauksiin myöhemmässä elämässä. Taulukko 1. Kokoomataulukko lapsuusajan maatila-altistuksen vaikutuksia käsittelevistä tutkimuksista (Von Mutius ja Vercelli 2010, muokattu). Diagnosoitu heinänuha Heinänuhan oireet Atooppinen ihottuma Atooppinen herkistys Maa Ikä Astma Hengityksen vinkuna Sveitsi Suomi Itävalta, Saksa, Hollanti, Ruotsi ja Sveitsi Etelä-Saksa Ruotsi Itävalta Itävalta Tanska Hollanti AHR Tutkimukset

25 25 Saksa Suomi Iso-Britannia Pohjois- Saksa Itä-Suomi Ruotsi Itävalta, Saksa ja Sveitsi Tyroli, Itävalta Göteborg, Ruotsi Länsi-Gothia, Ruotsi Turku, Suomi Belgia, Saksa, Hollanti, Ruotsi ja Uusi-Seelanti Australia 7 12 tai tai Uusi-Seelanti Uusi-Seelanti Uusi-Seelanti Kanada British Columbia, Kanada USA Quebeck, Kanada Wisonsin, USA Iowa, USA Iowa, USA : riskin vähenemä ilman tilastollista merkitsevyyttä, : riskin vähenemä, joka on tilastollisesti merkitsevä, -: ei määritetty, : ei maatilan suojavaikutusta, AHR: hengitysteiden yliherkkyys (airway hyperresponsiveness). # Ks. alkuperäisen kokooma-artikkelin viiteluettelo 2.5 MAATILA-ALTISTUKSEN IMMUNOBIOLOGIA Maatila-altistuksen aikaansaamat immuunivasteet Ennen syntymää tai varhaisessa lapsuudessa tapahtuvan maatila-altistuksen aikaansaaman suojavaikutuksen tarkkoja immunologisia mekanismeja ei vielä tunneta tarkasti (Schaub et al.

26 ). Kuitenkin maatilaympäristölle tyypillisen laajan mikrobialtistuksen aikaansaaman immuunivasteen tiedetään suojaavan allergisten sairauksien ja astman kehittymiseltä. Suojavaikutuksen syntymiseen osallistuu yhteistyössä sekä synnynnäinen että hankittu immuniteetti. Tutkimusta synnynnäisen immuniteetin roolista maatila-altistuksen suojavaikutuksen syntymisessä vauhditti hypoteesi siitä, että synnynnäinen immuniteetti toimii korkean mikrobialtistuksen aikaansaaman signaalin välittäjänä hankitulle immuunijärjestelmälle. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Tätä teoriaa tukee tutkimus, jossa saatiin selville, että maatiloilla kasvaneiden lasten perifeeriset verisolut ilmensivät enemmän CD14- ja TLR2-reseptoreita kuin muualla kasvaneiden lasten perifeeriset verisolut (Lauener et al. 2002). Lisää näyttöä saatiin tutkimuksesta, jossa tutkittiin äidin raskaudenaikaista maatila-altistusta ja sen vaikutusta lapsen allergioiden kehittymiseen. Tutkimuksessa huomattiin, että myöhemmin näillä lapsilla verisolut ilmensivät enemmän CD14- ja TLR2-reseptoreita kuin vertailuryhmän (ilman maatila-altistusta) lapsilla. Lisäksi huomattiin, että myös TLR4-reseptoreiden määrä oli noussut vertailuryhmään nähden. Samassa tutkimuksessa löydettiin myös annos-vaste-suhde eläinlajien määrän, joille äiti raskaudenaikanaan oli altistunut ja TLR2, TLR4 sekä CD14 mrna reseptoreiden runsauden kouluikäisten lasten perifeerisissä verisoluissa välillä. (Ege et al ) Vastasyntyneillä mitatut alhaiset interferoni-γ-tasot (IFNγ) ovat yhdistetty kohonneelle riskille sairastua allergisiin sairauksiin myöhemmässä elämässä. Ensimmäisen elinvuoden aikana mitatut alhaiset IFNγ-tasot ennustavatkin vahvasti hengitystieahtaumien kohonnutta riskiä myöhemmässä lapsuudessa. Äidin raskaudenaikainen maatila-altistus nostaa lapsen IFNγ-tasoja, joka osaltaan vähentää lapsella riskiä sairastua allergisiin sairauksiin myöhemmässä elämässä. (Vuillermin et al. 2009, Stern et al. 2007, Wright 2004.) Maanviljelijöiden lasten verisoluja tutkimalla on saatu lisäksi selville, että kyseisten lasten T-auttajasolut ovat yleisesti anergisempia (reagoimattomia) kuin vertailuryhmän (vanhemmat eivät olleet eläneet maatilalla) lasten T-auttajasolut. Tämä saattaa johtua aktivoituneen synnynnäisen immuniteetin erittämistä regulatorisista sytokiineista. (Frei et al ) Myös maatilaympäristöllä on vaikutusta immuunivasteen kehittymiseen: tutkimuksessa (Stein et al. 2016) huomattiin, että perinteisellä maatilalla (tutkimuksessa amish-maatila) synnynnäisen immuniteetin aktivoituminen on voimakkaampaa kuin nykyaikaisia maanviljelytekniikoita käyttävillä maatiloilla. Nämä tutkimukset yhdessä viittaavat siihen, että ennen syntymää tai/ja ensimmäisten elinvuosien aikana tapahtuva altistuminen perinteisillä maatiloilla tyypillisesti esiintyvälle laajalle mikrobialtistukselle johtaa synnynnäisen immuniteetin aktivoitumiseen reseptorisääntelyn kautta (Stein et al. 2016, Frei et al. 2014, Von Mutius ja Vercelli 2010).

