Loppuraportti Työsuojelurahastolle

Transkriptio

1 NANOPARTIKKELEIDEN TERVEYSVAIKUTUSTEN TUTKIMINEN PROTEOMIIKAN AVULLA Hankkeen vastuuhenkilöt: Harri Alenius, Anne Puustinen Raportin laatija: Jukka Sund, Anne Puustinen, Harri Alenius Hankkeen toteuttaja: Työterveyslaitos, Immunotoksikologian yksikkö, Terveys ja Työkyky - osaamiskeskus Yhteyshenkilö: Harri Alenius, dos., tutkimusprofessori Immunotoksikologian kärkitutkimusyksikön johtaja Työterveyslaitos Topeliuksenkatu 41 a A, Helsinki puh fax sähköposti: harri.alenius@ttl.fi Loppuraportti Työsuojelurahastolle Hankenumero

2 1. LÄHTÖKOHDAT JA TAUSTAT Nanomateriaalit ja niiden terveysvaikutukset TAVOITTEET MENETELMÄT JA TOTEUTUS Valitut nanomateriaalit ja niiden ominaisuudet Solukokeet Solujen kasvatus In vitro -altistuskokeet Elektronimikroskopia Proteiini-nanomateriaali-interaktiokokeet Proteiinien tunnistaminen Proteiinien ilmentymismuutokset nanomateriaalialtistuksen jälkeen Kaksisuuntaisen differentiaali geelielektroforeesin (2D-DIGE) periaate Sytoplasma- ja mitokondrioproteiinien ilmentymismuutoksien analysointi TULOKSET Nanomateriaalit kulkeutuvat solujen sisään Materiaalien koko ja pintaominaisuudet vaikuttavat nanomateriaalien ja proteiinien välisiin interaktioihin Nanomateriaalin pintavaraus ja -modifikaatio vaikuttavat tarttuneiden proteiinien laatuun Mikro- ja nanokokoisten titaanidioksidipartikkelien erilainen solulysaattiproteiinien sitomiskyky Nanopartikkelialtistus aiheuttaa soluissa oksidatiivistä stressiä POHDINTA Nanomateriaalit kerääntyvät sisälle soluihin Nanomateriaalien pintaominaisuudet vaikuttavat sitoutuneiden soluproteiinien määrään ja laatuun Nanopartikkelialtistus saa aikaan puolustusvasteen ihmisen primäärimakrofaageissa JOHTOPÄÄTÖKSET LÄHDELUETTELO SUPPLEMENTIT... 24

3 1. LÄHTÖKOHDAT JA TAUSTAT 1.1. Nanomateriaalit ja niiden terveysvaikutukset Nanomateriaaleilla tarkoitetaan kooltaan alle 100 nanometrin rakenteita. Nanomateriaalien valmistusta, tutkimusta ja tuotekehitystä tehdään maailmanlaajuisesti sadoissa nanoteknologian yrityksissä ja niiden hyödyntäminen eri teollisuuden aloilla kasvaa jatkuvasti. Suomessa nanoteknologian ja nanomateriaalien tuotekehittelyn parissa toimii useita satoja henkilöitä ja heidän määrä tulee lisääntymään nopeasti lähivuosina. Nanomateriaalien teknisiä käyttökohteita ovat mm. pinnoitteet, sähköä johtavat muovit, paristot ja nanoelektroniikan komponentit. Myös eräät lääkeaineet ja kosmeettiset tuotteet sisältävät nanomateriaalien kokoisia aineosia (Salata, 2004). Nanomateriaalit ovat oleellisesti elävää solua pienempiä ja ne käyttäytyvät poikkeavasti sekä kemialliseen yhdisteeseen että tavanomaiseen partikkelimaiseen materiaaliin verrattuna. Ne voivat kulkeutua sisään soluihin ja siten aiheuttaa muutoksia solutasolla. Nanomateriaalien tuotannon ja käytön yhteydessä altistumista tapahtuu erityisesti keuhkojen kautta (Nemmar ym, 2001). On tärkeää selvittää nanomateriaalien terveysvaikutukset huolellisesti, jotta vältytään odottamattomilta terveysongelmilta. Materiaalin hiukkaskoolla on tärkeä merkitys niiden terveyshaitoille. Eläinkokeissa on havaittu, että titaanidioksidin nanokokoiset partikkelit poistuvat keuhkoista huomattavasti hitaammin kuin saman aineen suurempikokoiset partikkelit (Oberdorster ym, 1994). On olemassa alustavaa näyttöä siitä, että titaanidioksidin nanopartikkelialtistus aiheuttaa monia erilaisia muutoksia solutasolla, mm. lisää keuhkokasvaimia koe-eläimissä (Bermudez ym, 2004). Nanokokoisen titaanidioksidin on osoitettu läpäisevän ihokerroksen, joten ne voivat vaikutaa ihon puolustusmekanismeihin (Kreilgaard, 2002). Myös osa hiilinanoputkista aiheuttaa koe-eläinaltistuksissa tulehduksen ja granuloomien muodostumista. Kudosreaktio oli merkittävästi suurempi kuin grafiitti- tai kvartsihiukkasilla, mikä viittasi siihen, että hiilinanoputkien erikoisrakenteella on vaikutusta niiden toksisiin ominaisuuksiin (Donaldson ja Tran, 2004 ja Warheit ym, 2004). Aikaisemassa TSR-tutkimuksessamme (hanke nro ) osoitimme, että koe-eläinten lyhytaikainen alistuminen titaanidioksidin nanopartikkeleille lisää neutrofiilien kulkeutumista keuhkoihin (Kuva 1a). Nanopartikkelialtistuminen aiheutti myös pitkäaikaisemmassa altistumisessa voimakkaampaa makrofaagien ja CXCL2/3 kemokiinin (solujen kulkeutumista ohjaava välittäjäaine) erittymistä saman aineen suurempi kokoisiin hiukkasiin verrattuna (Kuva 1b). a) b) Neutrofiilit Makrofaagit CXCL2/3 50 *** 40 ** 300 *** kpl / HPF 25 0 *** *** *** kontr. 0 h 4 h 24 h 0 h 4 h 24 h kpl / HPF ru μg/ml μg/ml 2 h alt. 4 x 2 h alt. Kuva 1(a) Neutrofiilien määrä hiiren keuhkoissa 2 tunnin ja 4 kertaa 2 tunnin altistusten jälkeen. (b) Makrofaagien määrä ja CXCL2/3 välittäjäaineen erittyminen keuhkoissa karkean ja nanokokoisen TiO 2 - altistuksen jälkeen. TiO 2 karkea TiO 2 nano TiO 2 karkea TiO 2 nano

4 Joutuessaan kontaktiin eliön bionesteiden kanssa nanomateriaalien pinta peittyy heti liuoksessa (esim. veressä) olevilla proteiineilla ja partikkelin lopullinen kohtalo elimistössä määräytyy sen ylle muodostuneen proteiinipäällyskerroksen ohjaamana (Cedervall ym. 2007). Mekanismit, jotka vaikuttavat biomolekyylien ja nanomateriaalien interaktioon, tunnetaan kuitenkin huonosti, vaikka niistä olisi suurta hyötyä nanomateriaalien kulkeutumisen ja elimistöstä poistamisen ymmärtämisessä, ja täten turvallisuuden arvioimisessa. 2. TAVOITTEET Projektin yleisenä tavoitteena on arvioida nanopartikkeleiden mahdollisia terveysvaikutuksia tutkimalla nanomateriaalien ja biologisten systeemien vuorovaikutuksia proteomiikkaa ja solumalleja hyödyntämällä. Hankkeen yksityiskohtaiset päätavoitteet ovat: 1. Selvittää nanomateriaalien pintareaktiivisuuksia proteiini-interaktiokokeilla. Pinta-reaktiivisuuksia vertailemalla ja analysoimalla voidaan arvioida nanomateriaalien vaikutuksia elimistössä. 2. Tutkia nanomateriaalialtistumisen aiheuttamaa vastetta makrofaagisolujen proteomissa. Ekspressioprofiilin muutokset valottavat mahdollisten soluvaurioiden mekanismeja ja luovat mahdollisuuksia parempaan riskinarviointiin ja altistumista kuvaavien biomonitorointimenetelmien kehittämiseen. 3. MENETELMÄT JA TOTEUTUS 3.1. Valitut nanomateriaalit ja niiden ominaisuudet Testattaviksi materiaaleiksi valittiin nanokokoiset titaanidioksidit (päällystämättömät rutiili/anataasi [r/atio 2 ] ja anataasi [atio 2 ]-muodot sekä amorfisella piillä [silikapäällystetty rtio 2], alumiinilla [alumiinipäällystetty rtio 2 ] ja silikonilla [silikonipäällystetty rtio 2 ] päällystetyt titaanidioksidit), sinkkioksidi (ZnO), amorfinen piidioksidi (SiO 2 ), yksi- ja moniseinäiset hiilinanoputket (swcnt ja mwcnt) sekä mikrometrikokoluokan titaanidioksidi (karkea rtio 2 ) ja kvartsikiteet (MIN-U-SIL5). Ennen kokeita materiaalit karakterisoitiin tarkasti käyttämällä hyödyksi elektronimikroskopiaa (pyyhkäisy- ja läpäisyelektronimikroskopia, TEM), energiadispersiivistä spektroskopiaa (EDS, energy dispersion spectroscopy), röntgen-diffraktiota ja Brunauer-Emmet-Teller-menetelmää (BET). (Taulukko 1.) (Vippola ym, 2009). Taulokossa 1 esitetyt nanomateriaalien zeta-potentiaalit (pintavaraukset) mitattiin inteaktiokokeessa käytetyssä ME-puskurissa (1 % Nonidet P40, 0,5 % natrium deoksikolaatti, 80 mm MOPS, 2 mm EDTA ph 7.2) Zetasizer Nano ZS -laitteella (Malvern Instruments Inc.). Mittaus on kuvattu Jiang ym. (2009) julkaisemassa artikkelissa. Puskuriliuoksen ph ei muuttunut nanomateriaalien lisäyksen jälkeen. Dispersiossa olevia materiaaleja käsiteltiin ultraäänellä (sonikoitiin) 15 minuuttia aina ennen käyttöä altistuksissa ja mittauksia.

