FNR-like-proteiinin sijainti ja toiminta kasvien kloroplasteissa

Transkriptio

1 1 FNR-like-proteiinin sijainti ja toiminta kasvien kloroplasteissa Olavi Misin Turun Suomalaisen Yhteiskoulun lukio Biologia

2 2 Tiivistelmä Minä, Olavi Misin, olin kahden viikon ajan mukana Turun yliopiston biokemian ja elintarvikekemian laitoksen molekulaarisen kasvibiologian osaston käynnistämässä tutkimuksessa koskien kasvien FNR-like-proteiinia. Tutkimuksen tavoitteena oli ja on edelleen selvittää tuon entsyymin tarkka sijainti ja tehtävä fotosynteettisten eukaryoottien kloroplasteissa. Aineistona tähän tutkielmaan toimi oma käytännön kokemukseni tutkimukseen liittyvästä laboratoriotyöstä, työnohjaajani Paula Mulon minulle antama materiaali, sekä itse hankkimani kirjallisuus fotosynteesiin liittyen. Kaikki aineisto oli peräisin korkeintaan muutaman vuoden takaa. Tutkimuksessa saatiin selville, ettei geenin keskeyttämisen kautta aikaansaatu FNR-like-proteiinin vajaus vaikuta koeorganismina käytetyn lituruohon lehden muiden FNR-proteiinien tuotantoon, mistä voidaan päätellä, ettei FNR-like-proteiinin synteesi ole yhteydessä lehden muiden FNRproteiinien synteesiin. FNR-like-proteiinin vajaus ei myöskään näy kyseisen kasvin valohaavikompleksien, sytokromi b 6 f -kompleksien taikka tyypin I fotosysteemien runsaudessa. Tutkitun entsyymin tarkka sijainti ja toiminta jäivät kuitenkin vielä tuntemattomiksi ja tutkimus FNR-like-proteiinin parissa jatkuu yhä.

3 3 Sisällys 1 Johdanto s Fotosynteesi yleisesti s Fotosynteesi eukaryooteilla s Kloroplastit ja pigmentit s Fotosysteemit ja Z-reitti s Ferredoksiini-NADP + -oksidoreduktaasi-entsyymi s.7 2 Aineisto ja menetelmät s Tutkimussuunnitelma s Koeorganismit s Tutkimusmenetelmät s Bradfordin menetelmä s Työvaiheet s Ensimmäinen SDS-PAGE s Työvaiheet s Ensimmäinen Western blot menetelmä s Työvaiheet s Toinen SDS-PAGE ja Western blot s Työvaiheet s.15 3 Tulokset ja tulosten tarkastelu s Bradfordin menetelmä s Ensimmäinen SDS-PAGE ja Western blot s Toinen SDS-PAGE ja Western blot s Lopulliset tulokset s Mahdollisuudet jatkotutkimuksille s.20 4 Kiitokset s.20 5 Lähteet s.21

4 4 1 Johdanto 1.1 Fotosynteesi yleisesti Fotosynteesi, eli valon avulla yhteyttäminen, on vihreissä kasveissa, levissä ja tietyissä bakteereissa tapahtuva kemiallinen prosessi, jossa veden, hiilidioksidin ja auringon valon avulla tuotetaan orgaanisia hiiliyhdisteitä (pääosin glukoosia), sekä happea oheisen kokonaisreaktioyhtälön mukaisesti: 6 CO H 2 O + valoenergiaa C 6 H 12 O O H 2 O (Veden esiintyminen reaktioyhtälön molemmilla puolilla täsmentää reaktioiden tapahtuvan vedessä, sekä painottaa sitä, että fotosynteesissä syntyvä happi on peräisin nimenomaan hajotetusta vedestä, eikä hiilidioksidista.) Fotosynteesi voidaan prosessina jakaa kahteen osaan, joista ensimmäisessä, valoreaktioissa, tuotetaan valon avulla ATP-molekyylejä, NADPH:ta sekä happea, ja toisessa, hiilensidontareaktioissa, ATP ja NADPH käytetään hiilidioksidista saatavan hiilen assimilointiin, eli sokeriyhdisteiden tuottoon. Fotosynteesin lopulliset tuotteet, sokeri ja happi, toimivat lähtöaineina kaikkien elollisten olentojen elämää ylläpitävässä perusreaktiossa, eli soluhengityksessä, jonka kokonaisreaktioyhtälö on esitetty alla (Happonen ym. 2007): C 6 H 12 O O 2 6 CO H 2 O + 38 ATP Kuten reaktioyhtälöistä voidaan todeta, fotosynteesi ja soluhengitys ovat toisilleen käänteisiä prosesseja. Niiden yhdistetty, auringon valon avulla pyörivä kierto pitää yllä elämää Maan päällä. 1.2 Fotosynteesi eukaryooteilla Kloroplastit ja pigmentit Levissä ja korkeammissa kasveissa, eli fotosynteettisissä eukaryooteissa fotosynteesi on happea tuottavaa ja tapahtuu kloroplasti-nimisessä soluelimessä (Taiz & Zeiger 2006). Kloroplastit ovat keskimäärin 10 µm:n pituisia, usein hieman käyristyneitä lieriöitä, joita tavataan pääasiassa mesofyllisolukossa, eli kasvien lehdissä, uloimpien solukerrosten välissä. Tyypillinen mesofyllisolu voi sisältää viidestä viiteenkymmeneen kloroplastia. Kloroplastia ympäröi kaksi kalvoa, jotka kontrolloivat aineiden siirtymistä kloroplastin ja sytoplasman välillä. Kloroplasti sisältää stroomanestettä, joka on fotosynteesin pimeäreaktioiden tapahtumapaikka, sekä tylakoidikalvoston, jossa tapahtuvat valoreaktiot. Tylakoidikalvosto koostuu granatylakoideista, jotka muistuttavat muodoltaan litteitä kiekkoja ja ovat asettuneina päällekkäin grana-nimisiksi pinoiksi, sekä