27 27 Maatila-altistuksen immunoregulatoriset vaikutukset eivät rajoitu vain synnynnäiseen immuniteettiin. Myös hankitulla immuniteetilla on maatila-altistuksen suojavaikutuksen synnyssä keskeinen rooli. Tutkimuksessa (Stern et al. 2007) arvioitiin niin sanotussa ALEX-tutkimuksessa mukana olleiden kouluikäisten lasten IgG ja IgE vasteita yleisimpiin hengitettäviin allergeeneihin (ruoho, kissan karvat ja pölypunkit). Tutkimuksessa altistuminen kissoille ja ruoholle ei vaikuttanut IgG2 ja IgG3 vasta-aine isotyyppien esiintyvyyteen, mutta esti tehokkaasti IgG1, IgG4 ja IgGE vasta-aineiden (auttaja-t-solutyyppi 2 painoitteinen immuunivaste) tuotannon. Pölypunkkialtistuksessa puolestaan IgE vasta-aineiden osuus oli maatiloilla kasvaneilla lapsilla hieman, mutta kuitenkin merkitsevästi noussut verrattuna vertailuryhmän altistumiseen kissoille ja ruoholle. (Stern et al ) Tutkimuksessa havaittujen immuunivasteiden tarkkoja immunologisia mekanismeja ei tunneta tarkasti, mutta tuloksista voidaan vahvistaa päätelmän siitä, että maatila-altistuksen aikaansaama suojavaikutus on spesifinen tietyille allergeeneille. Immunoglobuliinilöydökset puolestaan osoittavat, että eri allergeenit synnyttävät erilaisia immuunivastesignaaleja. Nämä signaalit taas ovat vuorovaikutuksessa kukin omalla tavallaan maatilaympäristössä suojavaikutusta synnyttävien yhdisteiden kanssa muodostaen monimutkaisen immuunivasteiden verkoston. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Kouluikäisillä maatilalla kasvaneilla lapsilla tehtyjen tutkimusten lisäksi immunologisia analyysejä on suoritettu myös vastasyntyneillä lapsilla, jotta voitaisiin arvioida ennen syntymää tapahtuvan maatila-altistuksen merkitystä erityisesti astman kehittymisen kannalta (Von Mutius ja Vercelli 2010). Pasture-tutkimuksessa (Pfefferle et al. 2008) tutkittiin vastasyntyneiden napanuoraveren IgE vasta-aineiden pitoisuuksia allergeenialtistuksen jälkeen. Kohonneiden IgE vasta-aineiden pitoisuus napanuoraveressä arvellaan olevan yhteydessä ennen syntymää tapahtuneelle allergeenialtistumiselle. Täyttä tarkkuutta ei kuitenkaan ole pystytty osoittamaan, johtuvatko napanuoraverestä mitatut IgE vasta-ainepitoisuudet raskaudenaikaisesta tilapäisestä äidin verenkierron mukana tapahtuvasta vasta-aineiden siirtymisestä, synnytyksessä tapahtuvasta vasta-ainekontaminaatiosta vai todellisesta sikiön allergeenialtistumisesta. Tutkimuksen tuloksissa huomattiin, että tietyille allergeeneille spesifiset IgE-vasteet napanuoraveressä olivat korkeampia niillä vastasyntyneillä, joiden äidit eivät olleet altistuneet maatilaeläimille ja eläimien rehulle. (Pfefferle et al ) Huomattavaa oli myös se, että napanuoraveren mononukleaaristen solujen erittämä interferoni-γ (IFNγ) ja TNF-sytokiinien (sytokiinien joukko, jotka aiheuttavat solukuolemaa eli apoptoosia) tasot olivat huomattavasti korkeammat vastasyntyneillä, joiden äidit olivat eläneet maatilaympäristössä. Th 2-solujen erittämien sytokiinien IL-5 ja IL-10 ja Th 1-solujen erittämän sytokiinin IL-12 tasoihin vastasyntyneiden napanuoraveressä

28 28 maatila-altistus ei vaikuttanut. Äidin raskaudenaikainen altistuminen maatilan eläimille ja prosessoimattomasta maidosta valmistetun voin kulutus huomattiin lisäävän vastasyntyneen IFN γ ja TNF tuotantoa. (Pfefferle et al ) Tulokset viittaavat siihen, että äidin raskaudenaikainen maatila-altistus vaikuttaa vahvasti jälkeläisten sytokiinituotantokapasiteettiin syntymässä (Pfefferle et al ja Pfefferle et al. 2008). Viimeaikaisissa syntymäkohorttien immunologisissa analyyseissä on noussut esiin hypoteesi siitä, että regulatoristen T-solujen aktivoituminen voi liittyä raskaudenaikanaan maatila-altistuneiden äitien lapsilla ilmenevän allergiasuojavaikutuksen syntymiseen. Hypoteesia tukevia tuloksia saatiin äidin maatila-altistuksen ja vastasyntyneiden lasten immuunimekanismeja käsittelevässä tutkimuksessa. (Schaub et al ) Tutkimuksessa saatiin selville, että maatila-altistuneiden (tutkimuksessa erityisesti talli) äitien vastasyntyneiden lasten napanuoraveren CD4+CD25-Treg-solut olivat sekä runsaslukuisampia että tehokkaampia vaimentamaan T-solujen lisääntymisen. Huomattavinta oli kuitenkin se, että äidin altistuminen eri maatilaeläinlajeille nosti regulatoristen T-solujen markkerina toimivan glukokortikoidin aiheuttaman TNF reseptorin (GITR-reseptori) ilmentymistä ja IFNγ:n eritystä napanuoraverisoluissa. (Schaub et al ) Saman tutkimusryhmän myöhemmin julkaisemassa tutkimuksessa regulatoristen T- solujen lisääntyminen selitti osittain sen, että maatilamaitoa juovilla lapsilla esiintyi vähemmän astmaa (Lluis et. al 2014). Dendriittisolujen roolia maatilaympäristön aikaansaaman allergia- ja astmasuojavaikutuksen synnyssä ei tiedetä vielä tarkasti. Tutkimuksissa on kuitenkin havaittu dendriittisolujen lukumääriä vertailemalla eroavaisuuksia maatilalla kasvaneiden lasten ja ei-maatilaympäristössä kasvaneiden lasten välillä. Lipopolysakkaridilla (LPS) stimuloiduilla PBMC-soluilla havaittiin prosentuaalisesti vähemmän mdc-soluja, jos lapsi oli kasvanut maatilaympäristössä. Täten maatilaympäristölle tyypillisille allergeeneille altistuminen voi aiheuttaa erilaisia immunomodulaarisia vaikutuksia dendriittisolujen määrän muuttuessa. (Kääriö et al ) Tutkimuksessa (Martikainen et al. 2015) havaittiin samankaltaisia tuloksia: mdc-solujen osuus oli pienempi maatilalla asuvilla lapsilla kuin muualla kasvaneilla lapsilla. Vaikka edellä käsitellyt tutkimukset eroavat tutkimusasetelmiltaan ja tuloksiltaan, pystytään niistä kuitenkin löytämään myös yhtäläisyyksiä. Altistumisen ajoituksella on erityisen tärkeä rooli maatilaympäristön aikaansaaman suojavaikutuksen syntymisessä: raskaudenaikana ja varhaisessa lapsuudessa tapahtuva maatila-altistus on erityisen tehokas muovaamaan immuunijärjestelmän toimintaa. Lisäksi äidin raskaudenaikainen kontakti maatilalla kasvatettaviin eläinlajeihin on positiivisesti yhteydessä regulatoristen T-solujen aktivoitumiseen ja IFNγ tuotantoon