5 Taulukko 1 Kokeissa käytettyjen materiaalien ominaisuudet Nimi Myyjä Tuotenumero Partikkelikoko Spesifinen pinta-ala Zeta- Faasi Koostumus Potentiaali silikapäällystetty rtio 2 Sigma-Aldrich x40 nm 132 m 2 /g ( m 2 /g S-A: ilmoittama) -38 mv rutiili Ti, O, SiO 2 päällystys (<5 % S-A:n ilmoittama) alumiinipäällystetty rtio 2 Kemira UV-TITAN M111 ~14 nm 112 m 2 /g (~100 m 2 /g Kemiran ilmoittama) -47 mv rutiili Ti, O, alumiini päällystys (~3 %Kemiran ilmoittama) silikonipäällystetty rtio 2 Kemira UV-TITAN M170 ~14 nm 84m 2 /g (~80 m 2 /g Kemiran ilmoittama) -10 mv rutiiili Ti, O, alumiini päällystys + silikoni käsittely r/atio 2 NanoAmor 5485HT nm 23 m 2 /g (~30 m 2 /g NA:n ilmoittama) -62 mv rutiili + anataasi Ti, O atio 2 Sigma-Aldrich <25 nm 222 m 2 /g ( m 2 /g S-A:n ilmoittama) -40 mv anataasi Ti, O karkea rtio 2 Sigma-Aldrich <5 μm 2 m 2 /g -73 mv rutiili Ti, O ZnO Umicore ZANO nm 22m 2 /g -27 mv sinkiitti Zn, O SiO 2 NanoAmor 4850MR 10 nm 515 m 2 /g (~640 m 2 /g NA:n ilmoittama) -43 mv amorfinen Si, O mwcnt SES Research nm x 1-2 μm 60 m 2 /g -50 mv nanoputki C, Ni (katalystijäämä) swcnt SES Research <2 nm x 1-5 μm 436 m 2 /g -43 mv nanoputki C, Co (katalystijäämä) Kvartsikide US Silica MIN-U-SIL5 <5 µm 4 m 2 /g -70 mv kvartsi Si, O

6 3.2. Solukokeet Solujen kasvatus Kokeissa käytettiin ihmisen keuhkorakkuloiden epiteelisolulinjaa, A549 (ATCC) ja ihmisveren monosyyteistä erilaistettuja makrofaageja (Veripalvelu, Suomen Punainen Risti). Epiteelisolut kasvatettiin RPMI 1640 elatusliuoksessa (Invitrogen), jossa oli 10 % lämpöinaktivoitua seerumia (fetal bovine serum, FBS), 1 % penisiliini-streptomysiini-antibioottia (PEST) ja 2 mm L-glutamiini. Solut kasvatettiin +37 o C:ssa ja 5 % CO 2 :ssa. Makrofaagit erilaistettiin veren perifeerisistä monosyyteistä, jotka oli eristetty puna-valkosolukerroksesta (Buffy coat) Ficoll gradientti-sentrifugaation avulla. Monosyytit pestiin kolmesti PBS:llä (ph 7.4), jonka jälkeen niiden annettiin tarttua 6-kuoppalevyille 50 minuuttia +37 o C:ssa ja 5 % CO 2 :ssa RPMI mm L- glutamiini-1% PEST elatusliuoksessa. Tämän jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS:llä. Solut erilaistettiin ja kasvatettiin 1 ml:ssä Serum-Free Macrophage Medium -elatusliuosta (Invitrogen), johon oli lisätty kasvutekijä (10 ng/ml GM-CSF = granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, Immunotools) ja 1 % PEST. Makrofaagi-elatusliuos vaihdettiin kahden päivän välein ja solut olivat valmiita altistettaviksi seitsemän päivää eristyksen jälkeen In vitro -altistuskokeet Elektronimikroskopiaa varten makrofaagit altistettiin 24 tuntia +37 C, 5 % CO 2 :ssa 300 µg/ml nanomateriaaleja, jotka oli dispersoitu makrofaagielatusliuokseen (yllä) täydennettynä 1 % albumiinilla (BSA, Sigma-Aldrich), mikä paransi nanomateriaalien dispersoitumista kasvatusliuoksessa. Altistus lopetettiin pesemällä solut kaksi kertaa PBS:llä, jonka jälkeen solut fiksattiin 2,5 % glutaraldehydillä 0,1 M fosfaattipuskurissa ja raavittiin pois kuoppalevyltä. Epiteelisolut altistettiin 24 tuntia +37 C, 5 % CO 2 :ssa 300 µg/ml nanomateriaaleja, jotka oli dispersoitu A549 solujen elatusliuokseen (kohta 3.2.1). Seuraavana päivänä solut pestiin kaksi kertaa PBS:llä, irroitettiin trypsiinillä ja fiksattin 2,5 % glutaraldehydillä 0,1 M fosfaattipuskurissa. Proteiiniekspressiokokeita varten makrofaagit altistettiin silikapäällystettyllä rtio2:lla ja r/atio 2 kuten yllä. Kumpikin altistus tehtiin neljä eri kertaa yhdessä altistamattomien kontrollisolujen kanssa. Altistuksen jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS:llä ja raaputettiin pois kuopista. Tämän jälkeen soluista eroteltiin tumat, mitokondriot ja sytoplasma kaupallisen kitin avulla (Qproteome Mitochondria Isolation Kit, Qiagen Inc.) Elektronimikroskopia Altistetut solut jälki-fiksattiin 1 % osmiumtetroksidilla, niistä poistettiin vesi ja ne valettiin epoksiin. Ohutleikkeet kerättiin päällystämättömille kuparihiloille, värjättiin uranyyliasetaatilla sekä lyijysitraatilla ja analysoitiin läpäisyelektronimikroskoopilla 80 kv:n käyttöjännitteellä (JEM-1220, Jeol Ltd) Proteiini-nanomateriaali-interaktiokokeet Interaktiokokeet tehtiin MacCorklen ym. (2006) käyttämää menetelmää muokkaamalla. Solut (makrofaagit tai epiteelisolut) kerättiin, jäädytettiin ja hajotettiin 20 minuuttia jäillä ME-puskurissa, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoria (Complete Mini, Roche Diagnostics GMBH). Solulysaatti sentrifugoitiin ( g, 5 min, +4 o C). Supernatantissa olevien proteiinien (~1 mg proteiinia/ml) annettiin reagoida ME-puskuriin dispersoitujen nanomateriaalien (0,5 mg/ml) kanssa. Vaihtoehtoisesti käytettiin ihmisen laimennettua veren plasmaa (~7 mg proteiinia/ml), laimentamatonta plasmaa (70 mg proteiinia/ml) tai makrofaageista kaupallisella kitillä (ProteoJet Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit, Fermentas International Inc.) eristettyä sytoplasmaa. Negatiivisena kontrollina käytettiin lysaattia ilman nanopartikkeleita, jotta nähtiin tarttuuko koeputken pintaan proteiineja. Proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad DC Protein Assay - kitin (Bio Rad) auvlla. Nanomateriaali-lysaatti/plasmaseosta sekoitettiin pyörittelijässä (Grant-Bio