5 5 stroomatylakoideista, jotka näyttävät mutkittelevilta putkilta ja yhdistävät granatylakoideja toisiinsa. Tylakoidikalvojen sisällä, proteiineihin kiinnittyneinä sijaitsevat auringon valon energiaa vangitsevat väriainepigmentit (Nabors & Cummings 2004.) Pigmentit ovat hiukkasia, jotka pystyvät virittymään absorboimalla fotoneita. Virittyessään pigmentti hyödyntää fotonin liike-energian oman elektroninsa nostamiseen korkeammalle energiatasolle, ja näin ollen fotoni voi absorboitua pigmenttiin vain, jos pigmentissä vallitsee sellainen elektronikuorien välinen energiaero, joka vastaa fotonin energiaa tai on sitä pienempi. Fotonin liike-energia riippuu sen aallonpituudesta, ja tästä johtuen kukin pigmentti voi absorboida vain sen ominaiselle aallonpituusalueelle kuuluvia fotoneita (Taiz ym ) Klorofylli a on fotosynteesin primaarinen pigmentti, eli ainoa pigmentti, joka osallistuu valoreaktioihin suoraan. Muita kloroplastin pigmenttejä, kuten karotenoideja ja klorofylli b:tä kutsutaan apupigmenteiksi, sillä ne virittyessään luovuttavat saamansa energian välittömästi klorofylli a:lle jatkamatta sen siirtoa keskenään. Apupigmenttien tehtävänä on laajentaa kasveihin absorboituvan valon spektriä, minkä lisäksi niillä on hiljattain todettu olevan fotosysteemejä suojaavia vaikutuksia (Nabors ym ) Fotosysteemit ja Z-reitti Fotosysteemit koostuvat tylakoidikalvoille määrätysti järjestäytyneistä pigmenteistä sekä muista proteiineista. Fotosysteemit koostuvat reaktiokeskuksesta ja valohaavikomplekseista (LHC, light harvesting complex ). Valohaavikompleksin kidemäisesti asettuneiden pigmenttien, eli ns. antennimolekyylien, tehtävänä on kanavoida valosta saatua energiaa reaktiokeskukseen. Reaktiokeskus koostuu reaktiokeskusklorofyllistä ja primaarisesta elektronin vastaanottajasta, jotka puolestaan käyttävät valohaavikompleksilta saadun energian elektroninsiirtoketjuksi nimetyn hapetuspelkistysreaktioiden sarjan käynnistämiseen. Siis kun fotosysteemiin osuu valoa, jokin valohaavikompleksissa oleva pigmenttimolekyyli virittyy ja siirtää virityksensä toiselle pigmentille, joka tekee samoin, kunnes varaus on päätynyt reaktiokeskusklorofyllille. Reaktiokeskusklorofylli tarvitsee virittymiseensä vähemmän energiaa kuin antennimolekyylit, ja siksi se viritysenergian saadessaan ionisoituu, eli luovuttaa virittyvän elektroninsa täysin (Nabors ym ) Fotosysteemeitä on kahta tyyppiä: I ja II (nimetty löytämisjärjestyksessä). Suurin ero systeemien välillä on siinä, että fotosysteemin II reaktiokeskus, P680, absorboi valoa parhaiten aallonpituudella 680 nm, kun taas fotosysteemin I:n reaktiokeskukselle, P700:lle, sopivin aallonpituus on 700 nm.

6 6 Lisäksi fotosysteemissä II on yhtä paljon klorofylli a:ta sekä b:tä, kun taas fotosysteemissä I b:tä on vähemmän. Fotosynteettisillä eukaryooteilla, toisin kuin joillakin prokaryooteilla, on tylakoidikalvoillaan molemmat fotosysteemit, joita yhdistää elektroninsiirtoketju (Nabors ym ) Näiden fotosysteemien aikaansaamaa tapahtumasarjaa fotosynteesin valoreaktioissa kutsutaan usein Z-reitiksi, sen reaktiokaavion muodon vuoksi (kuva 1). Z-reitissä on oikeastaan esitetty valoreaktioiden elektroninsiirtäjät vedeltä NADP + :lle vertikaalisesti järjestettyinä hapetuspelkistyspotentiaalinsa (E ) mukaan (Taiz ym ) Hapetus-pelkistyspotentiaali kuvaa pelkistimen taipumusta luovuttaa elektroneja ja on sitä negatiivisempi, mitä voimakkaampi pelkistin on kyseessä. Z-reitti myös tiivistää valoreaktioiden tapahtumat: kyseessä on prosessi jossa valon energian ja vedeltä saatujen elektronien avulla muodostetaan pelkistin, joka siten muuttaa NADP + :n NADPH:ksi. Vaikka useimmiten eukaryoottien valoreaktiot tapahtuvat Z-reitin mukaisesti, on tämän lineaarisen elektroninsiirtoketjun lisäksi olemassa myös syklinen elektroninsiirtoketju, jossa fotosysteemi I toimii ikään kuin kehässä (Nabors ym. 2004). Kuva 1. Valoreaktioiden Z-reitti ( org/tj/v17/i3/photosynthesis.as p) Z-reitin muodostava reaktiosarja saa alkunsa, kun kummankin fotosysteemin valohaavikompleksit virittyvät ja siirtävät virityksen reaktiokeskuksiinsa. P680 luovuttaa ionisaatiossa elektroninsa primaariselle elektronin vastaanottajalle, joka puolestaan siirtää sen elektroninsiirtoketjuun kohti sytokromi b 6 f -kompleksia (kuvassa 1 keskellä). Uuden elektronin P680 saa mangaanin avulla vedeltä, vettä hajottavasta proteiiniyhdistymästä (kuvassa 1 vasemmalla), jossa tapahtuu seuraava reaktio: 2 H 2 O O H e - Reaktiossa syntynyt happi poistuu tässä vaiheessa kloroplastista, syntyneet elektronit siirtyvät ionisoituneelle reaktiokeskusklorofyllille, mutta protonit jäävät toistaiseksi tylakoidin sisäpuolelle. Kun elektroninsiirtoketjun elektronit saavuttavat sytokromi b 6 f -kompleksin, se pumppaa elektronien energialla lisää protoneja tylakoidin sisään vahvistaen tylakoidin ulko- ja sisäpinnan

7 7 välille muodostuvaa ph-gradienttia. Tämä gradientti tasoittuu, kun ylimääräiset protonit löytävät tiensä ulos tylakoidista tämän kalvorakenteessa olevan ATP-syntaasin läpi. ATP-syntaasi hyödyntää lävitseen kulkevan protonivirran fotofosforylaatio-nimisessä reaktiossa liittämällä stroomassa liikkuviin ADP-molekyyleihin yhden epäorgaanisen fosfaattiosan lisää. Tällöin syntyy ATP:tä, joka on valoreaktioiden ensimmäinen lopputuote (Taiz ym ) Toinen valoreaktioiden lopputuote syntyy, kun elektronit jatkavat matkaansa sytokromi b 6 f - kompleksista plastosyaniinin kautta fotosysteemi I:n reaktiokeskukseen pelkistäen siellä reaktiokeskusklorofyllin. P700:n reaktiokeskusklorofylli on jo ennen näiden elektronien saapumista nostanut virittyvän elektroninsa energiatasoa valohaavikompleksilta saadulla energialla ja lähettänyt tämän elektronin ferredoksiini-nimiselle proteiinille. Ferredoksiini, yhdessä ferredoksiini-nadp + - oksidoreduktaasi-entsyymin kanssa, käyttää tämän korkeaenergisen elektronin NADP + :n pelkistämiseen NADPH:ksi synnyttäen valoreaktioiden toisen lopputuotteen. Kootusti eukaryoottien fotosynteesin valoreaktiot voidaan esittää seuraavalla yhtälöllä (Heino & Vuento 2004): 2 H 2 O + 2 NADP fotonia O NADPH + 2 H Ferredoksiini-NADP + -oksidoreduktaasi-entsyymi Ilman ferredoksiini-nadp + -oksidoreduktaasi-entsyymiä, eli lyhyemmin FNR-entsyymiä, fotosynteesin valoreaktiot eivät voisi tuottaa NADPH:ta, mikä toimii tärkeänä pelkistävänä voimana monissa kasvin reaktioissa, kuten hiilen assimiloinnissa, typen käsittelyssä sekä strooman hapetuspelkistysreaktioiden hallinnassa. Ilman NADPH:ta monet kasvin metaboliset reaktiot eivät siis voisi toteutua, eivätkä kasvit pystyisi esimerkiksi tuottamaan orgaanisia sokereita tyydyttämään omaa ja muiden eliöiden energiantarvetta. FNR-entsyymin arvellaan myös toimivan säätelevänä tekijänä lineaaristen ja syklisten elektroninsiirtoketjujen välillä, minkä lisäksi se ehkäisee vaarallisten hapettimien muodostumista stroomassa (Lintala ym. 2009). FNR on siis keskeinen metabolinen entsyymi. FNR:ää esiintyy kasvien lehdissä kahta eri tyyppiä: lfnr1:a ja lfnr2:a. Lyhenteiden edessä olevat l-kirjaimet viittaavat englannin kielen sanaan leaf lehti, ja erottavat nämä entsyymit sellaisista FNR-proteiineista, joita esiintyy kasvien juurissa ja muissa ei-yhteyttävissä solukoissa. Nämä ns. juuri-fnr-proteiinit toimivat lehtien FNR-entsyymeille päinvastaisella tavalla hapettaen NADPH:ta ja käyttäen tämän elektroneja mm. typen ja rikin sidontaan. Lehden FNR-proteiinit