29 29 syntymässä sekä synnynnäisen immuniteetin reseptorien ilmentymiseen lapsuudessa. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Kuva 4. Yksinkertaistettu malli maatila-altistuksen immunobiologisista vaikutuksista. Äidin raskaudenaikainen altistus maatilatöissä erilaisille maatilalla kasvatetuille eläimille yhdistettynä prosessoimattoman maidon kulutukselle johtaa immuunijärjestelmän mukautumiseen vahvaan mikrobiologiseen ja mahdollisesti ksenogeeniseen paineeseen. Tämä yhteisaltistuminen, joka tapahtuu ratkaisevassa vaiheessa immuunivasteiden kehittymisen kannalta, lisää vastasyntyneen reglatoristen T-solujen ja interferoni-γ:n (IFNγ) tuotantoa. Tämä parantaa hankitun immuniteetin immuunivasteita (tiettyjen reseptoreiden lisääntyneen ilmentymisen kautta) ja vaimentaa Th2-tappaja-T-solutyyppiriippuvaista allergista tulehdusta aikaisessa lapsuudessa. Altistuminen eläimille ja prosessoimattomalle maidolle varhaisessa lapsuudessa vahvistaa raskaudenaikaisen altistumisen aiheuttamaa suojavaikutusta. IFNγ suurentunut tuotanto syntymässä vahvistaa immuunivasteita astman kehittymisen riskiä lisääviä virusinfektioita vastaan (Von Mutius ja Vercelli 2010, muokattu) Maatila-altistuksen aikaansaamien immuunivasteiden solutason mekanismit Maatila-altistuksen aikaansaamien immuunivasteiden tarkkoja solutason mekanismeja ei vielä tiedetä tarkasti, mutta aikaisempaan tutkimustietoon tukeutuen maatila-altistuksen tarkoista solutason mekanismeista on tehty erilaisia todennäköisyysmalleja. Koontiartikkelissa (Von Mutius ja Vercelli 2010) maatila-altistuksen suojavaikutuksen syntyyn johtavien immuunivasteiden solutason mekanismit ovat selitetty mallilla, jossa maatilaympäristölle tyypillisessä mikrobirikkaassa ympäristössä mikrobialtistus aktivoi synnynnäisen immuunijärjestelmän. Tämä

30 30 johtaa TNF-sytokiinien erittymiseen, joka aktivoi regulatoriset T-solut ja saa ne jakautumaan. Regulatoriset T-solut tasapainottavat hankitun immuunijärjestelmän immuunivasteita vaimentamalla allergeenien indusoimaa Th 2-soluihin yhteydessä olevaa sytokiinituotantoa ja Th 2- soluriippuvaista IgE tuotantoa. Mallissa maatila-altistuksen aikaansaamat immunoregulatoriset vaikutukset inhiboivat useita allergisen tulehdusreaktion syntyä ohjaavia solutason mekanismeja, pääasiassa vaimentamalla Th 2-tyypin immuunivasteita (kuva 4). (Von Mutius ja Vercelli 2010.) IFNγ on mallissa keskeisessä roolissa toimien allergia- ja astmariskin indikaattorina. IFNγ on valittu malliin allergia- ja astmariskin indikaattoriksi, koska alentuneen IFNγ-tasot syntymässä on yhdistetty suurentuneeseen riskiin sairastua myöhemmin elämässä allergisiin oireisiin ja atooppisiin sairauksiin. (Wright 2004, Vuillermin et al ) Lisäksi matalat IFNγ-tasot ensimmäisen elinvuoden aikana lisäävät hengitystien ahtaumien todennäköisyyttä myöhemmin lapsuudessa (Stern et al. 2007). Täten äidin maatila-altistuksen aikaansaama IFNγ-tasojen nousu voi olla olennainen osa maatila-altistumisen aikaansaaman allergiasuojavaikutuksen synnyssä lapsella. Äidin altistumisen tulee kuitenkin tapahtua siinä kriittisessä vaiheessa, jolloin lapsen immuunijärjestelmä on muokkautumassa. Tarkkoja mekanismeja, jotka selittävät havaintoja maatilaeläimille altistuneiden äitien vastasyntyneiden lasten IFNγ-tasojen noususta ei vielä tiedetä. Olemassa olevan tiedon avulla voidaan havainnosta kuitenkin muodostaa useita hypoteeseja. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Useissa tutkimuksissa on todistettu, että ihmisen hankitun immuniteetin vasteet (sekä Th1 että Th 2 tyyppinen immuunivaste) ovat tyypillisesti kehittymättömiä syntymähetkellä johtuen muun muassa vähäisestä mikrobialtistuksesta (Halonen et al. 2009, Levy 2007). Siksi arvellaan, että maatilaeläimille altistuneiden äitien vastasyntyneiden lasten suurentunut IFNγ tuotanto onkin riippuvainen pääasiassa synnynnäisen immuniteetin mekanismeista. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Äidin raskaudenaikainen altistuminen useille maatilalla kasvatetuille eläimille ja epätavallisen runsaalle mikrobiympäristölle voi käynnistää TLR-reseptoreita ilmentävien luonnollisten tappajasolujen IFNγ-vasta-aineen erittämisen (Von Mutius ja Vercelli 2010, Muzio et al. 2000). Vastasyntyneen korkeat IFNγ tasot voivat hidastaa allergeenin indusoimaa Th2-tappaja-T-solutyypin erilaistumista ja aktivoida dendriittisolujen IL-12 tuotantoa ja siten kiihdyttää Th1-tyypin immuunivasteita (Snijders et al. 1998, Von Mutius ja Vercelli 2010) (kuva 5). Nämä immuunivasteet tuottavat parantuneen suojan solunsisäisiä patogeenejä vastaan. Näistä suojavaikutuksen vaikutuspiiriin kuuluvista patogeeneistä tärkeimpiä ovat erityisesti hengitystieinfektioita aiheuttavat virukset, jotka