7 PTR-30, Wolf Laboratories Limited) 15 tuntia 4 o C:ssa, minkä jälkeen nanomateriaalit pelletoitiin ( g, 5 min, +4 o C) ja sitoutumattomat proteiinit poistettiin pesemällä pelletti kuusi kertaa 20 mm Tris-MOPS, ph 7.4:llä. Jokaisen pesun jälkeen nanomateriaalit vorteksoitiin kevyesti ja sentrifugoitiin ( g, 5 min, +4 o C). Pesut kerättiin talteen ja analysoitiin Na-dodekyylisulfaatti polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), jotta saatin selville että pesujen määrä oli riittävä tarttumattomien proteiinien poistamiseksi. Tarttuneet proteiinit irrotettiin kuumentamalla nanomateriaaleja 10 minuuttia +70 o C:ssä pelkistävässä puskurissa (62,5 mm Tris-HCl ph 6.8, 5 % β-merkaptoetanoli, 2 % bromofenolin sininen, 2 % SDS, 25 % glyseroli) ja eroteltiin SDS- PAGEssa. Geelillä olevat proteiinit värjättiin Coomassie blue -värillä (0.1 % Serva Blau G, 50 % metanoli, 1 % etikkahappo), ylimääräinen väri poistettiin värinpoistoliuoksella (20 % metanoli, 1 % etikkahappo). Geelit kuvannettiin ja värjäytyneiden proteiinikaistaleiden intensiteetit laskettiin ImageQuant 5.0 -ohjelmalla (GE Healthcare) proteiinien sitoutumisen kvantitoimiseksi. Surfaktantin vaikutus proteiinien ja nanomateriaalien interaktioon PBS:ssä ja ME-puskurissa määritettiin lisäämällä proteiini-nanomateriaaliseokseen 1,2 µg/ml Curosurf -surfaktanttiseosta (Nycomed International Management GmbH). Epiteelisolulysaatti, johon oli lisätty surfaktanttia, altistettiin ultraäänikäsitellyille nanomateriaaleille, jotka oli dispersoitu PBS:ään tai ME-puskuriin. Tarttuminen analysoitiin kuten yllä. PBS:ssä tehtyjä kokeita ei voitu pitää luotettavina, koska nanomateriaalit eivät dispersoituneet riittävän hyvin fosfaattipuskuriin. ZnO:n kanssa ilmeni dispersoitumisongelmia myös ME-puskurissa. ph:n vaikutusta nanomateriaalien kykyyn takertua proteiineihin tutkittiin karkea rtio 2 ja r/atio 2 - partikkeleilla. Makrofaagilysaatin proteiinien annettiin tarttua partikkeleihin kolmessa eri ph:ssa. Sitoutuminen analysoitiin kuten yllä. ph-puskurit olivat: ph 6 (250 mm natrium asetaatti), ph 7.2 (ME-puskuri) ja ph 9 (100 mm Tris-HCl) Proteiinien tunnistaminen Coomassie-värjätyt proteiinikaistaleet leikattiin geelistä, geelissä olevat proteiinit pilkottiin trypsiinillä ja muodostuneet peptidit analysoitiin kuten Korolainen ym. (2006) kuvaa. Peptidiuutteet kuivattiin vakuumisentrifuugissa ja analysoitiin LC-ESI-QTOF-massaspektrometrillä (QTOF Global, Waters). Käänteisfaasierottelu tehtiin 75 μm 15 cm NanoEase Atlantis dc 18 - kolonnilla (Waters) 250 nl/min virtausnopeudella. Peptidit eluoitiin kolonnista 60 minuutissa lineaarisella 0-60 % liuos B (0.1 % muurahaishappo 95 %:ssa asetonitriilissä) -gradientilla. Aloitusliuoksena käytettiin 0,1 % muurahaishappoa 5 %:ssa asetonitriilissä. Proteiinitunnistukset LC-MS/MS aineistosta tehtiin tietokantahaun avulla (Mascot, Matrix Science) Proteiinien ilmentymismuutokset nanomateriaalialtistuksen jälkeen Kaksisuuntaisen differentiaali geelielektroforeesin (2D-DIGE) periaate Kaksisuuntaisessa geelielektroforeesissa proteiinit erotellaan ensin toisistaan proteiinien isoelektrisen pisteen (pi) (isoelektroninen fokusointi) ja sen jälkeen molekyylipainon mukaan geelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Näin proteiinitäplät saadaan levitettyä isommalle pinta-alalle. Geelipohjaisten proteomiikkamenetelmien suurin ongelma on tarpeeksi hyvän toistettavuuden aikaansaaminen. Eri aikoina suoritettujen isoelektristen fokusointien ja geelielektroforeesien välillä voi olla suuriakin eroja proteiinispottien koossa ja ajautumisessa, vaikka näyte olisi sama. Tutkimuksessa käytettiin differentiaali geelielektroforeesi (DIGE) -tekniikkaa, jolla toistettavuuseroja voidaan merkittävästi vähentää (Ünlü ym, 1997). Yksi proteiininäyte leimattaan fluoresoivalla Cy5-leimalla (esim. kontrolli) ja toinen Cy3-leimalla (esim. nanomateriaali altistettu). Cy2-leimalla leimataan niin kutsuttu sisäinen standardi, joka sisältää yhtä paljon kaikkia kokeessa mukana ollevia näytteitä (Kuva 2.). Tämän jälkeen leimatut proteiiniuutteet sekoitettiin keskenään ja niissä olevat proteiinit erotellaan 2D-geelielektroforeesilla. Geelit kuvannetaan kolmella eri aallonpituusalueella fluoresenssidetektorilla (Ettan Dige Imager, GE Healthcare), jolloin yhdestä geelistä saadaan kolme eri proteomia (Kuva 2.). Koska näytteitä

8 tarvitaan vähintään kolme/ryhmä biologisten erojen toteamiseksi, joudutaan ajamaan useampi geeli. Teknisen variaation korjaamiseksi kaikilla ajetuilla geeleillä käytetään samaa Cy2-leimattua sisäistä standardia, jota hyödynnetään vertaillessa proteiinien ilmentymistä ja intensiteettiä eri ryhmien välillä. Cy2 leimattu sisäinen standardi Niiden proteiinispottien leikkaus ja proteiinien digestointi geelissä, joiden ilmenemisessä on eroja näytteiden välillä Cy3 leimattu proteeiniuute (kontrolli) Cy5 leimattu proteiiniuute (altistettu) Leimattut uutteet yhdistetään 2DE erottelu Kuvantaminen (Ettan DIGE Imager) Ekspressio profiliin analysointi (DeCyder) Peptidien massaspektrometrinen analysointi Tietokantahaut massaspektrometriadatalla Erilailla ekspressoitujen proteiinien tunnistus Kuva 2. 2DE-DIGE:n ja proteiinien identifioinnin periaatteet Sytoplasma- ja mitokondrioproteiinien ilmentymismuutoksien analysointi Nanopartikkelialtistumisen (neljä näytettä/ryhmä) aiheuttamat sytoplasma- ja mitokondrioproteiinien ilmentymismuutokset analysoitiin omina kokeinaan. Eristetyt sytoplasma- ja mitokondrioproteiiniuutteet puhdistettiin isoelektristä fokusointia häiritsevistä aineista kuten suoloista (Ettan 2D clean-up kit). 50µg silikapäällystetyllä rtio2:lla, r/atio 2 :lla tai altistamattomia mitokondrio- tai sytoplasmaproteiineja inkuboitiin 200 pmol:lla Cy5- tai Cy3- leimalla 30 minuuttia pimeässä jäillä. Sisäinen standardi tehtiin yhdistämällä yhtäsuuri määrä silikapäällystetty rtio2:lla, r/atio 2 :lla ja altistamattomia mitokondrio- tai sytoplasmaproteiineja, jotka leimattiin Cy2 värillä. Isoelektrinen proteiinien fokusointi tehtiin 18 cm IPG-liuskoilla (Immobiline Drystip 13 cm 3-10 nl, GE Healthcare) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Isoelektrinen fokusointi suoritettiin Ettan IPGphor II -laitteella (ohjelma: 150 V 3 tuntia, 300 V 3 tuntia, V gradientti 6 tuntia, V gradientti 1 tunti, 8000 V 2 tuntia). Fokusoinnin jälkeen liuskoilla olevat proteiinit pelkistettiin ensin 15 minuuttia 65 mm ditiotreittoli (DTT)- tasapainotuspuskurissa ja sitten alkyloitiiin 15 minuuttia 53 mm iodoasetamidi (IAA)- tasapainotuspuskurissa Tämän jälkeen proteiinit eroteltiin koon perusteella SDS-PAGE:lla (12,5 % geeli) DALT six -laitteistolla (GE Healthcare) 15 ma/geeli 5 tuntia. Geelit kuvannettiin (Ettan DIGE Imager, GE Healthcare) ja proteiinitäplien ilmentyminen analysoitiin DeCyder 7.0 -ohjelmalla (GE Healthcare). Kiinnostavien proteiinitäplien määritelmäksi valittiin 1,5 kertainen ekspressiomuutos verrattuna kontrolliin ja t-testiarvo <0.01. Mielenkiintoiset proteiinitäplät leikattiin geelistä ja tunnistettiin kuten kohdassa 3.5.