8 8 esiintyvät osittain liukoisina stroomassa ja osittain kiinnittyneinä tylakoidikalvoille sekä jossain määrin myös kloroplastia peittävän kalvon sisäpinnalle. Kummatkin lehden FNR-proteiineista ovat röntgenkristallografisten menetelmien ansiosta rakenteeltaan tunnettuja ja niiden on todettu muodostavan korkean molekyylimassan komplekseja tylakoidien pinnalla. Kummatkin entsyymeistä ovat tutkimusten mukaan myös aktiivisia sekä lineaarisessa että syklisessä elektroninsiirtoreitissä (Lehtimäki 2010.) Hiljattain on kuitenkin löytynyt myös kolmas lehdessä esiintyvä FNR-proteiini. Tämä uusi tulokas osoittaa suurta yhtenevyyttä aikaisemmin löydettyihin entsyymeihin, ja onkin siksi saanut nimen FNR-like-proteiini ( like kaltainen ). FNR-like-proteiinin on tietokonemallien ja proteomiikan tutkimusten perusteella todettu esiintyvän kloroplasteissa ja olevan tuman geenien koodittama, minkä lisäksi proteiinin rakenneanalyysit ovat paljastaneet sen sisältävän NADP + -molekyylin sitomiseen sopivan kohdan. FNR-like-proteiini on kuitenkin osoittautunut kykenemättömäksi ferredoksiinin sidontaan, mistä johtuen kyseinen entsyymi ei lehden muiden FNR-proteiinien tavoin pysty osallistumaan NADP + :n pelkistykseen (Lehtimäki 2010.) FNR-like-proteiinin kloroplastin sisäinen sijainti sekä tehtävä kloroplastissa ovat siis vielä toistaiseksi tuntemattomia ja niiden selvittämiseksi Turun Yliopisto aloitti asiasta tutkimuksen, jossa sain olla mukana välisenä aikana. 2 Aineisto ja menetelmät 2.1 Tutkimussuunnitelma Turun yliopiston biokemian ja elintarvikekemian laitoksen molekulaarisen kasvibiologian osaston laboratoriossa käynnissä oleva tutkimus pyrkii selvittämään FNR-like-proteiinin sijainnin ja tehtävän lituruohon kloroplasteissa. FNR-like-proteiinin sijainnin selvittämiseksi lituruohon kloroplasteja hajotetaan näytteiksi liukoisesta stroomasta sekä tylakoidimassasta. Saatujen näytteiden proteiinikonsentraatiot määritetään Bradfordin menetelmällä, jonka jälkeen näytteet läpikäyvät SDS-PAGE- sekä Western blot -menetelmät (Lehtimäki 2010.) SDS-PAGE-ajolla tutkitaan myös FNR-like-proteiinin puutoksen vaikutuksia lehtien muiden FNR-proteiinien tuotantoon sekä kasvien fotosysteemien muihin proteiinikomplekseihin.

9 9 2.2 Koeorganismit Turun Yliopisto käyttää nykyisin fotosynteettisten eukaryoottien mallikasvina lituruohoa (Arabidopsis thaliana). Lituruoho soveltuu ominaisuuksiltaan ideaalisesti kasvikehityksen genetiikan tutkimuksiin ja on maailman ensimmäinen genomiltaan kokonaan sekvensoitu kasvi. Lituruohon geenistä koostuva genomi on kasvikunnan pienimpiä ja sisältää hyvin vähän turhaa DNA:ta, eli mm. toistojaksoja ja introneita. Lituruoho myös kasvaa nopeasti ja pienessä tilassa, tuottaa paljon siemeniä, sekä ilmentää herkästi mutaatioita (users.rcn.com 2004.) Tutkimusta varten laboratorio oli tilannut kolme mutanttilinjaa lituruohoa, jossa FNR-likeproteiinia koodittava geeni oli keskeytetty agrobakteerin T-DNA-insertin avulla. T-DNA-insertti on sellainen alue agrobakteerin perimässä, joka pystyy helposti siirtymään osaksi kasvin perimää ja vaimentamaan näin jonkin kasvin geenin, jonka keskelle se osuu (Happonen ym. 2006). Viittaan näihin mutantteihin jatkossa usein nimellä FNR-like-mutantit. 2.3 Tutkimusmenetelmät Bradfordin menetelmä Bradfordin menetelmä on tuntemattoman näyteliuoksen proteiinikonsentraation määrittämiseen tähtäävä spektrometrinen, analyyttinen toimenpide. Menetelmä perustuu coomassie-väriaineen värinvaihdokseen sen sitoutuessa liukoisen näytteen proteiineihin. Coomassie hapettaa proteiinin ionisoituvat kohdat, mikä saa aikaan proteiinin tertiäärirakenteen denaturoitumisen ja hydrofobisten osien kääntymisen poolittomista taskuista ulospäin. Tämän jälkeen dispersiovoimat ajavat proteiinimolekyylit väriaineeseen kiinni ja ionisidokset proteiinien positiivisesti varattujen aminoryhmien ja väriaineen negatiivisten osittaisvarausten välillä sinetöivät liitoksen. Coomassie vaihtaa värinsä punaisesta siniseksi ja tämän värinvaihdoksen voimakkuus on suoraan verrannollinen liuoksen proteiinikonsentraatioon (wikipedia 2010a.) Värinvaihdoksen voimakkuus voidaan mitata spektrometrisesti tarkkailemalla sitä, miten paljon jonkin tietyn aallonpituuden säteilyä pääsee coomassiella värjätyn liuoksen läpi ja määrittämällä tämän perusteella liuoksessa tapahtuvan absorbanssin suuruus. Tuntemattoman näytteen proteiinikonsentraatio voidaan tällöin selvittää konsentraatioiltaan tunnettujen näytteiden absorbanssiarvojen avulla. Tunnettujen näytteiden konsentraatiot ja absorbanssit sijoitetaan absrobanssi-konsentraatio koordinaatistoon, jolloin syntyneisiin pisteisiin voidaan sovittaa suora (konsentraatio absorbanssin funktiona, eli ns.