31 31 vaikuttavat hengitysteiden toimintaan ja lisäävät riskiä astman kehittymiseen herkillä ihmisryhmillä kuten atooppisilla lapsilla. (Martinez 2009, Von Mutius ja Vercelli 2010.) Kuva 5. Mallikuva mahdollisista maatila-altistuksen suojavaikutuksen syntyyn johtavista solutason mekanismeista. Mallissa maatila-altistuminen (erityisesti erilaisille maatilalla kasvatetuille eläimille) johtaa synnynnäisen immuniteetin aktivoitumiseen suuren mikrobialtistuksen yhteydessä. Tämä johtaa voimakkaaseen sytokiinien ohjaamaan (TNF, IL-10) regulatoristen T- solujen aktivaatioon, joka tasapainottaa hankitun immuniteetin immuunivasteita ja vaimentaa allergisen tulehdusreaktion päämekanismeja (allergeenien indusoima Th2-auttaja-T-solutyypin sytokiinituotanto ja Th2-soluriippuvainen IgE-synteesi). Lisäksi vähentynyt IL-4 ja IL-13 tuotanto vähentää Th2 solutyyppiin yhdistettyä sytokiiniriippuvaista CD14-reseptorien inhibitiota. Tämä lisää patogeenejä tunnistavien reseptorien (pattern-recognition receptors) ilmentymistä vahvistaen synnynnäisen immuniteetin immuunivastetta. Interferoni-γ (IFNγ) tuotannon nousu maatila-altistuneiden (pääasiassa altistuminen erilaisille maatilaeläimille) äitien lapsilla johtuu pääasiassa synnynnäisen immuniteetin aktivoitumisesta. Synnynnäisen immuniteetin aktivaatiosta huolehtivat dendriittisolut ja TLR-reseptoreita ilmentävät luonnolliset tappajasolut. Toisaalta myös ksenogeeninen kuormitus jatkuvassa maatilaeläinaltistuksessa voi johtaa luonnollisten tappajasolujen IFN γ tuotannon lisääntymiseen. Tämä vaimentaa Th2-solujen sytokiinituotantoa ja nopeuttaa Th1-solutyypin vasteita aktivoimalla dendriittisolujen hallinnoimaa IL-12 tuotantoa. Kaikki nämä mekanismit toimivat yhdessä vähentäen Th2-tyypin allergista tulehdusreaktiota. (Von Mutius ja Vercelli 2010, muokattu.)

32 KAUPUNKI-ILMAN PIENHIUKKASET Kaupunki-ilman pienhiukkaskoostumus on hyvin heterogeeninen. Eri päästölähteistä peräisin olevat kemialliset ja mikrobiperäiset komponentit muodostavat kaupunki-ilmassa hyvin monimutkaisen seoksen, joka käy ilmakehässä fysikaalisia ja kemiallisia muutoksia useiden erilaisten mekanismien kautta. Nämä ilmakehässä tapahtuvat pienhiukkasten kemiallisia ja fysikaalisia ominaisuuksia muuttavat mekanismit ovat hyvin riippuvaisia vuodenajasta, joten kaupunkiilman pienhiukkaskoostumus vaihtelee suuresti myös eri vuodenaikoina. (Jalava et. al 2015.) Kaupunki-ilmalle on lisäksi tyypillistä, että pienhiukkaspitoisuudet vaihtelevat suuresti kaupungin eri osien välillä. Esimerkiksi vilkkaasti liikennöityjen teiden, puun pienpolttoalueiden ja teollisuusalueiden läheisillä alueilla pienhiukkaspitoisuudet muodostavat niin sanottuja kuumia pisteitä, joissa pitoisuudet ovat huomattavasti muuta kaupunkialuetta korkeampia. (Vallius 2005.) Kaupunki-ilman pienhiukkaset jaotellaan usein kolmeen luokkaan: ultrapieniin hiukkasiin (läpimitta 0,01-0,1 µm), akkumulaatio- eli kertymähiukkasiin (läpimitta 0,1-1,0 µm) ja karkeisiin hiukkasiin (yli 1,0 µm tai yli 2,5 µm). Ultrapienien hiukkasten päästölähteet liittyvät aina palamiseen ja kaupunkialueilla liikenne onkin pääasiallinen ultrapienien hiukkasten päästölähde. Ultrapienet hiukkaset eivät massaltaan muodosta kuin vain muutaman prosentin kaupunki-ilman hiukkasista, mutta lukumäärältään ja pinta-alaltaan ne muodostavat jo keskeisen osan kaupunki-ilman pienhiukkaskoostumuksesta. Ultrapienet hiukkaset muodostavat yhteen kerääntyessään suurempia akkumulaatiohiukkasia, jotka pysyttelevät ilmassa jo useita viikkoja. Suomessa akkumulaatiohiukkasten suurin lähde on kaukokulkeuma. Karkeat hiukkaset puolestaan ovat pääasiassa peräisin maaperästä ja ovat koostumukseltaan useimmiten erilaista kiviainesta. Karkeita hiukkasia irtoaa kaupunki-ilmaan erityisesti autojen renkaiden irrottamana pölynä sekä varsinkin keväällä hiekoitushiekasta tuulen ja liikenteen välityksellä (kuva 6). (Pekkanen 2004.) Tyypilliset PM10 vuosikeskiarvot suomalaisissa kaupungeissa ovat noin 20 µg/m 3. PM2,5 hiukkaset muodostavat vuosikeskiarvosta noin puolet. (Vallius et al )

33 33 Kuva 6. Kaavio kaupunki-ilman pienhiukkasten massapitoisuuksista ja päästölähteistä. Ultrapienet hiukkaset (läpimitta alle 0,1 µm) ovat pääosin erilaisia hiiliyhdisteitä. Akkumulaatiohiukkaset (0,1-1,0 µm) koostuvat pääosin palamisessa syntyvistä rikki- ja typpioksideista (SO4, NO3) ja hiiliyhdisteistä. Karkeat hiukkaset (yli 1,0 µm tai 2,5 µm) ovat pääosin maaperästä peräisin olevia alkuaineita. (Pekkanen 2004.) 2.7 KAUPUNKI-ILMAN PIENHIUKKASTEN TERVEYSVAIKUTUKSET Epidemiologia Useat epidemiologiset tutkimukset ovat löytäneet yhteyden kaupunki-ilman pienhiukkasten ja erilaisten terveyshaittojen välillä (Henschel et al. 2012). Tutkimukset ovat osoittaneet, että kaupunki-ilman pienhiukkasmaiset epäpuhtaustasot vaikuttavat suoraan väestön sairastavuuteen ja kuolleisuuteen. Tarkkoja solutason mekanismeja, joilla kaupunki-ilman hiukkasmaiset epäpuhtaudet aiheuttavat havaittuja terveysvaikutuksia ei tiedetä täysin. Vuosikymmenten aikana kerääntyneet epidemiologiset todisteet kaupunki-ilman hiukkasmaisten epäpuhtauksien ja vakavien terveysvaikutuksien välillä ovat kuitenkin niin vahvat, että tiedeyhteisö pitää yleisesti näiden välistä yhteyttä kiistattomana. (Kunzli et al ) Epidemiologiseen- ja toksikologiseen tietoon perustuen on myös todettu, että kaupunki-ilman pienhiukkaset saattavat osaltaan