9 4. TULOKSET 4.1. Nanomateriaalit kulkeutuvat solujen sisään Läpäisyelektronimikroskooppikuvat (TEM) osoittivat, että kaikki testatut nanomateriaalit kulkeutuivat sekä ihmisen makrofaagisolujen että keuhkorakkuloiden epiteelisolujen sisään, kun soluja altistettiin 24 tuntia 300 µg/ml pitoisuudella (Sund ym. 2011). Materiaalit käyttäytyivät samankaltaisesti molemmissa solutyypeissä. r/atio 2, silikapäällystetty rtio 2 ja alumiinipäällystetty rtio 2 eroavat muista sillä, että niitä näyttäisi olevan sekä kalvorakenteiden sisällä (Kuva 3A-E, mustat nuolet) että vapaina sytoplasmassa (Kuva 3A-E, valkoiset nuolet). Muut materiaalit löytyivät kalvorankenteiden sisältä. Tumasta ei löytynyt nanomateriaaleja altistuksen jälkeen. mwcnt oli ainoa, joka vaikutti pääsevän solun sisään tunkeutumalla solukalvon läpi (Kuva 3 H, nuolenpää). Mikrokokoisten materiaalien sijaintia solun sisällä oli vaikea arvioida, koska suurikokoiset hiukkaset aiheuttivat repeämiä ohutleikkeisiin (Supplementit 1 ja 2). Kuva 3. Läpäisyelektronimikroskooppikuvia ihmisen keuhkorakkulan epiteelisoluista, joita on altistettu erilaisilla nanomateriaaleilla (300 µg/ml) 24 tuntia. r/atio 2 (A) ja suurennos (B), silikapäällystetty rtio 2 (C ja D), alumiinipäällystetty rtio 2 (E ja F) ja mwcnt (G ja H). Valkoiset nuolet osoittavat partikkeleita, jotka ovat kalvorakenteiden ulkopuolella ja mustat nuolet partikkeleita kalvorakenteiden sisäpuolella. Mustan nuolenpään oikealla puolella solukalvon läpi tunkeutuva moniseinäinen hiilinanoputki (H) Materiaalien koko ja pintaominaisuudet vaikuttavat nanomateriaalien ja proteiinien välisiin interaktioihin Proteiini-nanomateriaalitarttumiskoe tehtiin kvantitatiivisten sitoutumiserojen löytämiseksi nanomateriaalien ja solulysaatti- ja verenplasmaproteiinien välillä (Sund ym. 2011). Sitoutumiserojen perusteella pyrittiin selvittämään, että tarttuvatko materiaalit vain tietynlaisiin proteiineihin. Kaikki kokeillut materiaalit tarttuivat samankaltaisesti plasmaproteiineihin. Sen sijaan sitoutumisessa solulysaatin proteiniineihin havaittiin suuria eroja (Kuva 4A). Osa nanokokoisista titaanidioksidimuodoista vaikutti tarttuvan proteiineihin voimakkaimmin. Silikapäällystetty rtio 2, r/atio 2 ja atio 2 sitoivat paljon tehokkaammin plasman ja molempien solulysaattien proteiineja. Hydrofobiset silikonipäällystetty rtio 2 ja swcnt adsorboivat hyvin heikosti solulysaattien

10 proteiineja, mutta muutamat plasman proteiinit kiinnittyivät niihin. Mikrokokoiset karkea rtio 2 ja kvartsikiteet (MIN-U-SIL5) sitoutuivat paremmin plasmaproteiineihin kuin solulysaatien proteiineihin, mikä havaittiin myös alumiinipäällystetyllä rtio 2, mwcnt, SiO 2 ja ZnO - materiaaleilla. Silikapäällystetty rtio 2, r/atio 2, atio 2, SiO 2 ja kvartsikiteet sitoivat saman määrän plasman proteiineja riippumatta tarttumiskokeessa käytetystä plasmakonsentraatiosta. Muilla materiaaleilla tarttuminen oli 2-5 kertaa voimakkaampaa laimentamattomalla plasmalla kuin laimennetulla plasmalla. Nanokokoisilla materiaaleilla voitiin havaita hienoinen korrelaatio partikkelin koon ja plasmaproteiinien tarttumisen määrän välillä, siten että suuremman koon omaavat partikkelit sitoivat enemmän plasman proteiineja. Vastaavaa ei havaittu solulysaattiproteiinien ja nanomateriaalien välillä. Materiaalien z-potentiaalilla eikä pinta-alalla ei myöskään havaittu yhteyttä proteiinien tarttumisen määrään (Supplementti 3) Plasma- ja makrofaagisolulysaattiproteiinien tarttuminen nanomateriaaleihin 15 tunnin aikana on esitetty kuvassa 4B. Plasmaproteiinien kiinnittyminen analysoitiin myös yhden tunnin interaktiokokeessa. Tällöin sitoutuneita proteiineja oli kuitenkin määrällisesti yhtä paljon ja proteiinit olivat samoja kuin pidemmällä reaktioajalla. Kaikkiin partikkeleihin tarttuivat samat plasmaproteiinit (Kuva 4B 1-6a), jotka tunnistettiin massaspektrometrian avulla (fibrinogen alpha, I; beta, II; gamma, III ja immunoglobuliinien kevyen ketjun proteiineja, IV). Muita tunnistettuja plasmaproteiineja olivat komplementin proteiinit, fibronektiini, apolipoprotein A, albumiini ja fibriini. Kaikki tarttuneet proteiinit sisältävät sokeriketjuja, mikä on yleistä plasmaproteiineille. Nanomateriaalien sitoutuminen makrofaagisolulysaattiproteiineihin on vaihtelevampaa ja eri nanomateriaalien välillä on suuria eroja (Kuva 4B 1-6b). Silikapäällystetty rtio 2, r/atio 2 ja atio 2 tarttuminen on samankaltaista, vain sitoutumisen määrässä on eroja. Nanokokoisten ja mikrokokoisten (karkea rtio 2 ) titaanidioksidien sitoutumisessa solulysaattiproteiineihin voitiin sen sijaan havaita suuria eroja. Alumiinipäällystetyn titaanidioksidin tarttuminen plasmaproteiineihin oli samankaltaista kuin muilla titaanidioksideilla, mutta solulysaattikokeessa tarttumisprofiili erosi muista selvästi (Kuva 4B, 1b). Keuhkojen alveolisolut erittävät keuhkorakkuloiden sisäpinnalle proteiini- ja fosfolipidiseosta, surfaktanttia, joka vähentää nestekalvon pintajännitystä ja auttaa siten keuhkorakkuloita pysymään avoimina. Koska hengitettyjen nanopartikkelien täytyy ensin läpäistä surfaktanttikerros ennen kuin ne kohtaavat alveolisoluja, halusimme tutkia miten tämä pinta-aktiivinen aine vaikuttaa proteiinien tarttumiseen nanomateriaalien pintaan. Nanomateriaalien kyky sitoa soluproteiineja väheni huomattavasti (Kuva 4C). Suurin vaikutus surfaktantilla oli niiden nanomateriaalien tarttumiskykyyn, jotka sitoivat voimakkaimmin proteiineja (Figure 4C 2-4). Massaspektrometrinen proteiinianalyysi osoitti, että nanomateriaalit sitoutuivat samanlaisiin proteiineihin riippumatta siitä, oliko tarttumiskokeessa mukana surfaktanttia vai ei. Poikkeuksena oli nanomateriaaleihin vahvasti sitoutunut pulmonaarinen surfaktanttiproteiini B, joka oli kiinnittynyt kaikkiin testimateriaaleihin surfaktanttiliuoksesta.