10 10 standardisuora). Standardisuoran avulla tuntemattomien näytteiden absorbanssiarvot voidaan muuttaa proteiinikonsentraatioiksi (msnstate.edu.) Bradfordin menetelmän puutteita ovat standardisuoran lyhyt lineaarinen osuus (absorbanssiarvojen kasvaessa kuvaaja lähtee vähitellen kaareutumaan), sekä joidenkin detergenttien, kuten SDS:n (natriumlauryylisulfaatti), vaikutus prosessiin. Jos näyteliuoksen SDS-pitoisuus on alle 0,0667 % (paino per tilavuus), SDS sitoutuu liuoksen proteiineihin, jolloin ne eivät enää pysty liittymään coomassie-väriaineeseen ja mittauksista saatavat proteiinikonsentraatiot jäävät todellisia pienemmiksi. Jos taas näyteliuoksen SDS-konsentraatio ylittää mainitun pitoisuuden, alkavat SDSmolekyylit sitoutua myös coomassie-väriaineeseen, jolloin mittauksista saatavat konsentraatiot alkavat kasvaa todellisia arvoja suuremmiksi (wikipedia 2010a.) Työvaiheet Lituruohon villimuodolta (WT, wild type ) sekä FNR-like-mutantilta tarvittiin tutkimusta varten proteiinikonsentraatioltaan tunnetut proteiininäytteet kloroplasteista kokonaisuudessaan, sekä tylakoideista ja stroomasta erikseen. Kloroplastinäytteet saatiin suoraan lituruohon lehdistä eristämällä, mutta tylakoidi- ja stroomanäytteiden saamiseksi kloroplastit tuli hajottaa. Kloroplastien hajottamiseksi lituruohon lehdet jäädytettiin nestetypen avulla ja jauhettiin sokkipuskurissa, jonka sisältämä sokeri rikkoi lehtien kalvorakenteet osmoottisella paineella. Syntynyt seos suodatettiin ja sentrifugoitiin, minkä seurauksena kloroplastien strooman liukoiset proteiinit jäivät nestefaasiin, kun taas tylakoidimurska saostui sentrifugointiastian pohjalle. Nestefaasi, eli supernatantti otettiin talteen stroomanäytteeksi ja tylakoidinäyte tuli puolestaan valmiiksi, kun kiinteä faasi, eli pelletti vielä liuotettiin säilytyspuskuriin (Lehtimäki 2009.) Saatujen näytteiden proteiinikonsentraatiot määritettiin Bradfordin menetelmällä tutkimuksen seuraavaa vaihetta, eli SDS-PAGE ajoa varten. Kun tunnetaan näytteiden proteiinikonsentraatiot, voidaan valmistaa proteiinimassaltaan tunnettuja näytteitä, mikä on SDS-PAGE-ajossa tärkeää. Bradfordin menetelmän aluksi coomassie-väriaineen sisältävästä Bradford-reagenssista muodostettiin värilaimennos, jota lisättiin yhdessä MQ-veden (tislattu ja ionipuhdistettu vesi) kanssa näytteisiin. Kolmesta villityypin näytteestä ja kolmesta FNR-like-mutantin näytteestä tehtiin kustakin kolme rinnakkaista näyteputkea ja spektrofotometria varten valmistettiin standardisuora IgG-proteiiniseoksesta. Tässä tuli ottaa huomioon, että myös muut näyteliuosten aineet, kuin pelkästään näytteiden coomassiella värjätyt proteiinit, absorboivat valoa

11 11 spektrofotometrimittauksessa, minkä vuoksi spektrofotometriin tulee jättää koko mittauksen ajaksi ns. tausta, eli 0-näyte. Tämä 0-näyte kuuluu standardisuoraan ja sisältää siis proteiineja lukuun ottamatta kaikkea näyteliuoksissa esiintyvää vähentäen tämän absorption automaattisesti muiden näyteliuosten tuloksista Ensimmäinen SDS-PAGE SDS-PAGE, eli natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi, on biokemiassa yleisesti käytetty kromatografinen tekniikka, jolla erotellaan proteiineja niiden elektroforeettisen liikkuvuuden mukaan. Tähän liikkuvuuteen vaikuttavat mm. proteiinin polypeptidiketjun pituus, molekyylipaino ja laskostuminen, mutta mikäli proteiinin natiivi rakenne ei ole jatkotutkimusten kannalta merkittävä, liikkuvuuteen vaikuttavia tekijöitä pyritään karsimaan. Tästä johtuen analysoitavaan proteiiniliuokseen lisätään ennen itse toimenpidettä SDS:ää, joka on proteiinien sekundaari- ja tertiäärirakenteita denaturoiva anioninen detergentti. SDS suoristaa proteiinit ja varaa ne negatiivisesti suhteessa niiden molekyylimassaan, jolloin proteiinit erottuvat geelielektroforeesissa vain molekyylipainonsa mukaisesti (työ 4.) SDS:ää sitoutuu yhtä proteiinigrammaa kohti 1,4 grammaa, joten useimpien proteiinien massa/varaus-suhde on suurin piirtein yhtenäinen ja proteiinin geelillä vaeltama matka tällöin suoraan verrannollinen proteiinin massaan. Proteiinien denaturoimisen varmistamiseksi voidaan näyteliuosta vielä kuumentaa nopeasti lähellä sen kiehumispistettä pelkistimen läsnä ollessa (wikipedia 2010b.) Elektroforeesia varten kahden lasilevyn väliin valetaan polyakryyliamidigeeli (kuva 2), joka on akryyliamidin ja bis-akryyliamidin yhteispolymeraation tuloksena syntyvä verkko. Amidien välinen reaktio käynnistyy, kun niihin lisätään TEMED:iä (tetrametyylietyyliamiini) ja APS:ää (ammoniumpersulfaatti). Aluksi levyjen väliin tehdään erotusgeeli, eli tämän kromatografisen menetelmän varsinainen proteiineja erotteleva kiinteä faasi, joka sisältää 5-15 % akryyliamidia. Erotusgeeli tasataan MQ-veden ja isopropanolin seoksella ja annetaan hyytyä kiinteäksi, jonka jälkeen sen päälle valetaan ohut kerros pakkausgeeliä. Pakkausgeeli muistuttaa koostumukseltaan erotusgeeliä, mutta siinä on vain 3-4 % akryyliamidia, joten se on erotusgeeliä harvempaa. Pakkausgeeliin tehdään kaivot näytteiden pipetointia varten ja sen tarkoituksena on pakata kaikki näytekuoppaan tulevat proteiinit erotusgeelin rajapintaan, jolloin ne lähtevät varsinaiseen elektroforeesiajoon samalta viivalta. Kun geelit on valettu, ne asetetaan lasilevyjen välissä vertikaalisesti ajolaitteistoon siten, että levyn yläpäässä on puskuriliuoksen täyttämässä altaassa negatiivinen elektrodi ja alapäässä (samanlaisessa altaassa) positiivinen elektrodi. Elektrodit