34 34 vaikuttaa astman kehittymiseen tietyillä geneettisesti herkillä ihmisryhmillä, jotka elävät vilkkaasti liikennöityjen teiden välittömässä läheisyydessä (Gowers et al. 2012) Lyhytaikaisvaikutukset Ulkoilman hiukkaspitoisuuden lyhytaikaisvaikutuksia tutkitaan erityisesti aikasarjatutkimuksilla, joissa pystytään luotettavasti todentamaan jo pienienkin ulkoilman hiukkaspitoisuuksien vaihteluiden vaikutukset esimerkiksi sairaalakäynteihin ja kuolleisuuteen tietyllä aikavälillä. Useissa aikasarjatutkimuksissa ulkoilman hiukkaspitoisuuden onkin todettu olevan läheisesti yhteydessä sairastavuuteen ja kuolleisuuteen. Vahvin yhteys on todettu hengitys- ja verenkiertoelimistön sairauksiin. (Brunekreef ja Holgate 2002.) Varsinkin erityisryhmät, kuten vanhukset, lapset, astmaatikot ja muut hengitystiesairauksista kärsivät oireilevat herkemmin ja pienemmissä pienhiukkaspitoisuuksissa (Pekkanen 2004). Eurooppalaiset APHEA (Air Pollution and Health: a European Approach) tutkimukset antoivat keskeistä lisätietoa ja todistusaineistoa kaupunki-ilman pienhiukkasten lyhytaikaisvaikutuksista ihmisten terveyteen. Niin sanotussa APHEA2-projektissa 29 eurooppalaisen kaupungin asukkaiden (yhteensä noin 43 miljoonaa ihmistä) kuolleisuutta tutkittiin yli viiden vuoden ajan. Tuloksista saatiin selville muun muassa, että pienhiukkaspitoisuuden (PM10) noustessa 10 µg/m 3 päivittäinen kuolleisuus nousi 0,6 %, yli 65-vuotiaiden astmaatikkojen sairaalakäynnit nousivat 1,0 % sekä sydän- ja verisuonitautien vuoksi sairaalaan hakeutuneiden määrä nousi 0,5 %. (Katsouyanni et al ) Myös Euroopan ulkopuolella on tehty tutkimusasetelmaltaan samankaltaisia tutkimuksia, joista on saatu samassa linjassa olevia tuloksia APHEA tutkimusten kanssa: Yhdysvalloissa NMMAPS (National Mortality, Morbidity and Air Pollution Studies) tutkimuksissa käsittelyn kohteena oli Yhdysvaltojen 20 suurinta metropolialuetta asukkaineen (yhteensä noin 50 miljoonaa asukasta). Tutkimuksessa pienhiukkaspitoisuuden (PM10) noustessa 10 µg/m 3 kokonaiskuolleisuus nousi 0,5 %, yli 65-vuotiaiden astmaatikkojen sairaalakäynnit nousivat 1,5 % ja yli 65-vuotiaiden sydän- ja verisuonitautipotilaiden sairaalakäynnit nousivat 1,1 %. (Samet et al ) Tutkimusten tulokset ovat linjassa keskenään ja tuloksia voidaan pitää luotettavana, koska aikasarjatutkimuksissa tuloksia sekoittavia tekijöitä ovat pääasiassa vain pienhiukkaspitoisuuksien kanssa päivittäin vaihtelevat muuttujat, kuten säätila ja muiden ilmansaasteiden pitoisuudet ilmassa (Pekkanen 2004).

35 Pitkäaikaisvaikutukset Toisin kuin lyhytaikaisvaikutuksissa, ulkoilman pienhiukkasten aiheuttamia pitkäaikaisvaikutuksia on vaikeampia tutkia. Suurin epävarmuus liittyy pienhiukkasten aiheuttamaan kuolleisuuteen, sillä kokonaiskuolleisuuteen vaikuttaa lukemattomia muita muuttujia pienhiukkaspitoisuuden lisäksi. (Pekkanen 2004.) Ensimmäinen merkittävä pitkäaikaisen pienhiukkasaltistuksen ja terveysvaikutusten yhteyttä käsittelevä seurantatutkimus Six Cities Study tutki 8111 aikuista yksilöä kuudesta eri kaupungista. Tutkimuksessa kaupunkien pienhiukkaspitoisuuksia seurattiin tarkasti ja pienhiukkaspitoisuuden lisäksi muut terveyteen vaikuttavat riskitekijät selvitettiin. Tutkimuksessa huomattiin, että tutkittujen kuolleisuuden lisääntyminen korreloi suoraan kaupunki-ilman keskimääräisen pienhiukkaspitoisuuden kasvun kanssa (kuva 7). Erityisesti sydän- ja verisuonitaudit sekä keuhkosyöpä aiheuttivat lisääntynyttä kuolleisuutta. (Dockery et al ) Tutkimuksen tulos on sittemmin vahvistettu kahdessa muussa yhdysvaltalaisessa tutkimuksessa (Pope et al. 2002, McDonnell et al. 2000). Pitkäaikaisen pienhiukkasaltistuksen ja sydän- ja verisuonisairauksien sekä keuhkosyövän yhteyttä on tutkittu useissa tutkimuksissa. Esimerkiksi eurooppalaisen seurantatutkimuksen (Hoek et al. 2002) tuloksista ilmeni, että liikenteessä syntyvät pienhiukkaset lisäävät riskiä sairastua sydän- ja verisuonitauteihin. Lisäksi useat epidemiologiset ja toksikologiset tutkimukset ovat osoittaneet kaupunkiilman pienhiukkasten ja keuhkosyövän välisen yhteyden (Cohen 2000).