11 Kuva 4. (A) Partikkelien tarttuminen seerumin sekä makrofaagi- ja epiteelisolulysaatin (A549) proteiineihin. Proteiinien määrällinen sitoutuminen esitetty proteiinien painon suhteena nanomateriaalien painoon. Seerumi (valkoinen pylväs), makrofaagisolulysaatti (musta pylväs) ja epiteelisolulysaatti (harmaa). alumiinipäällystetty rtio 2 (1); silikapäällystetty rtio 2 (2); r/atio 2 (3); atio 2 (4); karkea rtio 2 (5); mwcnt (6); swcnt (7);silikonipäällystetty rtio 2 (8); SiO 2 (9); ZnO (10); MIN-U-SIL (11) (B) Coomassie-värjätyt, SDS-PAGE-geelikuvat partikkelien sitomista seerumin (a) ja makrofaagisolulysaatin (b) proteiineista. Alumiinipäällystetty rtio 2 (1); silikapäällystetty rtio 2 (2); r/atio 2 (3); atio 2 (4); karkea rtio 2 (5); mwcnt (6) I: fibrinogeeni alpha, II: fibrinogeeni beta, III: fibrinogeeni gamma, IV: immunoglobuliinien kevyt ketju (C) Nanomateriaalien kyky sitoa epiteelisolulysaatin proteiineja ilman surfaktanttia (harmaa) ja surfaktantin kanssa (valkoinen). Alumiinipäällystetty rtio 2 (1); silikapäällystetty rtio 2 (2); r/atio 2 (3); atio 2 (4); karkea rtio 2 (5); mwcnt (6); swcnt (7);silikonipäällystetty rtio 2 (8); SiO 2 (9); ZnO (10); MIN-U-SIL (11) 4.3. Nanomateriaalin pintavaraus ja -modifikaatio vaikuttavat tarttuneiden proteiinien laatuun Nanomateriaaleihin tarttuneet proteiinit tunnistettiin massaspektrometrian avulla, jotta kyettäisiin arvioimaan nanomateriaalien mahdollisia vaikutuksia solun toiminnoille. Kun sitoutuneet proteiinit luokiteltiin teoreettisen isoelektrisen pisteen (pi) perusteella, voitiin havaita että titaanidioksidipartikkelien pintavaraus määrittää osittain minkälaisia soluliman proteiineja nanopartikkeleihin tarttui (Kuva 5 A). Proteiineilla on positiivinen pintavaraus sillon kun ympäristön ph on matalampi kuin niiden pi. Näin proteiinit, joilla on korkea pi, ovat herkemmin vuorovaikutuksessa sellaisten nanomateriaalien kanssa, joilla on matala z-potentiaali kuten r/atio 2 ja karkea rtio 2 (Kuva 5 A:3 ja A:5). Kuvassa 5 B: 1-6 esitetään tarttuneet primäärimakrofaagien soluliman proteiinit, jotka on lajiteltu proteiinien solutoiminnan perusteella. Suurin osa tunnistetuista (n=79) sytoplasmisista proteiineista liittyvät toiminnaltaan solutukirankaan (30 %), uusien proteiinien tuotantoon (26 %) tai aineenvaihduntaan (22 %); yhteensä nämä luokat pitävät sisällään kaksikolmasosaa tunnistetuista proteiineista. Loput ryhmät jakautuivat seuraavasti: tulehdusvaste (5 %), signaalinvälitys (9 %), kuljetus (5 %), oksidatiivinen stressi (2 %) ja muut (1 %) (Kuva 5 B:1). Silikapäällystetty rtio 2 - partikkelit (tunnistuneita proteiineja 61) sitoivat erityisesti signaalinvälityksessä toimivia proteiineja, sillä signaalinvälitys-luokka oli lähes kaksi kertaa suurempi (16 %) kuin sytoplasmassa,

12 joka ei ollut reagoinnut nanomateriaalien kanssa. Uusien proteiinien tuotanto -kategoria sen sijaan oli huomattavasti pienempi, kuin altistamattomassa solulimassa (18 %) (Kuva 5B:2). r/atio 2 - partikkelit peittyivät 78 erilaiseen proteiiniin (Kuva 5B:3), joista solutukiranka -ryhmä oli pienempi (19 %) ja vastaavasti muut -luokan proteiinit (13 %) suurempi kuin vertailusytoplasmassa. Anataasi titaanidioksidin (atio 2 ) sitomat soluliman proteiinit jakautuivat samankaltaisesti toiminnallisiin luokkiin kuin vertailusytoplasmassa (Kuva 5B:4). Mikrokokoiset karkeat rtio 2 partikkelit tarttuivat erityisesti uusien proteiinien tuotantoon (40 %) sekä oksidatiiviseen stressiin (10 %) liittyviin proteiineihin (Kuva (5B:5). Moniseinäiset hiilinanoputket adsorboivat pelkästään säiemäisiä proteiineja, jotka tunnistuivat myosiiniksi, vimentiiniksi ja aktiiniksi (Kuva 5B:6). Kuva 5. Kuvassa A nanomateriaaleihin tarttuneet makrofaagisoluliman proteiinit on luokiteltu proteiinien isoelektristen pisteiden perusteella (A:1-6). B kuvassa nanomateriaaleihin tarttuneet proteiinit on luokiteltu toiminnan mukaan (B:1-6). Interaktiokokeet ilman nanomateriaaleja (1), silikapäällystetyn rtio 2 kanssa (2), r/atio 2 kanssa(3), atio 2 kanssa (4), karkean rtio 2 kanssa (5) ja mwcnt kanssa (6).

13 Kaikki titaanidioksidipartikkelit tarttuivat peroksiredoksiini 1:een, anneksiini A2:een ja useisiin ribosomaalisiin ja solutukirangan proteiineihin. Ainoastaan nanokokoiset TiO 2 -materiaalit näyttivät sitovan S100-perheen proteiineja, jotka sisältävät paljon negatiivisesti varattuja aminohappoja (Santamaria-Kisiel ym, 2006). Negatiivisesti varautuneilla proteiinidomeeneilla voi olla suuri merkitys proteiinien ja nanomateriaalien interaktioissa Mikro- ja nanokokoisten titaanidioksidipartikkelien erilainen solulysaattiproteiinien sitomiskyky Mikrokokoista titaanidioksidia käytetään yleisesti fosforyloitujen peptidien rikastamiseen proteiiniseoksista (Schmidt ym, 2007). Menetelmässä fosforyloidut peptidit tarttuvat titaanidioksidiin kiinni ph:ssa 6.5 ja ne eluoidaan materiaalista muuttamalla liuoksen ph alkaliseksi. Koska muutamat nanokokoiset TiO 2 -muodot sitovat proteiineja paremmin kuin mikrokokoinen TiO 2, selvitettiin ph:n vaikutus nanokokoisen r/atio 2 :n ja mikrokokoisen rtio 2 kykyyn sitoa makrofaagisolulysaatin proteiineja. Nanokokoisen titaanidioksidin affiniteetti proteiineja kohden väheni vain hieman, kun puskurin ph muuttuu emäksisemmäksi. Karkean rtio 2 kyky sitoa proteiineja sen sijaan romahti korkeammassa ph:ssa (Kuva 6A). Kun partikkeleihin sitoutuneet proteiinit luokiteltaan niissä olevien fosforylaatiokohtien lukumäärän perusteella, havaitaan että r/atio 2 -nanopartikkelit sitovat enimmäkseen fosforyloimattomia proteiineja (Kuva 6B). Sen sijaan mikrokokoinen titaanidioksidi tarttui proteiineihin, joissa oli useita fosforylaatiokohtia (Kuva 6C). Tulokset osoittavat, että nanokokoisen titaanidioksidin pintakemia eroaa mikrokokoisen TiO 2 :n pintakemiasta oleellisesti, eikä nanokokoisten titaanidioksidien tehokkaampi proteiinien sitomiskyky johdu pelkästään suuremmasta pinta-alasta. Kuva 6. Mikrokokoisen ja nanokokoisen titaanidioksidien kyky sitoa ihmisen primäärimakrofaagisolulysaatin proteiineja. ph:n vaikutus tarttuneiden proteiinien määrään nanokokoisessa (valkoinen pylväs) ja mikrokokoisessa TiO 2 -partikkelissa (musta pylväs). Sitoutuneiden proteiinien määrä kvantifioitiin Coomassie-värjätyn SDS-PAGEgeelin kaistaleiden värin syvyyden perusteella ph 6:ssa (z-potentiaali molemmilla -2 mv), ph 7:ssä (-62 ja -73 mv) ja ph 9:ssä (-37 ja -46 mv) (A). Tarttuneet partikkelit luokiteltu fosforylaatiokohtien määrän perusteella: r/atio 2 (B) ja karkea rtio 2 (C) Nanopartikkelialtistus aiheuttaa soluissa oksidatiivistä stressiä Aikaisemmin in vivo-testatuista nanomateriaaleista silikapäällystetty rtio 2 oli ainoa, joka sai aikaan neutrofiliaa ja muita tulehdusvaikutuksia hiiren keuhkoissa (Rossi ym, 2010), minkä vuoksi se ja sen päällystämätön titaanidioksidiversio, r/atio 2, valittiin solujen proteomimuutosten tutkimiseen. Altistetuista ihmisen primäärimakrofaagien sytoplasmoista löydettiin 114 proteiinitäplää, joiden ilmentyminen oli muuttunut verrattuna negatiivisena kontrollina käytetyihin altistamattomiin soluhin. Näistä 84 pystyttiin tunnistamaan tandem-massaspektrometrian avulla (Kuva 7). Mitokondriovertailussa löytyi 37 proteiinitäplää, jotka täyttivät tilastollisessa analyysissä