12 12 kytketään virtalähteeseen ja SDS:llä negatiivisesti varautuneet proteiinit lähtevät vaeltamaan geelin verkkorakenteen läpi kohti positiivista elektrodia (työ 4.) Lopulta tuloksena on geelille syntyvä raita-kuvio, jossa proteiinit ovat jakautuneet molekyylimassansa mukaan. Kuva 2. SDS-PAGE laitteisto ( hods-page.jpg) Työvaiheet Tutkimuksessamme kaksi geeliä ladattiin näytteillä taulukon 1 kuvaamalla tavalla. Kuten taulukosta nähdään, näytteistä on Bradfordin menetelmän ansioista pystytty tekemään proteiinimassoiltaan juuri tietyn suuruisia. Taulukko 1. Ensimmäisen SDS-PAGE ajon näytteet. Lyhenteet: klo kloroplastit, tyl tylakoidit, str strooma, WT villityypin lituruoho, FNR-like FNR-like-mutantit, STD standardinäyte, SB solubilointipuskuri. Käytän samoja lyhenteitä myös seuraavissa taulukoissa. kaivot: geeli 1 näyte proteiinia (µg) kaivot: geeli 2 näyte proteiinia (µg) 1 WT: klo STD 2 WT: klo WT: tyl 10 3 FNR-like: klo FNR-like: tyl 10 4 WT: tyl WT:str 10 5 WT: tyl FNR-like: str 10 6 FNR-like: tyl SB 7 WT: str 30 8 WT: str 60 9 FNR-like: str STD STD, eli standardinäyte (taulukko 1) on kaupallinen seos erimassaisia proteiineja, joiden molekyylipainot tunnetaan. Nämä proteiinit asettuvat elektroforeesissa erotusgeelille tasavälisiksi raidoiksi ja toimivat ikään kuin mittatikkuna geelin reunassa. Vertaamalla tuntemattomien proteiinien asemaa tähän mittatikkuun voidaan saada selville kyseisten proteiinien massa. SB, eli solubilointipuskuri mainitaan taulukossa 1 erillisenä näytteenä (kaivo 16), mutta SB:tä lisätään tosin myös kuhunkin näytteeseen erikseen. Solubilointipuskurin tehtävä on hajottaa näytteissä mahdollisesti olevia saostumia, varmistaa proteiinien denaturoituminen, sekä ylläpitää näytteiden

13 13 sopivaa ph:ta. Erilliseksi näytteeksi asetettuna SB myös omalla massallaan estää proteiinijuovien vääntymisen SDS-PAGE-ajon aikana. Geelin 1 tarkoituksena on nimenomaan FNR-like-proteiinin sijainnin selvittäminen, mutta geelin 2 näytteiden avulla pyritään sen sijaan ilmentämään FNR-like-mutaation vaikutuksia lehtien FNRproteiineihin. Latasin näytteet täysin omatoimisesti ja geeli 2 olikin myös ikään kuin oma harjoitustyöni. Kun näytteet oli pipetoitu pakkausgeeliin ja ajopuskuriliuos kaadettu SDS-PAGE-laitteistoon, kytkettiin laitteistoon virta muutamaksi tunniksi, kunnes proteiiniajautuman alareuna hipoi erotusgeelin alareunaa. Alareunaa lukuun ottamatta proteiiniajautuman raitakuvio ei työn tässä vaiheessa ollut vielä ihmissilmälle näkyvä ja erotusgeelien tuleekin vielä läpikäydä Western blot - menetelmä, ennen kuin niitä voidaan analysoida. SDS-PAGE-ajon tulokseksi toivotaan geelin 1 osalta sellaista raita-kuviota, jossa villityypin lituruohon proteiiniajautumassa on yksi raita enemmän kuin FNR-like-mutantilla. Tämän raidan tiedettäisiin silloin koostuvan FNR-like-proteiinista, sillä tuota proteiinia ei mutantilla tulisi olla. Raidan sijainnin (minkä näytteen kaivon alla se oli) perusteella voitaisiin tuolloin selvittää, toimiiko FNR-like-proteiini tylakoidikalvoilla vai stroomassa, ja verrattaessa raidan sijaintia STD-näytteen muodostamaan mittatikkuun saataisiin selville myös proteiinin molekyylimassa. Teoreettinen molekyylimassa FNR-like-proteiinille on jo muodostettu sen tunnetun aminohapposekvenssin perusteella, mutta tämä laskennallinen arvo ei aina vastaa todellisuutta, sillä kasveissa tuotetut proteiinit eivät välttämättä ole heti translaation jälkeen natiivissa rakenteessaan. Translaatiossa syntyvästä aminohappoketjusta saatetaan poistaa joitakin aminohappoja tai siihen voidaan lisätä esimerkiksi hiilihydraattiosia. Esimerkiksi juuri FNR-proteiinit saavat translaatiossa aminopäähänsä ns. signaalisekvenssin, jonka avulla ne saadaan toimitetuksi kloroplastiin, ja joka leikataan irti proteiinin päästyä määränpäähän Ensimmäinen Western blot -menetelmä Kun näytteiden sisältämät proteiinit on saatu erottumaan geelille massansa mukaan, eli käytännössä samat tai ainakin samankokoiset proteiinit ovat ajautuneet samoihin raitoihin, voidaan näytteiden proteiineja tunnistaa vasta-ainetekniikan avulla. Western blot -menetelmä, eli western blottaus ( blotting siirto ) on juuri antigeenireaktioon perustuva proteiinien tunnistusmenetelmä, jolla