36 36 Kuva 7. Keskimääräisen pienhiukkaspitoisuuden yhteys suhteelliseen riskiin kuolla kuudessa yhdysvaltalaisessa kaupungissa (kirjaimet kaupungin nimen etukirjaimen mukaan) (Dockery et al. 1993) Kaupunki-ilman pienhiukkasten yhteys lasten allergioihin ja astmaan Kaupunki-ilman hiukkasmaisten ilmansaasteiden yhteyttä lapsuusaikana kehittyviin allergisiin sairauksiin ja astmaan on tutkittu useissa eri tutkimuksissa ympäri maailmaa. Lyhytaikaisvaikutuksista tiedetään muun muassa, että altistuminen kaupunki-ilman hiukkasmaisille epäpuhtauksille voi astmaatikoilla laukaista astmaoireita. Tieteellinen tutkimustyö on kuitenkin nykyään kiinnostunut erityisesti kaupunki-ilman epäpuhtauksien aiheuttamille pitkäaikaisvaikutuksille, koska niistä tiedetään paljon vähemmän kuin lyhytaikaisvaikutuksista. (Carlsten ja Melen 2012.) Useiden tutkimusten mukaan lapset ovat herkimpiä kaupunki-ilman pienhiukkasten aiheuttamille terveysvaikutuksille. Tämä johtuu useista tekijöistä. Ensinnäkin lasten keuhkot kehittyvät ja kasvavat jatkuvasti, joten altistuminen ilmansaasteille vaikuttaa herkemmin keuhkojen normaaliin toimintaan ja kehittymiseen. Toiseksi lapset viettävät suhteellisen paljon aikaa ulkona verrattuna aikuisiin. Ulkona olemiseen liittyy usein myös fyysiset aktiviteetit, jotka lisäävät sisäänhengitetyn ilman määrää. Seurauksena sisäänhengitetyn ilman mukana lapset altistuvat suuremmille määrille ilman hiukkasmaisia epäpuhtauksia kuin aikuiset. Kolmanneksi nuoret lapset hengittävät pääasiallisesti suun kautta, jolloin alempiin hengitysteihin päätyy enemmän ilmansaasteita kuin nenän kautta hengitettynä. (Esposito et al ) Ruotsalaisen kohorttitutkimuksen mukaan varhaisessa lapsuudessa tapahtuva altistuminen erityisesti liikenneperäisille hiukkasmaisille epäpuhtauksille voi olla yksi merkittävä tekijä allergisten sairauksien kehittymiselle myöhemmällä iällä. Tutkimuksessa saatiin selville, että ensimmäisen elinvuoden aikana tapahtuva altistuminen liikenneperäisille ilmansaasteille on yhteydessä suurentuneeseen riskiin saada hengitysvaikeuksia. Lisäksi altistuminen on yhteydessä suurentuneeseen herkistymisriskiin erilaisille allergeeneille myöhemmässä lapsuudessa. Ensimmäisen elinvuoden aikana tapahtuva altistuminen alensi myös lasten keuhkojen toimintakykyä myöhemmässä lapsuudessa. (Nordling et al ) Laajoissa epidemiologisissa

37 37 tutkimuksissa on lisäksi havaittu positiivinen yhteys ilmansaasteiden ja kouluikäisillä lapsilla puhkeavan allergisen nuhan välillä (Lee et al. 2003, Gehring et al. 2010). Viimeisin tieteellinen tutkimustyö on tuottanut uusia todisteita, joiden mukaan kaupunki-ilman hiukkasmaiset epäpuhtaudet ovat yhteydessä lisääntyneeseen astman esiintyvyyteen sekä lapsilla että aikuisilla (Carlsten ja Melen 2012). Hollannissa tehdyssä kohorttitutkimuksessa (Gehring et al. 2010) käytettiin useita ilmansaasteita (noki, PM2,5 ja NO2) käsittelevää mallinnusta. Mallinnuksen avulla saatiin selville, että PM2,5 pitoisuudet ilmassa olivat yhteydessä merkittävään astman ja astmaoireiden esiintyvyyden lisääntymiseen. Samankaltaisia tuloksia on saatu myös useista muista tutkimuksista. Esimerkiksi Yhdysvaltalaisessa tutkimuksessa (Jerrett et al. 2008) löydettiin yhteys liikenneperäisten hiukkasmaisten ilman epäpuhtauksien ja puhjenneen astman välillä. Syntymäkohorttitutkimuksissa on lisäksi löydetty yhteys kohdunaikaisen ja varhaisen lapsuuden aikaisen altistumisen ilmansaasteille (PM2,5, musta hiili, noki) ja lisääntyneen astman, hengenahdistuksen sekä allergisen herkistymisen välille (Clark et al. 2010, Brauer et al. 2007). Ruotsalaisessa tapaus-verrokkitutkimuksessa saatiin selville, että lähellä vilkasliikenteisiä teitä asuvilla vuotiailla havaittiin lisääntynyttä astman esiintyvyyttä (Modig et al. 2006). Harvassa tutkimuksessa kuitenkaan selvennetään, onko kyseessä normaali astma vai allerginen astma. Kaupunki-ilman hiukkasmaisten epäpuhtauksien rooli allergioiden kehittymisessä on kuitenkin vieläkin melko epäselvä, vaikka useissa tutkimuksissa on saatu rohkaisevia tuloksia kaupunki ilman hiukkasten merkityksellisestä roolista erityisesti allergisten sairauksien kehittymisessä. Tämä johtuu siitä, että osassa tutkimuksissa puolestaan ei ole löydetty minkäänlaisia todisteita kaupunki-ilman epäpuhtauksien ja allergisen herkistymisen väliltä. (Gruzieva et al. 2011, Hirsch et al. 1999, Nicolai et al ) Lisäksi tarjolla ei ole vertailuun tarpeeksi pitkiä seurantajaksoja sisältäviä kohorttitutkimuksia (Gehring et al. 2010). Esimerkiksi 8 vuoden seurantatutkimuksessa (Gruzieva et al. 2011) saatiin selville, että altistuminen liikenneperäisille ilmansaasteille (vuotuisat PM10 ja NOx keskimääräispitoisuudet) ei näyttänyt lisäävän kokonaisriskiä allergisen herkistymisen kehittymiseen 8 vuoden ikään mennessä. Tosin tutkimuksessa huomattiin, että riski herkistyä erilaisille ruoka-allergeeneille ja siitepölyille oli hienoisesti noussut 8 vuoden ikään mennessä. Myös tässä tutkimuksessa altistuminen ilmansaasteille oli tärkeintä ensimmäisen elinvuoden aikana. Haasteita tutkimukselle luo myös se, että allergioiden ja astman syntyyn vaikuttaa ympäristötekijöiden lisäksi useat geneettiset ominaisuudet. Ympäristötekijöiden ja yksilöiden geneettiset ominaisuudet huomioon ottavia tutkimuksia on verrattain vähän allergioita ja astmaa käsittelevässä tutkimuksessa. (Carlsten ja Melen 2012.)