14 käyttetyt kriteerit. Fosforylaatioista ja muista translaation jälkeisistä proteiinien modifikaatioista johtuen useat tunnistetuista sytoplasman proteiinitäplistä osoittautuivat saman proteiinin isoformeiksi (Kuva 7). Erilaisia proteiineja tunnistui lopulta 51 (Taulukko 2). Altistetuissa soluissa näkynyt ekspression alentuminen voi johtua proteiinin tarttumisesta soluihin kertyneisiin nanopartikkeleihin (kohta 4.3.) eikä varsinaisesta solun vasteesta. Tunnistuneista proteiineista valittiin seitsemän mielenkiintoista validointia varten: anneksiini A2 (Kuva 8A), peroksiredoksiini 1 (Kuva 8B), "makrophage-capping" proteiini (Kuva 8C), kloridin intrasellulaarinen kanavaproteiini 1 (Kuva 8D), katepsiini D (Kuva 8E), superoksidi dismutaasi 2 [Mn] (Kuva 8F) ja "heterogenous nuclear ribonucleoprotein" A2/B1 (Kuva 8G). Kuva 7. 2D-Differentiaali geelielektroforeesi (2D-DIGE) kuva ihmisen primäärimakrofaagien sytoplasmasta. Makrofaagit altistettiin 300 µg/ml, 24 tuntia, silikapäällystetty rtio2:lle, r/atio2:lle tai kasvatusmedialle, joka toimi kontrollina. Sinertävät pisteet ovat proteiineja, joiden ilmentyminen on heikentynyt nanopartikkelialtistetuissa soluissa verrattuna kontrolliin. Vihertävät pisteet ovat proteiineja, joiden ilmentyminen on lisääntynyt verrattuna kontrolliin.

15 Taulukko 2 Tunnistuneet proteiinit Uniprot Mascot Ekspr. Tunnistus Toiminta t-test pisteet muutos P Heat shock protein HSP 90-beta proteiinien laskostuminen 0,0044-3,49 P moesin solutukiranka 0,0037-2,03 P ezrin solutukiranka 0,009-2,54 P Plastin-2 t-solujen aktivaatio 0,0097-6,08 P V-type proton ATPase catalytic subunit A protonien kuljetus 0,0056-2,74 P T-complex protein 1 subunit theta proteiinien laskostuminen 0,0078-3,96 P Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 apoptoosi 0,0028-2,19 P Importin subunit alpha-1 proteiinien kuljetus 0,0073-2,13 Q9BQE3 461 Tubulin alpha-1c chain solutukiranka 0,0021-2,87 Q Dihydropyrimidinase-related protein 2 signaalinvälitys 0,0093 2,2 P Pyruvate kinase isozymes M1/M2 metabolia 0,0091-2,75 P glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase metabolia 0,0033 2,07 P S protease regulatory subunit 6A metabolia 0,007-2,27 Q9UNH7 108 Sorting nexin-6 proteiinien kuljetus 0,0021-2,34 P Ribonuclease inhibitor metabolia 0,007 2,15 P Eukaryotic initiation factor 4A-I translaatio 0,0034-5,99 P vimentin solutukiranka 0,0052 3,36 P Heat shock protein HSP 90-alpha stressivaste 0,0047 2,94 P Annexin A2 stressivaste 0,0079-2,48 P Tropomyosin alpha-3 chain solutukiranka 0,0055 2,17 P Hexokinase-3 metabolia 0,005-1,97 P Cytoplasmic aconitate hydratase metabolia 0,0075 1,51 P Heat shock 70 kda protein 4 stressivaste 0,0095 1,61 Q S proteasome non-atpase regulatory subunit 2 metabolia 0,0056 1,77 P Tyrosyl-tRNA synthetase, cytoplasmic apoptoosi 0,0033-1,88 P Elongation factor 1-gamma translaatio 0,0091 1,52 P Aspartate aminotransferase, cytoplasmic metabolia 0,0092-1,54 P Actin, cytoplasmic 1 solutukiranka 0,0053 1,53 P Annexin A1 tulehdusvaste 0,0094-1,54 P Ribose-phosphate pyrophosphokinase 1 metabolia 0,0075-1,84 O S proteasome non-atpase regulatory subunit 14 proteiinien laskostuminen 0,0042 1,64 P Cathepsin B proteolyysi 0,0058 1,99 P Sulfotransferase 1A1 metabolia 0,0055-1,72 P Phosphoglycerate mutase 1 metabolia 0,006 1,67 P Macrophage-capping protein Rooli makrofaagien 0,0057 1,83 toiminnassa Q9Y3Z3 52 SAM domain and HD domain-containing protein 1 tulehdusvaste 0,0011-3,04 P T-complex protein 1 subunit delta proteiinien laskostuminen 0, ,81 Q Histone-binding protein RBBP4 translaatio 0,0017 1,57 P Annexin A11 tulehdusvaste 0, ,13 P tubulin alpha-1b solutukiranka 0,0012-5,22 P Acylamino-acid-releasing enzyme proteolyysi 0, ,65 P Protein S100-A8 tulehdusvaste 0,0014 1,71 P Tubulin beta chain solutukiranka 0, ,69 P Actin, cytoplasmic 2 solutukiranka 0, ,99 O Chloride intracellular channel protein 1 kloorikanava 0, ,88 P cathepsin D proteolyysi 0, ,23 P Grancalcin solumembraani 0,0011-1,66 P Peroxiredoxin-2 solun redoksitasapaino 0, Q peroxiredoxin 1 solun redoksitasapaino 0, ,23 P Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial happitasapaino 0, ,93 P Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 RNA kuljetus 0,0017 1,88

16 Kuva 8. Validointiin valittujen proteiinien ilmentymismuutokset. Altistamaton vs. silikapäällystetty rtio 2 vs. r/atio 2. Anneksiini A2 (A), Peroksiiredoksiini 1 (B), Macrophage-capping proteiini (C), Kloridin intrasellulaarinen kanavaproteiini 1 (D), Katepsiini D (E), Superoksidi dismutaasi (F), Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 (G). 5. POHDINTA 5.1. Nanomateriaalit kerääntyvät sisälle soluihin Nanomateriaalien mahdollisien terveysvaikutuksien arvioiminen edellyttää altistumisen ensivaiheiden ymmärtämistä. Hengitysteiden kautta tapahtuvassa altistumisessa nanomateriaalit kohtaavat ensimmäiseksi hengityselimistön limakerroksen, mikä koostuu lähinnä surfaktanttiproteiineista ja -lipideistä. Läpäistyään surfaktanttikalvon nanomateriaalit kulkeutuvat syöjäsolujen ja endoteelisolujen sisään, missä ne voivat tarttuvat kiinni solujen proteiineihin.