14 14 SDS-PAGE-ajon proteiiniraidat voidaan saada näkyviksi ja analysoitaviksi. Ennen tunnistusta proteiinit siirretään sähkövirran avulla polyvinyylideenifluoridi-kalvolle (PVDF-kalvolle), sillä vasta-aineet toimivat siinä paremmin kuin geelin päällä (työ 4.) Tunnistuksen aluksi PVDF-kalvo käsitellään primaarisella vasta-aineella, joka on tuotettu kanissa, ja joka, kohtuullisen spesifisesti, tunnistaa kalvolta halutun proteiinin. Sekundaarinen vasta-aine, jolla kalvo käsitellään seuraavaksi, on puolestaan tuotettu vuohessa kanin proteiineja vastaan, mistä johtuen se sitoutuu primaariseen vasta-aineeseen. Näin syntynyt vasta-aineiden kompleksi voidaan tämän jälkeen löytää lisäämällä kalvolle kemiluminesenssireagenssia, sillä sekundaarisessa vasta-aineessa on kiinnittyneenä alkaalinen fosfataasi-ryhmä, joka tehokkaasti katalysoi fosfaattiryhmän poistoa kemiluminesenssireagenssin sisältämästä fenyylifosfaatti-substituoidusta 1,2-dioksitaanista. Tässä reaktiossa syntyvä välituote emittoi hajotessaan valoa, joka on havaittavissa asettamalla röntgenfilmi kalvon päälle (Lehtimäki 2010.) Etsityn proteiinin raita näkyy siis menetelmän lopuksi röntgenfilmille valottuneena Työvaiheet Tutkimusryhmäni SDS-PAGE-ajosta saamien geelilevyjen proteiiniraidat siirrettiin PVDF-kalvolle puolikuivalla elektrofforeesilaitteella. Kyseinen laitteisto koostuu kahdesta elektrodista, joiden väliin geelilevy ja PVDF-kalvo asetetaan siirtopuskurilla kyllästettyjen paperipalojen ympäröimänä. Siirtopuskurin toimiessa elektrolyyttinä SDS-reagenssista edelleen negatiivisesti varautuneet proteiinit kulkeutuvat laitteistossa kohti anodia ja liimautuvat samalla PVDF-kalvoon. Tunnin blottauksen jälkeen PVDF-kalvot huuhdeltiin TBS-puskurilla ja asetettiin tunniksi maitojauheen ja TTBS-puskurin liuokseen, minkä tarkoituksena oli estää kalvon vasta-aineiden epäspesifistä sitoutumista. PVDF-kalvo ottaa nimittäin herkästi kiinni mihin tahansa proteiineihin, mistä johtuen sen pinnalle saattaa joutua myös sellaisia proteiineja, jotka pystyvät sitoutumaan vasta-aineisiin ja siten häiritsemään tutkimusta. Kalvon kontaminoituminen estetään täyttämällä sen pinta maidon proteiineilla, jotka eivät reagoi vasta-aineiden kanssa. Tämän menettelyn jälkeen kalvot saivat jatkokäsittelyä varten geelejä vastaavat nimet (taulukko 1) kalvo 1 ja kalvo 2 ja kumpikin niistä asetettiin omaan primaariseen vasta-aineeseensa. Kalvolle 1 asetettiin FNR-likevasta-ainetta ja kalvolle 2 FNR-proteiineja tunnistavaa vasta-ainetta. PVDF-kalvojen annettiin reagoida primaarisen vasta-aineen kanssa yön yli ja sekundaarisen vastaaineen kanssa muutaman tunnin, jonka jälkeen kalvoille lisättiin kemiluminesenssireagenssi. Valmistuneet PVDF-kalvot suljettiin muovitaskuihin ja puristettiin pimiössä yhteen röntgenfilmien

15 15 kanssa vaihtelevilla valotusajoilla. Mitä pidempään kalvo on kiinni röntgenfilmissä, sitä enemmän kemiluminesenssi ehtii valottaa filmiä toistaen siihen ihmissilmälle näkyviksi jo elektroforeesigeelille muodostuneet proteiiniraidat. Oma PVDF-kalvoni (kalvo 2) vietiin vielä coomassie-värjäykseen kaivojen latauksen tasaisuuden, eli mahdollisten pipetointivirheiden tarkkailemiseksi Toinen SDS-PAGE ja Western blot Työvaiheet Ensimmäinen SDS-PAGE tuotti kalvon 2 (oman kalvoni) osalta pipetointivirheen vuoksi epäselvän tuloksen, joten se päätettiin toistaa. Samanaikaisesti päätettiin tutkia FNR-like-mutaation vaikutuksia fotosynteesin muissa proteiinikomplekseissa. Tällä kertaa käytettiin ureatonta geeliä ja itse ajo suoritettiin pienemmällä SDS-PAGE-laitteistolla, joka oli myös uudempi. Ureaton geeli oli kaupallisen yrityksen Amrescon patentoimaa Next-geeliä, joka sisälsi ainakin akryyliamidia, mutta oli koostumuksensa muilta osin salattu. Geeliliuoksen polymeroitumisreaktiot käynnistettiin ensimmäisen SDS-PAGE:n tavoin APS-liuoksella sekä TEMED:illä, mutta pakkausgeeliä ei tämän geeliliuoksen kohdalla täytynyt valmistaa. Myös ajopuskuri, Next Sel Running Buffer, oli Amrescon patentoima, ja se lisättiin ajolaitteistoon laimennettuna. Näytteet tähän SDS-PAGE-ajoon valmistettiin taulukon 2 mukaisesti. Nämä näytteet olivat peräisin samasta eristyksestä kuin ensimmäisen SDS-PAGE-ajon näytteet, eikä niiden proteiinikonsentraatioiden määrittämiseksi siksi täytynyt toistaa Bradfordin menetelmää. Taulukko 2. Toisen SDS-PAGE:n näytteet. kaivot: geeli 1 näyte proteiinia (µg) kaivot: geeli 2 näyte proteiinia (µg) 1 WT: tyl 7 11 WT: tyl 5 2 FNR-like: tyl 7 12 FNR-like: tyl 5 3 WT: str WT: str 5 4 FNR-like: str FNR-like: str 5 5 STD 15 STD 6 WT: tyl WT: tyl 10 7 FNR-like: tyl FNR-like: tyl 10 8 WT: str WT: str 10 9 FNR-like: str FNR-like: str SB 20 SB Geelin 1 neljän ensimmäisen näytteen (taulukko 2) kautta toistetaan ensimmäisen SDS-PAGE-ajon geelin 2 näytteiden (taulukko 1) koejärjestely. Näihin näytteisiin käytettään siis myös tulevassa Western blot -menetelmässä samaa, FNR-proteiineja tunnistavaa primaarista vasta-ainetta.