38 Pienhiukkasten aiheuttamien terveysvaikutusten mekanismit Pienhiukkaset vaihtelevat kooltaan ja kemialliselta koostumukseltaan hyvin paljon toisistaan, joten yhteistä mekanismia, joka selittäisi pienhiukkasten aiheuttamia lyhyt- tai pitkäaikaisvaikutuksia, on vaikea määrittää (Stone ja Godleski 1999). Epidemiologiset tutkimukset ovat todistaneet, että varsinkin PM2,5 ja ultrapienet hiukkaset vaikuttavat pienhiukkasista eniten kuolleisuus- ja sairastavuustilastoihin. PM2,5 ja varsinkin ultrapienet hiukkaset tunkeutuvat syvälle keuhkokudokseen ja pääsevät näin nopeasti verenkiertoon aiheuttaen erilaisia terveysvaikutuksia. (Pekkanen 2004, Stone ja Godleski 1999.) Eläinkokeilla ja in vitro kokeilla saavutettu toksikologinen tieto tukee käsitystä siitä, että pienhiukkaset aiheuttavat keuhkoihin tunkeutuessaan oksidatiivista stressiä ja sitä kautta tulehdusta. Oksidatiivisen stressin aiheuttama tulehdustila ja sen aiheuttamat terveysvaikutukset ilmenevät erityisesti herkillä ryhmillä, kuten kroonisista keuhkosairauksista kärsivillä, tupakoijilla, lapsilla ja vanhuksilla. Pienhiukkasten laukaisema lisääntynyt oksidatiivinen stressi keuhkoissa voi aiheuttaa muun muassa veren hyytymistekijöiden pitoisuuden nousua ja lisätä tätä kautta sydäninfarktin riskiä. Erityisesti ultrapienten hiukkasten aiheuttama oksidatiivinen stressi voi myös vähentää keuhkorakkuloiden makrofagien fagosytoosia. (Donaldson et al ) Oksidatiivisen stressin aiheuttaman tulehduksen on huomattu lisäävän veriplasman fibrinogeenikonsentraatiota. Tämä voi osaltaan lisätä sydäninfarktin riskiä. (Pekkanen et al ) Pienhiukkasaltistus on lisäksi liitetty sydämen autonomisen säätelyn häiriöihin (Stone ja Godleski 1999). Eläinkokeissa pienhiukkasaltistuksen on varmistettu aiheuttavan keuhkojen tulehdusta ja pahentavan puhjennutta ateroskleroosia (valtimonkovettumatauti) (Saldiva et al. 2002, Suwa et. al 2002). Tarkkoja mekanismeja, joilla pienhiukkasaltistus vaikuttaa sydän- ja verenkiertoelinsairauksien kehittymiseen, ei kuitenkaan vielä tiedetä (Pekkanen et. al 2002). Pienhiukkasten terveysvaikutuksilla on toksikologisten tutkimusten mukaan vahva yhteys pienhiukkasten massapitoisuuden lisäksi niiden koostumukseen. Pienhiukkasten aiheuttamia terveysvaikutuksia osaltaan mahdollisesti aiheuttavien toksisten yhdisteiden selvittäminen onkin noussut suosituksi tutkimuskohteeksi. Tietyt yhdisteet, kuten metallit, ovat yhdistetty toksikologisissa tutkimuksissa pienhiukkasaltistuksen yhteydessä esiintyvään keuhkotulehdukseen. (Saldiva et al ) Erityisesti siirtymämetallien tiedetään aiheuttavan biologisissa kudoksissa oksidatiivista stressiä johtaen tulehdusreaktion käynnistymiseen. Keuhkotulehdus voi siis aiheutua hengitysilman mukana kulkeutuvista pienhiukkasista itsessään ja/tai niiden pinnalla

39 39 kulkeutuvista kemiallisista yhdisteistä. Pienhiukkasista erityisesti ultrapienet hiukkaset ovat terveysvaikutusten kannalta vaarallisimpia, johtuen niiden pienen koon mahdollistamasta kyvystä tunkeutua keuhkojen alveoleista suoraan verenkiertoon. Tällöin niiden mukanaan kantamat kemialliset yhdisteet pääsevät suoraan elimistöön. (Magnani et al ) Toksikologisissa tutkimuksissa onkin todistettu, että ultrapienet hiukkaset aiheuttavat suuremman tulehdusvasteen kuin massaltaan sama määrä halkaisijaltaan suurempia hiukkasia (Oberdörster 2001). Intensiivisetä tutkimustyöstä huolimatta tutkimuksissa ei ole saatu selvitettyä mitään keskeistä yhdistettä, joka selittäisi pienhiukkasten aiheuttamat terveysvaikutukset (Pekkanen 2004) Pienhiukkasten arvioidut vaikutusmekanismit allergioiden ja astman kehittymisessä Nykytietämys ei täysin ymmärrä tarkkoja mekanismeja, joilla allergiat ja astma kehittyvät ja ilmansaasteiden osuus näiden sairauksien kehittymisessä on vielä vahvasti epäselvä. Allergioiden ja astman kehittymisessä tulee aina ottaa huomioon yksilöiden geneettinen alttius ympäristötekijöiden (pienhiukkasaltistus) rinnalla. Nykytutkimuksessa geenien ja ympäristötekijöiden välisten vuorovaikutusten selvittäminen onkin entistä tärkeämpää, jotta kaupunki-ilman epäpuhtauksien vaikutusmekanismeista allergioiden ja astman kehittymisessä voitaisiin saada lisää laadukasta tietoa. Astman ja allergisten sairauksien tutkimuksessa erityisesti tulehdusreaktioon (TNF, tuumorinekroositekijä), synnynnäiseen immuniteettiin (TLR2 ja TLR4) ja antioksidatiiviseen järjestelmään vaikuttavat geenit ovat intensiivisen tutkimustyön alla (Guarnieri ja Balmes 2014, Carlsten ja Melen 2012).

40 40 3. TYÖN TAVOITTEET Tieteellisissä tutkimuksissa on osoitettu, että maatilaympäristö suojaa allergioiden ja allergisten sairauksien kehittymiseltä. Tämä johtuu mahdollisesti jo ennen syntymää tai varhaisessa lapsuudessa tapahtuvasta immuunijärjestelmän jatkuvasta aktivoitumisesta maatilaympäristölle tyypillisessä mikrobirikkaassa ympäristössä. (Von Mutius ja Vercelli 2010.) Näihin tietoihin tukeutuen opinnäytetyön hypoteesina oli, että maatilapölyaltistus aktivoi immuunivasteen säätelymekanismeihin kuuluvia immuunisoluja ja kaupunki-ilman pienhiukkasilla on päinvastaiset vaikutukset. Opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää, minkälaisia vaikutuksia maatilapöly- ja kaupunki-ilman pienhiukkasaltisteilla on lasten verinäytteistä kerättyjen PBMC-solujen CD80/ILT4-vasteisiin. Tuloksia verrattiin keskenään ja peilattiin tieteellisessä kirjallisuudessa esitettyihin havaintoihin. Lisäksi työn tavoitteena oli harjoitella virtayssytometrianalyysiä ja asiallisia laboratoriotyöskentelytaitoja.