17 Tarttuminen estää proteiinien biologisen tehtävän suorittamisen ja siten häiritä koko solun toimintaa, mikä voi laukaista solukuoleman. EM-kuvien perusteella voidaan päätellä, että kaikki testatut nanomateriaalit kerääntyvät sekä ihmisen primäärimakrofaagien että endoteelisolujen sisään, kuten on jo aikaisemmin osoitettu joillakin partikkeleilla (Rossi ym, 2010; Simon-Deckers ym, 2008 ja Stearns ym, 2001). Nanomateriaalit ovat aggregaatteina solujen sisällä ja suurimmaksi osaksi kalvorakenteiden ympäröiminä. Osassa nanomateriaaleja partikkeleita näkyi myös vapaina solulimassa (Kuva 3). Tumista nanomateriaaleja ei tässä työssä löytynyt Nanomateriaalien pintaominaisuudet vaikuttavat sitoutuneiden soluproteiinien määrään ja laatuun Aiemmin on osoitettu, että nanopartikkelit päällystyvät seerumin proteiineilla, muodostaen proteiinikoronan (Cedervall ym, 2007). Päällystymistä voidaan kuvata Vroman-ilmiöllä, jossa partikkeleihin kiinnittyy aluksi proteiineja, joita on paljon ympäristössä. Myöhemmin proteiinit, joita on ympäristössä vähemmän, mutta joilla on suurempi affiniteetti partikkeleita kohtaan syrjäyttävät ensimmäiset sitoutujat (Vroman ym, 1980). Tutkimuksissamme havaitsimme, että muutamat titaanidioksidi-nanomateriaalit sitoivat selkeästi enemmän solulysaatin ja plasman proteiineja kuin muut. Nanomateriaaleihin sitoutuneet plasman proteiinit tunnistettiin fibrinogeeni alphaksi, betaksi ja gammaksi sekä immunoglobuliinin kevyemmäksi ketjuksi. Fibrinogeenien lisäksi plasmatarttumiskokeessa tunnistui opsonisaatiossa toimivia proteiineja: komplementin proteiineja, fibronektiinejä, immunoglobuliineja ja apolipoproteiineja. Opsonisaatio on tapahtuma, jossa elimistölle vieraat molekyylit päällystyvät yllä mainitulla merkkimolekyyleillä, joiden avulla syöjäsolut ja muut immuunisolut sitten tunnistavat tuhottavat molekyylit ja poistavat ne kierrosta (Owens III ja Peppas, 2006). Silikapäällystettyä rtio 2 :ta, r/atio 2 :ta ja atio 2 :ta lukuunottamatta muut testatut materiaalit tarttuivat huomattavasti huonommin solulysaatin proteiineihin kuin plasman proteiineihin (Kuva 4A). Nanomateriaali-plasmaproteiini-interaktio (opsonisaatio) näyttäisi tapahtuvan riippumatta nanomateriaalin pinnan ominaisuuksista. Sen sijaan solulysaattiproteiinien tarttumiseen materiaalin pintaominaisuuksilla on vaikutus, joten voi olla että plasma- ja soluproteiinien sitoutumisen taustalla on kaksi erilaista mekanismia. Yksi adsorptioon vaikuttava tekijä voisi olla solulysaatti- ja plasmaproteiinien modifikaatioiden erilaisuus, sillä plasmaproteiinit sisältävät huomattavasti enemmän sokerirakenteita kuin solulysaatin proteiinit, joissa taas esiintyy runsaasti fosforylaatiota. Surfaktantin lisääminen tarttumiskokeisiin laski merkittävästi nanomateriaalien tarttumistehokkuutta solulysaatin proteiineihin, mutta kokonaan sitoutuminen ei hävinnyt (Kuva 4C). Tarttumisen aleneminen voi johtua surfaktantin runsaasta fosfolipidipitoisuudesta, jolloin lipidit kilpailevat solulysaatin fosfoproteiinien kanssa sitoutumisesta. Nanomateriaalit ovat erittäin monimuotoinen ryhmä. Niiden pintoja on helppo muokata, jolloin saadaan aikaan uusia ominaisuuksia. Materiaaleihin on lisäksi voinnut jäänyt epäpuhtauksia, kuten metalleja. Tämän takia olisi tärkeä määrittää, johtuuko toksinen vaikutus materiaalin pinnan muokkauksesta, epäpuhtauksista vai materiaalista itsestään. Materiaalin pinta-alalla on teoriassa merkitys sen kyvylle sitoa proteiineja, sillä suurempi pinta-ala mahdollistaa tehokkaamman tarttumisen. Pintareaktiivisuus näyttää kuitenkin olevan määräävämpi tekijä proteiinien sitomiskyvylle, sillä päällystämättömät atio 2 ja r/atio 2 adsorboivat huomattavasti tehokkaammin proteiineja verrattuna alumiinilla ja silikonilla päällystettyihin titaanidioksideihin (Kuva 4A,C). Vertailtaessa silikapäällystetyn rtio 2 :n ja swcnt:n kykyä tarttua proteiineihin voidaan todeta, että suurempi pinta-ala ei aina tarkoita tehokkaampaa interaktiota proteiinien kanssa (Taulukko 1 ja Kuva 4A,C). Hydrofobisuus vaikeuttaa selkeästi materiaalin proteiinien sitomiskykyä. Vaikeampaa on selittää, miksi silika- ja alumiinipäällystetty rtio 2 tarttuvat proteiineihin niin erilaisella tehokkuudella, vaikka partikkeleilla on samankaltainen koko, z-potentiaali, pinta-ala ja kiderakenne.

18 Asbestin on aikaisemmin osoitettu sitovan solutukirangan proteiineja ja näin aiheuttavan ongelmia kromosomien järjestäytymiselle mitoosin aikana (MacCorkle ym, 2006). Samalla tavalla mwcnt näyttää sitovan pelkästään solutukirangan proteiineja, mikä voi myös saada aikaan samankaltaisia ongelmia solujen jakautumisessa (Kuva 5B). Muut nanomateriaalit sitovat vaihtelevasti proteiineja, jotka ovat mukana monenlaisissa solun toiminnoissa. Tarttuminen metaboliaan, uusien proteiinien tuotantoon ja stressivasteeseen liittyviin proteiineihin voi aiheuttaa häiriöitä solun elinkierrossa ja osaltaan selittää aiheutuvia toksisia vaikutuksia. Vaihtelemalla puskurin ph:ta voidaan vaikuttaa materiaalien kykyyn sitoa proteiineja. Tätä ilmiötä hyödynnetään yleisesti fosfoproteiinien eristyksessä: mikrokokoinen titaanidioksidi sitoo tehokkaasti fosforiryhmiä sisältäviä matalassa ph:ssa. Emäksisessä puskurissa proteiinien sitoutuminen katoaa ja tarttuneet proteiinit voidaan uuttaa pois TiO 2 -partikkeleista (Yu ym, 2009). Nanokokoisella TiO 2 :lla tätä ominaisuutta ei ole (Kuva 6A), joten sen pintakemian eroaa oleellisesti mikrokokoisen rtio 2 :n pintakemiasta. Tarttuminen proteiineihin on kuitenkin hieman tehokkaampaa alhaisemmassa ph:ssa. Kuten EM-kuvat osoittavat, nanomateriaalit ovat usein kalvorakenteiden sisällä, joissa vallitsee alhaisempi ph kuin sytoplasmassa. On mahdollista, että tarttuminen kalvoproteiineihin voi saada aikaan kalvon hajoamisen ja nanomateriaalien pääsyn solulimaan, missä niitä myös havaittiin EM-kuvissa (Kuva 3). Tämän jälkeen nanomateriaalit ovat vapaita häiritsemään sytoplasman proteiinien ylläpitämiä soluntoimintoja Nanopartikkelialtistus saa aikaan puolustusvasteen ihmisen primäärimakrofaageissa Nanomateriaalien vaikutuksia soluissa voidaan tutkia useilla menetelmillä. Sytoplasman proteomia tutkimalla saadaan kokonaiskuva altistuksen aiheuttamista proteiinien ilmentymismuutoksista ja soluvasteesta. Nanokokoisilla silikapäällystetty rtio2 ja r/atio 2 -partikkeleilla altistetuista soluista pystyttiin tunnistamaan 51 erilaista proteiinia, joiden ilmentyminen oli muuttunut tilastollisesti merkittävästi. Näistä suuri osa on proteiineja, joita löydetään aina kun soluja altistetaan, riippumatta altisteesta (Wang ym, 2009). Tarkempaan validointiin valittiin 7 proteiinia: anneksiini A2, peroksiredoksiini 1, "macrophage-capping" proteiini, kloridin intrasellulaarinen kanavaproteiini 1, katepsiini D, superoksidi dismutaasi 2 [Mn] ja "heterogenous nuclear ribonucleoprotein" A2/B1. Näistä peroksiredoksiini 1 (PRDX1) ja superoksidi dismutaasi 2 [Mn] (SOD2) kontrolloivat soluissa muodostuvia vapaita radikaaleja suojaten soluja oksidatiiviselta stressiltä. SOD2 on mitokondrion kalvolla oleva proteiini, joka sitoo mangaania ja jossain määrin myös rautaa (Culotta ym, 2006). SOD2:den ekspression on osoitettu kasvavan tulehduksessa. SOD2 inhiboi puolestaan tulehduksessa ja oksidatiivisessa stressissä toimivien proteiinien ekspressiota ja näin vähentää tulehdusta (Than ym, 2009). SOD2:n tuotto kasvaa myös nanopartikkelialtistuksen jälkeen viitaten solujen kärsivän radikaalien muodostumisesta (Kuva 8F). Peroksiredoksiini-perheen proteiinit muuntavat oksidatiivisessa stressissä muodostuvaa vetyperoksidia vedeksi aminoterminaalisen kysteiini-aminohapon hapettumisen kautta. Peroksiredoksiinit toimivat lisäksi immuunivasteessa, solujen erilaistumisessa ja lisääntymisessä. (Smith-Pearson ym, 2008 ja Zhang ym, 2009). Peroksiredoksiini 1:den ekspression on havaittu kasvavan useissa syövissä (Zhang ym, 2009). Solun ollessa voimakkaassa hapetusrasituksessa, PRDX1:n aktiivinen kysteiini saattaa ylihapettua, mikä johtaa proteiinin inaktivoitumiseen (Sue ym, 2005). Ylihapettuminen muuttaa proteiinin isolektristä pistettä, mikä voidaan tunnistaa 2D elektroforeesin avulla (Wagner ym, 2002). Nanomateriaalialtistuksen jälkeen PRDX1-täpliä tunnistui geeliltä useita. Kahden ilmentyminen oli voimakkaasti kasvanut ja yhden laskenut (Kuvat 7 ja 8B), mikä saattaa johtua PRDX1:n ylihapettumisesta tai vastaavasti fosforylaation muutoksista. PRDX1:n ja SOD2:n ekspressiomuutokset viittaavat soluissa käynnissä olevaan hapetusrasitukseen sekä tulehdusreaktioden käynnistymiseen. Myös CLIC1:sen (kloridin intrasellulaarinen kanavaproteiini 1) tuotto lisääntyy hapettavissa olosuhteissa ja sitä käytetäänkin oksidatiivisen stressin merkkiproteiinina. Hapettuminen muuttaa proteiinin muotoa ja saa aikaan sen siirtymisen