16 16 Taulukon muiden näytteiden avulla puolestaan tutkitaan FNR-like-mutaation vaikutuksia kloroplastien muiden proteiinikompleksien syntymiseen. Tämä tapahtuu Western blot -tekniikassa käyttämällä eri näyteryhmien kohdalla eri primaarisia vasta-aineita taulukon 3 osoittamalla tavalla. Taulukko 3. Toisen Western blot-menetelmän primaariset vasta-aineet. näyteryhmä vasta-aine vasta-aineen kohdeproteiini 1 5 FNR antibody FNR-proteiinit 5 10 LHCA1 antibody valohaavikompleksi Cyt b 6 f antibody sytokromi b 6 f -kompleksi PSA E antibody fotosysteemi I Toinen SDS-PAGE-ajo suoritettiin ensimmäisen kaltaisesti, ja sen tuottamat proteiiniajautumat siirrettiin PVDF-kalvoille samalla tavalla kuin alkuperäisessäkin Western blot -tekniikassa. Kuten taulukosta 3 voidaan havaita, STD-näytteet, jotka sijaitsivat SDS-PAGE-ajossa geelin keskellä, otettiin mukaan kahteen eri näyteryhmään. Tämä johtuu siitä, että Western blot -tekniikasta saadut PVDF-kalvot leikattiin kahtia aina STD-näytteen raitakuvion kohdalta, jolloin standardinäytteen raidat päätyivät molemmille syntyneistä kalvoista. Kaikki Western blot -tekniikasta saadut PVDFkalvot käsiteltiin kuten alkuperäisessä Western blot -tekniikassa ja kaikista saatiin erimittaisilla valotusajoilla useita röntgenfilmejä, joista valittiin lopuksi havainnollisimmat. 3 Tulokset ja tulosten tarkastelu 3.1 Bradfordin menetelmä Taulukon 4 tulokset laskettiin spektrofotometrista saatujen absorbanssiarvojen pohjalta. Taulukko 4. Bradford-mittauksen tulokset näyte proteiinikonsentraatio g/l WT: klo 13,1 WT: tyl 19,3 WT: str 2,75 like: klo 8,24 like: tyl 13,6 like: str 1,61 Tulosten avulla molempiin SDS-PAGE-ajoihin saatiin proteiinimassaltaan tunnetut näytteet. 3.2 Ensimmäinen SDS-PAGE ja Western blot Kalvolta 1 ei, tavoitteiden vastaisesti, saatu paikallistettua FNR-like-proteiinia, sillä kaikkien villityypin kasvien sekä FNR-like-mutanttien näytteiden raitakuviot vastasivat toisiaan. Kuvasta 3

17 17 voidaan nähdä kuinka esimerkiksi kaivojen 2 ja 3 proteiiniajautumista ovat värjäytyneet täsmälleen samat raidat. Ilmiölle on kaksi mahdollista selitystä: (1) kalvon kohdalla käytetty primaarinen vastaaine on epäspesifinen, eikä siis sitoudu ainoastaan FNR-like-proteiineihin vaan myös useisiin muihin proteiineihin; tai (2) kokeessa käytetyt mutantit eivät edusta puhdasta homotsygoottista mutanttilinjaa, vaan ainakin toinen niiden genomissa olevista FNR-like-proteiinia koodittavan geenin alleelleista ei ole kunnolla keskeytynyt ja saa FNR-like-proteiinia edelleen syntymään. Kokeessa käytettävien mutanttien homotsygoottisuus on kuitenkin jo moneen kertaan varmennettu PCR-analyysin avulla, joten vasta-aineen epäspesifisyys on virhetekijänä tässä tilanteessa todennäköisempi. Sillä FNR-like-proteiinia ei saatu kalvolta paikannettua, ei myöskään sen natiivimassaa taikka sijaintia kloroplastissa voitu määrittää. Kuva 3. Ensimmäisen SDS-PAGE-ajon raitakuvio geelin 1 osalta. Kaivot on numeroitu kuvaan taulukon 1 mukaan. Kuva 4. Ensimmäisen SDS-PAGE-ajon raitakuvio geelin 2 osalta. Kalvon 2 raitakuviosta (kuva 4) voidaan puolestaan todeta vasta-aineen olleen hyvinkin spesifinen: kultakin näytteeltä on valottunut kemiluminesenssissä vain yksi raita. Nuo valottuneet raidat sisältävät FNR-proteiineja ja niiden tummuutta tarkasteltaessa voidaan helposti havaita, että FNRproteiineja esiintyy sekä villityypin lituruoholla että FNR-like mutantilla enemmän stroomassa (kaivot 14 ja 15) kuin tylakoidikalvoilla (kaivot 12 ja 13), mikä on hyvinkin ilmeistä otettaessa huomioon kyseisen proteiinin toiminta valoreaktioiden elektroninsiirtoketjussa. Hieman erikoisempi tulos saadaan puolestaan tarkastelemalla strooma - ja tylakoidi näytteiden keskinäisiä tummuuseroja. Kuvasta 2 voidaan nimittäin tulkita, että mutanttikasvin tylakoideissa (kaivo 13) on hieman enemmän FNR-proteiineja kuin villityypin tylakoideissa (kaivo 12), kun taas mutantin

18 18 stroomassa (kaivo 15) proteiineja on hieman vähemmän kuin villityypin kasvin stroomassa (kaivo 14). Tästä voitaisiin siis teoriassa vetää johtopäätös, että FNR-like-mutaatio vaikuttaa kasvien FNRproteiinien syntymiseen tai hajoamiseen. Mielestäni johtopäätös oli myös jossain määrin perusteltu, sillä jos kerran FNR-like-proteiini muistuttaa FNR-proteiineja, niin voisi olla mahdollista, että FNR-like-proteiinin geeni voitaisiin joskus esimerkiksi vaihtoehtoisen silmukoinnin kautta lukea FNR-proteiiniksi tai toisinpäin. Työnohjaajani kuitenkin kumosi johtopäätökseni selittäen, että FNR-proteiineja ja FNR-like-proteiinia koodittavat geenit ovat liian erilaisia kuvaamani tapahtuman onnistumiseksi. Kalvon 2 coomassie-värjäys (kuva 5) lisäksi paljasti latauksen olleen geelin 2 kaivoissa hieman epätasainen, eli kuten kuvasta 5 nähdään, kaivoihin 13 ja 14 tuli hieman enemmän näytettä kuin olisi ollut tarkoitus. Tästä voidaan siis päätellä, että saatu tulos on mitä todennäköisimmin pipetointivirheen tuottama. Kuva 5. Kalvo 2 coomassiella värjättynä. Ratkaisuksi kalvon 1 tuloksettomuuteen, laboratorio päätti tilata uutta, tällä kertaa toivottavasti spesifisempää FNR-like -vasta-ainetta. Kalvon 2 tulos oli todennäköisestä virheellisyydestään huolimatta mielenkiintoinen ja siihen johtanut koejärjestely toistettiin (2.3.4 Toinen SDS-PAGE ja Western blot). 3.3 Toinen SDS-PAGE ja Western blot Näyteryhmä 1-5 Kuva 6. Kaivot on numeroitu kuvaan taulukon 2 mukaan. Kuvasta 6 voidaan nähdä, että kaivojen 1 ja 2 sekä 3 ja 4 raidat ovat keskenään hyvin pitkälti yhtä suuria. Tästä päätelmänä on, että villityypin lituruoholla sekä FNR-like-mutantilla FNR-proteiinia esiintyy sekä tylakoidikalvoilla että stroomassa yhtä paljon. Tämä sekä ensimmäisen Western blot menetelmän kalvon 2 coomassie-värjäys (kuva 5) osoittavat, että ensimmäisen SDS-PAGE-ajon kalvon 2 tuottama tulos on nimenomaan pipetointivirheen aiheuttama, eikä FNR-like- mutaatio mitä