41 41 4. AINEISTO JA MENETELMÄT 4.1 KÄYTETYT NÄYTTEET JA ALTISTEET PBMC-solut Pro Gradu -työn kokeellisen osan määrityksissä käytettiin suomalaisten 4-vuotiaiden lasten verinäytteistä eristettyjä ääreisverenkierron mononukleaarisia soluja (PBMC-solut). PBMCsolut ovat ääreisverenkierron pyörätumaisia soluja, joihin luetaan lymfosyytit (B- ja T-solut sekä luonnolliset tappajasolut), monosyytit ja dendriittisolut. PBMC-soluja säilytettiin jäädytettyinä nestetyppisäiliöissä Altisteet PBMC-soluja altistettiin Kiinan Nanjingin kaupunki-ilmasta kerätyillä hiukkasnäytteillä ja suomalaiselta maatilalta kerätyillä maatilapölynäytteillä. Kaupunki-ilmasta kerätyt hiukkasnäytteet olivat lajiteltu koon mukaan ultrapieniin- (ultrafine), pieniin- (fine) ja kertymähiukkasiin (accumulate). Annoskokoluokat olivat 25 µg/ml, 75 µg/ml ja 150 µg/ml. Maatilapölynäytteet olivat kerätty suomalaiselta maatilalta. Maatilapölyaltisteiden annoskokoluokat olivat 20 µg/ml, 40 µg/ml ja 80 µg/ml. Sekä maatilapölynäytteitä että hiukkasnäytteitä säilytettiin pakastimessa. Pilottitutkimuksen aikana kaikki annoskokoluokat testattiin ja lopullisiksi kokeissa käytettäviksi annoksiksi valittiin kaupunki-ilman hiukkasnäytteillä 75 µg/ml ja maatilapölynäytteillä 40 µg/ml.

42 KÄYTETTY MITTAUSLAITTEISTO Virtaussytometrian toimintaperiaate PBMC-solujen esikäsittelyn ja altistus-stimulaatioiden jälkeen solunäytteet analysoitiin virtaussytometrillä. Virtaussytometriassa vaippavirtausnesteen mukana kulkevat partikkelit (esimerkiksi solut) viritetään fluoresoivalla merkkiaineella ja valaistaan laserilla (kuva 8.). Virittyneen merkkiaineen lähettämää ja solujen siroamaa valoa mitataan ja näin voidaan erottaa solupopulaatiot toisistaan koon, rakenteen ja merkkiaineiden tunnistamien pinta- tai intrasytoplasmisten antigeenien perusteella (Ilveskero 2016, Jahan-Tigh et al. 2012). Työssä käytettiin pääasiassa virtaussytometristä immunofenotyypitystä. Immunofenotyypityksessä solun fenotyyppi (erilaistumislinja ja kypsyysaste) määritetään spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden avulla. Vasta-aineisiin on liitetty erilaisia fluorokromeja, jotka tunnistavat niille spesifisiä antigeenejä. Tällä tavoin solut ja niiden kypsyysasteet voidaan tunnistaa tarkoin (Bleesing ja Fleisher 2001). Virtaussytometrisen analyysin etuina ovat menetelmän nopeus, mahdollisuus tarkastella yhtäaikaisesti useita soluominaisuuksia yhdistettynä suurien solumäärien analysointiin. Toisaalta menetelmällä on myös omat ongelmansa. Näytteiden mahdollinen kontaminaatio sekoittaa helposti tuloksia ja samankaltaisia merkkiaineita sisältäviä solupopulaatioita voi olla vaikeaa erottaa toisistaan. Lisäksi menetelmässä käytettyjen fluorokromien emissiospekrit voivat mennä päällekkäin, jolloin yksittäinen detektori voi havaita useammasta kuin yhdestä kohdefluorokromista peräisin olevaa fluoresenssia. Emissiospektrien erottaminen joudutaan suorittamaan käyttämällä matemaattista algoritmia, jolloin yksittäinen detektori havaitsee vain tietyn fluorokromin emittoimaa valoa. Tästä toimenpiteestä käytetään nimeä kompensaatio. Virtaussytometrian käytön ongelmina ovat lisäksi tarkkojen standardien puuttuminen sekä datan analysoinnissa että tutkimusasetelman suunnittelussa. Analyysistä kerääntyvän suuren datamäärän käsittely vaatii pitkää perehtyneisyyttä, jotta tuloksista saadaan luotettavia (Jahan- Tigh et al. 2012, Bleesing ja Fleisher 2001).

43 43 Kuva 8. Virtaussytometrin toimintaperiaate. Näytteet esikäsitellään ja analyysiin valmiit solususpensiot syötetään järjestelmään. Soluliuos virtaa laminaarisesti halkaisijaltaan kapenevaa putkea pitkin, jolloin solut järjestäytyvät nesteessä peräkkäin jonoksi. Solut valaistaan laserilla ja solujen emittoima sekä siroama valo analysoidaan optisilla detektoreilla. Lopuksi optinen informaatio lähetetään tietokoneelle lopulliseen analyysiin. (1) FSC-detektori, (2) SSCdetektori, (3) fluoresenssidetektori, (4) filtterit ja peilit, (5) varatut levyt (Jahan-Tigh et al. 2012, muokattu) Virtaussytometrinen data-analyysi Virtaussytometrisen analyysin tuottamaa dataa käsiteltiin tietokoneohjelmalla (FlowJo ). Jokaisesta mittauksesta saatiin kuvan 9. mukainen fluoresenssidatasta muodostettu pistekuva, josta nähdään kaikki mittauksessa valoa emittoineet partikkelit. Jokainen histogrammissa oleva piste kuvaa solua (tai muuta roskaksi luettavaa hiukkasta). Pistejoukkojen värin muuttuessa, niiden tiheys tietyllä alueella nousee. Histogrammin x-akselilla on esitetty FSC-intensiteetti ja y-akselilla SSC-intensiteetti. FSC (forward scatter) kuvaa solujen suhteellista kokoa ja SSC (side scatter) tarjoaa informaatiota solujen granulariteetista (Jahan-Tigh et al. 2012).

44 44 Kuva 9. Pistekuva (dot plot) perifeerisistä verisoluista otetusta virtaussytometrianalyysistä. X-akselilla on esitetty FSC-intensiteetti (forward scatter area) ja y-akselilla on SSC-intensiteetti (side scatter area). Eri solupopulaatiot ovat erotettu toisistaan (Jahan-Tigh et al. 2012, muokattu). Mielenkiintoisia solupopulaatioita voidaan rajata graafisesti lähempää analyysiä varten. Tällöin puhutaan rajaamisesta, jota kuvaa englanniksi ammattitermi gating (Jahan-Tigh et al. 2012). Pro Gradu -työssäni rajaukset tehtiin jokaiselle käsiteltävälle solutyypille erikseen CD80- ja ILT4-proteiineille. Kuvassa 10. on esitetty esimerkki rajauksesta myeloidisten dendriittisolujen (mdc) kohdalla. Rajauksen avulla saadaan selville CD80- ja ILT4-reseptoreita ilmentävien solujen suhteellinen määrä koko solupopulaation solumäärästä.