19 sytoplasmasta solukalvolle, missä se muodostaa ionikanavan. Solukalvolla CLIC1 lisää kloridiionien diffuusiota ja siten vähentää solunsisäistä oksidaatiota (Averaimo ym, 2010). Endoteelisoluissa CLIC1:den on näytetty edistävän solujen vaellusta ja kasvua integriinivälitteisesti (Tung ja Kitajewski, 2010). Nanokokoisen titaanidioksidin on aiemmin havaittu kasvattavan CLIC1:den ekspressiotasoa rottien keuhkoissa (Cha ym, 2007). Samankaltaisesti Primäärimakrofaageilla CLIC1:den ilmentyminen on kasvanut samankaltaisesti (Kuva 8D), mikä vahvistaa käsitystä hapetusrasituksesta nanopartikkelialtistuksen jälkeen. Katepsiini D (CATD) on lysosomaalinen proteiini, jolla on tärkeä rooli proteiinien pilkkomisessa. Aggressiivisissa syöpämuodoissa CATD:tä eritetään ulos solusta, jossa se toimii muun muuassa kasvutekijänä (Zaidi ym, 2008). CATD tuoton on havaittu kasvavan hamstereiden keuhkoissa ja kauhkorakkuloiden makrofaageissa asbestialtistuksen jälkeen (Sjöstrand ym, 1989). Nanopartikkelialtistuksella näyttää olevan samanlainen vaikutus CATD:n ilmentymiseen makrofaageissa (Kuva 8E). CATD proteiinin määrän lisääntyminen sytoplasmassa voi viitata radikaalien aikaansaamaan lysosomien kalvon läpäisyvyyden kasvuun ja kaspaasi-välitteiseen apoptoosiin (Castino ym, 2007). Anneksiini A2 (ANXA2) -geelitäpliä löytyi PRDX1:n tapaan ilmentymiseltään sekä nousseita että laskeneita (Kuvat 7 ja 8A). Anneksiini-proteiiniperheen jäsenet ovat toiminnaltaan monipuolisia - niillä on sekä solun sisäisiä, että ulkoisia toimintoja. Pääosin anneksiini-proteiinit toimivat kalvojen pinnalla tarttuen negatiivisesti varattuihin fosfolipideihin kalsium-ionivälitteisesti vakauttaen kalvoja. Ca 2+ -ionien välityksellä kulkee myös useita tärkeitä signaaliketjuja, joissa anneksiinit ovat tärkeässä roolissa. ANXA2 toimii endo- ja eksosytoosissa sekä vesikkelien fuusiossa. Sen on myös osoitettu tarttuvan fosfatidyyli-inositoli-4,5 bisfosfaatteihin aktiinin sitoutumiskohdissa, välittäen sitoutumista kalvojen ja solutukirangan välillä. Solun ulkopuolella ANXA2 pystyy tarttumaan plasminogeeniin ja edes auttamaan fibriinin hajottamista (Gerke ym, 2005). Tanaka ym. (2004) näyttivät, että ANXA2:n ilmentyminen kasvaa happiradikaaleilla aiheutetussa munuaissyövässä, jolloin jatkuva hapetusrasitus saa aikaan ANXA2:n välittämänä metastaasia ja solujen lisääntymistä. Makrofaagien ANXA2-proteiinien ekspressio muuttuu nanopartikkelialtistuksen jälkeen. Proteiinin sisältämät useat fosforylaatiokohdat selittävät monen ANXA2-geelitäplän löytymisen ja osoittavat fosforylaatioasteen muuttuneen (Kuvat 7 ja 8A). Fosforylaatiomuutokset viittaavat yleensä proteiinin aktivoitumiseen, ja ANXA2:n on osoitettu olevan fosforyloitunut maksasyövässä (Mohammad ym. (2008). ANXA2:n lisääntynyt tuotto viittaa oksidatiiviseen stressiin sekä aktiiviseen kalvoliikenteeseen makrofaageissa. CapG:n (Macrophage capping protein) ekspression nousu kertoo makrofaagien kasvaneesta aktiivisuudesta ja fagosytoosista. Gelsoliini-proteiiniperheeseen kuuluva CapG tarttuu kalsiumin aktivoimana solutukirangan aktiiniin. Ilman CapG:tä makrofaagien fagosytoosi heikkenee huomattavasti ja vesikkelien liike ja pseudopodien muodostus vähenee (Witke ym, 2001). CapG:n ekspressiotason on näytetty kasvavan hapenpuutteessa syöpäsoluilla, edistäen syöpäkasvainten kasvua ja verisuonten muodostusta (Liao ym, 2009). hnrnp A2/B1 proteiinit (Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1) kuuluvat hnrnpproteiiniperheeseen, jonka jäsenet sukkuloivat tuman ja soluliman välillä. Nämä proteiinit muokkaavat telomeerejä, silmikoivat sekä stabiloivat mrna:ta, toimivat translaatiossa ja kuljettavat mrna:ta sekä muita molekyylejä tuman ja soluliman välillä (He ja Smith, 2009). hnrnp A2/B1 ekspression on osoitettu nousseen useissa syöpätyypeissä mm. keuhkosyövässä (Fielding ym, 1999, Zhou ym. 2001). Sitä käytetään myös syövän varhaismerkkiaineena. Cui ym. (2010) osoittivat, että hnrnp A2/B1:den kasvanut ekspressio sytoplasmassa kertoo maksasolusyövän pahanlaatuisuudesta ja metastaasista. hnrnp A2/B1:den ilmentyminen sytoplasmassa kasvaa myös nanopartikkelialtistuksen jälkeen. 6. JOHTOPÄÄTÖKSET Nanomateriaalien rajattomat mahdollisuudet ovat saaneet aikaan räjähdysmäisen kasvun myös nanomateriaaleja hyödyntävässä teollisuudessa. Nanoteollisuuden ja -kuluttajatuotteiden