19 19 todennäköisimmin vaikuta muiden lehden muiden FNR-proteiinien tuotantoon. Kuvasta 6 voidaan kuitenkin myös tulkita, että FNR-proteiineja esiintyy kasvien kloroplasteissa likimain yhtä paljon sekä tylakoidikalvoilla että stroomassa. Tämä on outoa, sillä kuvassa 4, johon on johtanut sama koejärjestely, FNR-proteiineja näkyy olevan stroomassa runsaasti enemmän. En osaa selittää tulosta. Näyteryhmä 5-10 Kuva 7. Kuvasta 7 nähdään heti, ettei valohaavikomplekseja esiinny lainkaan stroomassa (kaivojen 8 ja 9 kohdalla ei ole lainkaan proteiiniraitoja), mikä on ilmeistä, sillä nuo kompleksit ovat sitoutuneet tylakoidikalvoille. Kuvan 7 perusteella voidaan myös melko varmasti todeta, ettei FNR-likemutaatio vaikuta lituruohon valohaavikompleksien runsauteen: villityypin lituruohon ja mutantin raidat ovat tylakoidien osalta suurin piirtein samankokoisia. Näyteryhmä Kuva 8. Kuvasta 8 voidaan selkeästi havaita, että sytokromi b 6 f -komplekseja esiintyy ainoastaan tylakoidikalvoilla ja tämä tulos vastaa hyvin kirjallisuustietoja. Kuvan perusteella voidaan myös todeta, ettei FNR-like-mutaatio vaikuta lituruohon sytokromi b 6 f -kompleksien määrään. Näyteryhmä Kuva 9. Tämän näyteryhmän kohdalla vasta-aine tunnisti monia eri proteiineja, mutta kuvaan 9 on poimittu vain yhdet raitakuviot. Oikea raitakuvio osattiin poimia sen tiedon perusteella, että käytetty vastaaine tunnistaa tiettyä fotosysteemi I:ssä esiintyvää proteiinia ja fotosysteemi I:tä esiintyy

20 20 lituruohossa vain tylakoidikalvoilla, eikä lainkaan stroomassa (kuvassa on raidat vain tylakoidinäytteiden alla). Kuvan 9 perusteella voidaan myös sanoa, ettei FNR-like-mutaatio vaikuta merkittävästi fotosysteemi I:n runsauteen. 3.4 Lopulliset tulokset FNR-like-mutaatio ei näy lituruohon lehden muiden FNR-proteiinien määrissä, mistä voidaan päätellä, ettei FNR-like-proteiinin synteesi ole kytköksissä FNR-proteiinien synteesiin. FNR-likemutaatio ei myöskään vaikuta lituruohon valohaavikompleksien, sytokromi b 6 f -kompleksien taikka tyypin I fotosysteemien kokoon tai määrään. Sinä kahden viikon tutkimusjaksona, jona olin tutkimuksessa osallisena, FNR-like-proteiinin kloroplastin sisäisestä sijainnista, tehtävästä tai natiivimassasta ei saatu tarkempaa tietoa primaarisen vasta-aineen epäspesifisyyden vuoksi. 3.5 Mahdollisuudet jatkotutkimuksille Spesifisemmällä primaarisella vasta-aineella FNR-like-proteiinin sijainti olisi selvitettävissä. Mikäli tuo uusi vasta-aine antaa FNR-like-proteiinin sijainniksi tylakoidikalvoston, voidaan tämä tutkielman tutkimusmenetelmät toistaa erikseen lituruohon grana- ja stroomatylakoideilla sijainnin tarkentamiseksi. Bioinformatiikan menetelmillä voidaan myös paljastaa esiintyykö kyseistä proteiinia mitokondrioissa (Lehtimäki 2010). FNR-like-proteiinin toimintaa voidaan selvittää proteiinin aminohapposekvenssiin perustuvalla teoreettisella analyysillä, jossa tarkastellaan proteiinin funktionaalisia kohtia sekä rakenteellisia eroja lfnr1- ja lfnr2-entsyymeihin. Turun Yliopiston tutkimusryhmä yrittää lisäksi tälläkin hetkellä löytää kasvatusolosuhteita, joissa FNR-like-mutantit ja villityypin lituruohot eroavat fenotyypiltään. Tällaiset kokeet osoittaisivat eritoten FNR-like-mutaation vaikutuksia kasvin stressinsietoon. FNR-like-mutanttien hapentuotantoa tarkkailemalla voitaisiin myös selvittää FNRlike proteiinin vajauksen vaikutusta fotosysteemien yhdistettyyn toimintaan (Lehtimäki 2010.) 4 Kiitokset Tahtoisin kiittää akatemiatutkijaa Paula Muloa ja filosofian maisteria Nina Lehtimäkeä neuvoista ja materiaalista tähän tutkielmaan liittyen, sekä koko Turun Yliopiston kasvifysiologian ja

21 21 molekyylibiologian laitosta mahdollisuudesta seurata heidän tutkimustyötään. Kiitos kuuluu myös biologian opettajalleni Katja Tauriaiselle, jota ilman en olisi koskaan edes päätynyt tekemään tätä tutkielmaa. 5 Lähteet luettu 7.6, päivitetty luettu 7.6, julkaistu luettu 8.6, päivitetty 2010 (wikipedia 2010a) luettu 9.6, päivitetty 2010 (wikipedia 2010b) luettu 8.6, julkaisuajankohtaa ei ilmoitettu Happonen, P., Holopainen, M., Sariola, H., Sotkas, P., Tenhunen, A., Tihtarinen-Ulmanen, M. & Venäläinen, J BIOS 5, Bioteknologia. WSOY Oppimateriaalit Helsinki Happonen, P., Holopainen, M., Sotkas, P., Tenhunen, A., Tihtarinen-Ulmanen, M. & Venäläinen, J BIOS 2, Solu ja perinnöllisyys. WSOY Oppimateriaalit Helsinki Heino, J. & Vuento, M Solubiologia. WS Bookwell Oy Porvoo Lehtimäki, N Pro gradu tutkielma: Fotosynteesin syklisen elektronisiirron reitit. Turun yliopisto, Biologian laitos

22 22 Lehtimäki, N Tutkimussuunnitelma: roles of ferredoxin-nadp + oxidoreductase proteins in Arabidopsis thaliana chloroplasts Lintala, M., Allahverdiyeva, Y., Kangasjärvi, S., Lehtimäki, N., Keränen, M., Rintamäki, E., Aro, E. & Mulo, P Comparative analysis of leaf-type ferredoxin-nadp + oxidoreductase isoforms in Arabidopsis thaliana. The Plant journal Nabors, M. & Cummings, B Introduction to Botany Työ 4, Proteiinien immunologinen määrittäminen. Turun yliopiston toisen vuoden opiskelijoiden solu- ja molekyylibiologian harjoitustyö (työ 4) Taiz, L. & Zeiger, E Plant Physiology, fourth edition. Sinauer Associates, Inc., Publishers Sunderland, Massachusetts Tyystjärvi, T Molekyylibiologian luennot. Turun yliopiston Biologian laitos